Métodos de estudio de la célula I Microscopía óptica - Algunos hechos históricos sobre la microscopía óptica Clasificación de los microscopios Partes del microscopio óptico. Fundamento físico de la microscopía óptica. Manejo y uso del microscopio. Objetivos: Que los estudiantes sean capaces de: 1. Describir las partes del microscopio óptico, sus características y funciones. 2. Describir el principio de funcionamiento del microscopio óptico. La investigación en el área de la biología celular, como en todas las ciencias experimentales, depende de los métodos de laboratorio que se empleen para el estudio de la relación estructura- función. La mayoría de los avances importantes en el conocimiento de las células ha sido posible gracias al desarrollo de métodos que han abierto nuevas perspectivas a la investigación. Uno de los avances más importantes en el desarrollo de esta disciplina es la invención del microscopio. Algunos hechos históricos sobre la microscopía óptica Las células son pequeñas y complejas, por lo que es difícil observar sus estructuras. Por ello, la capacidad de ver sus detalles estructurales depende del empleo de instrumentos disponibles. De hecho, los avances sobre el conocimiento de las células son fruto de la introducción de nuevas técnicas para su estudio. El ojo humano tiene un poder de resolución de 100 µm. Esto significa, que, si observamos dos puntos separados entre sí por menos de 100 µm, se observarán como uno solo. Además de ser pequeñas, las células son incoloras y traslúcidas, por lo que es necesario teñirlas con colorantes para hacerlas visibles. Los historiadores no coinciden en las épocas, lugares, personas o hechos acerca de la evolución de los microscopios. Las primeras lentes de las cuales se tiene conocimiento, se fabricaron por civilizaciones antiguas. Además de permitir la observación de objetos de forma aumentada, esas lentes se utilizaban para concentrar los rayos de luz en un punto y poder hacer fuego, incluso, algunas tenían función decorativa. La lente más antigua que se ha conservado se fabricó en Nínive, capital del Imperio Asirio (650 a.c), donde el arqueólogo inglés sir John Layard descubrió en 1842 el primer vidrio de roca, plano convexo, elaborado con fines ópticos. Otros historiadores señalan a Alhazen, que ideó unas bolas de cristal, fundidas con varillas de cristal, que aumentaban la visión en la observación a través de las mismas. Las civilizaciones egipcia, griega y babilónica conocían las propiedades de las lentes. Una de las técnicas que se utilizaba en la antigua Roma era llenar esferas de vidrio con agua para observar objetos de manera aumentada al mirarlos a través de la esfera. A pesar del extenso uso de estas primeras lentes, su poder de aumento era muy limitado. Esto hizo que el verdadero desarrollo en el campo de la óptica no empezara hasta finales del siglo XVII, cuando en Italia se fabricaron las primeras lentes utilizadas como gafas. A partir de esta época, la mejora en las técnicas de fabricación de lentes dio lugar a la invención de instrumentos como el telescopio y el microscopio. Galileo Galilei (1564-1642) construyó en 1609 un anteojo convertible en microscopio basado en la combinación de una lente cóncava junto con una lente convexa. No es posible afirmar con absoluta certeza quién fue el verdadero inventor del microscopio. Varias fuentes apuntan a que Hans Janssen y su hijo Zacarías construyeron en Middelburg (Holanda) los primeros microscopios utilizados por aquella época. En 1590, Zacarías trabajaba junto a su padre como fabricante de anteojos. Durante sus trabajos tuvo la idea de conectar dos lentes mediante un tubo y se dio cuenta de que podía observar objetos con aumentos mayores que los que se conseguían con una lente. De acuerdos con los documentos de esa época los aumentos que se lograban eran entre 3x y 9x. Sin embargo, otros indicios señalan a que el inventor fue Hans Lippershey (Figura 1). Figura 1. A) Fotos de los inventores de los microscopios. B) Fotografía del instrumento creado por Zacarías Janssen al conectar dos lentes mediante un tubo, lo que permitió la observación de objetos con aumentos mayores. René Descartes, en su obra Dioptrique, describe también la construcción de un microscopio, y Anthony van Leeuwenhoek (1632-1723) realiza investigaciones microscópicas por medio de lupas de