PRACTICA # 2 tecnicas de inmunodiagnostico

UNIVERSIDAD DE SANTANDER - UDES
PROGRAMA MEDICINA VETERINARIA
INMUNOLOGIA Y VIROLOGIA VETERINARIA
DOCENTE: JOHN JAIRO URIBE GONZALEZ-BACTERIOLOGO.
PRACTICA N° 2
TECNICAS DE IMUNODIAGNOSTICO
OBJETIVO:
 Conocer las diferentes técnicas de inmunodiagnóstico de utilidad clínica en medicina
veterinaria.
 Describir cada una de las técnicas de inmunodiagnóstico y sus características en cuanto a
sensibilidad y especificidad.
MARCO TEORICO:
La respuesta inmune puede emplearse de dos maneras para diagnosticar una enfermedad. Los
anticuerpos específicos pueden utilizarse para detectar e identificar un antígeno de interés. Estos
antígenos pueden estar asociados con un agente infeccioso o simplemente ser moléculas que es
necesario localizar o cuantificar. Segunda, es posible determinar si un animal ha estado expuesto
previamente a un agente infeccioso mediante la detección de anticuerpos específicos en su suero.
Esto establecería un diagnostico o determinaría el grado de exposición de una población a ese
agente. La medición de las interacciones antígeno-anticuerpo con fines diagnósticos se denomina
serología.
Las técnicas serológicas se clasifican en tres amplias categorías, la primera integrada por las
pruebas de unión primaria que mide directamente la unión antígeno anticuerpo, algunas de estas
pruebas son el enzimoinmunoanalisis (ELISA) y el radioinmunoanálisis (RIA).
Las pruebas de unión secundaria miden el resultado de la interacción antígeno – anticuerpo in vitro,
estas pruebas son normalmente menos sensibles que las pruebas de unión primaria, pero son
fáciles de realizar o requieren tecnología más sencilla. Las pruebas in vivo, la tercera categoría mide
el efecto protector real de los anticuerpos en un animal.
REACTIVOS PARA PRUEBAS SEROLOGICAS.
SUERO: la fuente más común de anticuerpos es el suero obtenido de la sangre coagulada, el suero
puede almacenarse congelado y analizarse cuando sea conveniente. Si es necesario puede
suprimirse la actividad del complemento calentándolo a 56°C por 30 min.
ANTIGLOBULINAS: Son proteínas complejas con gran capacidad antigénica, se obtienen de la
inoculación de inmunoglobulinas en conejos; este, responderá produciendo anticuerpos específicos
contra la inmunoglobulina inoculada, dependiendo de la inmunoglobulina inoculada es posible
producir anti globulinas específicas frente a toda clase de inmunoglobulinas.
ANTICUERPOS MONOCLONALES: Un anticuerpo monoclonal es un anticuerpo homogéneo
producido por una célula híbrida producto de la fusión de un clon de linfocitos B descendiente de
una sola y única célula madre y una célula plasmática tumoral. Son anticuerpos idénticos porque
son producidos por un solo tipo de célula del sistema inmune, es decir, todos los clones proceden
de una sola célula madre. Es posible producir anticuerpos monoclonales que se unan
específicamente con cualquier molécula con carácter antigénico.
PRUEBAS DE UNION PRIMARIA
Las pruebas de unión primaria se realizan permitiendo que el antígeno y el anticuerpo se combinen
y midiendo después los inmunocomplejos formados. Para ello uno de los reactivos debe marcarse
químicamente. Se han empleado como marcadores en estas pruebas los radioisótopos, colorantes
fluorescentes o fluorocromos, materiales coloidales o enzimas.
RADIOINMUNOANALISIS (RIA): Los ensayos que utilizan radioisótopos como marcadores tienen
la ventaja de ser extremadamente sensibles. Por otra parte, los sistemas de detecion de isotopos
son costosos, combinados con el riesgo de la radioactividad y la necesidad de eliminar material
radioactivo con la máxima seguridad, hace que estas técnicas sean utilizadas en ensayos altamente
sensibles.
