EFECTOS DE LOS CANABINOIDES NUSCULO ESQUELETICO

Universidad de Colima
FACULTAD DE MEDICINA
EFECTOS DE LOS CANABINOIDES SOBRE EL MÚSCULO
ESQUELÉTICO
Tesis para optar por el título de
Maestra en Ciencias Fisiológicas
Que presenta:
Méd. Cir. Part. Mónica del S. Ortiz Mesina
Asesor: Dr. Miguel Huerta Viera
Co-asesora: Dra. Xóchitl A. R. Trujillo Trujillo
Colima, Colima, Agosto de 2005
Con gran cariño y amor a mis padres J.
Jesús Ortiz A. y Rosa María Mesina de O.
por contar siempre con su apoyo y
alentarme en el trabajo diario.
A mis hermanos Angélica y Jesús por su
apoyo y los debates sobre las acciones diarias.
Agradecimientos:
A mis asesores, los Dres. Miguel Huerta Viera y Xóchitl A. R. Trujillo Trujillo, por su
paciencia, enseñanza y el haberme permitido trabajar en su laboratorio.
A la Lic. Martha Patricia Rivera de la F. por su apoyo y consejos.
A mis compañeros Arael, Karla, Blas, Gina, Mario y Antonio por hacer que estos dos años
fueran amenos.
ii
Índice
ÍNDICE DE TABLAS Y FIGURAS. --------------------------------------------------------------------------------------- 1
RESUMEN ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 3
ABSTRACT --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 4
INTRODUCCIÓN ------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 5
EPIDEMIOLOGÍA DEL CONSUMO DE LA MARIHUANA ------------------------------------------------------ 7
RESEÑA HISTÓRICA DEL USO DE LA MARIHUANA ------------------------------------------------------------------------- 7
EPIDEMIOLOGÍA -------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 9
CANABINOIDES ------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 11
ENDOCANABINOIDES ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 13
Síntesis y liberación ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 15
EXO-CANABINOIDES-------------------------------------------------------------------------------------------------------- 18
Agonistas ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 18
Antagonistas/Agonistas inversos de los receptores a canabinoides.--------------------------------------------- 20
SÍNTESIS QUÍMICA DE ENDOCANABINOIDES ----------------------------------------------------------------------------- 21
CAPTURA Y DEGRADACIÓN DE LOS ENDOCANABINOIDES -------------------------------------------------------------- 22
SÍNTESIS, DEGRADACIÓN, ACCIÓN CELULAR DEL ENDOCANABINOIDE ANANDAMIDA. ----------------------------- 23
RECEPTORES A CANABINOIDES-------------------------------------------------------------------------------------------- 24
CANABINOIDES Y RECEPTORES (MECANISMO DE ACCIÓN). ------------------------------------------------------------ 26
LA ACTIVACIÓN DE LOS RECEPTORES CB1 Y CB2 EJERCEN DIFERENTES EFECTOS CELULARES. ------------------ 29
CANABINOIDES Y EL CONTROL MOTOR.------------------------------------------------------------------------ 30
LOS CANABINOIDES Y LA UNIÓN NEUROMUSCULAR. ----------------------------------------------------- 34
EFECTOS DE LOS CANABINOIDES EN LA UNIÓN NEUROMUSCULAR. --------------------------------------------------- 37
CANABINOIDES Y EFECTOS DIRECTOS EN EL MÚSCULO ESQUELÉTICO.-------------------------- 38
i
El papel del Ca2+ en la contracción muscular---------------------------------------------------------------------- 39
Acople excitación-contracción---------------------------------------------------------------------------------------- 39
EFECTOS DE LOS CANABINOIDES EN EL MÚSCULO ESQUELÉTICO ----------------------------------------------------- 41
EFECTO DE UN CANABINOIDE SOBRE LAS CONTRACTURAS POR CAFEÍNA EN LAS FIBRAS
MUSCULARES ESQUELÉTICAS LENTAS DE RANA. ----------------------------------------------------------- 42
Metodología ------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 42
Soluciones --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 43
Registro de contractura por cafeína: -------------------------------------------------------------------------------- 44
Análisis de datos-------------------------------------------------------------------------------------------------------- 44
Resultados --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 45
PERSPECTIVAS.------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 47
BIBLIOGRAFÍA: ------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 49
ii
Índice de Tablas y Figuras.
FIGURA 1 CANNABIS SATIVA. TOMADA DE EROWID.ORG --------------------------------------------------------------------- 7
TABLA 1 ESTIMACIÓN DE LA PREVALENCIA DEL CONSUMO MUNDIAL DE SUSTANCIAS ILÍCITAS, 2000-2001. -------- 9
FIGURA 2 ESTRUCTURA QUÍMICA DEL Δ9-TETRAHIDROCANABINOL (TOMADO DE IVERSEN, 2003). ----------------- 11
FIGURA 3. ESTRUCTURA QUÍMICA DE LOS CINCO LIGANDO CANNABINOIDES ENDÓGENOS IDENTIFICADOS
RECIENTEMENTE. (TOMADO DE DE PETROCELLIS Y COLS., 2004). ------------------------------------------------
14
FIGURA 5 ESQUEMATIZA LA POSIBLE VÍA DE FORMACIÓN DEL 2-ARAQUIDONILGLICEROL (TOMADO DE FREUND Y
COLS., 2003). ------------------------------------------------------------------------------------------------------------
16
FIGURA 6 VÍAS BIOQUÍMICAS PARA LA SÍNTESIS, DEGRADACIÓN Y ACCIÓN CELULAR DEL CANABINOIDE ENDÓGENO
ANANDAMIDA. (TOMADO DE RODRIGUEZ DE FONSECA Y COLS., 2005).
----------------------------------------- 17
FIGURA 7 ESTRUCTURA QUÍMICA DE TRES AGONISTAS A LOS RECEPTORES CANABINOIDES NO EICOSANOIDES (Δ9THC, CP 55,940 Y WIN 55,212,2) (MODIFICADO DE PERTWEE, 2001). ------------------------------------------ 19
FIGURA 8 ESTRUCTURA QUÍMICA DE ALGUNOS AGONISTAS EICOSANOIDES (MODIFICADO DE PERTWEE, 2001). --- 19
TABLA 2 EFICACIA RELATIVA DE LOS AGONISTAS A LOS RECEPTORES A CANABINOIDES. (TOMADO DE PERTWEE,
2001) --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 20
TABLA 3 CLASIFICACIÓN FARMACOLOGICA DE LOS PRINCIPALES ANTAGONISTAS/AGONISTA INVERSO Y LA
SELECTIVIDAD POR EL RECEPTOR CANABINOIDE. (MODIFICADO DE PERTWEE, 2001; INFORMACIÓN DE
TOCRIS.COM)
------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 21
FIGURA 9 MUESTRA EL ESQUEMA DEL RECEPTOR CANABINOIDE CB1 (TOMADO DE CAYMAN CHEMICALS). -------- 25
FIGURA 10 HOMOLOGÍA EN LA SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS ENTRE LOS RECEPTORES CB1 Y CB2. (MODIFICADO DE
WATSON, 2000) --------------------------------------------------------------------------------------------------------- 26
FIGURA 11 DISTRIBUCIÓN DE LOS RECEPTORS CANABINOIDES CB1 EN EL CEREBRO DE RATA, REBELADOS POR UNA
AUTORRADIOGRAFIA DE LA UNIÓN DE UN AGONISTA DE ALTA AFINIDAD MARCADO RADIOACTIVAMENTE EN
UN CORTE SAGITAL DE CEREBRO. (TOMADO DE IVERSEN, 2003).
------------------------------------------------- 32
FIGURA 12 SE ESQUEMATIZA LA MORFOLOGÍA DE UNA PLACA TERMINAL EN LA UNIÓN NEUROMUSCULAR QUE
CONSTA DE UN AXÓN MIELINIZADO Y UNA FIBRA MUSCULAR, SEÑALÁNDOSE LAS VESÍCULAS DEL
1
NEUROTRANSMISOR (ACETILCOLINA) LAS ZONAS ACTIVAS, LA HENDIDURA SINÁPTICA TAMBIÉN LLAMADO
ESPACIO ÍNTERSINÁPTICO, LA MEMBRANA POSTSINÁPTICA(TOMADO DE SIEGEL, 1999) -----------------------
35
FIGURA 13 MUESTRA LA LOCALIZACIÓN DE LAS VESÍCULAS SINÁPTICAS EN LAS ZONAS ACTIVAS DE LA MEMBRANA
PRESINÁPTICA (MODIFICADO DE SIEGEL, 1998)---------------------------------------------------------------------
35
FIGURA 14 MICROGRAFÍA DE ESCANEO ELECTRÓNICO DE UNIÓN NEUROMUSCULAR EN RANA (TOMADA DE
ALBERTS, 2002). -------------------------------------------------------------------------------------------------------- 38
FIGURA 15. CUANDO SE ESTIMULA EL MÚSCULO SE ACTIVAN LOS CANALES DE SODIO Y CLORO, DE ESTA MANERA
AL PROPAGARSE EL POTENCIAL DE ACCIÓN LLEGA A LOS TUBULOS T DONDE ACTIVA A LOS CANALES DE
DIHIDROPIRIDINA (CANAL DE CALCIO VOLTAJE DEPENDIENTE TIPO L) QUE ESTAN ACOPLADOS A LOS CANALES
DE RIANODINA DEL RETICULO SARCOPLÁSMICO CON LA CONSECUENTE LIBERACIÓN DE CALCIO DEL RETÍCULO
SARCOPLÁSMICO (TOMADO DE BERCHTOLD Y COLS., 2000)
.----------------------------------------------------- 40
FIGURA 17 REGISTRO DE LA TENSIÓN INDUCIDA POR CAFEÍNA A 4 MM SE MUESTRA EN LÍNEA NEGRA, LA TENSIÓN
INDUCIDA POR CAFEÍNA 4 MM MÁS EL AGONISTA ACPA (1 μM) SE MUESTRA EN LÍNEA ROJA ----------------
45
FIGURA 18 REGISTRO DE LA TENSIÓN MUSCULAR INDUCIDA CON CAFEÍNA (4 MM) EN LÍNEA NEGRA; SE MUESTRA
EN AZUL EL REGISTRO DE LA TENSIÓN INDUCIDA POR CAFEÍNA 4 MM 20 MINUTOS DESPUÉS DE LA
APLICACIÓN DEL AGONISTA ACPA 1 μM.
