DESVIACIONES DE LA LEY DE BEER La proporcionalidad entre la absorbancia y la concentración únicamente se cumple para disoluciones muy diluidas, observándose desviaciones más o menos acusadas al aumentar la concentración Las desviaciones de la ley de Beer pueden clasificarse de la forma siguiente: DESVIACIONES REALES. En la deducción de la ley de Beer que se hizo anteriormente, no se ha considerado que la absortividad depende del índice de refracción, n, según la expresión: Como, a su vez, el índice de refracción varía con la concentración, la absortividad no es rigurosamente constante para cualquier concentración, provocando desviaciones Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible 6 negativas. De todas formas, en la práctica, para concentraciones inferiores a 10–3 M puede prescindirse de la influencia de este factor, al ser el índice de refracción esencialmente constante. DESVIACIONES INSTRUMENTALES. Las fluctuaciones producidas en la corriente eléctrica, la inestabilidad de algunas fuentes de radiación o la respuesta no lineal del detector pueden originar el funcionamiento incorrecto de un determinado aparato. Además de éstos, pueden considerarse los siguientes factores de tipo instrumental como causas de desviaciones de la ley de Beer: a) Uso de radiación no monocromática. La deducción de la ley de Beer se hizo sobre la base de utilizar radiación monocromática, lo cual, en sentido estricto, nunca se cumple, pues en la práctica, todos los dispositivos seleccionan una banda más o menos ancha en torno a una determinada longitud de onda. La influencia de la radiación policromática sobre la ley de Beer puede mostrarse del siguiente modo: Cuando este haz constituido por las dos radiaciones atraviesa una disolución conteniendo especies absorbentes, la potencia del haz emergente es P1+P2, mientras que la del haz incidente sobre la muestra es P01 + P02. Según esto, la absorbancia medida que es la ley de Beer. Sin embargo, cuando ε1 es distinto de ε2, la relación entre AM y la concentración deja de ser lineal. Evidentemente, cuanto mayor sea la diferencia entre ε1 y ε2, mayores serán las desviaciones de la linealidad. Por eso mismo, aún será: cuando la anchura de banda sea relativamente grande, si las diferencias en los valores de la absortividad son pequeños, la utilización de un haz policromático no implica diferencias significativas respecto a uno monocromático (ver Fig. 3.3.a., banda N). b) Presencia de radiación parásita. El haz de radiación que sale de un monocromador suele estar contaminado con pequeñas cantidades de radiación parásita o dispersada originada por reflexión de los distintos componentes ópticos, dispersión por partículas de polvo atmosférico, etc. Por otra parte, la propia muestra puede originar dispersiones. Con frecuencia, la radiación dispersada tiene una longitud de onda diferente respecto a la radiación principal, pudiendo además, en ocasiones, llegar al detector sin haber atravesado la muestra. Por todo ello, la absorbancia medida en presencia de radiación parásita es: Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible 8 lo cual indica la presencia de desviaciones negativas en la ley de Beer debido a este factor. c) Errores de lectura. Los errores indeterminados en la lectura de la transmitancia o absorbancia son errores que potencialmente siempre están presentes y es necesario tenerlos en cuenta. En ocasiones, pequeños errores en la lectura de la transmitancia o de la absorbancia pueden ocasionar errores grandes en la concentración cuando se opera en los extremos de la escala. Esto se ilustra en la El error absoluto cometido en la determinación de la concentración, para un cierto error de lectura de transmitancia, es pequeño, pero al ser pequeña la concentración, el error relativo puede ser grande. En 3, la incertidumbre en la determinación de la concentración es alta, y en 2, hacia la mitad de la escala, parece que se trata de la situación más favorable. Puede demostrarse, como se indica a continuación, que el mínimo error relativo se obtiene para una absorbancia de 0.434. La primera derivada de la ley de Beer es: Derivando esta ecuación de nuevo e igualando a cero, se obtiene que la transmitancia óptima corresponde a 36.8 %, que equivale a una absorbancia de 0.434. Claudio González Pérez 9 DESVIACIONES QUIMICAS Se incluyen en este apartado toda una serie de desviaciones aparentes de la ley de Beer