Producción Industrial de Ácidos Órganicos

Producción industrial de ácidos orgánicos
Resumen
Durante la última década ha habido una creciente presión social, ambiental (legislaciones
ambientales) y empresarial (menor costo) para desarrollar métodos alternativos a la síntesis química
que produce la gran mayoría de compuestos orgánicos del mundo. Aquí describimos el desarrollo
de alternativas biotecnológicas para la síntesis de ácido ascórbico, ácido glutámico, ácido cítrico y
salicílico por microorganismos y procesos químicos de forma industrial.
Como la ruta biosintética para la obtención del ácido glutámico es muy conocida,
generalmente, se utilizan cepas comerciales mutantes en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos, con
un bloqueo en la α-cetoglutarato deshidrogenasa, lo cual permite la acumulación de ácido
glutámico. La producción y excreción del exceso del ácido glutámico depende de la permeabilidad
de la célula, por ello las cepas de uso comercial son bacterias seleccionadas.
La síntesis química del ácido L-ascórbico (L-AA) es un procedimiento caro y complicado que
conlleva muchos pasos químicos que parten de la D-glucosa, y un único paso enzimático que
implica a la enzima sorbitol-deshidrogenasa. Gracias a la tecnología de ADN recombinante, ha sido
posible aislar el gen de la 2,5-DKG-reductasa en la especie Corynebacterium y expresarlo en
Erwinia berbicola. Las células de Erwinia transformadas son capaces de convertir directamente la
glucosa en ácido 2-KLG. En el caso de las microalgas, se da la fermentación en una etapa utilizando
Chlorella pyrenoidosa. Pero utilizando la microalga Prototheca moriformis se consiguió la
acumulación de L-AA en el medio de fermentación.
El proceso general de obtención de ácido cítrico mediante fermentaciones es llevado a cabo
por Aspergillus niger. Actualmente se utiliza ampliamente el cultivo en superficie, lo que exige un
control extremado de la concentración de iones Mn2+ y una alta concentración de oxigeno disuelto y
también, es esencial mantener el pH por debajo de 2.0. También se comercializó un proceso de
cultivo sumergido con levaduras del genero Candida y más adelante se estudiaron otros métodos
más eficientes de producción con la cepa Yarrowia, que es capaz de utilizar las n-parafinas y los
ácidos grasos como fuentes de carbono.
El ácido salicílico se emplea en varios tratamientos médicos siendo su principal uso la
producción de Aspirina®. La producción industrial de ácido acetilsalicílico se lleva a cabo mediante
síntesis química empleando compuestos como el fenol. El modo de operación es principalmente
discontinuo, alcanzando el rendimiento de la reacción valores del 90% aproximadamente.
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Producción industrial de ácidos orgánicos
Introducción
La producción microbiana de ácidos orgánicos es un método prometedor para la obtención
de sustancias de interés comercial que está desplazando paulatinamente los métodos de síntesis
química. Aún así, hay algunos procesos químicos de producción de ácidos orgánicos que
continúan utilizándose en la industria, como el caso del ácido salicílico y ácido acetilsalicílico.
La ventaja de usar microorganismos para la producción industrial o combinar su uso con
procesos químicos de síntesis, es principalmente la habilidad de sintetizar enantiómeros
específicos, por su crecimiento a gran escala y la separación fácil de productos y substratos,
además, la gran diversidad metabólica permite su aplicación como productores de metabolitos
primarios y secundarios.
El hecho de conocer en profundidad los procesos biológicos y fisiológicos de la producción
microbiana ha hecho viable la producción a gran escala de ácidos orgánicos.Se ha conseguido
aumentar los rendimientos de los microorganismos aplicados en la industria mediante la
obtención de mutantes (técnicas de mutagénesis, recombinación genética, fusión de
protoplastos), el empleo de tecnología de DNA recombinante (introducción de enzimas claves
para la utilización de nuevos sustratos, etc), el diseño y selección de medios de cultivo y
fermentadores que maximicen la producción, disminuyan los costes o faciliten la recuperación de
productos, el diseño y selección de las condiciones y sistemas de cultivo mas convenientes.
Producción de ácido glutámico

El ácido glutámico
El ácido glutámico es uno de los aminoácidos más importantes, tanto por su abundancia en la
composición de las proteínas (6.3%), como por su papel en el intercambio de energía entre los
tejidos y el crecimiento celular (Alberts B. et al. 2002). Aislado del gluten de trigo por H.
Ritthausen en 1866, este aminoácido, o su forma ionizada, el glutamato (abreviado Glu o E),
pertenece al grupo de los llamados aminoácidos ácidos, o con carga negativa a pH fisiológico,
debido a que presenta un segundo grupo carboxilo en su cadena lateral (como se observa en la
ilustración) (Anfinsen, C.B. 1992).
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Producción industrial de ácidos orgánicos
Imagen 1. Estructura del ácido glutámico, conformación plana y tridimensional.
En 1908 Ikeda descubrió que este compuesto era el responsable de la potenciación del sabor
en sopas y alimentos derivados del alga Laminaria japonica, utilizada en la cocina Japonesa. Es por
ello, que hoy día se conoce su propiedad de proporcionar un sabor peculiar denominado “umami”,
considerado como “el quinto sabor”. En la industria alimentaria, el ácido glutámico se utiliza como
potenciador del sabor en sazones y condimentos en forma de glutamato monosódico (MGS o E621)
(Kirimura J. et al. 1969).
Además de intervenir en reacciones de transaminación y en la síntesis de diferentes
aminoácidos como la prolina, hidroxiprolina, ornitina y arginina, el ácido glutámico es el
neurotransmisor excitatorio por excelencia de la corteza cerebral humana. Normalmente, funciona
como mensajero químico en la sinapsis neuronal, pero por encima de unos niveles críticos, el
glutamato puede convertirse en un tóxico para el sistema nervioso, provocando su degeneración y
muerte, por lo que se le clasifica como excitotoxina (Palucha A. et al. 2005).
En los últimos 30 años, el uso de esta excitotoxina en la alimentación ha suscitado mucha
controversia a raíz de diversos artículos científicos sobre el papel de esta sustancia en la patogénesis
y la patología de muchas enfermedades del sistema nervioso central (SNC) y otras enfermedades
agudas y crónicas. En 1968, se describieron las reacciones agudas que pueden darse poco después
de ingerir alimentos que contengan glutamato (dolores de cabeza, debilidad, entumecimiento,
palpitaciones, asma, problemas de sueño, dolores abdominales, calambres, hormigueo, opresión en
el pecho, etc.), es decir, lo que se denominó el “síndrome de restaurante chino” (Rejane G. et al.
2002).
A pesar de los numerosos estudios que han demostrado la toxicidad del glutamato, la
legislación española permite hasta 10g/Kg de E-621 (glutamato sódico) solo o en combinación con
otros aditivos como el E-620 o del E-622 al E625, en su función de aditivo alimentario general
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Producción industrial de ácidos orgánicos
(salvo en alimentos para lactantes y niños de corta edad), mientras que en los condimentos y
aderezos se permite la dosis máxima de quantum satis, es decir, un nivel máximo no especificado
(BOE, 22/01/1986).