RIA PARA DETECCION DE ANTICUERPOS: los discos de celulosa impregnados de antígeno se
sumergen en el suero a analizar, de manera que cualquier anticuerpo específico se une al antígeno.
Después de lavar para eliminar los anticuerpos sin unir, el disco se sumerge en una solución que
contiene anti globulina marcada con un isotopo radioactivo. La cantidad de radiactividad que emite
el disco es una medida del nivel de actividad del anticuerpo específico del suero.
INMUNOFLUORESCENCIA
Los colorantes fluorescentes o fluorocromos se emplean con frecuencia como marcadores en las
pruebas de unión primaria, la más importante de estas pruebas es la isotiocianato de fluoresceína
(FITC) un compuesto amarillo que puede unirse químicamente a los anticuerpos sin afectar su
reactividad, cuando se aplica una luz ultravioleta invisible o una luz azul a 290 y 145 nm, el FITC
reemite una luz visible de color verde brillante, que puede verse con un microscopio de
fluorescencia fácilmente. Los anticuerpos marcados con FITC se usan en pruebas directas e
indirectas. Las pruebas directas se emplean para identificar la presencia de un antígeno en una
muestra de tejido, el anticuerpo especifico contra el antígeno se marca primero con FITC, un corte
de un tejido que contenga el microorganismo se fija en un portaobjeto de vidrio, se incuba con el
antisuero marcado y se lava para eliminar cualquier anticuerpo no unido, cuando se examina la
iluminación de campo oscuro en un microscopio con luz ultravioleta, el microorganismo al que se
une el anticuerpo marcado, presentara un brillo fluorescente.
La inmunofluorescencia indirecta se utiliza para detectar anticuerpos en el suero o para identificar
antígenos específicos en los tejidos o cultivos tisulares. Para medir los niveles de anticuerpos se
emplea el antígeno presente en un frotis, colocado sobre un portaobjeto, este se incuba con el
suero sospechoso de contener anticuerpos frente a este antígeno. Después se lava el suero
quedando solo los anticuerpos específicos unidos al antígeno, estos anticuerpo se observan,
incubando el frotis con una anti globulina marcada con FITC, cuando se elimina la anti globulina
marcada sin unir mediante lavados y se examina el portaobjeto, la presencia de fluorescencia indica
que hay anticuerpos en el suero analizado.
INMUNOCROMATOGRAFIA
Técnica que permite que una solución antigénica fluya a través de una banda porosa. Mientras fluye
la solución, primero pasa a través de una zona donde se encuentra con el anticuerpo marcado
desecado, al que solubiliza y con el que forma inmunocomplejos. Este anticuerpo esta marcado con
oro o selenio coloidal (banda rosa o azul). El líquido fluye a través de una zona de detección que
contiene el anticuerpo frente al antígeno, inmovilizado en la tira porosa, que captura a los
inmunocomplejos. En un resultado positivo se desarrolla una zona rosa o azul en la zona de
detección.
PRUEBAS DE UNION SECUNDARIA
Las reacciones entre antígeno y anticuerpo normalmente se sigue de una reacción secundaria. Así,
si los anticuerpos se combinan con antígenos solubles en solución, los inmunocomplejos
resultantes pueden precipitar. Los anticuerpos unidos a antígenos particulados pueden hacer que
formen grumos o aglutinen. Si un anticuerpo puede activar la vía clásica del complemento, y el
antígeno esta sobre la superficie celular, puede provocar lisis celular.