producidas como consecuencia de procesos químicos en los que participan las especies absorbentes. a) Influencia del equilibrio. Cuando la sustancia problema interviene o forma parte de un sistema en equilibrio con otras especies, el desplazamiento del equilibrio implica una modificación en la concentración, y, en consecuencia, en la absorbancia. Algunas situaciones que pueden producirse son las siguientes: Dimerizaciones. Cuando una disolución de dicromato potásico no tamponada se diluye, ocurre una transformación parcial en cromato, como consecuencia del equilibrio dímero-monómero: Cr2O72– + H2O <——> 2 CrO42– + 2 H+ (λmax = 350, 450 nm) (λmax = 372 nm) Acido–base. En la figura 3.5. se muestran los espectros de absorción de un indicador ácido-base. b) Influencia del disolvente. Como consecuencia de las interacciones soluto– disolvente se originan con frecuencia desplazamientos espectrales, ensanchamientos de bandas y otros fenómenos que pueden provocar desviaciones en la ley de Beer. En este sentido, no es posible hacer predicciones de forma general. Unicamente mencionar algunos términos relacionados con los desplazamientos espectrales: desplazamiento batocrómico o desplazamiento hacia el rojo, consiste en un desplazamiento del máximo de absorción hacia longitudes de onda mayores (este efecto suele producirse en disolventes de alta constante dieléctrica). Desplazamiento hipsocrómico o desplazamiento hacia el azul, es el desplazamiento hacia longitudes de onda más cortas. c) Influencia de la temperatura. La temperatura puede influir modificando el equilibrio químico de algunos sistemas, así como, en ocasiones, dar lugar a desplazamientos batocrómicos. De todas formas, la temperatura no suele ser un factor a considerar en la mayor parte de los sistemas absorbentes sencillos. d) Presencia de impurezas en los reactivos. Muchos métodos espectrofotométricos son lo suficientemente sensibles como para detectar cantidades a nivel de trazas, por lo que la presencia de impurezas absorbentes en los mismos reactivos pueden originar errores considerables. Debido a ello, en la práctica analítica ordinaria, las medidas espectrofotométricas se llevan a cabo frente a un blanco constituido por la propia célula, el disolvente y los reactivos. En este sentido interesa que la absorbancia del blanco sea pequeña, pues si es grande, un pequeño error en su medida puede implicar un gran error relativo en el resultado final. e) Interacciones entre especies absorbentes. Cuando en una disolución existen varias especies absorbentes, la ley de Beer se cumple para cada una de ellas, si todas actúan independientemente. Sin embargo, la interacción entre ellas puede producir alteraciones en la distribución de cargas, como consecuencia de lo cual puede modificarse la energía requerida para la absorción y, en consecuencia, variaciones en la posición, forma y altura de las bandas de absorción. Por otra parte, estas alteraciones en la distribución de cargas también pueden ser originadas por la presencia de sales inertes, con el consiguiente aumento de la fuerza iónica de la disolución. Claudio González Pérez 11 f) Interacciones soluto–radiación electromagnética. Aunque en sentido estricto no son factores de tipo químico, también deben considerarse otros tipos de interacción entre la radiación y la materia, distintos de los que intervienen en el proceso de absorción. Así, la posible emisión de resonancia y la presencia de fenómenos fluorescentes y fosforescentes pueden originar desviaciones aparentes en la ley de Beer. ERRORES PERSONALES En este sentido, los mayores errores suelen cometerse por el uso inadecuado de las cubetas de absorción. Resultan de utilidad las recomendaciones siguientes: * Es necesario asegurarse de que las cubetas están perfectamente limpias, no rayadas y exentas de huellas o adherencias en las paredes por las que ha de pasar la radiación. * Las cubetas de vidrio y cuarzo pueden limpiarse con ácido nítrico o con agua regia en frío, pero no con mezcla crómica. * Una vez limpias, las cubetas deben enjuagarse con agua destilada y con varias porciones de la disolución a medir. * No deben secarse interiormente, mientras que el exterior debe secarse con papel suave, comprobando, además, que, una vez llena con la disolución problema, no contiene burbujas de aire. * Aunque se debe trabajar con cubetas idénticas para la muestra y la referencia (blanco) INSTRUMENTACION