--------------------------------------------------------------------------- 46
FIGURA 19 REGISTRO DE LA TENSIÓN MUSCULAR POR LA CONTRACTURA INDUCIDA POR CAFEÍNA EN MÚSCULO
CRURALIS DE RANA EN COLOR NEGRO; LA TENSIÓN MUSCULAR DE LA CONTRACTURA INDUCIDA POR CAFEÍNA
8 MM CON EL ANTAGONISTA ACPA 1 μM SE MUESTRA DE COLOR ROJO.---------------------------------------- 46
2
Resumen
La Cannabis sativa ha sido utilizada por el hombre desde hace miles de años. El
ingrediente psicoactivo principal es el Δ9-tetrahidrocanabinol que interactúa sobre los
receptores a canabinoides. Ejerciendo diversos efectos: euforia, percepción alterada, sedación,
deterioro en la memoria, analgesia, anti-emesis y estimulación del apetito. Los principales
receptores a canabinoides (CB1 y CB2), el primero localizado en las terminales de células
nerviosas y el receptor CB2 en órganos linfoides. Otros receptores blanco son el receptor
vaniloidil, y los receptores semejantes a CB.
De los efectos por canabinoides, el mas estudiado es el control motor, siendo esto por
tres vías distintas: sistema nervioso central, placa motora y músculo esquelético, sin embargo
son pocas las referencias de los efectos en músculo esquelético, aunque recientemente se
tienen evidencias de regulación por canabinoides de la liberación de Ca2+ durante el acople
excitación-contracción y de la presencia de ARNm para CB1 en músculo esquelético.
3
Abstract
The Cannabis sativa has been used by humans for thousands of years. The major
psychoactive ingredient is Δ9-tetrahidrocanabinol, which interacts with the cannabinoid
receptors exerting effects diverse as euphoria, altered perception, sedation, impairment
memory, analgesia, anti-emesis and stimulation of the apetite.
The major cannabinoid receptors are CB1 and CB2, being the first located at the
terminals of nerve cells. The CB2 receptor has been located at lymphoid organs. Others target
receptors are vanilloid receptor and “CB-like” receptors.
From the cannabinoid effects the most studied is the motor control, which is due to
three ways: central nervous system, neuromuscular junction and skeletal muscle however,
there are few reference on skeletal muscle effects, although recent evidence show the
regulation by cannabinoid analogues on the mobilization of Ca2+ on the excitation-contraction
coupling and on the presence of mRNA for CB1 in skeletal muscle.
4
Introducción
La planta de la marihuana (Cannabis sativa) ha sido utilizada por el hombre desde hace
aproximdamente tres mil años A. C. por su psicoactividad; se le ha relacionando con la muerte
plasmada esta interpretación en los rituales de ciertas culturas, ha formado parte del conjunto
farmacológico en cierta época, ha sido inspiración para la composición de obras épicas,
actualmente es considerada como la droga más consumida a nivel mundial, sin embargo
también se le reconocen sus propiedades farmacológicas y su posible potencial benéfico en la
aplicación en la practica clínica como paliativo en varias patologías, como por ejemplo en la
esclerosis múltiple para alivio del dolor y en pacientes con caquexia como las victimas del
SIDA para estimular el apetito.
El ingrediente psicoactivo principal de la planta es el Δ9-tetrahidrocanabinol, aislado e
identificado por Gaoni y Mechoulam en 1964, este compuesto interactúa sobre los receptores
llamados canabinoides (CB). La acción de los derivados de los canabinoides es a través de los
receptores, los diversos efectos de esta droga están bien documentados en los individuos
consumidores de marihuana, por ejemplo: euforia, alteración de la percepción y en la función
motora, sedación, deterioro en la memoria, analgesia, anti-emesis y estimulación del apetito
(Voth, 1997).
Se han descrito dos tipos de receptores a canabinoides el CB1 y el CB2, actualmente ya
están clonados; estos pertenecen a la superfamilia de receptores 7 transmembranales acoplados
a proteínas G. El primero en ser descrito fue el receptor CB1, localizado principalmente en las
5
terminales de las células nerviosas, el sistema reproductivo, algunos sistemas glandulares y la
microcirculación. El receptor a canabinoide CB2 es encontrado en múltiples órganos linfoides,
con una alta expresión en los linfocitos B, moderada en monocitos y polimorfonucleares y
baja en los linfocitos T y en las células de la microglia. Los organismos sintetizan
canabinoides los cuales se denominan endocanabinoides. De esta manera, otros receptores
blanco de los endocanabinoides son el receptor vaniloidil, y los receptores semejantes CB,
localizados en el lecho vascular y los segundos en el axón terminal glutamatérgica.
En la literatura uno de los efectos de los canabinoides mas estudiados es sobre el
control motor, que puede ser por tres diferentes vías:
•
Por medio del sistema nervioso central, debido principalmente a la distribución
de los receptores CB1, que se han localizado en la corteza motora, cerebelo,
hipocampo y ganglios basales, por su localización también se ha relacionado con la
regulación de tres diferentes neurotransmisores, la dopamina, el GABA y el
glutamato (Sullivan 1999; Auclair, 2000; Katona y cols., 2001; Szabo 2004).
•
A nivel de placa motora, se ha demostrado una regulación en la transmisión
sináptica en esta, disminuyendo la frecuencia de los potenciales miniatura, así como
la amplitud de estos (Sánchez-Pastor y cols., 2004).
•
Por acción directa sobre el músculo esquelético (Vásquez y cols., 2000; Velasco
y cols., 2002; Sánchez-Pastor y cols., 2004; Velasco y cols., 2004).
6
Epidemiología del consumo de la Marihuana
Reseña Histórica del uso de la marihuana
El origen de la palabra marihuana es desconocida, existen dos versiones acerca de las
raíces del origen: la mexicana la deriva de “María Juana”, y la otra de origen portugués, de
“marigu-ano” que significa “intoxicado.
La planta marihuana pertenece a la familia Cannabaceae, genero Cannabis y a la
especie sativa (ver figura 1), se conocen otras dos
especies: C. Indica y C. Ruderalis (Spinella,
2001). En sus diversas variedades que están
distribuidas en todo el mundo. Sin embargo, es a
partir de la Cannabis sativa que se obtienen dos
derivados principales: la marihuana propiamente
dicha y el hachís obtenida como resina.
Figura 1 Cannabis Sativa. tomada de erowid.org
El empleo de la marihuana se conoce desde aproximadamente el año 3000 a.C., y era
utilizada por los chinos como complemento alimenticio, y en los siglos siguientes el cáñamo
derivado de esta planta fue utilizado para elaborar textiles y prendas finas (Belsasso, 2002;
Spinella, 2001)
La aplicación principal de la marihuana con propósitos medicinales apareció por
primera vez en la farmacopea china alrededor del año 2727 a.C. Teniendo como antecedente
sus propiedades curativa, los textos sagrados hindúes del Atharvaveda, la consideran como
hierba sagrada. También fue utilizada en los rituales dedicados al Dios Shiva. Entre los años
7
700 y 600 a.C., la marihuana ya era considerada como un buen narcótico, puesto que fue
registrada como tal en los textos persas del Zoroastrismo Zend-Avesta. Los escitas asociaron
el Cannabis con la muerte, enterrando a sus muertos con bolsas de cuero y semillas de la
planta, ritual que fue descubierto en una tumba a finales de 1940 en las montañas de Tien Shan
(actualmente Kazajistán). Para el año 430 a.C. Herodoto realizó descripciones de su uso
recreativo y ritual entre los escitas, y en el año 100 a.C. reaparece con sus propiedades
psicotrópicas en los textos de herbolaria china. Durante los dos primeros siglos de la era
cristiana, el Cannabis, en Roma era empleado como medicamento por Galeno como parte del
conjunto farmacológico de su trabajo. De esa manera, en los siglos subsiguientes su uso fue
difundido por Europa y Asia. El Cannabis llegó a Egipto durante el siglo XII extendiéndose
rápidamente entre la población, y durante la invasión por las fuerzas napoleónicas (1798) a
este país, Napoleón Bonaparte vio el uso indiscriminado que se hacía del hachís, por lo que
prohibió su uso; al regresar sus tropas a Francia, lamentablemente gran parte de estos lo
hicieron con este hábito. Dadas las diversas adicciones que surgieron por Europa y Asia
(principalmente alcohol, opio y hachís), alentaron a Mohammed ebn Soleiman a escribir el
poema épico Benk u Bode (a mediados del siglo XVI), donde narra la batalla entre el vino y el
hachís. La aparición del Cannabis en América data de 1840, aunque posiblemente se
conociera desde antes, por los viajes que ya se realizaban entre ambos continentes y a la gran
variedad del Cannabis en el mundo.