gran aumento construidas por él mismo. Van Leeuwenhoek (Figura 2) era un comerciante de telas. Su interés por la microscopía empezó con el objetivo de fabricar mejores lentes para analizar la calidad de las telas con las que comerciaba. De hecho, aportó al campo de la microscopía al descubrir una nueva técnica de fabricación de lentes que lograba un aumento de 200x. Sus microscopios eran microscopios simples, o sea, de una sola lente. Comparados con los microscopios actuales, los microscopios de Leeuwenhoek eran muy primitivos, pero mediante una cuidadosa manipulación y un buen enfoque, fue la primera persona en observar bacterias y protozoos. Anthony van Leeuwenhoek mantenía en secreto sus técnicas de fabricación, pero no sus descubrimientos. Describió sus observaciones en una serie de cartas dirigidas a la Royal Society de Londres, publicadas en 1684. Por sus aportes a la microscopía se le ha conocido como el padre de la Microbiología. A C B D Figura 2. A) Fotografía de van Leeuwenhoek B) Fotografía de una copia del microscopio de van Leeuwenhoek. La lente se montaba sobre la placa de latón cerca del extremo del tornillo ajustable de enfoque. C) Dibujos de bacterias publicados por van Leeuwenhoek en 1684 donde se pueden observar distintos tipos morfológicos de las bacterias D) Micrografía de una extensión de sangre humana vista a través de un microscopio de van Leeuwenhoek donde se observan los glóbulos rojos. Se dice que Cornelius Jacobzoon (1572-1634) describió y propagó el microscopio compuesto. Durante sus dos primeros siglos de existencia, la limitación principal de los microscopios compuestos eran las aberraciones ópticas. Las aberraciones ópticas son defectos en la formación de imágenes por las lentes sencillas. En consecuencia, hay pérdida de nitidez en las imágenes observadas, lo que limitó la popularidad de los microscopios en el ámbito científico. Las aberraciones que tenían mayor influencia en los primeros microscopios compuestos eran la cromática y la esférica (Figura 3). Figura 3. La aberración cromática se debe a que los bordes de las lentes se comportan como un prisma, por tanto, descomponen la luz blanca en diferentes colores. Como cada color tiene diferente λ y se refracta con ángulo de desviación diferente a los demás, se forman varias imágenes que se sobreponen y el observador ve una imagen borrosa. La aberración esférica ocurre con lentes de gran aumento debido al fenómeno de refracción. Los haces luminosos de la periferia recorren una distancia diferente que la de los rayos centrales, y se crean diferentes focos e imágenes en diferentes puntos y disminuye la nitidez. El hombre para contrarrestarlas ha creado diferentes tipos de ópticas corregidas para este tipo de aberraciones. No fue hasta 1730 que el inventor Chester Moore Hall encontró una combinación de lentes que lograba corregir la aberración cromática al tratar de educir esta aberración en los telescopios. Este descubrimiento se aplicó a los binoculares y luego al microscopio. En 1830, Joseph Jackson Lister perfeccionó la idea de Chester para corregir más tarde la aberración esférica al variar la distancia entre las lentes. Estos dos aportes resultaron en lentes acromáticas de alta calidad y gracias a estos aportes fue posible construir microscopios que evitaban las aberraciones ópticas más importantes. Desde esa época hasta nuestros días, la revolución en el campo de la microscopía ha alcanzado niveles de desarrollo elevados debido al adelanto en el entendimiento de la óptica de lentes y la aparición de nuevos instrumentos. A medida que el microscopio ganaba popularidad entre los científicos, aumentó el número de empresas dedicadas a su fabricación. Al principio la mayoría estaban en Alemania e Inglaterra donde se produjeron las modificaciones e innovaciones más importantes en los microscopios durante los siglos XVIII y XIX. En 1776, Jeremiah Sisson construyó el primer revólver para microscopios que permitía cambiar el objetivo con el que se observaba la muestra. Esta innovación fue introducida por la empresa Leiitz (hoy denominada Leica), que además construyó un microscopio binocular en 1913 que igualaba en términos de calidad de imagen a los monoculares de esa época. La otra gran empresa fabricante de microscopios en Alemania es conocida como Carl Zeiss AG. Se fundó en 1846 por el óptico