El instrumento que normalmente se utiliza para medir la transmitancia o la absorbancia de una muestra en función de la longitud de onda es el espectrofotómetro. Antes de pasar a describir sus componentes básicos, es conveniente indicar algunos términos relacionados con la nomenclatura utilizada a propósito de la instrumentación en los métodos ópticos de análisis. Las definiciones Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible 22 que se indican no pueden considerarse universales, pero sí están en razonable acuerdo con el uso popular y son las que se utilizan en las principales obras dedicadas al tema*. FOTOMETRO: Cualquier dispositivo utilizado para medir la intensidad de radiación. Normalmente se utiliza para designar un instrumento sencillo provisto de filtros para seleccionar una banda de longitudes de onda y de una fotocélula o un fototubo para medir la intensidad de radiación. ESPECTROFOTOMETRO: Instrumento más sofisticado que posee un monocromador en lugar de filtros. Además, el sistema de detección normalmente es un fotomultiplicador, más sensible que una fotocélula. COLORIMETRO: Instrumento muy simple que compara, usando el ojo humano como detector, el color de la sustancia problema con el de una disolución patrón. (El nombre de colorímetro suele aplicarse en la práctica a cualquier instrumento apropiado para medir en la region visible, y, en realidad, así se conocen muchos fotómetros de filtro comerciales). ESPECTROSCOPIO: Aparato diseñado para detectar detectar líneas espectrales a simple vista. Su aplicación está restringida al análisis cualitativo y para elementos con líneas de emisión en la zona visible del espectro. ESPECTROGRAFO: Instrumento que registra líneas espectrales sobre una placa fotográfica. ESPECTROMETRO: Denominación general que se aplica a instrumentos que poseen sistemas de detección eléctricos. Según las definiciones anteriores, un espectrofotómetro es un espectrómetro que mide fotones. Su utilización suele limitarse, en la práctica, a la región untravioleta, visible e infrarroja. * Eugene D. Olsen. "Métodos Opticos de Análisis". Ed. Reverté. Barcelona. Claudio González Pérez 23 Los componentes básicos de un espectrofotómetro son: una fuente de radiación, un monocromador, que seleccione una banda estrecha de longitudes de onda, una cubeta, o recipiente que contenga la muestra, un detector de radiación y un sistema de tratamiento y lectura de la señal detectada (figura 3.10.) Fuentes de radiación Las fuentes de radiación utilizadas en espectrofotometría ultravioleta y visible deben ser continuas en una amplia zona del espectro, de intensidad elevada y ser esencialmente constante con la longitud de onda. En la zona ultravioleta y visible, la fuentes más utilizadas son de dos tipos: fuentes térmicas, basadas en la emisión de radiación por efecto de la temperatura, y fuentes cuya radiación se debe a descargas eléctricas producidas en el seno de gases. Entre las primeras, la más común es la lámpara de filamento de volframio. En condiciones ordinarias de operación, esta lámpara resulta útil entre unos 350 nm y unos 3000 nm. (figura 3.11.) Figura 3.11. Curvas de distribución espectral de las lámparas de deuterio y volframio. Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible 24 Como puede observarse en la figura 3.11., la mayor parte de la energía emitida corresponde a la zona infrarroja. La distribución de la energía depende de la temperatura del filamento, la cual depende, a su vez, del voltaje; un incremento en la temperatura de operación aumenta la energía total emitida y desplaza el máximo de intensidad hacia longitudes de onda más cortas. Sin embargo, en la práctica, esto no se utiliza para obtener mayor cantidad de radiación ultravioleta, ya que se acorta considerablemente el tiempo de vida de la lámpara. Debido a que la radiación emitida depende únicamente del voltaje suministrado, éste tiene que ser muy estable, por lo cual los instrumentos llevan incorporado un sistema para la estabilización de la corriente. Por otra parte, el calor producido por la lámpara puede constituir un problema, por lo que, con frecuencia, en el lugar donde se coloca la lámpara se instala un ventilador con objeto de evitar el calentamiento de la muestra y de los demás componentes del instrumento. Por debajo de 350 nm, la potencia de una lámpara de volframio es inadecuada, debiéndose emplear una fuente diferente. La