Gran Bretaña prohibió su uso definitivamente en 1926. En Estados Unidos para el año
1937, el Cannabis era considerado federalmente ilegal. En el transcurso del siglo XX, las
producciones en Líbano, Grecia y Marruecos invaden Europa. La producción de Afganistán se
destaca y su calidad compite fuertemente con la de otros lugares, considerándose hoy en día
como una de las variedades más potentes. (Belsasso. 2002; Spinella, 2001; erowid.org).
8
Epidemiología
Los reportes de organizaciones internacionales contra las drogas indican que el
Cannabis es la droga ilegal más consumida en el mundo. Datos de la Oficina de las Naciones
Unidas contra la Droga y el Delito (ONUDD) reportaron que hay aproximadamente 200
millones de personas consumidoras de alguna sustancia ilícita, cifra que corresponde al 3.4 %
de la población mudial, siendo el Cannabis la más consumida, seguida de las anfetaminas, la
cocaína y los opioides. La ONUDD informó también que el 2.7% de la población mundial
total y el 3.9% de las personas de 15 años o más han consumido Cannabis al menos una vez
entre los años 2000 y 2001, datos que se muestran en la tabla 1(Organización Mundial de la Salud, 2004).
Tabla 1 Estimación de la prevalencia del consumo mundial de sustancias ilícitas,
2000-2001.
Información tomada de la OMS 2004.
En América, se estima que existen alrededor de 45 millones de personas consumidoras de
Cannabis. Desde el punto de vista de consumo de drogas, en nuestro país la Encuesta
9
Nacional de Adicciones (ENA) de 1993 reportó que el 3.9% de la población de 12 a 65 años
declararon haber consumido drogas ilegales alguna vez en su vida y entre las drogas
empleadas con mayor frecuencia en los 30 días anteriores a la encuesta estaba el Cannabis
(0.2%), así mismo el 3.3% de los entrevistados manifestó haber consumido el Cannabis
alguna vez en su vida. En 1998, la ENA da a conocer estadísticas donde se señala que el
consumo de drogas aumento en el país, informando que el Cannabis sigue siendo la droga más
consumida.( paho.org; La salud en las Américas, 2002).
10
Canabinoides
Los canabinoides son compuestos derivados de la planta Cannabis sativa, de la cual se
extraen 400 compuestos químicos de la planta, siendo 61 los compuestos considerados dentro
del grupo de los canabinoides (Spinella, 2001); de los canabinoides obtenidos de la marihuana,
el Δ9-tetrahidrocanabinol (Δ9-THC) es el principal responsable de las propiedades psicoactivas
de la planta, el cual fue aislado e identificado con técnicas de cromatografía por Gaoni y
Mechoulam en 1964. Su estructura química se muestra en la figura 2.
Δ9-THC
Figura 2 Estructura química del Δ9-tetrahidrocanabinol (Tomado de Iversen, 2003).
En años posteriores a la prohibición del consumo de la marihuana en los Estados Unidos, fue
sugerido su uso en el tratamiento de varias patologías. Actualmente el empleo de análogos
sintéticos del Δ9-tetrahidrocanabinol y los derivados de la planta Cannabis sativa en los
humanos es con fines paliativos y tiene sus indicaciones clínicas precisas que incluyen la
nausea asociada a la quimioterapia, en la esclerosis múltiple para alivio del dolor (véase mas
11
adelante) (Voth y Schwartz, 1997; Felder y Glass, 1998). En 1992 en Estados Unidos se
publico la aprobación por parte de la Food and Drug Administration (FDA) del empleo de un
análogo sintético canabinoide, el dronabinol (capsulas de 2.5, 5 y 10 mg) como estimulante
del apetito, teniendo como indicación la aplicación en pacientes con caquexia, como ejemplo
las víctimas del Síndrome de Inmuno Deficiencia Adquirida (SIDA) (Felder y Glass, 1998;
fda.gov).
Otra de las indicaciones clínicas para la aplicación de este análogo canabinoide es el
alivio del dolor central en pacientes con esclerosis múltiple, Svendsen y cols. (2004) en su
estudio doble ciego realizado en pacientes con diagnostico de esclerosis múltiple y dolor
neurológico, se aplico dronabinol vía oral a dosis máxima diaria de 10 mg o placebo, durante
tres semanas. Los resultados reportan una disminución del dolor, así como un alto numero de
pacientes con efectos adversos en pacientes con dronabinol que los pacientes con placebo
siendo los más frecuentemente reportados el vértigo y el mareo, especialmente durante la
primera semana de tratamiento, la habilidad funcional de los pacientes con esclerosis múltiple
no cambio.
De un estudio de efectos a corto y largo plazo en el control de la espasticidad por
canabinoides en humanos, fueron publicados recientemente los primeros resultados, siendo
este seguimiento el más largo realizado a la fecha sobre el uso del Δ9-THC en la clínica;
reportando ausencia en la mejoría de la espasticidad, pero subjetivamente los pacientes si lo
perciben y refieren como tal. Estos resultados preliminares aunque son incongruentes el
estudio de seguimiento continua y se sugiere en el comunicado que tal vez se encuentre mayor
beneficio a largo plazo que los hallados en la primera parte del estudio (Boletín de IACM,
2005).
12
Para que el compuesto psicoactivo Δ9-THC ejerza sus efectos debe estar presente un
receptor; el primer indicador de la naturaleza molecular de este receptor canabinoide fue el
descubrimiento que el Δ9-THC produce una disminución en la concentración del segundo
mensajero monofosfato de adenosina cíclico (AMPc) en las células de neuroblastoma
(Howlett y cols., 1984), donde reportan una inhibición del cAMP por los compuestos Δ8-THC
y Δ9-THC a concentraciones micromolares, lo cual no fue bloqueado por atropina, yohimbina
o naloxona, sugiriendo que esta inhibición no involucraba receptores opiaceos. Así al
describirse posteriormente la presencia del receptor de membrana al canabinoide Δ9-THC, fue
sugerido
una
síntesis
de
canabinoides
por
el
propio
organismo
denominados
endocanabinoides, lo que dio paso a un sistema de señalización endógena conocida ahora
como sistema endocanabinoide (Elphick y Egertová, 2001)
Endocanabinoides
Los canabinoides endógenos también denominados endocanabinoides, son derivados
de ácidos grasos poliinsaturados, representados por el ácido araquidónico. Estos compuestos
presentan semejanza a otros transmisores lipídicos eicosanoides como las prostaglandinas o
leucotrienos (Arévalo-Martín y cols., 2002). Diversos estudios realizados revelan la existencia
de otras estructuras relacionadas con los mensajeros lipídicos que incluyen a la
palmitiletanolamida o eloiletanolamida, los cuales no activan los receptores canabinoides, sin
embargo presentan importancia fisiológica al participar en los procesos de inflamación,
control de dolor, alimentación y metabolismo de los lípidos (Freund y cols., 2003)
Los endocanabinoides hasta ahora caracterizados en su vía de síntesis, son derivados
del acido araquídonico conjugado con etanolamida o glicerol. En la figura 3 se representa la
13
estructura química de cinco endocanabinoides identificados en el cerebro, en el plasma y en el
tejido
periférico
de
diversas
especies animales.
Estos
son
la
Anandamida,
2-
Araquidonoilglicerol (2-AG), Virodamina, 2-Araquidonil gliceril éter noladin (noladin éter),
N-Araquidonoil-dopamina (NADA) (De Petrocellis y cols., 2004).
Anandamida
2-Araquidonoil-glicerol
Noladin Etér
Virodamina
N-Araquinodoil-Dopamina
Figura 3. Estructura química de los cinco ligando cannabinoides endógenos identificados recientemente.
(Tomado de De Petrocellis y cols., 2004).
El arquidoniletanolamida (anandamida) es un derivado del acido araquidonico
identificado por Devane y cols. en el cerebro porcino (1992). Las concentraciones del
canabinoide endogeno anandamida en el cerebro es 200 veces mayor que el 2-AG. Teniendo
en cuenta que el 2-AG es un intermediario metabólico de los lípidos mientras que la
anandamida es el producto de la hidrolisis de un fosfolípido de la membrana celular.
14
Síntesis y liberación
La síntesis de la anandamida es el producto de la hidrólisis del N-araquidonoilfosfatidiletanolamina (NAPE). En la figura 4 se esquematiza uno de los posibles mecanismos
de la formación de anandamida. La anandamida es sintetizada por la enzima N-aciltranferasa
(NAT) al catalizar la transferencia de acido araquidónico desde la fosfatidilcolina a la cabeza
del grupo de fosfatidiletanolamina. Esta reacción puede ser iniciada por el aumento
intracelular de Ca2+ y es regulada por el AMPc, que aumenta la actividad de la NAT por
fosforilación mediada por la proteína kinasa A (PKA) dependiente de AMPc. La liberación de
anandamida desde NAPE es catalizada por una fosfolipasa D (por sus siglas en ingles, PLD)
específica. La actividad de PLD es ampliamente regulada por la activación de el receptor
ionotrópico glutamato N-metil-D-Aspartato (NMDA), por receptores neuronales nicotínico α7
o por estimulación de un receptor metabotrópico de los principales neurotransmisores
incluyendo la dopamina, el glutamato y la acetilcolina en neuronas corticales (Stella y
Piomelli, 2001; Freund y cols., 2003).
Figura 4 En esta figura se ilustra el mecanismo
propuesto para la formación de anandamida.