Ruta biosintética del ácido glutámico
Los aminoácidos podemos clasificarlos en esenciales, que son aquellos que no somos capaces
de sintetizar metabolitamente y que tenemos que incorporarlos en nuestra dieta, y los no esenciales,
que son aquellos que sí podemos sintetizar. Los aminoácidos no esenciales se sintetizan a partir de
precursores que derivan de distintas rutas metabólicas, entre las que destacan:
Ruta metabólica
Precursor de aminoácido
Glucólisis
3-Fosfoglicerato
Fosfoenolpiruvato
Piruvato
Ciclo de Krebs
Oxalacetato
α-Cetoglutarato.
Pentosas-fosfato
Ribosa-5-fosfato
El ácido glutámico, o glutamato, es un aminoácido no esencial, que deriva directamente de
un intermediario del ciclo de Krebs, concretamente el α-cetoglutarato. Esta conversión es posible
principalmente gracias a la acción de enzimas como la Glutamato deshidrogenasa, capaz de
catalizar la reacción:
α-cetoglutarato + NH4+ + NADPH + H+  glutamato + NADP+
Y en menor medida por otras enzimas como la Glutamato sintasa, que usa la glutamina como
donadora del grupo amonio:
α-cetoglutarato + glutamina + NADPH + H+  2 glutamato + NADP+
O la Carbamilfosfato sintetasa, que lo sintetiza de forma indirecta:
HCO3- + glutamina + 2 ATP  carbamil fosfato + glutamato + 2 ADP + Pi
Gracias a estas tres enzimas, podemos obtener anabólicamente el ácido glutámico o su forma
ionizada, el glutamato (Stryer, 2003).
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Producción industrial de ácidos orgánicos
En condiciones óptimas para la producción de glutamato a partir de glucosa, predomina la ruta
de Embden-Meyerhof-Parnas o Glucólisis que dirige los precursores del carbono hacia el ciclo del
ácido cítrico o ciclo de Krebs. El NADPH + H+ formado en la descarboxilación oxidativa del
isocitrato a α-cetoglutarato suministra el cofactor reducido, que, junto con el NH3, se necesita para
la conversión de α-cetoglutarato a glutamato por la acción de la glutamato deshidrogenasa
(Lehninger, 2005).
Imagen 2. Desvío de los productos de la glucólisis al ciclo de Krebs.
Las cepas productoras de ácido glutámico comercial carecen del enzima α-cetoglutarato
deshidrogenasa del ciclo del ácido cítrico y por consiguiente, en ausencia de iones NH4+ aunque con
suficiente oxígeno, el ácido α-cetoglutárico se acumula (Lehninger, 2005).
Los compuestos intermedios del ciclo de Krebs, necesarios para el aprovisionamiento del
oxalacetato que interviene en la reacción de condensación de las citrato sintetasa y otras reacciones
celulares, provienen de reacciones anapleróticas, como el paso de fosfoenolpiruvato con la adicción
de CO2 a oxalacetato. Por otra parte, los compuestos intermedios del ciclo de Krebs pueden
provenir del ciclo del glioxilato. Estequiométricamente a partir de 1.4 moles de glucosa se obtiene 1
mol de glutamato mediante el ciclo del glioxilato, mientras que la ruta que implica la fijación del
dióxido de carbono bajo la acción de la fosfoenolpiruvato carboxilasa es más eficaz y produce 2
moles de glutamato por 1 mol de glucosa (Lehninger, 2005).
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Producción industrial de ácidos orgánicos
Es por ello, que con el objeto de incrementar la eficacia de la conversión se han introducido en
la producción algunos mutantes que tienen niveles bajos del enzima isocitrato liasa del ciclo del
glioxilato. En el esquema adjunto se muestra la vía metabólica seguida para la producción de
glutamato a partir de glucosa, destacando las enzimas clave en el proceso (Lehninger, 2005).
Glucosa
Glucosa
PEP
carboxilasa
Fosfoenolpiruvato
Fosfoenolpiruvato
CO
CO22
Piruvato
Piruvato
Acetil-CoA
Citrato
Citrato
NH
NH33
Oxalacetato
Oxalacetato
Isocitrato liasa Isocitrato
Isocitrato
Glioxilato
Glioxilato
-cetoglutarato
-cetoglutarato
NADP+
NADP+
Malato
Malato
Succinato
Succinato
NADPH
NADPH++HH
Glutamato
Glutamato

Glutamato
deshidrogenasa
Producción Industrial del ácido glutámico
En 1909, Saburosuke Suzuki and Ikeda llevaron a cabo por primera vez la producción
industrial de L-glutamato monosódico (MSG). El primer proceso de producción industrial consistió
en la extracción de glutamato a partir de proteínas vegetales, las cuales eran tratadas con ácido
hidroclorídrico para romper los enlaces peptídicos. El ácido L-glutamico era entonces aislado desde
este material y purificado como MSG. Esta producción inicial de MSG estaba limitada debido a los
problemas técnicos que presentaba el método para ser desarrollado a gran escala (Sano C., 2009).
Extracción de tejidos vegetales
La proteína vegetal hidrolizada (PVH) es fuente de glutamato procesado en la que hay
concentraciones altas de dicho compuesto. Las proteínas hidrolizadas que se utilizan para realzar el
sabor se preparan utilizando ácidos o enzimas que permiten digerir químicamente la harina de soja,
el gluten de trigo, las cepas comestibles de levadura, etc. Este proceso, que consiste en hervir
productos vegetales en un recipiente lleno de ácido sulfúrico durante varias horas, para luego
neutralizar el ácido con sosa cáustica, descompone las proteínas en sus aminoácidos constituyentes.
Así se obtiene un fango de color marrón que se recoge y se deja secar. El producto final es un polvo
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Producción industrial de ácidos orgánicos
marrón con altas concentraciones de glutamato. Además, igual que el glutamato obtenido por
fermentación, la PVH contiene las mismas sustancias cancerígenas que este tipo de glutamato, así
como las formas D y L de esta sustancia (Sano C., 2009).
Mejoras en la producción del ácido glutámico no aparecieron hasta los años 50s. Una de estas
mejoras consistía en la síntesis química directa, que fue utilizada para la producción de MSG desde
1962 hasta 1973 (Sano C., 2009).
Síntesis química
El acrilonitrilo se forma catalíticamente con CO/H2 y en presencia de [Co(CO)4]2, para dar un
aldehído que mediante la reacción de Strecker, en presencia de ácido cianhídrico y amoniaco, se
transforma en el dinitrilo del ácido glutámico. En medio básico se obtiene la mezcla racémica del
ácido glutámico, que contiene los isómeros D y L:
H2C=CH-CN  OHC-CH2-CH2-CN  NC-CH(NH2)-CH2-CH2-CN  ácido D,L-Glutámico
La separación de la mezcla racémica se consigue favoreciendo la cristalización de ácido Lglutámico a partir de la disolución sobresaturada de la mezcla de isómeros mediante siembra con el
derivado L (Sano C., 2009).
Es importante hacer mención a la estereoisomería del producto obtenido. El glutamato natural,
que se encuentra en el organismo humano y en los productos vegetales y animales, es el ácido Lglutámico. El glutamato procesado obtenido por procesos industriales diferentes a la fermentación
no contiene solamente ácido L-glutámico, sino también su isómero el ácido D-glutámico, cuya
estructura difiere químicamente. Las enzimas digestivas que metabolizan el ácido L-glutámico no
reconocen el ácido D-glutámico, dado que se trata de una sustancia extraña para el organismo. El
glutamato procesado siempre contiene cantidades iguales de ácido L-glutámico y ácido Dglutámico, además de otras sustancias cancerígenas como el ácido piroglutámico, el monocloro y el
dicloro propanol y las aminas heterocíclicas. Para eliminar el isómero D, tendríamos que realizar
técnicas de resolución de la mezcla racémica de los isómeros (Sano C., 2009).
En 1956 se desarrolló un método de fermentación para la producción del ácido glutámico. Las
ventajas de la fermentación (reducción de los costes de producción, reducción del impacto
medioambiental, etc.) eran lo suficientemente buenas como para hacer que todos los fabricantes de
glutamato adoptaran el nuevo método. Hoy en día, la producción mundial total de MSG mediante
fermentación es de unos 2 millones de toneladas anuales (2 billones Kg/año), (Sano C., 2009).
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Producción industrial de ácidos orgánicos
Fermentación Industrial
De todos los procesos de producción
de aminoácidos, el del ácido L-glutámico es
probablemente
el
más
importante
en
términos cuantitativos. En el esquema,
observamos un diagrama de flujo del
proceso de producción industrial que a
continuación detallaremos.
El primer paso en la producción
industrial
de
ácido
glutámico
es
la
preparación del medio de cultivo, que va a
estar formado principalmente por melazas,
producto líquido espeso derivado de la caña
de azúcar y en menor medida de la
remolacha azucarera, obtenido del residuo
restante en las cubas de extracción de los
azúcares. Para ello, en fermentadores a escala industrial (tanques reactores de 450 m 3 de acero
inoxidable con agitación) se mezcla las melazas con amoniaco para formar un caldo o extracto que
será fermentado aeróbicamente durante 30-40 horas a una temperatura de 30-37° C (dependiendo
del microorganismo utilizado). Este proceso, con generalmente una configuración productiva en
lote, es realizado para cultivar bacterias capaces de convertir el carbono presente en la melaza en
glutamina necesaria para la producción de ácido glutámico (Tsao J.H. et al. 1991).
Se conocen numerosos microorganismos capaces de producirlo a partir de diferentes fuentes
de carbono, entre los más importantes se encuentran:

Arthrobacter globiformis (Veldkamp H. et al. 1963).

Brevibacterium sp. (K. Madhavan Nampoothiri, 1996).