PRUEBAS DE PRECIPITACION
Al mezclar cantidades suficientes de Ag soluble con Acs específicos, la interacción Ag-Ac puede dar
lugar a una red capaz de ser visualizada como un precipitado. Esa red de la que hablamos, no es
otra cosa que grandes complejos inmunes (CI) formados por la interacción Ag-Ac. Tal como se
observa en la figura, cuando se agregan concentraciones crecientes de Ag soluble a una cantidad
fija de suero conteniendo Acs específicos, a medida que la cantidad de Ag agregado aumenta, la
cantidad de precipitado se incrementa hasta alcanzar un máximo, luego del cual declina. En un
extremo de la curva de precipitación, cuando se agregan pequeñas cantidades de Ag, los CI se
forman en exceso de Ac. En el otro extremo, al agregar grandes cantidades de Ag, los CI se forman
en exceso de Ag siendo pequeños y probablemente constituidos por una molécula de Ac y dos de
Ag. Entre estas dos situaciones extremas se encuentra la zona de equivalencia, en donde la relación
Ag-Ac permite la formación de grandes redes de CI que precipitan.
INMUNODIFUSION
Esta técnica permite cuantificar de manera sencilla y económica inmunoglobulinas de isotipo G, M y
A o antígenos solubles (C3, C4, transferrina, etc) presentes en muestras biológicas. La técnica se
basa en la difusión de la muestra conteniendo el antígeno a medir (inmunoglobulinas o antígenos
solubles) en una matriz semisólida de agar en la que se encuentra disuelto el Ac específico. La
muestra biológica se introduce en los orificios cilíndricos excavados en el agar y a medida que el
antígeno difunde en forma radial, se alcanza la relación Ag-Ac que permite la formación
precipitados visibles. Una vez finalizada la difusión se mide el radio (R) de los precipitados que es
proporcional a la concentración de antígeno (C). La concentración de proteína en la muestra
biológica (Cx) se calcula realizando una curva de calibración utilizando muestras patrones de
concentración conocida.
AGLUTINACION
Las reacciones de aglutinación, tal como vimos para las reacciones de precipitación, involucran una
interacción secundaria entre Ag-Ac que llevará a la aparición de un aglutinado que se visualiza
como grumos. Los principios fisicoquímicos que gobiernan la formación de estos aglutinados son
los mismos que gobiernan la formación de un precipitado. La gran diferencia entre las reacciones
de precipitación y las reacciones de aglutinación son las características del antígeno: mientras que
en las reacciones de precipitación se emplean antígenos solubles, en las reacciones de aglutinación
el Ag es particulado. Con un Ag soluble, también es posible diseñar una reacción de aglutinación
gracias a que es posible utilizar distintas partículas (partículas inertes o glóbulos rojos) y realizar un
pegado químico o fisicoquímico del Ag soluble a dichas partículas, generando de esa manera un
“Ag particulado” útil para fines diagnósticos. Considerando que es posible inmovilizar muchos tipos
diferentes de proteínas a distintos tipos de partículas inertes, es posible clasificar las reacciones de
aglutinación pasiva en:
Reacciones de aglutinación pasiva directa; o Reacciones de aglutinación pasiva reversa.
Las reacciones de aglutinación directa se basan en la sensibilización de la partícula inerte con el Ag,
por lo que resultan útiles para la detección y titulación de Ac en distintos fluidos biológicos. Las
reacciones de aglutinación reversa se basan en la inmovilización del Ac (en general, se inmoviliza un
anticuerpo monoclonal –AcMo-) en la superficie de la partícula inerte, siendo este tipo de
reacciones particularmente útiles para la detección de Ag en distintas muestras biológicas.
TITULACION
Aunque la detección de anticuerpos o antígenos es suficiente, normalmente es deseable cuantificar
la reacción. Una manera de medir los niveles de anticuerpos específicos es mediante una titulación.
El suero que se analiza se diluye en una serie de concentraciones decrecientes y cada una de ellas
se analiza en busca de actividad. El reciproco de la dilución mas alta que da una respuesta positiva
se denomina titulo y proporciona una estimación de los anticuerpos de ese suero. En determinadas
muestras en las que existe una gran cantidad de Ac es posible que a diluciones bajas (es decir, a
altas concentraciones de suero) no se observe aglutinación. Este fenómeno se denomina efecto
“prozona” y se debe a que en exceso de Ac se forman preferentemente complejos Ag-Ac solubles
(como los formados en la zona de exceso de Ac en la curva de precipitación). En este caso, el título
de Ac sigue siendo la máxima dilución de suero que produce aglutinación visible.