(Tomado de Freund y cols., 2003).
15
La síntesis y liberación de 2-AG difiere de la síntesis de la anandamida, ya que por ser
un monoglicerido, su síntesis es asociada al metabolismo del triacilglicerol, por la activación
de un receptor dependiente de fosfolipasa C fosfatidil-inositol específico (PLC). Existen dos
rutas posibles para la biosíntesis del 2-AG, las cuales se resumen en la figura 5. La hidrólisis
de los fosfolípidos de la membrana mediada por la fosfolipasa C (PLC) puede producir
diacilglicerol (DAG), el cual subsecuentemente es convertido a 2-AG por actividad de la
lipasa diacilglicerol (DGL). La vía alternativa, es la fosfolipasa A1 (PLA1) la cual puede
generar lisofosfolípido, al hidrolizarse a 2-AG por actividad liso-PLC.
Acil
Araquidonil
Fosfatidilinositol
Acil
Araquidonil
Araquidonoil
OH
Araquidonil
2-AG
Figura 5 esquematiza la posible vía de formación del 2-araquidonilglicerol (Tomado de Freund y cols.,
2003).
16
Una vez sintetizados la anandamida y el 2-AG, se tienen dos vías posibles de
interacción con receptores: 1) se unen a los receptores a canabinoides (CB) de la misma célula
donde son formados, por difusión en la membrana celular ó 2) pueden ser liberados al espacio
extracelular. De esta manera la activación de los receptores metabotrópicos acoplados a PLC y
lipasa diacilglicerol (DGL), es una vía que sistemáticamente permite el incremento en la
producción de 2-AG. Aunque la formación de 2-AG es dependiente de Ca2+, y la regulación es
independiente de la síntesis y liberación de anandamida. En la figura 6, se observa el modelo
dinámico de síntesis, degradación y acción celular de los endocanabinoides (Rodríguez de
Fonseca y cols., 2005)
Figura 6 Vías bioquímicas para la síntesis, degradación y acción celular del canabinoide endógeno
anandamida. (Tomado de Rodriguez de Fonseca y cols., 2005).
17
Exo-canabinoides
Como se señalo anteriormente, el Δ9-THD es el principal responsable de las
propiedades psicoactivas de la Cannabis sativa. Además de este, otros canabinoides como el
Δ8-THC, el canabinol y el canabidiol también se encuentran en esta planta. A partir de la
estructura química de estos se han desarrollado los canabinoides sintéticos, exocanabinoides
(Arevalo-Martín y cols., 2002).
De los canabinoides sintéticos, se clasifica según la interacción que tienen con el
receptor en agonistas, antagonistas y los bloqueadores de la acido graso amida hidrolasa
(responsable de la hidrólisis de la anandamida).
Agonistas
Los agonistas a los receptores canabinoides se dividen esencialmente en cuatro grupos
químicos: clásicos, no clásicos, aminoalquilindol y los eicosanoides.
Los canabinoides clásicos consisten en derivados dibenzopiranos y derivados de los
componentes de la planta cannabis o de sus análogos sintéticos. Entre los más estudiados de
estos se incluye a los psicotrópicos de la planta, Δ9-tetrahidrocanabinol (Δ9-THC), Δ8-THC y
el canabinoide sintético 11-hidroxi- Δ8-THC-dimetilheptil (HU-210). Los canabinoides no
clásicos, son similares en estructura a los canabinoides clásicos, es decir, estos consisten en
análogos bicíclicos del Δ9-THC carentes del anillo pirano. Como ejemplos son el CP 55940,
CP 55244, CP 50556 (L-nantradol) y el desacetil-L-nantradol.
Del tercer grupo aminoalquilindol, el prototipo inicial es el WIN 55,212-2. Este grupo
contiene compuestos diferentes en estructura de los canabinoides clásicos y no clásicos (ver
figura 7).
18
Figura 7 estructura química de tres agonistas a los receptores canabinoides no eicosanoides (Δ9-THC, CP
55,940 y WIN 55,212,2) (modificado de Pertwee, 2001).
La última familia de moléculas con actividad canabimimética se desarrolló a partir del
descubrimiento de los endocanabinoides, el miembro prototipo del grupo de los eicosanoides
es la anandamida. La mayoría de los agonistas de los receptores a canabinoides contienen un
centro quiral y esto les confiere una estéreo selectividad en los ensayos farmacológicos,
algunos de estos son el araquidonilcyclopropamida (ACPA), R-+-metanandamida y el
araquidonil-2-cloroetilmida (ACEA) (ver figura 8).
Figura 8 estructura química de algunos agonistas eicosanoides (modificado de Pertwee, 2001).
19
La afinidad de los agonistas a los receptores canabinoides ya se ha establecido. En la
tabla 2 se muestra la afinidad de los agonistas por los receptores a canabinoides, observando
que se han identificado tres compuestos selectivos para CB1 sin demostrarse su afinidad para
CB2, el resto ha demostrado afinidad para ambos receptores a canabinoides CB1/CB2.
Tabla 2 Eficacia relativa de los agonistas a los receptores a canabinoides.
(tomado de Pertwee, 2001)
Ligando
CB1
CB2
1) Δ9-THC
+++
+
2) HU-210
+++++
+++++
3) CP 55940
+++++
+++++
4) WIN 55,212-2
+++++
+++++
5) Anandamida
++++
+
6) ACEA
+++++
-
7) ACPA
++++
-
-
+++++
8) JHW-133
Señalando con + la selectividad del agonista por el receptor
Antagonistas/Agonistas inversos de los receptores a canabinoides.
Los antagonistas de los receptores canabinoides, son considerados a su vez como
agonistas inversos, los cuales no solo bloquean el efecto del agonista, sino al actuar sin
presencia del agonista nos dan el efecto contrario al agonista. Son dos los grupos principales:
los diarilpirazoles, como el SR141716A, el cual es un ligando altamente potente y selectivo
20
para el receptor CB1 y los Benzofuranos, siendo representativo el LY320135 y el AM630
(Pertwee, 2001; Howlett y Cols., 2002) en la tabla 3 se muestran los principales antagonistas,
señalando su clasificación como antagonista, agonista inverso y su selectividad para los
receptores canabinoides.
Tabla 3 clasificación farmacologica de los principales antagonistas/agonista inverso y la
selectividad por el receptor canabinoide. (modificado de Pertwee, 2001; información de
tocris.com)
Antagonista
CB1
CB2
1) SR141716A
A/I
-
2) AM281
A/I
-
3) AM251
A
-
4) AM630
-
A/I
5) O-2050
A
-
6) LY320135
A/I
-
Clasificación farmacológica de los principales antagonistas/agonista inverso (A/ AI) y
la selectividad por el receptor canabinoide.
Síntesis química de endocanabinoides
Lon endocanabinoides que se han sintetizado recientemente son el noladin éter,
virodamina y el N-araquidonoil dopamina (NADA) (ver figura 3). A la fecha, es controversial
el hallazgo del noladin éter en tejidos de mamíferos, puesto que el único acil éter encontrado
en animales es el 2-acil- éter (De Petrocellis y cols., 2004). El N-araquidonoil-dopamina fue
21
sintetizado por Bisogno y cols. en el año 2000, reportando una selectividad 40 veces mayor
para los receptores CB1 sobre los CB2.
El noladin éter fue aislado de cerebro de porcino, y se identifico su estructura química
por medio de espectrometría de masa, resonancia magnética nuclear. Este compuesto se une a
los receptores canabinoides CB1 con alta afinidad in vitro [la constante de disociación (KD) es
de 21 nM] ejerciendo efectos semejantes a los canabinoides en el ratón in vivo, incluyendo
sedación, inmovilidad, hipotermia y antinocicepción (Hanus y cols., 2001).
La virodamina fue aislada en cerebro de rata, identificando su estructura química por
medio de espectrometría de masa. Este compuesto mostró activar los receptores CB1
débilmente en un ensayo de unión con 35S-guanosin-5’-O-(3-tiotrifosfato) marcado (GTPγS)
(concentración media efectiva 1.9 μM) donde mostró una actividad agonista parcial. Sin
embargo, la virodamina disminuye la temperatura corporal en ratón, aunque es menos efectiva
que la anandamida (Porter y cols., 2002).
Captura y degradación de los endocanabinoides
La vía de señalización endocanabinoide termina en un proceso de dos pasos que
incluye la internalización del endocanabinoide y su hidrólisis por dos sistemas enzimáticos
específicos. La primera es mediada por un transportador ampliamente distribuido en el cerebro
(AT), aunque las evidencias de su presencia son dudosas, Glaser y cols., (2003) en su trabajo
reportan en base a sus observaciones en la cinética de la hidrólisis de la anandamida, que esta
entra a la célula por un proceso de difusión simple. Otros trabajos que apoyan la presencia del
transportador refieren que es una molécula que trabaja de manera similar a otros
transportadores lipídicos, es decir, facilita la captura de anandamida y 2-AG sin consumo de
22
energía. La hipótesis de la presencia del transportador deriva de las observaciones realizadas
en ciertas líneas celulares en donde la acumulación de anandamida es saturable y puede ser
bloqueada por el AM404 (Giuffrida y cols., 2001; Fegley y cols., 2004; Alger, 2004).
Debe aclararse que los procesos de transporte y degradación del endocanabinoide son
independientes. La degradación de los endocanabinoides es realizada por dos sistemas
enzimáticos específicos: la acido graso amida hidrolasa (FAAH) y la monoacilglicerido lipasa
(MAGL) (Rodriguez de Fonseca y cols.,2005).