Corynecabterium glutamicum (Delaunay S. et al. 2002).
En todos los casos se alcanzan concentraciones de 100 g/l o superiores, lo que supone un
rendimiento de producción del 48.6% y una conversión de ácido glutámico a glutamato monosódico
del 92% aproximadamente.
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Producción industrial de ácidos orgánicos
Imagen 3: Diagrama esquemático del sistema de fermentación
A partir de este diagrama general de la fermentación, iremos detallando los componentes
necesarios para alcanzar un rendimiento adecuado en la producción de ácido glutámico por este
procedimiento (Tsao J.H. et al. 1991).
La fuente de nitrógeno (sales amónicas, urea o amonio) es añadida lentamente para evitar la
inhibición de la producción de L-glutamato. La concentración de los iones amonio debe mantenerse
a un nivel bajo en el medio, puesto que las concentraciones altas son perjudiciales para el
crecimiento celular y la formación de producto. El pH es mantenido de 7-8 por la adicción de
tampones básicos, de otra manera el pH progresivamente iría cayendo conforme el ácido glutámico
fuera secretado y el ión amonio asimilado. Para evitarlo se añade amoniaco gaseoso con objeto de
controlar simultáneamente el nivel de nitrógeno del medio y mantener un pH estable. Aparte de las
fuentes de C y N, el medio de fermentación debe contener sales inorgánicas, que proporcionan
Mg+2, Mn+3, PO4-3 y K+, y por último, niveles limitantes de biotina (Tsao J.H. et al. 1991).
Todas las cepas productoras de ácido glutámico necesitan para su crecimiento biotina que es
una coenzima esencial en la síntesis de ácidos grasos. La acumulación del aminoácido en cuestión
es máxima a una concentración de biotina crítica de 0.5 μg/g de células (secas), que es subóptima
para un crecimiento máximo. La biotina es un cofactor de la acetil CoA carboxilasa, primer enzima
en la ruta biosintética del ácido oleico (C18:1, insaturado) y su posterior incorporación a los
fosfolípidos. Si la bacteria crece en altas concentraciones de biotina, se aumenta la síntesis de ácido
oleico y se tiene un alto contenido de fosfolípidos en la membrana celular. El alto contenido de
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Producción industrial de ácidos orgánicos
fosfolípidos impide la excreción del ácido glutámico originando que la síntesis intracelular se
detenga por retroinhibición. Si la cepa crece en un medio deficiente en biotina se reduce la síntesis
de fosfolípidos y la membrana se daña llevando a una relación diferente entre ácidos grasos
saturados y no saturados. En estas condiciones el ácido glutámico intracelular se excreta fácilmente
(Tsao J.H. et al. 1991).
La fuente de carbono preferida son los carbohidratos, preferiblemente glucosa o sacarosa, pero
en la actualidad se está optando por los tallos o melazas de remolachas. Cuando se utiliza esta
fuente de carbono, el medio requiere modificaciones como la de los niveles de biotina, que tienden
a ser demasiados altos. Esto puede arreglarse por la adicción de ácidos grasos saturados, penicilina
o surfactantes con los que se ayuda a secretar el producto.
Los ácidos grasos saturados de 16 y 18 átomos de carbono inhiben la acetil CoA carboxilasa.
Los fosfolípidos regulan la permeabilidad de la célula al glutamato y las concentraciones
subóptimas de biotina o los ácidos grasos de fosfolípidos en la célula, y por tanto aumentan la
permeabilidad de la célula al glutamato.
La penicilina inhibe la síntesis de las paredes bacterianas y la acumulación intensificada de
glutamato. Se cree que esto se produce porque las células se hinchan y las paredes se debilitan,
dañando la barrera de permeabilidad de la membrana celular.
Morfológica y fisiológicamente todas las cepas usadas son muy parecidas a C. glutamicum, es
decir, son gram-positivas que no esporulan y que no tienen motilidad. Todos los productores de
ácido glutámico requieren de biotina, y carecen o tienen poca actividad de la enzima α-cetoglutarato
deshidrogenasa y una alta actividad de glutamato deshidrogenasa. Se puede usar, las células en
solución, si se usan medios viscosos como las melazas, o inmovilizada en poliacrilamida si se usan
medios, menos viscosos como soluciones de azúcares.
La ruta biosintética para la obtención del ácido glutámico es muy conocida. Usando glucosa
como fuente de carbono, se usa la ruta Embden-Meyerhof-Parnas y el ciclo pentosa-fosfato,
canalizándolos al ciclo de los ácidos tricarboxílicos. Generalmente, se utilizan cepas comerciales
mutantes en este último ciclo, con un bloqueo en la α-cetoglutarato deshidrogenasa, lo cual permite
la acumulación de ácido glutámico. La estequiometría de la reacción con base en glucosa es de 1
mol de aminoácido por 1.4 mol de glucosa.
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Producción industrial de ácidos orgánicos
La producción y excreción del exceso del ácido glutámico depende de la permeabilidad de la
célula, por ello las cepas de uso comercial son bacterias seleccionadas a través de los siguientes
mecanismos:

Deficiencia de biotina.

Deficiencia de ácido oleico en auxótrofos de ácido oleico.

A través de la adicción de ácidos grasos saturados.

A través de la adicción de penicilina.

Deficiencia de glicerol en auxótrofos de glicerol.
Imagen 4: Estimación de la concentración de ácido glutámico
En la gráfica se observa como se logra alcanzar concentraciones de más de 50 Kg/m 3 de ácido
glutámico tras 20 horas de fermentación, esto se puede extender a cualquiera de las cepas
anteriormente citadas (Tsao J.H. et al. 1991).
Una vez fermentado, el caldo concentrado es acidificado para producir ácido glutámico en
forma de cristales. Este proceso es realizado por medio de la bajada del pH hasta su punto
isoeléctrico (pI 3.2) añadiendo ácido clorhídrico a través de una serie de tanques de enfriamiento
diseñados para reducir gradualmente la temperatura y el pH del caldo.
Posteriormente, este caldo concentrado en ácido glutámico cristalizado es neutralizado
añadiendo cenizas de sosa (hidróxido de sodio, NaOH) para producir glutamato monosódico (MSG)
de forma cruda. La solución de MSG será refinada y decolorizada para luego ser transferida a un
evaporador donde será concentrada para la última etapa.
La etapa final consiste en centrifugar los cristales de MSG para la eliminación total del agua.
Por último, los cristales de MSG refinados son secados y empaquetados en cajas de cartón.
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Producción industrial de ácidos orgánicos
Producción de ácido ascórbico

