Radioinmunoensayo bueno

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
RADIOINMUNOENSAYO (RIA)
Nombres y Apellidos: Kevin Javier Del Aguila Rios
Docente: Dr. Manuela Natividad Luján Velásquez
EL PRINCIPIO DEL RIA
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Incluye la unión competitiva de un antígeno
radiomarcado y antígeno no marcado a un anticuerpo
de alta afinidad. El antígeno marcado se mezcla con
una anticuerpo a una concentración que satura los
sitios de unión de antígeno del anticuerpo.
En seguida se añaden en cantidades crecientes las
muestras de antígeno no marcado de concentración
desconocida
El anticuerpo no distingue el antígeno marcado del no
marcado, por lo que los dos tipos de antígeno
compiten por los sitios de unión disponibles en el
anticuerpo. Conforme a la concentración de antígeno
no marcado aumenta, más antígeno marcado se
desplaza de los sitios de unión.
RADIOINMUNOANÁLISIS (RIA)
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Una de las técnicas más sensibles para detectar
antígeno o anticuerpo es el radioinmunoensayo.
La técnica la desarrollaron en 1960 dos
endocrinólogos, para determinar las
concentraciones de complejos de insulina y antiinsulina en diabéticos.
Aunque la técnica se recibió con escepticismo,
pronto se demostró su valor para medir
hormonas, proteínas séricas, fármacos y
vitaminas a concentraciones de 0.001
microgramos por mililitro o menos.
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La disminución de la cantidad de antígeno
radiomarcado que se une al anticuerpo específico
en presencia de la muestra en estudio se mide
para determinar la cantidad de antígeno que esta
última contiene.
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Por lo general el antígeno se marca con un
isótopo de emisión gamma como I125, pero
también suelen emplearse como marcas isótopos
de emisión beta como tritio.
El antígeno radiomarcado es parte de la mezcla
de valoración; la muestra de estudio puede ser
alguna compleja; como suero u otros líquidos
corporales, que contiene el antígeno no marcado.
ETAPAS DEL RIA
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La primera etapa para llevar a cabo un RIA es
determinar la cantidad de anticuerpo necesario
para unir 50 a 70% de la cantidad fija de
antígeno radioactivo Ag* en la mezcla por
valorar.
Esta relación de anticuerpo con Ag* se eligió para
asegurar que la cantidad de epítopos que el
antígeno marcado presenta siempre exceda el
número total de sitios de unión de anticuerpo.
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En consecuencia el antígeno no marcado
adicionado a la mezcla de estudio compite con el
antígeno radiomarcado por el abastecimiento
limitado de anticuerpo.
Inclusive una cantidad pequeña de antígeno no
marcado añadido a la mezcla de valoración de
antígeno marcado y anticuerpo origina un
descenso en la cantidad de antígeno radiactivo
unido y esta disminución es proporcional a la
cuantía del antígeno no marcado añadido.
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Con el objeto de determinar la cantidad de
antígeno marcado unida, al complejo Ag-Ac se
precipita para separarlo del antígeno libre
(antígeno no unido a Ac) y se mide la
radioactividad en el precipitado.
Puede generarse una curva estándar utilizando
muestras de antígeno no marcado de
concentración conocida (en lugar de la muestra
de estudio) y a partir de esta gráfica es posible
determinar con precisión la cantidad de antígeno
en la mezcla de estudio.
SEPARACIÓN DE LAS FASES LIGADA Y NO
LIGADA
Tras la reacción antígeno-anticuerpo, en el
tubo de reacción encontraremos:
 las fracciones libres, constituidas por
antígeno frío y antígeno marcado
 las fracciones ligadas formadas por
complejos antígeno-anticuerpo y antígeno
marcado-anticuerpo.
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Sin embargo, la radiactividad total en el tubo
permanece constante antes y después de la
reacción, por lo que hay que separar la fase
ligada de la no ligada y contar la radiactividad en
una de ellas, sin interferencia de la otra.