Síntesis, degradación, acción celular del endocanabinoide anandamida.
En la figura 6 se muestra una revisión de las vías para la síntesis, degradación y
acciones celulares del canabinoide endógeno anandamida. En el primer paso, la andamida es
liberada desde un lípido precursor de la membrana, el N-araquidonoil-fosfatidiletanolamina
(NAPE) por la acción de una fosfolipasa D especifica (PLD) que a su vez es activada por la
despolarización o la estimulación de un receptor acoplado a proteína G (GPCR).
La biosíntesis del NAPE es catalizada por una enzima de la membrana, la Naciltransferasa (NAT) activada por el calcio (Ca2+) y AMPc. La anandamida actúa como un
mensajero retrógrado en los receptores a canabinoides (CB1) presinápticos donde regula la
liberación del neurotransmisor (NT) a través de un segundo sistema de transducción
[principalmente por el Ca2+ incorporado a través de los canales de calcio dependientes de
voltaje (VGCC)] de la membrana presináptica (Felder y cols., 1993). Otro de los efectos de
este endocanabinoide es actuar como un neuromodulador del sistema mayor de transmisores,
incluyendo la dopamina, en las células postsinápticas en donde regula la excitabilidad y la
23
plasticidad sináptica, a través de la modulación de los canales de potasio (K+) y por las
proteinas quinasas (PK) incluyendo la proteína quinasa A.
La acción de la anandamida finaliza a través de un proceso de dos pasos, que incluye
primero la recaptación celular de la anandamida a través de un transportador especifico (AT) y
segundo, la degradación por hidrólisis enzimático a acido araquidónico (AA) y etanolamida
por la enzima ácido grasa amidohidrolasa (FAAH) (Rodríguez de Fonseca y cols., 2005)
Receptores a canabinoides
Los receptores a canabinoides reciben este nombre por unirse a compuestos
canabinoides, como el Δ9-THC y ejercer una respuesta metabólica. Pertenecen a la familia de
receptores 7 dominios transmembrana, por estar constituidos por 7 segmentos ubicados en la
membrana celular y además son activadores de las proteínas G de la familia Gi/o.
Para referirse a los tipos de receptores a canabinoides, estos son denotados por la
abreviación CB por las siglas en ingles de canabinoid y brain, y numerado en el orden en que
fueron descubiertos (CB1, CB2) (Howlett y cols., 2002). Los dos principales tipos son el CB1 y
el CB2, que han sido caracterizados molecularmente. Hasta la fecha se han descrito otros dos
receptores blanco, los no-CB1 no-CB2, Hajos y cols. (2001) reporta una modulación de la
neurotransmisión glutamatérgica con el agonista WIN55,212,1 y Breivogel y cols. (2001)
demuestra la actividad de los canabinoides en cerebro de rata knockout (CB1 -/-); el otro
receptor blanco de los canabinoides son los receptores vaniloidil demostrado por Zigmunt y
cols. (1999), en su trabajo muestra una activación de estos receptores por anandamida
presentando bloqueo por el antagonista al receptor vaniloidil 8-37 CGRP, pero no por el
antagonista canabinoide SR141716A.
24
El receptor CB1 de rata fue clonado por Matsuda y cols. en 1990. Los receptores CB1
de rata, ratón y humano muestran una semejanza en la secuencia de aminoácidos entre el 97 y
99 %, en la figura 9 se muestra el esquema del receptor CB1. Este tipo de receptores CB1 están
localizados principalmente en cerebro donde se encuentran altamente localizados en la corteza
cerebral, el hipocampo, los ganglios basales y el cerebelo, sin embargo, presentan bajos
niveles de expresión en el hipotálamo y la medula espinal, y están ausentes en los centros
respiratorios del tallo cerebral, apoyando la observación clínica de la baja letalidad de una
sobredosis de Cannabis (Herkemhan y cols., 1990).
Figura 9 muestra el esquema del receptor canabinoide CB1 (tomado de Cayman Chemicals).
El receptor CB2 fue clonado por Munro y cols. en 1993, y este receptor CB2 de ratón
posee un 82% de semejanza en la secuencia de aminoácidos con respecto al receptor CB2 de
humano. Este receptor CB2 se ha localizado principalmente en células del sistema inmune con
una alta expresión en los linfocitos B, moderada en monocitos y polimorfonucleares, baja en
los linfocitos T, en las células de la microglia y en tejidos como el hígado y la retina.
Ambos tipos de receptores CB1 y CB2, muestran una homología del 48% entre ellos
(Howlett y cols., 2002). Ver figura 10.
25
Figura 10 Homología en la secuencia de aminoácidos entre los receptores CB1 y CB2. (Modificado de
Watson, 2000)
Aún cuando los receptores CB1 y CB2 se localizan principalmente en tejido neuronal y
células inmunes, respectivamente. Matias y cols., (2002) por medio de RT-PCR y la técnica de
Western immunoblotting encontraron que las células dendríticas las cuales derivan de células
madres de la medula ósea y son células presentadoras de antígenos del sistema inmune,
expresan cantidades cuantificables de ambos receptores, CB1 y CB2.
Canabinoides y receptores (mecanismo de acción).
La activación de los receptores a canabinoides CB1 y CB2 por un agonista, activa un
número de vías de la transducción de la señal a través de las proteínas G, de la familia Gi/o.
Al activarse el receptor el cual esta acoplado a una proteína Gi/o, esta proteína se
disocia en dos subunidades, la Giα y el dímero βγ. Liberada la subunidad Giα, esta regula a la
adenilil ciclasa, desencadenando una inhibición en la producción del AMP cíclico. Referente
al dímero βγ, este media la regulación de los canales iónicos, la vía de la proteína quinasa
activadas por mitógeno (MAPK) y la fosfatidil-inositol-3-quinasa (PI3K) (Howlett y cols.,
26
2002). Así la activación de los receptores canabinoides CB1 causa inhibición de la adenilil
ciclasa, la cual es sensible a la toxina pertussis, confirmando que esta activación es a través de
proteínas Gi/o, también, esta activación bloquea los canales de Ca2+ tipo L en las células del
músculo liso de las arterias cerebrales (Gebremedhim y cols., 1999) y los canales de Ca2+ tipo
N y P/Q de la terminal presináptica (Mackie y Hille, 1992), activa los canales de K+
(McAllister y cols., 1999; Mackie y cols., 1995) y la vía de las MAPK (Bouaboula y cols.,
1995). Las neuronas del sistema nervioso central la regulación de corrientes intracelulares de
Ca2+ liberado desde almacenes intracelulares (Netzeband y cols., 1999). Sin embargo los
cannabinoides también presenta un efecto contrario en el acople a la adenil ciclasa vía proteína
Gs sensible a la toxina pertussis (Bohnaus y cols., 1998).
La activación de los receptores CB2 involucra la inhibición de la adenililciclasa y
activación de MAPK (Bouaboula y cols., 1996).
Gebremedhim y cols. (1999) reportaron que en el músculo liso de las arterias
cerebrales de gato expresaba acido ribonucleico mensajero (ARNm) para el receptor CB1.
Identificando la corriente de Ca2+ tipo L probaron un agonista cannabinoide, el WIN55,212,2
que indujo una inhibición de esta corriente [máximo de 82 ± 4% a concentración 100 nM],
estos efectos inhibitorios fueron bloqueados por el antagonista a receptor CB1, SR141716A y
la toxina perstussis. Esto fue correlacionado con el papel que desempeñan los receptores CB1
en la regulación del tono de las arterias cerebrales y la reactividad por modulación del flujo de
Ca2+ a través de los canales de Ca2+ tipo L.
Los trabajos realizados por Mackie y Hille (1992), reportan en los canales de Ca2+ tipo
N y P/Q una relación entre la activación del receptor canabinoide y la amplitud de la corriente
de calcio (ICa) en células del neuroblastoma NG108-15 utilizando el agonista WIN55,212,2.
27
Sus estudios revelaron que la activación de ese receptor reduce la amplitud de la corriente de
calcio voltaje dependiente, siendo una inhibición potente (100 nM) y reversible. Esta
inhibición es bloqueada por la toxina pertussis, sin alteración en la corriente de Ca2+ al
tratamiento con (análogos del AMPc resistentes a la hidrólisis) junto con inhibidores de la
fosfodiesterasa, sugiriendo de esta manera que la vía de transducción entre el receptor
canabinoide y el canal de calcio involucra una proteína de unión a GTP sensible a la toxina
pertussis y que esta vía es independiente del metabolismo del AMPc.
En trabajos posteriores, Mackie y cols. (1995) demostraron en células AtT20
transfectadas con el cDNA de CB1 de cerebro de rata, que el agonista canabinoide
WIN55,212-2 aumenta el flujo de corriente de potasio (Kir) por la vía de una proteína G
sensible a la toxina pertussis, así como una inhibición de las corrientes de calcio tipo Q.
Utilizando un sistema de expresión heterologa, McAllister y cols. (1999) caracterizaron
farmacológicamente el acople del receptor canabinoide que activa los canales rectificadores
entrantes de K+ (GIRK) en oocitos de Xenopus laevis. Reportando que los receptores CB1 y
CB2 se acoplan de manera diferente a estos canales, y demostrando el acople de los receptores
CB1 a los canales GIRK, donde la anandamida produjo un 46% del aumento de corriente y el
acople de los receptores CB2 con WIN 55,212-2 fué menos eficiente.