El ácido ascórbico
El ácido ascórbico es un ácido de azúcar, nutriente fundamental para los humanos y otros
animales. El nombre de "ascórbico" le viene del prefijo a- (que significa "no") y de la palabra latina
scorbuticus (escorbuto), una enfermedad causada por la deficiencia de vitamina C. Sin embargo, en
el momento de su descubrimiento, en los años 20, fue llamado ácido hexurónico por algunos
investigadores. Su aspecto es de polvo o cristales de color blanco-amarillento y es soluble en agua.
Muy frágil en solución, se destruye al contacto con el aire, por la luz o el calor.
Imagen 1. Estructura molecular y tridimensional del ácido L-ascórbico.
En 1937, Walter Haworth recibió el Premio Nobel de Química por su trabajo en la
determinación de la estructura del ácido ascórbico (compartido con Paul Karrer, que recibió su
premio por el trabajo con las vitaminas). Ese mismo año el premio de Fisiología y Medicina fue
para Albert Szent-Györgyi por sus estudios de las funciones biológicas del ácido L-ascórbico.
El enantiómero L de este ácido, ácido L-ascórbico (L-AA), se conoce popularmente como
vitamina C, y tiene importantes propiedades antioxidantes, ya que reacciona con radicales libres de
oxígeno (ROS) muy reactivos, como el anión superóxido y los radicales hidroxilos, que están
implicados en muchas enfermedades crónicas, incluyendo el cáncer y las enfermedades
cardiovasculares. Su función antioxidante es posible porque la molécula de ácido L-ascórbico está
disponible para una oxidación energéticamente favorable. Los ROS contienen electrones no
emparejado, por lo que son muy reactivos y perjudiciales a nivel molecular porque interaccionan
con los ácidos nucleicos, proteínas y lípidos, alterándolos.El ascorbato actúa oxidando a los ROS,
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Producción industrial de ácidos orgánicos
formando primero monodehidroascorbato y luego dehidroascorbato. Las especies reactivas de
oxígeno son reducidas a agua, mientras que las formas oxidadas del ascorbato son relativamente
estables y no reactivas, por lo que no causan daño celular (Sauberlich, 1994).
A nivel fisiológico, el ácido L-ascórbico actúa como cofactor para un gran número de
metaloenzimas. Es necesario para la síntesis de colágeno y los glóbulos rojos, y contribuye al buen
funcionamiento del sistema inmunitario. También juega un papel en el metabolismo del hierro, en la
transformación de dopamina en noradrenalina y en la biosíntesis de carnitina (Hancock R.D. et al.
2001).
Imagen 2. Ácido L-ascórbico, los productos resultantes de su oxidación y otros compuestos relacionados. El
ácido L-ascórbico se oxida a monodehidroascorbato (MHDA), que se reorganiza dando dehidroascorbato
(DHA). Ambos compuestos se pueden volver a reducir para generar el ácido L-ascórbico. El DHA es muy
inestable y suele hidrolizarse dando 2,3-diketo-L-gulonic acid.
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Producción industrial de ácidos orgánicos
El ácido ascórbico y sus sales de sodio, potasio y calcio suelen usarse como aditivos
antioxidantes de los alimentos. Estos compuestos son solubles en agua y, por tanto, no pueden
proteger a las grasas de la oxidación. Para este último fin pueden usarse como antioxidantes los
ésteres de ácido ascórbico solubles en grasa, con ácidos grasos de cadena larga, como el palmitato
de ascorbilo o el estereato de ascorbilo. El código de aditivos E que se usan en Europa con este
ácido orgánico son (García J.M., 2009):
o
E300: Ácido ascórbico.
o
E301: Ascorbato de sodio.
o
E302: Ascorbato de calcio.
o
E303: Ascorbato de potasio.
o
E304: Ácidos grasos ésteres de ácido ascórbico: (i) palmitato de ascorbilo y (ii)
estereato de ascorbilo.
Como ya hemos destacado, su principal función es la de antioxidante, y con este fin, también
se emplea la forma R del ácido ascórbico, la cual, al contrario que la forma L, no presenta actividad
vitamínica.

Ruta biosintética del ácido ascórbico
El ácido ascórbico se encuentra en animales, plantas y microorganismos, ya que todos los
seres vivos lo necesitan. Aunque el ácido ascórbico sea un nutriente esencial para el ser humano
(por lo que es llamado vitamina C), en realidad es un metabolito natural producido en el hígado en
la mayoría de los animales.
En el caso de los animales, los reptiles y los órdenes más antiguos de aves sintetizan el ácido
ascórbico en los riñones. Los órdenes recientes de aves y la mayor parte de mamíferos sintetizan el
ácido ascórbico en el hígado, donde la enzima L-gulonolactona oxidasa convierte la glucosa en
ácido ascórbico. Los humanos y algunos primates no son capaces de sintetizar la L-gulonolactona
oxidasa debido a un defecto genético, y son por tanto incapaces de fabricar ácido ascórbico en el
hígado (Hancock R.D. et al. 2001). Esta mutación genética ocurrió hace aproximadamente 63
millones de años y hubiese tenido consecuencias letales para los primates si no fuera porque
muchos de los productos alimenticios que consumían contenían ácido ascórbico (Chatterjee 1973).
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Producción industrial de ácidos orgánicos
Imagen 3. Ruta biosintética de ácido ascórbico a partir de D-glucosa en animales. Enzimas: 1 D-ácido
gucorónico reductasa; 2 L-gulono-1,4-lactona hidrolasa; 3 L-gulono-1,4-lactona oxidasa.
La ruta biosintética del ácido ascórbico en plantas, juega un papel crucial en la detoxificación
del peróxido, ozono y radicales libres, y es esencial para la actividad fotosintética porque regenera
los antioxidantes solubles de la membrana y permite el control del pH a través del complejo
fotosintético PS II de los cloroplastos. Las células vegetales acumulan grandes cantidades de ácido
L-ascórbico, sobretodo en los tejidos verdes y los órganos de almacenamiento (Hancock R.D. et al.
2001).
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Producción industrial de ácidos orgánicos
Imagen 4. Ruta biosintética del ácido L-ascórbico en plantas. Enzimas: 1 hexokinasa; 2 hexosa fosfato
isomerasa; 3 fosfomanosa isomerasa; 4 fosfomanosa mutasa; 5 GDP-manosa pirofosforilasa; 6 GDP manosa3,5-epimerasa; 7 L-galactosa deshidrogenasa; 8 L-galactono-1,4-lactona deshidrogenasa; 9 D-arabinosa
deshidrogenasa; 10 D-arabinono-1,4-lactona oxidasa. Las enzimas que intervienen en la hidrólisis de GDPL-galactosa no han sido aun determinadas.