 Hay
diferentes métodos de separación
están basados en las distintas propiedades
del antígeno libre y del complejo antígenoanticuerpo:
 Adsorción
 Precipitación química
 Precipitación inmunológica
 Fase sólida
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Adsorción: Con carbón activo, dextrano o resinas.
Adsorben (se unen) específicamente la fase libre
(antígenos frío y caliente) pero no se unen a los
complejos antígeno-anticuerpo que quedarían en
solución. Tras centrifugación, el carbón
sedimenta en el fondo del tubo con la fase no
ligada mientras que la fase ligada queda en el
sobrenadante, que se aspira o decanta. Este
método se utiliza cada vez menos.
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Precipitación química: Hay substancias como el
etanol, el propilenglicol o el sulfato amónico que
alteran la solubilidad de las proteínas provocando
su precipitación. Precipitan los complejos ligados.
Tras centrifugación, quedan los complejos ligados
en el sedimento y la fracción libre en el
sobrenadante, que se elimina por aspiración o
decantación.
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Precipitación inmunológica: Se utiliza un
segundo anticuerpo contra el anticuerpo del
sistema. La unión del segundo anticuerpo al
complejo antígeno-anticuerpo da lugar a un
complejo de gran tamaño, en general insoluble y
fácilmente precipitable. Tras incubación y
centrifugación, la fase libre queda en el
sobrenadante y se separa por aspiración o
decantación. Este método es muy utilizado en
RIA.
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Por ejemplo, si el complejo Ag-Ab contiene anticuerpo
IgG de conejo, entonces la IgG anticonejo de cabra se
une a la IgG de conejo y precipita el complejo.
En otro método se utiliza el hecho de que la proteína
A de Staphylococcus aureus tiene alta afinidad por la
inmunoglobulina G (IgG). Si el complejo Ag-Ab
contiene un anticuerpo IgG, el complejo puede
precipitarse mezclándolo con S. aureus muerto con
formalina.
Tras eliminar el complejo por cualesquiera de estos
métodos es posible medir la cantidad de antígeno
marcado libre que queda en el sobrenadante con un
contador de radiación; la sustracción de este valor de
la cantidad total de antígeno marcado añadido
proporciona la cantidad de antígeno marcado unido.
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Fase sólida: Consiste en inmovilizar al anticuerpo
a un soporte sólido, que puede ser la propia pared
del tubo, bolitas de vidrio, partículas de
Sephadex(polímero). La separación se consigue
simplemente aspirando el medio de incubación.
Este método tiende cada vez más a utilizarse por
ser sencillo, práctico, más corto y requiere menos
manipulación, e incluso permite
suautomatización.
ENSAYOS
INMUNORADIOMÉTRICOS
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Un diseño más es el ensayo inmunoradiométrico
(IRMA) en el cual no ocurre el proceso de
desplazamiento del trazador sino que se utiliza
únicamente la unión del anticuerpo a dos sitios
de unión distintos que posee el ligando.
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Entonces la marca está en el anticuerpo, una
población de anticuerpos está inmovilizado y la
otra está marcada y soluble. Cuando se une el
anticuerpo inmovilizado con el ligando, se fija el
complejo al soporte y posteriormente se une el
anticuerpo marcado a otro sitio libre, quedando el
ligando unido al complejo, en una estructura
llamada sandwich.
APLICACIONES
Cualquier sustancia del organismo puede ser
considerada un antígeno. Los anticuerpos que se
transforman sirven para medir la cantidad de
hormonas que hay en el organismo. Así se miden:
 Hormonas peptídicas: T3, T4, TSH, GH...Casi
todas las hormonas hipofisarias.
 Hormonas no peptídicas: Estrógenos,
testosterona...Hormonas sexuales.
 Sustancias no hormonales que pueden
considerarse como antígenos: Marcadores
tumorales digoxina, medicamentos.
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DESVENTAJAS
La vida del isotopo es muy corta
 Costosa y peligrosa
 Requiere un equipo especial que es el contador
gama para medir la radiación
 Siempre requiere de la elaboración de una curva
estándar para la lectura.
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GRACIAS………..