Bonhaus y cols. (1998), demostraron el acople de los receptores canabinoides a las
proteínas Gi/o y Gs. Como también cuantificaron la potencia y actividad intrínseca de los
agonistas canabinoides en la estimulación o inhibición de la acumulación de AMPc. En su
trabajo reportaron que el orden de la potencia de los agonistas canabionides en el incremento o
inhibición de la acumulación del AMPc estimulado por forskolina en las células CHO que
expresaron los receptores hCB1, fue idéntico, HU-210 > CP-55,940 > THC > WIN-55,212-2 >
anandamida.
28
En el estudio realizado por Chemin y cols. (2001) sobre la inhibición directa de los
canales de calcio tipo T por el endocanabiode anandamida, sus resultados sugieren que la
andamida actúa intracelularmente y demuestran que la inhibición de los canales de calcio tipo
T por la anandamida puede regular la excitabilidad neuronal de manera independiente de los
receptores canabinoides.
La activación de los receptores CB1 y CB2 ejercen diferentes efectos celulares.
Las corrientes de calcio entrantes en la membrana presináptica son requeridas para la
liberación del neurotransmisor en las sinapsis del sistema nervioso central. Los canabinoides
al activar los receptores CB1 de estas terminales inhiben los canales de Ca2+ presinápticos, lo
cual podría ser el mecanismo para la inhibición de la liberación del neurotransmisor desde las
terminales presinápticas que expresan el receptor CB1. Así la inhibición de los canales de
calcio puede ser el mecanismo por el cual los cannabinoides inhiben la liberación de los
neurotransmisores (MacKie y Hille, 1992; Felder y Glass, 1998; Sullivan, 1999; Chemin y
cols., 2001; Elphick y Egertova, 2001; Freund y cols., 2003; Iversen, 2003; Arevalo-Martín y
cols., 2002).
En los leucocitos, los canabinoides al actuar sobre los receptores CB2 inducen una
inhibición del adenilil ciclasa, dando lugar a una reducción en la señalización por AMPc que
se correlaciona con una disminución en la función inmune de este tipo celular(Arevalo-Martín
y cols., 2002).
29
Canabinoides y el control motor.
Uno de los efectos más documentados de los canabinoides, es sobre el control motor
(Arevalo-Martín y cols., 2002). Los estudios realizados en sistema nervioso central sobre el
efecto de los canabinoides en la regulación del control motor concluyen en tres puntos
principales:
•
Los canabinoides son capaces de producir cambios en la actividad motora en
humanos y en animales de experimentación. (Rodríguez de Fonseca y cols., 1998; ArevaloMatrín y cols, 2002)
•
Los diversos elementos que conforman el sistema endocanabinoide (los ligandos
endógenos y sus receptores), se encuentran presentes de forma abundante en los ganglios
basales, los cuales son importantes en la regulación del control motor y el movimiento
(Herkenham y cols., 1990; Egertova y cols., 1998; Egertova y Elphick, 2001; Iversen, 2003).
•
Los canabinoides alteran la funcionalidad de tres neurotransmisores con
importante participación a nivel de los ganglios basales, es decir, la dopamina, el GABA y el
glutamato (Sullivan 1999; Auclair y cols., 2000; Katona y cols., 2001; Szabo y cols., 2004).
La falla en la funcionalidad de los ganglios basales en el control motor se manifiesta en
el habla y el movimiento (dificultad para caminar, movimientos involuntarios, espasmos
musculares, aumento del tono muscular). Que se correlaciona con los datos de los efectos
motores producidos por la administración de diferentes tipos de canabinoides en modelos
30
animales apoyando la idea de que el sistema endocanabinoide participa de manera importante
a nivel de los ganglios basales, y la distribución de los receptores a canabinoides así lo sugiere.
Herkenham y cols. (1990) realizaron el primer mapeo de la distribución de los receptores a
canabinoides en el cerebro de diferentes mamiferos incluyendo rata y humano, por medio de
estudios autoradigráficos, utilizando radioligandos y el agonista marcado ([H3]CP-55,940) que
posee alta afinidad al receptor CB1. Su estudio reveló que los sitios de unión mas denso de los
radioligandos y el agonista marcado fue en los núcleos de los ganglios basales [en la sustancia
nigra pars reticulata y el globo pálido], en hipocampo y cerebelo (ver figura 10). La validez
del estudio fue confirmado por Zimmer y cols. (1999), empleando ratones manipulados
genéticamente con la ausencia de la expresión del receptor CB1 (ratones knockout), en los
cuales no fueron detectados los sitios de unión al canabinoide (Iversen, 2003). Hay reportes
por parte de Egertova y cols. (1998) quienes realizaron un análisis de la distribución de FAAH
comparándolo con la distribución de los receptores a CB1 por inmunohistoquímica, y
evidenciaron la cercana correspondencia en distribución y los patrones de expresión para
ambos, FAAH y el receptor CB1. Estos resultados apoyaron la participación de la FAAH en
los mecanismos de señalización canabinoide en cerebro. Los estudios realizados por Egertova
y Elphick (2001), con anticuerpos para la señalización de las regiones amino y carboxilo
terminal del receptor CB1, mostraron que los receptores CB1 están localizados principalmente
en el axón y en la terminal nerviosa, y están ausentes en el soma o las dendritas. La densidad
de los receptores a canabinoides en las regiones del cerebro humano y de animales
(Herkenham y cols., 1990) es diferente, de acuerdo a la región de que se trate, particularmente
la región frontal contiene alta densidad de receptores para CB1. También se observa una alta
densidad en los ganglios basales y en el cerebelo, ver figura 11. Los receptores CB1 están
relativamente ausentes en los núcleos del tallo cerebral, lo cual pudiera explicar la baja
31
toxicidad de los cannabinoides cuando se presenta una sobredosis (Herkenham y cols., 1990;
Iversen, 2003)
Figura 11 Distribución de los receptors canabinoides CB1 en el cerebro de rata, rebelados por una
autorradiografia de la unión de un agonista de alta afinidad marcado radioactivamente en un corte sagital
de cerebro. Las regiones marcadas son: Cb = cerebelo; CbN = núcleo cerebelar profundo; cc = cuerpo
calloso; EP = núcleo entopeduncular; Fr = corteza frontal; FrPaM = corteza frontoparietal area motora;
GP = globo palido; Hi = hipocampo; IC = colliculus inferior; LP = talamo postero lateral; Me = núcleo
amigdaloide medial; PO = corteza olfatoria primaria; PCRt = núcleo reticular parvocelular; SNR =
sustancia nigra reticular; Tu = tubérculo olfatorio; VP = talamo ventroposterior. (Tomado de Iversen,
2003).
Las sustancias sintéticas o endógenas que activan directa o indirectamente los
receptores CB1 producen efectos inhibitorios a nivel motor, que se manifiesta en roedores por
descensos de la actividad espontánea y en la frecuencia de aparición de actividades noambulatorias, y desarrollo de la inactividad llegando incluso a la catalepsia (Rodríguez de
Fonsea y cols., 1998; Arevalo-Martín y cols., 2002). Por el contrario, el bloqueo de estos
32
receptores con antagonistas selectivos como el SR141716A produce hiperlocomoción. Al
emplear a dosis bajas algunos agonistas CB1 se han podido evidenciar efectos estimuladores,
pero la mayor parte de los autores asumen que la activación de los receptores CB1 conlleva un
marcado efecto hipoquinético. No obstante, se debe mencionar que existen variaciones en
cuanto a la magnitud y/o la duración de los efectos de los distintos tipos de canabinoides,
variaciones que están relacionadas con sus diferencias en cuanto a la afinidad por los
receptores, potencia farmacológica y/o estabilidad metabólica (Arevalo-Martín y cols., 2002)
Los efectos motores provocados por la activación de los receptores CB1 con los
diferentes tipos de canabinoides endógenos o exógenos, son el resultado de la capacidad de
estas sustancias de interferir en la actividad de los tres principales neurotransmisores
implicados en la funcionalidad de los ganglios básales, es decir, dopamina (Patel y cols.,
2003), GABA (Katona y cols., 2001; Tsuo y cols., 1998) y glutamato (Rodríguez de Fonseca y
cols., 1998; Sullivan, 1999; Auclair y cols., 2000; Iversen,, 2003)
La relevancia que presenta el sistema endocanabinoide en el circuito de los ganglios
basales, es la regulación de la liberación de varios neurotransmisores: la dopamina aparece
como neurotransmisor en las neuronas que van de las substancia nigra al cuerpo estriado y
cuya disfunción origina la enfermedad de Parkinson. Mientras el GABA lo hace
principalmente en las neuronas estriatales que proyectan hacia la substancia nigra y el núcleo
entopenduncular (vía directa), o hacia el globo pálido (vía indirecta), y cuya disfunción origina
la enfermedad de Huntington u otras patologías con alteraciones coreicas (movimientos
involuntarios) (Rodríguez de Fonseca y cols., 1998)
33
Los Canabinoides y la unión neuromuscular.
Los efectos de los canabinoides en el control motor no solo son a nivel del sistema
nervioso central afectando la neurotransmisión, sino existen evidencias indirectas del efecto
sobre la unión neuromuscular. A continuación detallaré algunos aspectos estructurales y
funcionales de la unión neuromuscular.
Los primeros estudios detallados sobre la transmisión sináptica fueron realizados en la
unión neuromuscular. Esta unión esta formada por un axón mielinizado y una fibra muscular.
El axón mielinizado se origina desde una neurona motora localizada en la medula espinal y
termina en una serie de terminales desmielinizadas que corren longitudinalmente a lo largo de
la fibra muscular. Esta asociación de la unión neuromuscular también es conocida como placa
terminal.