PREINFORME
1.
2.
Investigar diferentes pruebas de unión primaria y secundaria como ELISA, western blot, inmunofiltracion y
citometria de flujo.
Describa las diferentes aplicaciones diagnosticas y clínicas que tienen las pruebas de unión consultadas.
MATERIALES:
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Pruebas de inmunocromatografia (prueba de gravidez y hemoglobina glicosilada)
Puntas amarillas y azules para micro pipetas.
Micro pipetas de 5 – 50 y 10 – 100 micro litros.
Tubos de ensayo
Muestras de sangre con EDTA
Muestras de suero
palillos
solución salina
Cámara húmeda
Alcohol, torundas de algodón, tubos tapa roja y agujas sistema al vacio.
Prueba de antiestreptolisina O, VDRL, Rosa de bengala.
PROCEDIMIENTO:
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Realizar ven punción: Obtener muestra de suero de paciente problema.
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Tecnica de inmunocromatografia: Colocar una gota 50 micro litros de suero problema en el porta
muestra con el que cuenta la columna de inmunocromatografia, dejar correr el suero por la superficie
porosa, realizar lectura 5 minutos después de la adición de la muestra.
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Técnica de precipitación: Colocar una gota 50 micro litros de suero problema en un portaobjetos
previamente identificado, adicionar una gota de reactivo VDRL, con el dispensador con el que cuenta el kit
de reactivo, mezclar en un agitador de mazzini por 4 minutos a una velocidad de 180 rpm y observar
resultados.
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Técnica de precipitación por inmunodifusion radial: Marque en el disco de inmunodifusion el pozo a
utilizar por su grupo de trabajo, tomar 10 micro litros de muestra de suero y dispensarla en el pozo
seleccionado. Colocar el disco en una cámara húmeda durante 24 horas, observar la presencia o ausencia
de líneas de precipitación por el complejo antígeno anticuerpo visible.
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Técnica de aglutinación: En muestras bovinas sospechosas, realizar la separación del suero mediante
centrifugación. Marcar tres sitios de muestras distribuidos para control negativo, positivo y muestra de
suero problema. Colocar una gota del reactivo de rosa de bengala sobre cada uno de los controles y
suero, con un aplicador de madera realizar una mezcla de ambos reactantes (suero y antígeno)
extendiendo la muestra en un amplio círculo sobre la cuadricula, sin exceder los limites delineados. Mover
manualmente la placa en forma giratoria. Dejar reposar la placa sobre el mesón por 1 minuto y realizar la
lectura.
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Técnica de aglutinación para ASTOS: Obtenga suero de un paciente, Marcar tres sitios de muestras
distribuidos para control negativo, positivo y muestra de suero problema. Colocar una gota del reactivo de
ASTOS sobre cada uno de los controles y suero, con un aplicador de madera realizar una mezcla de ambos
reactantes (suero y antígeno) extendiendo la muestra en un amplio círculo sobre la cuadricula, sin exceder
los limites delineados. Mover manualmente la placa en forma giratoria o siga las instrucciones de
agitación mecánica indicadas en el inserto de la prueba. Realizar lectura.

Tecina de dilución: Tomar y marcar 8 tubos de ensayo o una tarjeta con las diluciones a realizar. Colocar
una gota de suero problema de 50 micro litros y adicionar 50 micro litros de solución salina dilución 1:2,
colocar en el pocillo siguiente una gota de la dilución 1:2 y adicionar una gota de 50 micro litros de
solución salina dilución 1:4, realizar el mismo procedimiento hasta una dilución 1:128, agregar reactivo de
VDRL en cada una de las diluciones realizadas, mezclar con un palillo. Mover manualmente la placa en
forma giratoria o siga las instrucciones de agitación mecánica indicadas en el inserto de la prueba. Realizar
lectura, anotar la dilución hasta donde se observa la prueba positiva.
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ANALISIS DE RESULTADOS.
CAUSAS DE ERROR.
CONCLUSIONES.
BIBLIOGRAFIA.