más común es una lámpara de descarga de hidrógeno, o de deuterio. Cuando se produce una descarga eléctrica entre dos electrodos en el seno de un gas, como hidrógeno, las colisiones entre los electrones de la descarga y las moléculas gaseosas provocan la excitación electrónica, vibracional y rotacional de dichas moléculas, con lo que se obtiene un espectro de líneas que es característico del gas, siempre que la presión sea baja. Al aumentar la presión, las líneas se ensanchan, llegando a superponerse, hasta que, a presiones relativamente altas (0.2–5 mm) se produce un espectro continuo. Tanto la lámpara de hidrógeno como la de deuterio tienen un intervalo de utilización comprendido entre 175 y 350 nm (figura 3.11.). También se utilizan con la misma finalidad la lámpara de descarga de xenon y la de vapor de mercurio. Finalmente, indicar que, puesto que el vidrio absorbe fuertemente a longitudes de onda inferiores a unos 350 nm, las lámparas de ultravioleta deben utilizar ventanas de cuarzo. Claudio González Pérez 25 Filtros y monocromadores La misión de los filtros y de los monocromadores es seleccionar un haz de radiación "monocromática"*. Con este fin se utilizan los siguientes dispositivos: Los filtros de absorción se utilizan en la región visible y se basan en la absorción selectiva de ciertas longitudes de onda. Normalmente consisten en un vidrio coloreado o una suspensión de un colorante en gelatina que se coloca entre dos placas de vidrio. Los filtros de banda (figura 3.12. A) se caracterizan por su anchura de banda (anchura a la mitad de la altura) que puede oscilar entre 30 y 250 nm. Figura 3.12. Transmitancia de algunos filtros. Los filtros de corte tienen transmitancias de casi el 100 % en una zona del espectro visible, pero luego disminuye rápidamente hasta un valor de transmitancia cero (figura 3.12.B). Por combinación de diferentes filtros pueden seleccionarse bandas espectrales relativamente estrechas (figura 3.12.). * La radiación monocromática es la radiación de una sola longitud de onda. Por supuesto, es imposible producir radiación monocromática verdadera, en sentido estricto. Sin embargo, cuanto mejor sea el monocromador, tanto más estrecho será el intervalo de longitudes de onda. Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible 26 Los filtros de interferencia consisten en un dieléctrico transparente (frecuentemente, fluoruro cálcico o magnésico) recubierto en ambos lados con dos finas capas de plata semirreflectante. (figura 3.13.) Figura 3.13. Filtro de interferencia. Cuando un haz de radiación incide sobre este dispositivo, una fracción atraviesa la primera capa metálica, mientras que la restante se refleja. La parte que ha pasado sufre una escisión similar al llegar a la segunda capa metálica. Si la parte reflejada en la segunda interacción es de longitud de onda adecuada, se refleja, en parte, desde la cara interior de la primera capa en fase con la radiación incidente de la misma longitud de onda. El resultado es que se refuerza esa determinada longitud de onda, mientras que la mayoría de las otras, fuera de fase, sufren una interferencia destructiva. Estos filtros proporcionan anchuras de banda menores y transmitancias de pico mayores que los filtros de absorción. Se dispone de filtros de interferencia para todas las zonas de las regiones ultravioleta y visible, así como parte del infrarrojo. Un monocromador se caracteriza por producir un haz de radiación de gran pureza espectral y permitir variar, de forma continua y en un amplio intervalo, la longitud de onda de la radiación. Los componentes básicos de un monocromador son una rendija de entrada, que selecciona un haz de radiación policromática entrante, un elemento dispersante, prisma o red, que dispersa la radiación en sus longitudes de onda individuales, y una rendija de salida, que aísla la banda espectral deseada (figura 3.14.) La dispersión de radiación por un prisma se basa en el fenómeno de la refracción; esto es, el cambio de dirección que experimenta un haz de radiación al pasar de un medio a otro con distinto índice de refracción. El grado de desviación depende de la longitud de onda; así, los azules se desvían más que los rojos. Claudio González Pérez 27 El material de que está construido el prisma depende del tipo de radiación a dispersar; en la región visible se usan prismas de vidrio, mientras que en el ultravioleta es necesario usarlos