Las zonas activas son las regiones especializadas en la liberación del transmisor, están
orientadas opuestamente a los sitios de invaginación de la membrana postsináptica. Existen
aproximadamente 300 zonas activas por unión neuromuscular. Las zonas activas en la
terminal nerviosa muestran contener vesículas de neurotransmisor, de 50 a 60 nm de diámetro
habiendo aproximadamente 500, 000 vesículas en toda la zona activa en una unión
neuromuscular (figura 12). Se estima que en promedio una vesícula contiene 20,000 moléculas
de acetilcolina (ACh) (Siegel y cols.,1999). Sin embargo, otros autores mencionan que cada
vesícula contiene aproximadamente 5000 moléculas de ACh (Purves y cols., 2001).
34
Figura 12 se esquematiza la morfología de una placa terminal en la unión neuromuscular que consta de un
axón mielinizado y una fibra muscular, señalándose las vesículas del neurotransmisor (acetilcolina) las
zonas activas, la hendidura sináptica también llamado espacio íntersináptico, la membrana
postsináptica(Tomado de Siegel, 1999)
La membrana postsináptica, se localiza opuesta al sitio de liberación del transmisor
también se encuentra altamente especializada consistiendo en pliegues de la membrana
plasmática que presenta una alta densidad a los receptores a ACh nicotínicos (nAChRs). La
lámina basal con la matriz de proteínas es importante para la formación y mantenimiento de la
unión neuromuscular. La acetilcolinesterasa (AChE), es una enzima que hidroliza la ACh a
acetato y colina para inactivar el neurotransmisor, se encuentra asociado con la lámina
basal.(figura 13) (Siegel, 1999).
Figura 13 Muestra la
localización
de
las
vesículas sinápticas en
las zonas activas de la
membrana presináptica
35
(Modificado de Siegel, 1998)
Cuando se estimula una neurona motora se produce una despolarización de la placa
terminal. En 1952, Fatt y Katz observaron que los potenciales espontáneos de
aproximadamente 1 mV ocurrían en la placa terminal motora. Cada cambio de potencial
individual tenia un curso temporal similar a las repuestas evocadas en la membrana muscular
que resultaban de la estimulación eléctrica del nervio motor. Estos pequeños potenciales
espontáneos fueron llamados potenciales miniatura de placa terminal (MEPPs). Debido a que
los MEPPs son reducidos por los antagonistas nicotínicos como la D-tubocurarina e
incrementan en amplitud y duración por el inhibidor de AChE prostigmina, se concluyo que
son desencadenados por la liberación de ACh. Debido a que los cambios en el potencial de
acción son grandes para contar la interacción de moléculas individuales de ACh en la placa
terminal, Fatt y Katz postularon que era un reflejo de liberación en paquetes o cuantos de
moléculas de ACh desde la terminal nerviosa.
Posteriormente, Fatt y Katz observaron que cuando la concentración de Ca2+ es
reducida y la concentración de Mg2+ incrementada, los potenciales de placa evocados se
disminuyeron sin alterar el tamaño de los MEPPs espontáneos.
Katz y Miledi demostraron la importancia del Ca2+ en la liberación del
neurotransmisor. En la unión neuromuscular de rana perfundida con solución salina con Mg2+
pero deficiente en Ca2+, demostraron que al despolarizar eléctricamente la terminal nerviosa en
ausencia de Ca2+, no se evoca el potencial de placa. Si un pulso de Ca2+ es aplicado justamente
antes de la despolarización, se evoca el potencial de placa. Esto ultimo contrasta con la
ausencia del potencial de placa si el pulso de Ca2+ es inmediatamente seguido de la
despolarización. Los potenciales de placa ocurren cuando el pulso de Ca2+ es tan corto como 1
36
mseg precedente al inicio del pulso despolarizante. Estos experimentos demostraron la
importancia de la presencia de Ca2+ en la terminal nerviosa en el momento de la
despolarización para que se lleve a cabo la liberación del neurotransmisor (Siegel y cols.,
1999; Kandel y cols., 2000).
Efectos de los canabinoides en la unión neuromuscular.
Los estudios realizados en los años 70 por Layman y Milton (1971) observaron que el
Δ9-THC disminuye la respuesta a estímulos eléctricos en el íleo de cobayo y en ocasiones
potencía la respuesta mediada por la acetilcolina. Gill y cols., en 1970, en vasa deferentes la
respuesta disminuye levemente a trenes cortos de estímulos eléctricos a baja intensidad, con
gran respuesta a descargas fuertes únicas. Layman y Milton en 1971 no observaron efecto del
Δ9-THC en la preparación de nervio frénico de rata o preparación de rectus de rana; sin
embargo, Kayaalp y cols. (1974) reportaron el bloqueo neuromuscular, con evidencia para un
bloqueo parcial de la conducción axonal en la preparación de rata después de una larga
incubación con Δ9-THC. En 1975, Hoekman y cols. en su trabajo sobre transmisión
neuromuscular en diafragma de rata sugieren una alteración en la función presináptica en la
unión neuromuscular por el Δ9-THC.
Identificados los componentes del sistema endocanabinoide, en 1994 Van der Kloot en
su trabajo sobre los efectos de la anandamida en la unión neuromuscular, reporta que este
compuesto bloquea la enzima adenilato ciclasa en la unión neuromuscular en la rana,
Por los resultados de su trabajo es el primero en reconocer la presencia de un receptor
canabinoide en la terminal nerviosa motora.
37
En la unión neuromuscular de la rana (ver figura 14), Sánchez-Pastor y cols. (2004)
reportaron que al emplear directamente un agonista canabinoide se observo una disminución
en la frecuencia de los potenciales miniaturas y la disminución en la amplitud de estos,
proponiéndose la presencia de los receptores a canabinoides CB1 en la placa terminal de la
unión neuromuscular de rana, los cuales modulan la liberación del transmisor.
Figura 14 Micrografía de escaneo electrónico de unión neuromuscular en rana (Tomada de Alberts, 2002).
Canabinoides y efectos directos en el músculo esquelético.
El músculo esquelético es el efector del movimiento y de los más estudiados en
estructura y función, sin embargo, es un tejido donde se tiene poco conocimiento de los
efectos de los canabinoides que contribuyan a explicar el control motor.
38
El papel del Ca2+ en la contracción muscular
Uno de los componentes reguladores de la contracción muscular, es el ión Ca2+.. Su
función reguladora como segundo mensajero ha sido demostrada en tres aspectos generales: 1)
el mecanismo de activación, específicamente en el sistema troponina-tropomiosina asociado
con los filamento de actina; 2) en los músculos lisos de vertebrados, el Ca2+ junto con
calmodulina (CaM), activa la quinasa de la cadena ligera de la miosina, que inicia la
contracción muscular; 3) la unión directa del Ca2+ a la miosina, que regula la contracción en
los músculos de ciertos invertebrados, por ejemplo el scallop (Berchtold y cols., 2000).
Uno de los componentes principales en el acople excitación-contracción involucrados
en la liberación del ión Ca2+ esta el receptor a rianodina, este receptor es un canal de la
membrana del retículo sarcoplásmico que libera el Ca2+ desde el interior de este y es modulado
por diversos ligandos endógenos y exógenos, siendo la cafeína uno de estos activadores
exógenos. Muñiz y cols., (1992), mostraron los efectos de la cafeína en las fibras musculares
lentas de rana, sugiriendo que la cafeína promueve la liberación de calcio desde el retículo
sarcoplásmico. En trabajos realizados por Bhat y cols. (1997), utilizando un sistema de
expresión heterológa demostraron que la cafeína indujo apertura de los canales de rianodina de
manera dependiente de la concentración, sugiriendo que el sitio de unión de la cafeína reside
en la porción amino terminal del receptor de rianodina.
Acople excitación-contracción
La activación de las vías motoras en el sistema nervioso central como consecuencia de
un reflejo o un movimiento intencionado activa las motoneuronas del asta anterior de la
medula espinal, el potencial de acción se propaga a través de la membrana del axón motor
desencadenando la liberación de acetilcolina (ACh) desde las vesículas localizadas dentro de
39
las terminales del axón motor, esta ACh difunde a través de la hendidura sináptica y se une a
los receptores específicos en el sarcolema causando un potencial de placa que puede alcanzar
el umbral para el inicio de un potencial de acción. Este potencial de acción del músculo se
propaga por el sarcolema despolarizando los tubulos transversos (tubulos T), ocasionando la
activación de los canales de dihidropiridina y consecuentemente que el Ca2+ se libere desde la
cisternas laterales del retículo sarcoplásmico (RS). Los iones de Ca2+ difunden hacia los
sarcomeros dando lugar a la activación de los puentes cruzados. Cuando el músculo ya no es
estimulado la concentración de Ca2+ disminuye rápidamente por la acción de la ATPasa- Ca2+
del RS con la consecuente relajación del músculo.
En la figura 15 se muestra que posterior al estimulo del músculo con un pulso por
arriba del umbral nos da un potencial de acción que activa los canales de sodio y cloro, esta
despolarización al propagarse por los tubulos T activan los canales de dihidropiridina (canales
de Ca2+ tipo L) permitiendo la entrada de Ca2+ al interior de la célula muscular y activando los
canales de rianodina con la consecuente liberación de Ca2+ por parte del retículo
sarcoplásmico (Franzini-Armstrong, 1999; Favero, 1999).