Producción Industrial de ácido ascórbico
Actualmente, la producción mundial de ácido L-ascórbico es de 80.000 toneladas al año,
generando beneficios de unos $ 6000 millones en el mercado global, y hasta la fecha su producción
presenta una tasa anual de crecimiento de entre el 3-4%. Aproximadamente el 50% del ácido
ascórbico sintetizado se emplea para la prtoducción de suplementos vitamínicos y otras
preparaciones farmacéuticas. Pero está creciendo la demanda de este compuesto para la elaboración
de productos cosméticos, debido a sus potentes propiedades antioxidantes, y la estimulación que
produce en la síntesis de colágeno. El 25% de la producción mundial se destina a la industria
alimentaria, como aditivo, y el 15% a la fabricación de preparados para la prevención de la
decoloración de los productos, la protección del aroma y el sabor, y para mejorar su contenido
nutricional. Se estima que entorno al 10% de la producción total se destina a la fabricación de
piensos animales, a pesar de que para los animales de granja no es un nutriente esencial, ya que
pueden sintetizarlo ellos mismos. Donde si es importante es en acuicultura, ya que algunas especies
de peces como el salmón no son capaces de sintetizar el ácido ascórbico de novo (Hancock R.D. et
al. 2002).
Aislado originariamente de cítricos, la primera síntesis de ácido L-ascórbico a partir de Lxilosona se consiguió en 1933 (Reichstein et al., 1933). Ya en 1934, se desarrolló el proceso que
permitía su producción a partir de D-glucosa (Reichstein and Grüssner, 1934). Hoy en día, este
proceso denominado síntesis de Reichstein-Grüssner se sigue utilizando actualmente con pequeñas
modificaciones. El proceso consta de varias etapas químicas y una conversión enzimática, se trata
por tanto de un proceso mixto fermentación/químico. La etapa de oxidación desde D-sorbitol a Lsorbosa se lleva a cabo mediante Acetobacter suboxydans en un proceso sumergido a 30-35°C, con
agitación y aireación vigorosas. El sorbitol se añade a una concentración inicial del 20% en una
solución nutritiva que consiste en 0,5% de extracto de levadura o líquido de maceración de maiz y
CaCO3. La conversión está completada en 24h; concentraciones más altas de sorbitol prolongan el
tiempo de conversión. En el proceso global se produce aproximadamente 1 kg de ácido L-ascórbico
a partir de 2 kg de glucosa (Hancock R.D. et al. 2002).
16
Producción industrial de ácidos orgánicos
Imagen 5. Proceso de Reichstein-Grüssner para la producción industrial de ácido L-ascórbico.
La síntesis química del ácido L-ascórbico es un procedimiento caro y complicado que
conlleva muchos pasos químicos que parten de la D-glucosa, y un único paso enzimático que
implica a la enzima sorbitol-deshidrogenasa. La última etapa del proceso es la transformación
catalizada del ácido 2-ceto-L-gulcónico en ácido L-ascórbico.
Actualmente la mayor parte de la vitamina C producida se fabrica mediante fermentación con
la ayuda de microorganismos modificados genéticamente, ya que es más barato que la síntesis
química o mixta (Bremus C. et al. 2006).
17
Producción industrial de ácidos orgánicos
Se ha observado que, en la naturaleza, algunas bacterias como Acetobacter, Gluconbacter y
Erwinia, son capaces de transformar la glucosa en ácido 2,5-diceto-D-gulónico (2,5-DKG),
mientras que otras, Corynebacterium, Brevibacterium y Arthrobacter, son capaces de transformar el
ácido 2,5-DKG en ácido 2-KLG gracias a la enzima 2,5-DKG-reductasa. Gracias a la tecnología de
ADN recombinante, ha sido posible aislar el gen de la 2,5-DKG-reductasa en la especie
Corynebacterium y expresarlo en Erwinia berbicola, capaz de transformar la glucosa en 2,5-DKG
gracias a tres enzimas. Las células de Erwinia transformadas son capaces de convertir directamente
la glucosa en ácido 2-KLG (Bremus C. et al. 2006).
Imagen 6. Comparación entre la producción de ácido L-ascórbico utilizando microbacterias o mediante el
método clásico de Reichstein. (i) Método químico de Reichstein y Grüssner (1934) en el que se introdujo la
biotransformación de D-sorbitol a L-sorbosa. (ii) Métodos que emplean las enzimas L-sorbasa
deshidrogenasa (Sugisawa et al., 1990; Saito et al., 1997, 1998). (iii) 2-KLGA sintesis a partir de D-glucosa
(Sonoyama et al., 1982; Anderson et al., 1985). (iv) Conversión de D-gluconato mediante 5-ceto-Dgluconato (Gray, 1945).
Los principales requerimientos para síntesis de vitamina C se pueden resumir en la quiralidad
del producto, ya que sólo el L-enantiómero del ácido ascórbico es activo biológicamente, y que la
etapa final del proceso no sea oxidativa debido ya que el ascorbato es muy fácilmente oxidable.
En 1982, Sonoyama desarrolló un proceso de fermentación en dos etapas. La primera etapa
implica la oxidación de la glucosa por una especie del género Erwinia a ácido 2,5 diceto-Dglucónico (2,5-DKG). Durante una incubación de 26h se forman 328 g/l de 2,5-DKG cálcico con
18
Producción industrial de ácidos orgánicos
una eficiencia del 94%. La segunda etapa, una reducción de 2,5-DKG a ácido 2-ceto-L-gulónico (2KLG), la lleva a cabo Corynebacterium. En este proceso, una vez que Corynebacterium ha crecido
durante 16h, se le suplementa con el cultivo anterior de Erwinia esterilizado. Después de 66h de
incubación se obtiene 2-ceto-L-gulonato cálcico con una eficiencia del 92%. Este último producto
es transformado químicamente con facilidad (mediante dos reacciones químicas similares a las del
proceso Reichstein) a ácido L-ascórbico siendo el balance total, basado en consumo de glucosa, del
86%. Este método es más económico que el método Reichestein y permite reducir el consumo de
solventes tóxicos, lo que conlleva a una menor cantidad de productos de deshecho (Bremus C. et al.
2006).
No obstante, el mejor camino para convertir la glucosa en 2-KLG debería ser el utilizar un
único microorganismo que tuviera todos los enzimas que se requieren en esta conversión. Puesto
que la conversión de D-glucosa en 2,5-DKG por Erwinia herbicola incluye varios pasos
enzimáticos, mientras que la transformación de 2,5-DKG a 2-KLG por Corynebacterium requiere
sólo uno, la estrategia más simple para convertir D-glucosa en 2-KLG sería aislar el gen de la 2,5DKG reductasa de Corynebacterium y expresarlo en Erwinia herbicola. Esto es lo que hicieron los
científicos de la compañía Genentech en 1985, abriendo la posibilidad de realizar un proceso de
producción mediante fermentación en una sola etapa a partir de glucosa a ácido 2-ceto-L-gulónico
(Bremus C. et al. 2006).
Imagen 7. Comparación entre la conversión de D-glucosa en 2-KLG realizado en una fermentación en
dos pasos, utilizando Erwinia y Corynebacterium, o en una fermentación simple, empleando la cepa E.
herbicola expresando al enzima 2,5-DKG reductasa de Corynebacterium.
19
Producción industrial de ácidos orgánicos
Imagen 8. Metabolismo de la glucosa en la cepa recombinante de E. herbicola, en el que se producen
los precursores para la producción de ácido L-ascórbico.
Por otra parte, las levaduras no son capaces de sintetizar ácido ascórbico, pero sí producen un
compuesto llamado ácido D-eritroascórbico (D-EAA). Esta sustancia tiene características redox
similares y puede ser utilizada como antioxidante en aplicaciones industriales. Es interesante que
los dos últimos pasos de la síntesis de D-EAA se parecen a la ruta de síntesis de L-ácido glutámico
en plantas (Bremus C. et al. 2006).
Imagen 9. Comparación entre la ruta biosintética de ácido L-ascórbico en plantas y la producción de
ácido D-eritroascórbico en levaduras.
En el caso de las microalgas, se da la fermentación en una etapa utilizando Chlorella
pyrenoidosa. Se consiguieron unos 40 mg/L de L-Ácido ascórbico (L-AA) cultivando la especie
20
Producción industrial de ácidos orgánicos
silvestre. Tras ciclos de mutagénesis química se llegaron a producir hasta 2g/L de L-AA (unas 70
veces más). En este proceso el L-AA permanece en el interior celular. La acumulación de L-AA en
el medio de fermentación se consiguió utilizando la microalga Prototheca moriformis. Se observó
que reduciendo el pH se podía estabilizar el L-AA en el caldo de fermentación y recogerlo del
medio. El nivel de L-AA estaba correlacionado con la actividad de la enzima GDP-D-Man-3,5epimerasa, que cataliza la conversión de GDP-D-Man a GDP-L-Gal. En la imagen siguiente,
podemos apreciar el detalle de esta reacción (Bremus C. et al. 2006).
Imagen 10. Ruta propuesta para la síntesis de ácido L-ascórbico a partir de D-glucosa en P.
moriformis. Sólo se muestran las 5 últimas reacciones.
Producción de ácido cítrico

El ácido cítrico
El ácido cítrico o citrato, su forma ionizada,
es un ácido orgánico tricarboxílico ampliamente
distribuido en la naturaleza (MacKee, 2003), ya que se encuentra en la mayoría de las frutas, especialmente
en los cítricos como el limón y la naranja. (Grewal, 1995).
Su nomenclatura, según la IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry), es (ácido) 3hidroxi-1,3,5-pentanotricarboxílico y su fórmula química general corresponde a C6H8O7,
siendo su
estructura la del modelo anexo. (Lehninger, 2005)
21
Producción industrial de ácidos orgánicos
Imagen 1. Estructura del ácido cítrico
En bioquímica aparece como un metabolito intermediario en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos, una
ruta que es realizada por la mayoría de los seres vivos. (Lehninger, 2005)
El citrato tiene gran número de aplicaciones industriales. Un uso muy habitual es como aditivo en
muchos tipos de bebidas y alimentos (principalmente en la industria de la repostería), proporcionando un
gusto ácido o afrutado. También puede usarse como plastificador y como antiespumante (inhibidor de la
formación de espuma) en la fabricación de ciertas resinas, como mordiente para colores brillantes y como
antioxidante para conservar las propiedades organolépticas de los alimentos (G. Calabuit, 2004). Además,
gracias a sus tres grupos carboxilos cargados negativamente, el citrato es un buen quelante de iones
metálicos. Esto tiene un gran interés en el terreno agrícola, ya que en el suelo existen cantidad de iones
metálicos que pueden ser tóxicos para ciertas plantas (este es el caso del Al3+) (Turgut, 2004). Si se
consiguiera por ingeniería genética que la planta sensible a este ión sintetizara grandes cantidades de ácido
cítrico, podría ser resistente en este medio, y la producción aumentaría en un alto porcentaje.

