06 Principios de Microscopía - SILADIN Oriente

Principios de Microscopía.
Conocer los equipamientos para la observación celular
Tamaño celular
Las células son las unidades básicas de los seres vivos. La mayoría de ellas son de pequeño
tamaño por lo que es indispensable el uso de instrumentos como los microscopios para su
visualización. Por lo general el poder resolutivo del ojo humano es de 0.2mm (200 µm), o sea la
menor distancia vista o resuelta por el ojo humano es de dos líneas separadas 1mm de distancia;
si hay dos líneas a 200 µm de distancia, veremos una sola línea. Los microscopios se utilizan para
mejorar la resolución.
La invención del microscopio en el siglo XVII posibilitó la serie de descubrimientos posteriores de
las mismas. En 1665 Robert Hooke utilizando un microscopio óptico simple, examinó un corte de
corteza, encontró que esta estaba compuesta por una masa de diminutas cámaras, que
llamó “células”, en realidad sólo vió las paredes celulares, ya que este tejido está muerto a la
madurez y las células ya no tienen contenido. Mas tarde, Hoock y algunos de sus
contemporáneos observaron células vivas.
Existen dos tipos básicos de microscopios: ÓPTICOS y ELECTRÓNICOS.
UNAM, CCH. Plantel Oriente.Área de Ciencias Experimentales.BIOLOGÍA I, 1ª UNIDAD.
Principios de Microscopía.
Microscopio óptico (MO)El tipo de microscopio más utilizado es el microscopio óptico, que se sirve de la luz visible para
crear una imagen aumentada del objeto. El microscopio óptico más simple es la lente convexa
doble con una distancia
focal corta. Estas lentes
pueden
aumentar
un
objeto hasta 15 veces.
Por lo general se utilizan
microscopios
compuestos,
disponen
que
de
varias
lentes con las que se
consiguen
mayores.
Algunos
microscopios
pueden
aumentos
ópticos
aumentar
un
objeto por encima de las 2.000 veces.
El microscopio compuesto consiste en dos sistemas de lentes, el objetivo y el ocular, montados en
extremos opuestos de un tubo cerrado. El objetivo está compuesto de varias lentes que crean una
imagen real aumentada del objeto examinado. Las lentes de los microscopios están dispuestas de
forma que el objetivo se encuentre en el punto focal del ocular. Cuando se mira a través del ocular
se ve una imagen virtual aumentada de la imagen real. El aumento total del microscopio depende
de las longitudes focales de los dos sistemas de lentes.
El equipamiento adicional de un microscopio consta de un armazón con un soporte que sostiene el
material examinado y de un mecanismo que permite acercar y alejar el tubo para enfocar la
muestra. Los especimenes o muestras que se examinan con un microscopio son transparentes y
se observan con una luz que los atraviesa, y se suelen colocar sobre un rectángulo fino de vidrio.
El soporte tiene un orificio por el que pasa la luz. Bajo el soporte se encuentra un espejo que
refleja la luz para que atraviese el espécimen. El microscopio puede contar con una fuente de luz
eléctrica que dirige la luz a través de la muestra.
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Principios de Microscopía.
Los MO actuales tiene un poder resolutivo de 0,2 µm, unas mil veces la del ojo humano.
Existen distintas variantes de observación en MO:
Microscopía óptica normal (de campo brillante coloreado): El material a observar se colorea con
colorantes específicos que aumentan el contraste y revelan detalles que no aprecian de otra
manera
Célula de Pisum,
coloración:
safranina-fastgreen
Traqueidas del
leño de Pinus
Coloración:
safranina
Microscopía de
campo brillante: el material se observa sin
coloración. La luz pasa directamente y se aprecian detalles que estén naturalmente coloreados.
El microscopio en campo oscuro utiliza una luz muy intensa en forma de un cono hueco
concentrado sobre el espécimen. El campo de visión del objetivo se encuentra en la zona hueca
del cono de luz y sólo recoge la luz que se refleja en el objeto. Por ello las porciones claras del
espécimen aparecen como un fondo oscuro y los objetos minúsculos que se están analizando
aparecen como una luz brillante sobre el fondo. Esta forma de iluminación se utiliza para analizar
elementos biológicos transparentes y sin manchas, invisibles con iluminación normal.