Carl Zeiss. Esta empresa revolucionó el campo de la microscopía gracias a los avances del físico Ernest Abbe quien sentó las bases de la teoría óptica moderna. La teoría de Abbe permitió también mejorar la calidad de los objetivos de inmersión y que antes de acabar el siglo XIX se alcanzaran los límites de resolución posibles con un microscopio óptico. Otro factor clave resultó la invención por parte de Otto Schott de nuevos tipos de vidrios para la fabricación de lentes que permitieron llevar a la práctica algunos de los conceptos teóricos de Abbe (Figura 4). Figura 4. Principales fabricantes de microscopios Clasificación de los microscopios Microscopios de luz: Los microscopios de luz se clasifican en simples y compuestos. Microscopio simple: Es un instrumento destinado a producir imágenes virtuales y amplificadas de los objetos pequeños, cuyos pormenores escaparían a simple vista. Consta de una lente convergente, acromática y de corta distancia focal. Es de poco aumento y da imágenes derechas. El más sencillo es una lupa de mano. Los rayos en este tipo de microscopio siguen las leyes de las lentes convergentes. El microscopio descrito por Descartes es el primer microscopio simple conocido. Tenía una sola lente plana convexa de fuerte aumento que se iluminaba con luz directa e intercalando diafragmas en forma de simples agujeros. Microscopio compuesto: Los microscopios compuestos pueden ser monoculares o binoculares. El microscopio compuesto tiene una parte mecánica y una parte óptica. A su vez, la parte mecánica está formada por el sistema de soporte y el sistema de ajuste. El microscopio compuesto más simple es el microscopio de campo claro. En la Figura 5 aparecen las partes de un microscopio compuesto. Figura 5. Representación de un microscopio óptico compuesto y sus partes. Descripción de las partes del microscopio El microscopio compuesto tiene una parte mecánica y una parte óptica. Parte mecánica: La parte mecánica está formada por los sistemas de soporte y de ajuste. Sistema de soporte Pie o base: Es pesado y brinda gran estabilidad al microscopio. En los microscopios antiguos tenía forma de U o de herradura, pero en la actualidad, suele ser rectangular. En él se encuentra la fuente luminosa. Columna o Brazo: Es una columna perpendicular al pie por donde se sostiene y transporta el microscopio. Su forma es variable, aunque generalmente curva y sirve para sostener la platina, el tubo y los mecanismos de movimiento. Platina: Es una plancha horizontal metálica revestida de un material anticorrosivo, con una superficie amplia que permite el examen completo de las preparaciones ya que sirve para sostenerlas. Presenta un orificio central que permite el paso de los rayos procedentes de la fuente de iluminación situada por debajo. Posee dos pinzas de metal para sujetar el portaobjetos sobre la platina y un sistema de cremallera guiado por dos tornillos de desplazamiento que permiten el movimiento de la preparación de delante hacia atrás o de izquierda a derecha y viceversa. En la parte posterior de uno de los laterales se encuentra el nonius. Nonius: Es una regla graduada que permite precisar con exactitud la posición de un punto cualquiera de la preparación y volverla a examinar en cualquier momento con gran rapidez. El nonius consiste de dos reglas: la regla auxiliar y la principal. La regla auxiliar se aplica sobre la principal y está dividida de tal forma que 10 de sus partes corresponden a 9 de la regla principal. Tubo: Es el portador de la óptica de observación. Consiste en un cilindro de metal y está ennegrecido internamente para evitar los reflejos de la luz. En el extremo superior se sitúan los oculares y en el inferior el revólver con los objetivos. La longitud del tubo es de 160-170 mm. El tubo se encuentra unido a la parte superior de la columna mediante un sistema de cremalleras, las cuales permiten que el tubo se mueva mediante los tornillos. Revólver: Es un dispositivo metálico situado en la parte inferior del tubo. Lleva 2, 3, 4 ó 5 objetivos y mediante un movimiento giratorio permite cambiar rápidamente de objetivo sin necesidad de desenroscarlo. Sistema de ajuste: Está formado por los tornillos macrométrico y micrométrico (Figura 5). Son tornillos de enfoque que permiten el movimiento de la platina hacia arriba y hacia abajo. El macrométrico ejecuta