Ruta biosintética del Ácido Cítrico.
El ciclo del ácido cítrico es la vía final común para la oxidación de las moléculas
energéticas: carbohidratos, ácidos grasos y aminoácidos, etc. entrando la mayoría en el ciclo como
acetil-coenzima A, que es generado a partir de la descarboxilación oxidativa del piruvato que se
obtiene de la glucosa en condiciones aerobias. (J.M. Berg 2007)
El ciclo comienza con la condensación de oxalacetato (C4) y acetil-CoA (C2) para dar citrato
(C6) que se isomeriza a isocitrato (C6). La descarboxilación oxidativa de este intermediario produce αcetoglutarato (C5). La segunda molécula de dióxido de carbono se desprende en la reacción siguiente, en la
que el α-cetoglutarato se descarboxila oxidativamente generando succinil-CoA. El enlace tioéster del
succinil-CoA se rompe por el ortofosfato para producir succinato, y se genera simultáneamente un enlace
fosfato de alta energía en forma de GTP. El succinato se oxida hasta fumarato (C4), que se hidrata para
formar malato (C4). Finalmente el malato se oxida para regenerar el oxalacetato (C4). Así pues, dos átomos
22
Producción industrial de ácidos orgánicos
de carbono en forma de acetil-CoA entran en el ciclo y dos átomos de carbono dejan el ciclo en la forma de
CO2 en las descarboxilaciones sucesivas catalizadas por la isocitrato deshidrogenasa y la α-cetoglutarato
deshidrogenasa. Este ciclo se describe detalladamente en la siguiente imagen. (Lehninger, 2005)
Imagen 2. Esquema del ciclo del ác. Cítrico
En las cuatro reacciones de oxidación-reducción que tienen lugar en el ciclo se transfieren tres
pares de electrones al NAD+ y un par al FAD. Estos transportadores de electrones reducidos son
oxidados a continuación por la cadena de transporte de electrones para generar aproximadamente 9
moléculas de ATP. Además, en el ciclo del ácido cítrico se forman directamente un enlace fosforilo
de alta energía de transferencia. De aquí que por cada fragmento de dos carbonos oxidado
completamente hasta H2O y CO2 se generen un total de 10 moléculas de compuestos con enlaces
fosforilo de alta energía. (J.M. Berg 2007)
El ciclo del ácido cítrico opera solamente en condiciones aeróbicas porque requiere el
suministro de NAD+ y FAD. La irreversible formación de acetil-CoA a partir de piruvato es un
punto de regulación importante para la entrada en el ciclo del piruvato derivado de la glucosa. La
actividad del complejo piruvato deshidrogenasa esta estrictamente controlada mediante
fosforilación reversible. Los aceptores de electrones se regeneran cuando NADH y FADH2
transfieren sus electrones al O2 en la cadena de transporte de electrones, con la subsiguiente
formación de ATP. En consecuencia, la velocidad del ciclo del ácido cítrico depende de las
necesidades de ATP. En los eucariotas, otro punto importante de control es la regulación de la
actividad de dos enzimas del ciclo. Una carga energética elevada disminuye la actividad de la
isocitrato deshidrogenasa y de la α-cetoglutarato deshidrogenasa. Estos mecanismos se
complementan entre sí, reduciendo la velocidad de formación de acetil-CoA cuando la carga
23
Producción industrial de ácidos orgánicos
energética de las células es alta y cuando los intermediarios biosintéticos son abundantes. (J.M.
Berg 2007)
Cuando la célula dispone de energía suficiente, el ciclo del ácido cítrico puede servir como
fuente de precursores de biomoléculas importantes, tales como las bases de los nucleótidos, las
proteínas, y los grupos hemo. Esta utilización consume los intermediarios del ciclo. Cuando en el
ciclo nuevamente se precisa metabolizar moléculas energéticas, las reacciones anapleróticas
reponen los intermediarios que se necesitan. (J.M. Berg 2007)