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Microscopía en contraste de fase: se usa principalmente para aumentar el contraste entre las
partes claras y oscuras de las células sin colorear. Es ideal para espécimenes delgados, o células
aisladas. El microscopio de fase ilumina el espécimen con un cono hueco de luz, como en el
microscopio en campo oscuro. Sin embargo en el microscopio de fase el cono de luz es más
estrecho y entra en el campo de visión
del objetivo, que contiene un dispositivo
en forma de anillo que reduce la
intensidad de la luz y provoca un cambio
de fase de un cuarto de la longitud de
onda. Este tipo de iluminación provoca
variaciones minúsculas en el índice de
refracción de un espécimen transparente,
haciéndolo
visible.
Este
tipo
de
microscopio es muy útil a la hora de
examinar tejidos vivos, por lo que se
utiliza con frecuencia en biología y
medicina
Phase contrast image of cultured epithelial cells using a 20X objective.
Nomarski, microscopía diferencial de contraste de interferencia (DIC). Utiliza dos rayos de luz
polarizada
y
las
imágenes
combinadas aparecen como si la
célula estuviera proyectando sombras
hacia un lado. Fue diseñado para
observar relieves de especimenes
muy difíciles de manejar, es muy
utilizado
en
los
tratamientos
de
fertilización in-vitro actuales. DIC se
usa cuando el espécimen es muy
grueso para usar contraste de fases
Células epiteliales 200X
www.itg.uiuc.edu/technology/atlas/microscopy/images/20x_dic.tif
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Principios de Microscopía.
Microscopía de fluorescencia: una sustancia natural en las células o un colorante fluorescente
aplicado al corte es estimulado por un haz de luz, emitiendo parte de la energía absorbida como
rayas luminosos: esto se conoce como fluorescencia. La luz fluorescente de mayor longitud de
onda se observa como si viniera directamente del colorante.
Células epiteliales , triple coloración: núcleo (azul), microtubulos (verdes), actina (rejo). 200X (izq.) y
1000X (der.).
www.itg.uiuc.edu/technology/atlas/microscopy/images/100x_fluor.tif
Microscopía confocal.
Microscopía confocal y de fluorescencia http://www.itg.uiuc.edu/technology/atlas/
Página de la casa Leica, sobre fundamentos de este microscopio y modelos http://www.leicamicrosystems.com/llt_index.html
Curiosas microfotografías con microscopía de barrido y posibilidad de manejar virtualmente uno
de estos microscopios http://www.denniskunkel.com/
Completa colección de técnicas de tinción, con sus correspondientes protocolos
http://www.nottingham.ac.uk/pathology/default.html
Página de introducción al funcionamiento del microscopio confocal, preparación de muestras y
procesado de las imágenes http://www.cs.ubc.ca/spider/ladic/intro.html
Manual de técnicas de preparación de muestras y tinción
http://bris.ac.uk/pathandmicro/cpl/lablinks.html
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Principios de Microscopía.
Fundamentos de la microscopía de resonancia magnética y completa galería de imágenes
animadas http://wwwcivm.mc.duke.edu/civmGallery/L1Gallery.html
Una de las mejores páginas sobre microscopía, con amplios textos sobre los diversos tipos de
microscopios y su funcionamiento. Numerosos tutoriales en java sobre el manejo de distintos
microscopios. Se puede descargar un completo manual sobre microscopía en formato Acrobat.
http://micro.magnet.fsu.edu/primer/index.html
Descripción y funcionamiento del microscopio electrónico de barrido y galería de imágenes
http://www.mos.org/sln/sem/
Fundamentos del microscopio electrónico de barrido, descripción del funcionamiento con
numerosos esquemas. Galería de imágenes http://www.mse.iastate.edu/microscopy/home.html
Completo tratado sobre microscopía electrónica: fundamentos, microscopios, preparación de
muestras y procesado digital de las imágenes http://em-outreach.sdsc.edu/web-course/toc.html
Fundamentos teóricos de microscopía óptica, fluorescencia y confocal
http://www.btrip.mednet.ucla.edu/bri/homepage.htm
Descripción y fundamento de los microscopios electrónicos de transmisión y barrido
http://www.unl.edu/CMRAcfem/em.htm
Completo tutorial de digitalización de imágenes, donde se explican los términos básicos
http://www.library.cornell.edu/preservation/tutorial-spanish/contents.html
.
Ojeda sahún, José, Métodos de microscopía electrónica de barrido en Biología Univ. de
Cantabria. 1997.
Tomada de:
http://fai.unne.edu.ar/biologia/microscopia/microscopia1.htm
UNAM, CCH. Plantel Oriente.Área de Ciencias Experimentales.BIOLOGÍA I, 1ª UNIDAD.