los movimientos rápidos, lo cual permite el enfoque rápido de la preparación. El micrométrico ejecuta los movimientos lentos, lo que permite el enfoque exacto y nítido de la preparación. Generalmente lleva una graduación de divisiones de 0.001 mm que se usa para medir el espesor de los cortes histológicos. Parte óptica: La parte óptica comprende la fuente de iluminación, el aparato de aumento (objetivos, oculares) y el aparato de iluminación (condensador, diafragma y espejo). Aparato de aumento: Está formado por los oculares y los objetivos. Los oculares se localizan en la parte superior del tubo (Figura 5). Se denominan así porque están muy cercanos a los ojos. Su función es captar y ampliar la imagen formada en los objetivos. Están formados por un sistema de lentes colocadas en un tubo dentro del tubo principal del microscopio. La lente situada cerca del ojo del observador se denomina lente ocular. La más interna se denomina lente del campo o colectora. Entre ambas lentes se encuentra una especie de diafragma sobre el cual puede colocarse el micrómetro ocular usado para realizar mediciones longitudinales de objetos microscópicos. En los microscopios modernos hay dos oculares que están unidos mediante un mecanismo que permite ajustar la distancia interpupilar. Los más utilizados son los de 10X, que producen aumentos de 10 veces. Los objetivos (Figura 5) se localizan en la parte inferior del tubo y se insertan en el revólver. Generan una imagen real, invertida y aumentada. Constan de tres lentes denominadas lente frontal, lente media y lente superior. La lente frontal es la más cercana al objeto que se observa, es la menor y de foco más corto. La lente media es de foco más largo que la anterior y la superior, es la interna, la cual queda más próxima al ocular. Hay diferentes tipos de objetivos: objetivos secos, objetivos de inmersión y objetivos acromáticos. Los objetivos secos son aquellos en los que la cara superior de la preparación y la lente frontal del objetivo están separadas por el aire, cuyo n=1. O sea, se utilizan sin necesidad de colocar sustancia alguna entre ellos y la preparación. En la cara externa llevan una serie de índices que indican el aumento que producen y la apertura numérica. Por ejemplo, objetivo plan 40/0,65, significa que el objetivo es planacromático, su aumento es 40 y la apertura numérica 0,65. El número de objetivos varía de acuerdo con el tipo de microscopio. Los aumentos de los objetivos secos más utilizados son: 4X, 10X, 20X, 40X y 60X. Los objetivos de inmersión son aquellos que necesitan de un líquido transparente interpuesto entre la lente frontal y la superficie superior de la preparación. Este líquido debe tener n˃1 acercándose lo más posible al vidrio que es de 1,52, ya que las lentes, los portaobjetos y los cubreobjetos generalmente son de vidrios. El medio por el cual se propaga la luz es homogéneo. El objetivo de inmersión ofrece la ventaja de anular la desviación o refracción brusca que sufren los rayos luminosos al pasar del vidrio al aire y del aire a la lente frontal del objetivo. Por otra parte, con el objetivo de inmersión penetra mayor número de rayos luminosos y se elimina la reflexión total de aquellos rayos que tienen cierta oblicuidad con relación al eje, lo que disminuye la luminosidad. Con el uso del aceite de cedro se aumenta la apertura numérica del equipo, y, por consiguiente, su poder resolvente. Generalmente, estos objetivos son de 100X y se distinguen por la presencia de uno o dos círculos o anillos de color negro o blanco que rodea su extremo inferior. Si el anillo es negro, se usa aceite de cedro y si es blanco, glicerina. Líquidos usados Aceite de cedro n 1.515 Agua 1.33 Glicerina 1.46 Objetivos acromáticos: Son aquellos que poseen lentes de vidrio Objetivos apocromáticos: Se denominan así a aquellos que poseen lentes de fluorita y como poseen el grado máximo de corrección de las aberraciones de especificidad y cromática, da imágenes de gran brillantez. Estos objetivos llevan casi siempre la palabra APO. Aparato de iluminación. El aparato de iluminación está formado por el condensador, el diafragma, el espejo, los filtros (Figura 5). Fuente de iluminación: Es una lámpara incandescente de tungsteno y en las versiones más modernas son lámparas leds. Se enciende y se apaga con un interruptor y en su superficie