Figura 15. cuando se estimula el músculo se activan los canales de sodio y cloro, de esta manera al
propagarse el potencial de acción llega a los tubulos T donde activa a los canales de dihidropiridina (canal
40
de calcio voltaje dependiente tipo L) que estan acoplados a los canales de rianodina del reticulo
sarcoplásmico con la consecuente liberación de calcio del retículo sarcoplásmico (Tomado de Berchtold y
cols., 2000) .
Efectos de los canabinoides en el músculo esquelético
A la fecha, las evidencias que se tienen del efecto directo de los canabinoides sobre el
músculo esquelético se ubican en tres puntos principales:
•
Efectos de canabinoides sobre las propiedades mecánicas del músculo
esquelético lento.
•
Efecto de canabinoides sobre las propiedades mecánicas del músculo
esquelético rápido.
•
Presencia de ARNm que codifica para receptor a canabinoide CB1 en fibras de
músculo esquelético rápido y lento.
Los estudios iniciales del efecto directo de los canabinoides en músculo esquelético
fueron realizados por Vásquez y cols (2000), quienes investigaron la respuesta mecánica de las
fibras musculares esqueléticas lentas de la rana al agonista canabinoide WIN55,212-2.
Reportando una reducción en la tensión pico y una disminución en la tensión total producida
por potasio, efectos que fueron reversibles. Con esos resultados obtenidos, se sugirió que la
tensión evocada por la solución de alto potasio en fibras musculares esqueléticas lentas de rana
puede ser modulada por canabinoides.
41
En las fibras musculares rápidas de rana, Velasco y cols (2002) aplicaron directamente
el canabinoide (WIN55,212-2) reportando un enlentecimiento en la activación de la
contractura y una disminución en la tensión pico y total. Estos efectos fueron revertidos. Con
esos resultados se sugierió que la generación de la tensión isométrica puede ser modificada por
el canabinoide debido a la alteración en la liberación del calcio desde el retículo sarcoplásmico
y probablemente por la reducción de la concentración intracelular total de ese ión.
Recientemente Sánchez-Pastor y cols., (2004) reportaron la presencia de ARNm que
codifica para el receptor a canabinoide CB1 de músculo esquelético tanto en fibras lentas como
rápidas de rana y de pollo, siendo los niveles de expresión menores en el músculo lento que en
el músculo rápido.
Efecto de un canabinoide sobre las contracturas por cafeína en las fibras
musculares esqueléticas lentas de rana.
Con la finalidad de explorar el efecto directo de un canabinoide (ACPA, agonista
selectivo para el receptor CB1) sobre las contracturas inducidas por cafeína en las fibras
musculares esqueléticas lentas de rana. Realice el trabajo que se describe a continuación.
Metodología
Para el estudio de los efectos del agonista del receptor a canabinoides CB1 (ACPA) se
emplearon ranas adultas de la especie pipiens (figura 16). Se diseco el fascículo tónico del
músculo cruralis
42
Figura 16 rana pipiens
Las ranas se sacrificaron por decapitación, con posterior desmedulación con estilete.
Enseguida se diseco el músculo cruralis, colocándolo en una caja de petri con fondo de resina
transparente (Sylgard). Se fijó el músculo con alfileres entomológicos (minuties) al fondo de
la cámara, bañado por solución Ringer normal (Véase soluciones). Bajo microscopio
estereoscópico se retiró el exceso de tejido conectivo del músculo para obtener fascículos
delgados (0.5 – 1.0 mm de grosor).
Soluciones
La solución Ringer normal (en mM): NaCl 117.5; KCl 25; CaCl2 1.8; la solución fue
ajustada a un pH de 7.4 con Imidazol-Cl 2 mM.
En la solución alto potasio (40 mM): fue preparada sustituyendo equimolarmente el
sodio por el potasio de la solución normal.
La solución de cafeína: se realizo con la solución Ringer normal agregando volúmenes
necesarios de cafeína para obtener las concentraciones requeridas a partir de soluciones madre,
se utilizaron a dos concentraciones (4 y 8 mM).
43
Registro de contractura por cafeína:
La preparación del músculo fue colocada en una cámara de registro experimental, la
cual consta de dos depósitos, uno con dos placas deslizables para colocación de la preparación
y las placas deslizables se ajustan a la anchura del canal para la perfusión de las soluciones de
registro y otro depósito donde se retiran las soluciones. El músculo se fijo por el extremo
proximal al fondo de la cámara y el extremo distal al gancho del transductor mecanoeléctrico
(Transductor Cambridge Technology, Inc., series 400A force trasnducer system) conectado al
amplificador (CyberAmp 320 Axon instruments).
Se registro la tensión de la contractura muscular inducida por cafeína (a las
concentraciones de 4 y 8 mM) con una duración de 4 minutos, se dio un período de
recuperación (20 minutos), después se aplico el fármaco (ACPA 1 μM) para incubar la
preparación durante 4 minutos, posteriormente se registro la tensión de la contractura inducida
con solución de cafeína (4 y 8 mM) y el fármaco (ACPA 1 μM) con una duración de 4
minutos.
Análisis de datos
De las contracturas inducidas por cafeína a las concentraciones de 4 y 8 mM se midió
la tensión máxima (tensión pico) y la tensión total (área bajo la curva de tensión). Realizando
el análisis con computadora con procesador celeron, “software” Clampfit versión 9.0.
Las mediciones fueron normalizadas con respecto a las contracturas control. Los
valores se representan como media ± error estándar de la medida de 4 y 5 experimentos (n). La
44
significancia de los promedios se determinó empleando la prueba estadística “t” de Student,
siendo considerados como significativos los valores de p<0.05.
Resultados
Con 4 mM de cafeína, la tensión máxima disminuyó hasta un 87.92 ± 10.65% (p=
0.063, n=4) y la tensión total se redujo a un 91.31 ± 9.22% (p= 0.1, n=4) con respecto al
control. En la figura 17 se muestra un registro representativo de la tensión muscular inducida
por cafeína (4mM) y el efecto del ACPA (1 μM) sobre la tensión inducida.
Figura 17 registro de la tensión inducida por cafeína a 4 mM se muestra en línea negra, la tensión inducida
por cafeína 4 mM más el agonista ACPA (1 μM) se muestra en línea roja
En las contracturas musculares inducidas por cafeína (4 mM) 20 minutos después de la
aplicación del agonista ACPA (1 μM), la tensión máxima disminuyó hasta un 80.46 ± 8.25%
(p= 0.003, n=4) y la tensión total se redujo a un 80.81 ± 10.14% (p= 0.009, n=4) con respecto
al control inicial. En la figura 18 se muestra un registro representativo.
45
Figura 18 Registro de la tensión muscular inducida con cafeína (4 mM) en línea negra; se muestra en azul
el registro de la tensión inducida por cafeína 4 mM 20 minutos después de la aplicación del agonista ACPA
1 μM.
Cuando se incrementó la concentración de cafeína a 8 mM, en presencia de ACPA 1
μM, la tensión máxima disminuyó hasta un 77. 56 ± 6.43 % (p= 0.008, n= 5) y la tensión total
a 75.46 ± 5.55 % (p= 0.002, n=5) con respecto al control. En la figura 19 se muestra un
registro representativo del efecto del ACPA a concentración de 1 μM en una contractura
muscular inducida por cafeína (8 mM) en las fibras musculares de cruralis.
Figura 19 Registro de la tensión muscular por la contractura inducida por cafeína en músculo cruralis de
rana en color negro; la tensión muscular de la contractura inducida por cafeína 8 mM con el antagonista
ACPA 1 μM se muestra de color rojo.
46
Estos resultados obtenidos nos sugieren que el canabinoide ACPA a concentración 1
µM afecta la liberación de calcio del retículo sarcoplásmico en las fibras musculares
esqueléticas lentas de la rana.
Perspectivas.
De acuerdo a la literatura del campo se ha observado que el estudio del efecto de los
canabinoides a nivel de sistema nervioso central es amplio y resalta como uno de los
principales el de control motor. Las evidencias de los mecanismos donde los canabinoides
ejercen efecto sobre el control del movimiento, se pueden ubicar en tres niveles: 1) en sistema
nervioso central, 2) a nivel de placa neuromuscular y posiblemente en base a las evidencias
antes mencionadas, 3) en el mecanismo de contracción muscular. A pesar de los numerosos
estudios sobre el mecanismo por el cual los canabinoides ejercen su efecto en el control motor,
a nivel de placa neuromuscular y en la contracción muscular, específicamente, es en el
músculo esquelético donde es poco lo que se conoce hasta ahora.
Los estudios de los efectos de los canabinoides en las contracturas inducidas por
potasio y por cafeína en músculo esquelético sugieren que estos compuestos afectan el acople
excitación contracción de las fibras musculares lentas aumentando el retardo en la liberación
de Ca2+ del retículo sarcoplásmico, sin descartar una regulación de los otros componentes
involucrados en el mecanismo de excitación contracción, sin embargo falta mucho por hacer
para validar estos efectos.
47
Con la evidencia de la presencia de ARNm codificante para el receptor a canabinoide
CB1 en músculo esquelético rápido y lento de rana y pollo, resulta importante realizar mayores
estudios desde varios aspectos: 1) la caracterización del efecto de los canabinoides sobre el
acople excitación-contracción en músculo esquelético lento y rápido, 2) determinar mediante
inmunocitoquímica la presencia de los receptores canabinoides a nivel de la membrana de la
terminal presináptica y en la membrana de la célula muscular, 3) caracterizar la vía de
señalización desencadenada por la acción de los agonistas canabinoides, 4) cuantificación de
las concentraciones de calcio en citoplasma en presencia de los canabinoides.
48
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