Producción Industrial del Ácido Cítrico
Inicialmente se extraía del zumo de limón, posteriormente se sintetizaba a partir de glicerol
y de otros compuestos químicos, y finalmente, desde 1923, se obtiene por fermentación industrial
(King and Cheetham, 1987). En 1933, la producción mundial anual superó las 10.000 toneladas, de
las cuales, más del 80% se obtuvieron por fermentación. Con la sustitución de los polifosfatos por el
citrato de sodio en los detergentes en 1970, el mercado anual creció rápidamente y actualmente se
estima que se producen aproximadamente 1.6 millones de toneladas anuales (Berovic, 2007).
Inicialmente se utilizaron métodos de cultivo en superficie con Aspergillus niger; después de la
Segunda Guerra Mundial se introdujeron procesos de cultivo sumergidos también con A. niger.
Aproximadamente en 1977 se comercializó un proceso de cultivo sumergido con levaduras del
genero Candida (Betancourt, 2003) y más adelante se estudiaron otros métodos de producción con
la cepa Yarrowia (Papanikolaou, 2006).
En 2004 comenzaron a desarrollarse investigaciones con el objetivo de encontrar
microorganismos productores de ácido cítrico y que, a diferencia de A. niger pudieran acceder a las
n-parafinas (Crolla, 2004) y los ácidos grasos (como las grasas animales) (Papanikolaou, 2006) para
utilizarlos como fuentes de carbono. La levadura Yarrowia lipolytica cumple este perfil y además
resulta eficiente en la producción de ácido cítrico de otras fuentes, tales como la glucosa y sacarosa
(Foster, 2007). Dadas estas condiciones, Y. lipolytica es utilizada a escala industrial, aunque poco
se conoce sobre los detalles de los métodos o los volúmenes de producción, ya que su desarrollo
aún se encuentra en estadíos muy tempranos. (Sauer, 2008)
El proceso general de obtención de ácido cítrico mediante fermentaciones llevada a cabo por
A. niger tiene varias fases:
24
Producción industrial de ácidos orgánicos
-
A. niger puede utilizar como sustrato sacarosa, glucosa, fructosa y maltosa. (Drysdale,
1995). El primer paso consiste en acondicionar las melazas obtenidas de la caña de azúcar
o la remolacha, que consiste en mezclar el jarabe con agua para diluirlo y pasarlo por un
filtro de vacío para eliminar los sólidos suspendidos y las impurezas de la melaza. (Citric
Acid Production. Patented Nov. 15, 1966).
-
Preparación del inóculo: dejar crecer pellets de A. niger en agitación y buenas condiciones
de aireación a una temperatura de 27 ºC durante 2-3 días en un medio de la misma
composición que el medio de producción (Darouneh, 2009)
-
Fermentación aeróbica del sustrato:
• Cultivo en superficie: se siembra el inóculo en la superficie del medio de cultivo en
bandejas de acero inoxidable u otro tipo de superficies planas. Estas bandejas se
apilan en las salas de fermentación, donde se suministra aire filtrado que sirve tanto
para el suministro de oxígeno como para controlar la temperatura de fermentación.
(Meers & Milson, 1987)
• Cultivo sumergido: Los microorganismos se crecen en el caldo de fermentación
directamente, al cual hay que ajustarle el PH y añadir nutrientes. La fermentación se
lleva a cabo en tanques aireados y agitados de acero inoxidable en los que la
transferencia de oxígeno se realiza mediante burbujas de aire, lo cuál también asegura
una homogeneización de la mezcla en el fermentador. (Darouneh, 2009)
Cuando se alcanza la concentración máxima de ácido cítrico en el cultivo, los micelios
de A. niger se separan del caldo de fermentación mediante filtración. (Darouneh,
2009).
-
La biomasa obtenida se lava con agua para eliminar los restos de ácido cítrico
y el
agua de lavado se añade al licor principar. (Darouneh, 2009)
-
El ácido cítrico debe ser separado de la biomasa, el azúcar residual (restos de sustrato), las
proteínas producidas por la fermentación y otras impurezas solubles. Este proceso se
puede llevar a cabo mediante varias operaciones, por ejemplo mediante la adición de
hidróxido cálcico con la consecuente formación de un precipitado insoluble en forma de
gránulos que se compone principalmente de citrato cálcico además de células. (Rottigni,
1981)
25
Producción industrial de ácidos orgánicos
-
Adición de ácido sulfúrico para descomponer el citrato de calcio. Se forma sulfato de
calcio el cual es retirado de la solución por medio de un filtro rotatorio al vacío y se
constituye como un desperdicio o como un subproducto del proceso. (Grewal, 1995)
-
Eliminación de impurezas con carbón activado y resinas de intercambio iónico (Grewal,
1995)
-
Concentración del licor mediante evaporación (aproximadamente a 40ºC)
-
Finalmente, se lleva a cabo la cristalización (20-25ºC), obteniéndose cristales de ácido
cítrico hidratados que se someten a deshidratación y se empaquetan para su distribución.
(Grewal, 1995)
-
Para recuperar el ácido cítrico del cultivo, también se han utilizado métodos de extracción
con solventes como el 2-butanol o el tributil-fosfato. (Colins, 1960) (Colins, 1962). La
“Food & Drugs Administration” de EEUU recomienda como solvente para extracción una
mezcla de n-octil alcohol y tridodecilamina. (U.S. Food & Drugs Administration, 1975).
Tratamiento
del sustrato
Fermentación
Separación
Cristalización
Eliminación
de impurezas
Deshidratación
Empaquetado
Descomposición
Imagen 4.: Diagrama del proceso de producción de ácido cítrico
26
Producción industrial de ácidos orgánicos
Imagen 5.: Diagrama de flujo de la producción del Ác. Cítrico realizado con el programa Aspen Plus
En la siguiente tabla se muestran las principales características de los procesos industriales
implicados:
27
Producción industrial de ácidos orgánicos
Imagen 6: Parámetros relevantes en la producción de ácido cítrico
Actualmente aún se utiliza ampliamente el cultivo en superficie con A. niger, puesto que,
aunque es un proceso que requiere más trabajo que el de cultivo sumergido, las necesidades
energéticas son menores. En los procesos sumergidos se prefieren fermentadores agitados por aire,
que permiten utilizar recipientes de mayor tamaño, ya que este producto es de un volumen de
producción alto entre los obtenidos por fermentación. (Darouneh, 2009)
La materia prima que más se utiliza para la producción de citrato, las melazas, tiene el
problema de la gran variabilidad del material. En las fermentaciones sumergidas con A. niger las
concentraciones elevadas de azúcar estimulan la producción de citrato obteniéndose rendimientos
bajos cuando la concentración de azúcar es inferior a 140 kg/m3. En general, se suministra
nitrógeno a una concentración de 0.1 - 0.4 g/L. La adición de NH4+ durante la fermentación
aumenta la producción de citrato. (Sauer, 2008)
La producción de ácido cítrico con A. niger es extremadamente sensible a la concentración
de iones Mn2+, de forma que su producción se ve ya drásticamente reducida a un nivel de
manganeso del orden de 3 mg/L (Papagianni, 2007) Por tanto, es necesario pretratar las melazas con
agentes que acomplejen o precipiten este metal, por ejemplo con hexacianoferrato (HCF) o con
cobre, que contrarresta el efecto del manganeso al inhibir su absorción por las células. Las
condiciones deficientes en manganeso también favorecen la producción de pequeños gránulos
micelianos con superficies lisas y compactas, característicos de las buenas fermentaciones fúngicas
de citrato. Cuando la concentración de manganeso aumenta, la morfología fúngica se vuelve
28
Producción industrial de ácidos orgánicos
filamentosa, incrementando drásticamente la velocidad del cultivo y disminuyendo rápidamente de
forma concomitante la tensión de oxigeno disuelto. Como la producción de ácido cítrico necesita
oxígeno, la velocidad de producción de ácido aumenta a medida que aumenta la cantidad de
oxigeno disuelto. Además, una corta interrupción del suministro de oxigeno puede conducir al cese
irreversible de la producción de citrato. Para la biosíntesis de citrato es esencial mantener el pH por
debajo de 2.0, puesto que pH superiores, A. niger acumula ácido glucónico en vez de citrato. (D.S.
Clarck, 2004)
Las cepas de levadura que se usan actualmente o fueron empleadas alguna vez en procesos
industriales de producción de ácido cítrico son: fibrae, subtropicales, lipolitica, oleophila,
zeylanoides y, en mayor medida, guilliermondii. La producción de citrato con Candida difiere en
varios aspectos del proceso sumergido con A. niger.. Por ejemplo, la deficiencia de manganeso no
es un prerrequisito, siendo innecesaria una etapa de pretratamiento para eliminar este metal del
medio; el citrato se produce a un pH superior (4.0-7.0). (Rottigni, 1981) Además, la limitación de
nitrógeno provoca la acumulación de ácido. La principal ventaja del proceso que emplea Candida
respecto al que emplea A. niger consiste en que la productividad global de la fermentación es
superior, ya que se pueden utilizar concentraciones de azúcar más altas debido a la naturaleza más
osmotolerante de los organismos y además la fermentación es más rápida. (Grewal, 1995)
El proceso metabólico que conduce a la acumulación de citrato implica:
a) La descomposición de las hexosas a piruvato y acetil-CoA.
b) La formación anaplerótica de oxalacetato a partir de piruvato y CO2.
c) La acumulación de citrato dentro del ciclo de los ácidos tricarboxílicos.
En este esquema no debería eliminarse CO2 durante la producción de citrato, puesto que el
CO2 liberado en la descarboxilación oxidativa del piruvato a acetil-CoA debería utilizarse en la
conversión de piruvato en oxalacetato. La enzima clave que cataliza esta reacción, la piruvato
carboxilasa, la producen intrínsecamente las especies Aspergillus. Las concentraciones elevadas de
azúcar aumentan además la actividad de esta enzima así como la de las enzimas glucolíticas y
pueden inhibir algunas de las enzimas del ciclo de los ácidos tricarboxílicos. Para que se acumule
citrato es necesario que al menos una de las enzimas de este ciclo resulte inhibida. Las evidencias
recientes sugieren que la principal etapa reguladora es al de α-cetoglutarato deshidrogenasa, etapa
limitante de la velocidad en el ciclo y la única reacción irreversible. Esta enzima se inhibe al
incrementar las concentraciones fisiológicas de oxalacetato y NADH durante la producción de
29
Producción industrial de ácidos orgánicos
citrato. La fosfofructoquinasa es inhibida por el citrato, aunque esta inhibición puede contrarrestarse
con concentraciones intracelulares elevadas de NH4+. (Lehninger, 2005)
La deficiencia de manganeso reduce la actividad de algunas de las enzimas de la ruta de las
pentosas fosfato (que podrían desviar las hexosas de la glucólisis y la producción de citrato) y
también inhibe el ciclo de los ácidos tricarboxílicos (Kubicek, 1977), y además perjudica el
metabolismo anabólico en general, incluyendo el recambio de las proteínas y los ácidos nucleicos.
Durante estas deficiencias, se forma una proteasa ácida y la reserva intracelular de ácidos nucleicos
y proteínas disminuye con la producción concomitante de péptidos, aminoácidos y niveles elevados
de NH4+. Por tanto, en conclusión, el principal efecto de la deficiencia de manganeso es su impacto
en el recambio proteico, haciendo que la concentración de iones amonio se incremente en tanto que
contrarreste la inhibición de la fosfofructoquinasa por el citrato.
Para la reoxidación metabólica del NADH durante la producción de ácido cítrico se necesita
oxígeno. Durante la acumulación de citrato, un sistema respiratorio alternativo sensible al ácido
salicilhidroxámico (SHAM), mantiene el sistema respiratorio con la re-oxidación del NADH,
aunque sin producción concomitante de ATP.
Imagen 7.: relación entre SHAM y NADH
El hecho de que la acumulación de ácido cítrico esté fuertemente inhibida por el SHAM indica
la importancia de este sistema. La respiración sensible al SHAM depende de una tensión elevada de
oxigeno y el sistema se inactiva por una corta interrupción de la aeración. (Kirimura, 1987)
La producción de ácido glucónico con A. niger está catalizada por una glucosa oxidasa
extracelular, parcialmente unida al micelio, que se inactiva a pH inferior a 2.0. A pH superior, se
produce ácido glucónico a partir de glucosa mediante la acción de A. niger. La glucosa induce esta
enzima a pH superior a 4.0, lo que hace necesario mantener en las fermentaciones para la
producción de citrato un pH inferior a 2.0. (Papagianni, 2007)
30
Producción industrial de ácidos orgánicos
En resumen, la producción de citrato por A. niger se caracteriza por:
 Una actividad elevada de las enzimas glicolíticas y de la piruvato carboxilasa
inducida por los carbohidratos que conducen a la síntesis de citrato.
 La inhibición de una enzima del ciclo de los ácidos tricarboxílicos que podría causar
la descomposición de citrato.
 La producción mediada por una deficiencia de manganeso y una concentración
elevada de NH4+ intracelular que contrarresta la inhibición de la fosfofructoquinasa por el
citrato.
 Una tensión de oxigeno elevada y el suministro continuo de oxigeno para mantener
activa la respiración sensible al SHAM para la reoxidación de NADH.
 Un pH bajo para inactivar la glucosa oxidasa.
En los avanzados sistemas modernos de producción, agitación y aeración en fermentadores
industriales es necesario asegurar un mínimo de oxígeno disuelto del 75% de saturación en el medio
de cultivo con aire por debajo del cual la producción de ácido cítrico cesa. (Grewal, 1995)
Producción de ácido salicílico