de cuarzo. Figura 3.14. Dispersión de radiación por un prisma. Los prismas presentan las ventajas de su gran pureza espectral (no hay órdenes de dispersión superiores, como en las redes), mientras que el principal inconveniente reside en que la dispersión no es lineal; esto es, las longitudes de onda no se dispersan de manera uniforme: es mayor para las longitudes de onda más cortas. Las redes de reflexión*, que son las más utilizadas, consisten en una superficie dura, pulida, sobre la que se ha grabado un gran número de surcos paralelos y muy próximos entre sí (entre 300 y 2000 surcos por milímetro para las regiones ultravioleta y visible). . En la Figura 3.15. se muestran los haces paralelos 1 y 2. La máxima interferencia constructiva entre ambos se produce cuando la diferencia de caminos recorridos por ellos sea un múltiplo entero de la longitud de onda, y esta diferencia es AB – CD. Los segmentos AB y CD pueden expresarse en función de d y de los ángulos i y . * Tambien existen las redes de transmisión, que normalmente se construyen trazando una serie de surcos paralelos sobre una placa de vidrio, con una punta de diamante. Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible 28 AB = d sen i CD = – d sen φ** por lo cual, nλ = d (sen i + sen φ) donde n, número entero, se denomina orden de difracción. Según la ecuación anterior, existen distintos valores de λ para unos determinados ángulos i y φ, por lo que junto con la línea de primer orden (n=1) aparecen líneas de órdenes superiores. Ordinariamente, la línea de primer orden es la más intensa. Las líneas de órdenes superiores pueden eliminarse mediante filtros. El fenómeno de la difracción de una radiación policromática por una red se representa esquemáticamente en la figura 3.16. Para seleccionar la radiación de una determinada longitud de onda, se hace girar la red hasta hacer que la radiación que interesa coincida con la rendija de salida, eliminando los órdenes superiores mediante filtros. Figura 3.16. Difracción de una radiación policromática por una red. En cuanto a la anchura de rendija de salida debe tenerse en cuenta lo siguiente: a medida que disminuye la anchura de rendija se reduce la anchura de banda, siendo posible aumentar la resolución, pero solo hasta un cierto límite, ya que, a partir de un determinado valor, la difracción por la propia rendija comienza a ser apreciable. Además, es necesario considerar que al disminuir la anchura de rendija, disminuye también la intensidad del haz de radiación, por lo que hay que tener en cuenta la sensibilidad del detector, la cual puede limitar el estrechamiento de la rendija. ** El signo menos indica que el ángulo de reflexión, φ, cae en el lado opuesto al ángulo de incidencia, i. Claudio González Pérez 29 En resumen, y comparando con los prismas, las redes de difracción presentan las ventajas de su elevada resolución, dispersión lineal y pocas pérdidas de radiación por absorción. Posiblemente, el mayor inconveniente esté relacionado con la presencia de órdenes de difracción superiores. Recipientes para las muestras En espectrofotometría analítica, casi siempre se trabaja con disoluciones, por lo cual la mayoría de los recipientes para las muestras son celdas o cubetas para colocar líquidos en el haz del espectrómetro. Estos recipientes deben estar fabricados con un material que permita el paso de radiación de la región espectral de interés. Así, el vidrio puede emplearse entre 350 y 2000 nm, mientras que en la región ultravioleta se necesita cuarzo o sílice fundida (ambas sustancias también son transparentes en la región visible). En algunos instrumentos baratos se utilizan a veces tubos de ensayo cilíndricos como recipientes para las muestras. Es importante que estos tubos siempre se coloquen igual, para lo que se marcan en un lado, y la marca siempre se pone en la misma dirección cuando se coloca el tubo en el compartimento de cubetas del instrumento. Las celdas se deben llenar de tal forma que el haz de radiación pase a través de la disolución, con el menisco por encima del haz. Las celdas típicas para las regiones ultravioleta y visible tienen 1 cm de paso óptico, si bien existe una gran variedad en cuanto a tamaño, forma y otras peculiaridades, como se muestra en la figura 3.17. estándar Figura Celdas para espectrofotometría. Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible 30 Detectores Los detectores usados en espectrofotometría ultravioleta y visible son transductores que convierten la energía radiante en una señal eléctrica*. Un detector ideal deberá presentar las características siguientes: * Sensibilidad elevada en la región espectral de interés. * Respuesta lineal para la energía radiante. * Tiempo de respuesta pequeño. * Utilizable en un amplio intervalo de longitudes de onda. * Elevada relación señal/ruido. * Mínima señal de salida en ausencia de radiación. * Buena disponibilidad para la amplificación. Sin embargo, no existe el detector ideal, por lo que en la práctica, se evalúan todos los factores anteriores y se selecciona algún detector que resulte adecuado al caso. Los más utilizados son: células fotovoltaicas, fototubos y tubos fotomultiplicadores. Células fotovoltaicas. Consisten en una placa de hierro, que actúa de electrodo positivo, sobre la que se deposita una fina capa de un material semiconductor, como selenio, y éste se recubre de una capa muy fina de oro o plata, que actúa como segundo electrodo o electrodo colector (figura 3.18.) Figura 3.18. Célula fotovoltaica. Cuando la radiación electromagnética incide sobre el selenio, se promocionan 3.17. electrones a las bandas de conducción, haciendo que pasen electrones desde la superficie del selenio hasta el electrodo colector de plata, produciéndose un aumento de la conductividad proporcional al número de fotones que inciden sobre la superficie del semiconductor. Las células fotovoltaicas presentan las siguientes características: son sencillas de construir, relativamente baratas y no requieren una fuente de energía externa, por lo que pueden conectarse directamente a un galvanómetro o un amperímetro. En cuanto a los inconvenientes, su uso limitado a la región visible (su máxima sensibilidad * En espectrofotometría infrarroja suelen utilizarse detectores térmicos, que responden al calor. Claudio González Pérez 31 se presenta hacia los 550 mn, mientras que la respuesta a 350 y a 750 nm disminuye hasta un 10 % de la máxima), presentan dificultades para la amplificación, y fenómenos de fatiga, de forma que la corriente de salida disminuye gradualmente con el tiempo. Fototubos. Consisten en un cátodo semicilíndrico recubierto interiormente de un material fotosensible, y un ánodo, en el interior de un recipiente en el que se ha hecho el vacío (figura 3.19.). Figura 3.19. Fototubo. Cuando la radiación incide sobre el cátodo, se produce una emisión de fotoelectrones que se dirigen al ánodo, originándose una corriente que posteriormente se amplifica. La emisión de electrones depende de la naturaleza de la superficie del cátodo y de la frecuencia de la radiación. En el comercio existen fototubos que difieren en el material con el que está construida la superficie del cátodo, siendo, por tanto, diferente su respuesta a la radiación de diversas frecuencias. Muchos espectrofotómetros están provistos de detectores intercambiables que permiten mantener una buena respuesta en un amplio margen de longitudes de onda. En general, puede concluirse que los fototubos son más sensibles que las células fotovoltaicas, por la posibilidad de poder amplificar la corriente inicialmente generada. Tubos fotomultiplicadores. Este tipo de detector consiste en un cátodo fotosensible y una serie de electrodos (dínodos), cada uno a un potencial menos negativo que el que le precede (figura 3.20.) Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible 32 Figura 3.20. Tubo fotomultiplicador. La radiación que llega al fotocátodo provoca la emisión de electrones primarios, que son acelerados hasta el primer dínodo. Al incidir en él, cada fotoelectrón origina la emisión de varios electrones adicionales; éstos, a su vez, son acelerados hasta el dínodo 2, y así sucesivamente, hasta que al final, la corriente así producida se recoge en el ánodo, se amplifica electrónicamente y se mide. Normalmente, los tubos fotomultiplicadores contienen 9 ó 10 dínodos, los cuales originan de 106 a 107 electrones por cada fotón. Este sistema de detección se caracteriza por su respuesta rápida y elevada sensibilidad. El límite de detección viene condicionado por el ruido de fondo que se origina como consecuencia de la emisión termoiónica, la cual puede reducirse enfriando. De hecho, estas corrientes pueden eliminarse virtualmente enfriando el detector a –30 ºC, si bien esto no se lleva a cabo en el trabajo espectrofotométrico ordinario.