externa puede tener una especie de anillo para colocar filtros que facilitan la visualización. Condensador: Es un sistema de lentes situadas bajo la platina (Figura 5). Puede efectuar movimientos ascendentes y descendentes mediante la cremallera y un tornillo, lo que facilita el aumento o la disminución de la intensidad de la iluminación. Su función es concentrar la luz generada por la fuente de iluminación hacia la preparación. El condensador concentra los rayos luminosos provenientes del espejo. Pueden obtenerse dos tipos de iluminación: campo claro y campo oscuro. La iluminación de campo claro se obtiene cuando la luz proveniente del espejo atraviesa la preparación y penetra en el objetivo. La iluminación de campo oscuro se obtiene cuando la luz procedente del espejo, al pasar al condensador, ilumina el objeto oblicuamente, de modo que al llegar a la cara superior del cubreobjetos muchos rayos sufren una reflexión total y retornan al espejo. Diafragma: El diafragma es un aparato situado debajo de la platina. Los microscopios modernos llevan un diafragma o iris cuya función es limitar la cantidad de rayos que atraviesan el sistema de lentes eliminando aquellos que están demasiados desviados, o sea, los marginales. Espejo: es de forma circular y tiene dos caras: una plana y una cóncava (Figura 5). Filtros: Son cristales de colores que se interponen al rayo luminoso y absorben determinadas radiaciones para darnos una luz que viabiliza la observación microscópica, por lo que la imagen posee mayor brillantez. Un concepto importante en microscopía es el término campo. Se denomina campo al área circular que se divisa cuando observamos por los oculares y que contiene la muestra. Aumento del microscopio. Todos los microscopios producen una imagen amplificada de un objeto pequeño, pero la naturaleza de las imágenes depende del tipo de microscopio empleado. La determinación del aumento es fácil porque casi todos los equipos llevan marcados los objetivos y oculares con las cifras del aumento específico de ellos. El aumento microscópico está dado por la siguiente ecuación: Aumento(a) = 250/f donde f es la distancia focal. La amplificación o amplitud total proporcionada por el microscopio es igual al aumento del objetivo multiplicado por el aumento del ocular. Ampliación= aumento del objetivo X aumento del ocular Por ejemplo: Si se emplea un ocular de 10X y un objetivo de 45X, la ampliación del microscopio es de 450X, lo que significa que la imagen del objeto está ampliada 450 veces. Si hay lentes intermedias hay que tenerlas en cuenta. Lo más importante de los microscopios no es el aumento, sino el poder de resolución (PR), o sea, la capacidad de distinguir como imágenes distintas dos que se encuentren cercanas. Se mide utilizando como unidad la inversa del límite de resolución (LR). PR = 1/LR El LR se define como la distancia mínima entre dos puntos para que puedan distinguirse como tales. Se calcula mediante la fórmula de Abbe: LR= 0.61*λ/AN donde: LR: Límite de resolución, λ: longitud de onda. Dependerá de la luz empleada. Si la luz es natural blanca es de 550 nm. AN: apertura numérica, se define como el tamaño del cono de luz que entra a las lentes del microscopio luego de pasar a través de la muestra, o sea, es la capacidad de una lente de colectar la luz. La apertura numérica se calcula por la siguiente fórmula: AN= n* sen α donde: n: índice de refracción del medio situado entre la lente y la muestra. El máximo es alrededor de 1.5 cuando se utiliza aceite de inmersión. α: ángulo de semiapertura de la lente. Es el ángulo formado entre el eje óptico imaginario del objetivo y el haz de luz más externo colectado por éste. El valor de sen α< 1. En los microscopios actuales el valor es de 0.93. El máximo valor que puede tener senα es 1, y eso sucede cuando α es igual a 90º, en un sistema óptico esta condición es imposible lograrla porque implica que el lente objetivo tendría que estar pegada a la muestra. LR= 0.61*550 nm/ (1.51*0.93) = 240 nm Si se tiene en cuenta que el LR del ojo humano es de 0.23 nm, el microscopio óptico ha multiplicado en aproximadamente 1000 veces su poder de resolución. Manejo y uso del microscopio óptico Reglas para el manejo del microscopio. 1. Debe colocarse el microscopio sobre una mesa sólida, con la altura adecuada para que el observador pueda situarse de manera cómoda. 2. En teoría el color de la mesa debe ser negro mate para evitar la luz reflejada en su superficie. 3. Si se usa luz natural se colocará la mesa cerca de una ventana para que penetre la luz. No debe usarse la luz solar directa. 4. Si el microscopio pasa de un local frío a uno caliente debe esperarse a que las lentes no estén empañadas por el cambio de temperatura. 5. Si la observación de realiza con un microscopio monocular debe mirarse con los dos ojos ya que con el ojo que no se trabaja debe mirarse también al vacío. Cuando se utiliza un binocular se deben colocar los oculares a la abertura adecuada según la distancia entre los ojos del observador. 6. Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina completamente. Este procedimiento se realiza ya que los objetivos de menor aumento captan una mayor área de la muestra, a diferencia de los otros, que, aunque permiten observar con mayor aumento, captan una menor área de la preparación, es por ello que se corre el riesgo de perder la muestra en el cambio de objetivo si no se realiza dicho procedimiento. 7. El portaobjetos que contiene la preparación se coloca sobre la platina con el cubreobjetos situado hacia arriba y procurando que el objeto que se va a examinar quede inmediatamente debajo del objetivo. La preparación se sujeta con las pinzas metálicas. 8. El enfoque de la preparación se realiza primero con el objetivo más débil y luego se irán usando sucesivamente otros objetivos más potentes. No deberá usarse más aumento que el necesario para estudiar las estructuras deseadas, pues la intensidad de la luz disminuye con los objetivos de mayor aumento. Al utilizar el objetivo más débil tenemos, por tanto, más luz y mayor campo donde localizar las estructuras deseadas. Por lo tanto, se debe comenzar la observación con el objetivo de 4x o colocar el de 10x si la preparación es de bacterias. 9. Para realizar el enfoque de la preparación, se deberá mirarse por fuera al acercar el tubo al portaobjeto, procurando que no toque la preparación la lente frontal del objetivo. Este paso no debe hacerse mirando por el ocular ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación y tanto éste como la preparación pueden resultar dañadas. Este paso se hace a través del tornillo macrométrico. Luego, mirando por el ocular, se va separando lentamente el objetivo de la preparación con el tornillo macrométrico y cuando aparezca la imagen, mover el tornillo micrométrico hasta obtener un enfoque fino. 10. Colocar el siguiente objetivo. Para hacer un cambio de objetivo debe observarse lateralmente para evitar que la lente frontal toque la preparación. A mayor aumento del objetivo menor será la distancia entre éste y la preparación y menor será la intensidad luminosa. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación y por ello es fácil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparación si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersión si se observa una preparación que ya se enfocó con el objetivo de inmersión. 11. Para el uso del objetivo de inmersión, se baja totalmente la platina, se sube totalmente el condensador para ver el círculo de luz que nos indica la zona que se va a visualizar y dónde habrá que adicionar la gota de aceite de cedro encima del cubreobjetos, se gira el revólver hasta la posición del objetivo de inmersión. 12. Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toque la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente. 13. Enfocar de manera cuidadosa con el tornillo micrométrico. Como la distancia entre la lente y la preparación es mínima hay que tener cuidado con el daño de la preparación. 14. Una vez que se haya aplicado la gota de aceite no se puede volver a usar el objetivo 40X en esa zona, pues se ensuciaría de aceite. Por lo tanto, si desea enfocar otro campo hay que bajar la platina y repetir nuevamente la operación. 15. Cuando se termina la observación de la preparación, se baja la platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el revólver. En este momento ya se puede retirar la preparación de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersión en posición de observación. 16. Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel especial para óptica o con xilol o benzol. Comprobar además que el objetivo 40X esté perfectamente limpio.