El ácido salicílico
La búsqueda de sustancias capaces de calmar el dolor físico ha sido una constante a lo largo de
la existencia de la humanidad. En un principio, los remedios más antiguos se tomaban directamente
de la propia naturaleza. La corteza de sauce blanco (Salix alba), usada desde la antigüedad para el
alivio de la fiebre y el dolor, constituye uno de estos remedios. (González R., 2005)
La primera descripción cuasi-científica del sauce como sustancia antinflamatoria, se atribuye al
reverendo Edmund Stone, en Inglaterra en 1763. Stone describe en una carta dirigida al conde de
Macclesfield, su éxito al tratar pacientes con fiebre, posiblemente malaria, con una preparación a
base de Salix alba. En 1898, Johann Buchner, profesor de Farmacología en Munich, extrae salicina
de la corteza del sauce, y un año más tarde Henry Leroux obtiene salicina cristalina. (González R.,
2005)
El ácido salicílico, un glucósido derivado de la salicina fue inicialmente obtenido por el químico
italiano Raffaele Piria, mientras que su estructura fue identificada y sintetizada por Hermann Kolbe en
31
Producción industrial de ácidos orgánicos
1859 en Alemania. Fue el padre de Felix Hoffmann, un químico de la compañía alemana Bayer
dedicada a la fabricación de tintes, quien pidió a su hijo un compuesto de sabor más agradable y menos
irritante para el estómago para aliviar sus dolores reumáticos. Hoffmann lo logró en 1897, sintetizando
el conocido ácido acetilsalicílico. Anteriormente a los experimentos de Hoffmann, los estudios para
mejorar sus propiedades se habían dirigido hacia cambios en el grupo carboxílico. Hoffmann obtuvo el
ácido acetilsalicílico en una forma pura y estable al acetilar el grupo fenol (Jones R., 2001) mejorando
su tolerancia y favoreciendo su consumo. Aspirina® fue el nombre comercial acuñado por los
laboratorios Bayer para el comprimido fabricado con esta sustancia, convirtiéndose en el primer
fármaco del grupo de los antiinflamatorios no esteroideos, AINE. (González R., 2005)
El ácido salicílico se emplea en varios tratamientos médicos. Por ejemplo, su uso tópico
debe considerarse como tratamiento de primera línea para las verrugas víricas cutáneas. En el
mercado se ofrecen cremas, pomadas, geles y coloides con concentraciones desde un 11% hasta un
50% de ácido salicílico preparados para su administración por vía tópica. La gran ventaja que
presenta este ácido orgánico se basa en que sólo rompe la piel hiperqueratósica, pero no irrita el
resto de piel sana. (Sladden, 2004).
Otro efecto es el resultado de la combinación del subsalicílico con el bismuto, para formar
subsalicílico de bismuto (BSS), más conocido por su nombre comercial: Pepto- Bismol. Esta
sustancia empezó a utilizarse de forma común como aliviante estomacal desde que gracias a ella se
consiguió curar a muchos niños afectados por la enfermedad conocida como cólera infantil,
caracterizada por diarrea, vómitos y deshidratación acelerada. (Bierer, 1990)
Es bien conocido que el principal uso del ácido
salicílico es la producción de Aspirina® (ácido
acetilsalicílico, un fármaco antiinflamatorio no esteroideo
usado frecuentemente como:
1. Antiinflamatorio: La inflamación es una
respuesta del organismo de una lesión tisular ya
sea interna o externa. En los procesos inflamatorios son liberadas diversas sustancias como
las prostaglandinas, las cuales provocan vaso dilatación y sensibilizan los receptores
nerviosos al dolor. Disminuye los síntomas inflamatorios estabilizando las membranas
celulares e inhibiendo numerosas rutas que intervienen en el proceso inflamatorio.
2. Analgésico (alivio del dolor leve y moderado): Actúa bloqueando la transmisión del
impulso doloroso en una acción analgésica periférica. Es decir, la actuación se realiza
32
Producción industrial de ácidos orgánicos
sobre el mismo foco del dolor no a nivel del sistema nervioso central. Una lesión en un
tejido, lesión hística localizada, induce la liberación de prostaglandinas, el ácido
acetilsalicílico inhibe la actuación de la enzima, la ciclooxigenasa, que activa las
prostaglandinas, por lo tanto rompe el mecanismo de reconocimiento del dolor por parte
del sistema nervioso. También se acopla a los receptores neuronales de la serotonina y la
histamina.
3. Antiagregante plaquetario (impide o dificulta la coagulación sanguínea).
4. Antipirético: La fiebre es una alteración de los mecanismos reguladores de la homeostasis
de un organismo, es una reacción ante la presencia de la presencia de agentes externos
patógenos o disfunciones fisiológicas internas. El ácido acetilsalicílico actúa como
vasodilatador y ayuda a la disminución de la temperatura. El efecto antipirético es
selectivo, es decir, sólo se presenta cuando el organismo presenta síntomas de febrícula ya
que esta viene mediada también por la presencia de prostaglandinas. (Windholz, 1983)
Los mecanismos biológicos para la producción de la inflamación, dolor o fiebre son muy
similares. En la zona de la lesión se generan prostaglandinas que informan al sistema nervioso
central de la agresión y se ponen en marcha los mecanismos biológicos de la inflamación, el dolor o
la fiebre.(Abbas, 2008) En 1971 el farmacólogo británico Sir John R. Vane, describió el mecanismo
de acción de la Aspirina, es decir, demostró que el ácido acetilsalicílico actúa interrumpiendo los
mecanismos de producción de las prostaglandinas intensificadoras del dolor y tromboxanos. (Ruíz,
2006) La capacidad de la aspirina de suprimir la producción de prostaglandinas y tromboxanos se
debe a la inactivación irreversible de la ciclooxigenasa (COX), enzima que es requerida para la
síntesis de esas moléculas proinflamatorias. La acción de la aspirina produce una acetilación de un
residuo de serina situado en el sitio activo de ambas isoformas de COX. (Graciani, 2007)
El ácido acetil salicilico es un inhibidor no selectivo de ambas isoformas de la ciclooxigenasa:
COX-1 y COX-2. La aspirina inhibe irreversiblemente a la COX-1 y modifica la actividad
enzimática de la COX-2. Tanto la COX-1 como la COX-2 catalizan una reacción como
ciclooxigenasas en la que el ácido araquidónico (AA) y dos moléculas de oxígeno molecluar (O2)
se convierten en prostaglandina tipo G2 (PGG2) y otra reacción en la que la PGG2 se reduce a
PGH2, que a continuación podrá ser convertida por diversas isomerasas y sintetasas celulares
específicas en cinco tipos de prostaglandinas biológicamente activas. Estas dos reacciones se
producen en sitios distintos pero interconectados estructural y funcionalmente. (Praveen, 2008)
33
Producción industrial de ácidos orgánicos
Imagen 8: Biosíntesis de PG y acción de la Aspirina en ella.
Desde hace tiempo se sabe que las prostaglandinas se comportan como importantes
mediadores fisiológicos y patológicos implicados en procesos como la inflamación, el dolor, la
fiebre, incluso el cáncer, la disfunción sexual masculina, la osteoporosis, o enfermedades
cardiovasculares y asma. (Abramovitz, 1998). De aquí deriva el gran abanico de posibilidades
terapéuticas que puede presentar una sustancia capaz de modular la síntesis de prostaglandinas
como la Aspirina.
Algunos de los efectos beneficiosos del ácido acetil salicílico se basan en la acetilación de la
COX-2, pero de la acetilación de la isoforma COX-1 derivan efectos adversos, por ejemplo
generación de úlceras. Debido a esto, los AINEs más recientes se han desarrollado para inhibir la
COX-2
exclusivamente
(AINEs
selectivos)
para
reducir
así
los
efectos
secundarios
gastrointestinales de la inhibición de la COX-1 y potenciar el poder antiinflamatorio y analgésico.
(Praveen, 2008)
34
Producción industrial de ácidos orgánicos
La aspirina es más eficaz reduciendo el dolor leve o de moderada intensidad por medio de sus
efectos sobre la inflamación y porque es probable que pueda inhibir los estímulos del dolor a nivel
cerebral subcortical. Posee además un efecto antipirético, pues reduce la fiebre, mientras que la
temperatura normal del cuerpo solo se ve ligeramente afectada con la administración del
medicamento. Los efectos antipiréticos de la aspirina probablemente son mediados tanto por la
inhibición de la COX en el sistema nervioso central y por la inhibición de la Interleucina-1, el cual
es liberado por los macrófagos durante los episodios de inflamación. (Katzung, 2007)
A dosis bajas de aspirina, se da un efecto antiplaquetario, produciendo una leve prolongación
en el tiempo de sangrado, se duplica si la administración de la aspirina continúa por una semana. El
cambio se debe a la inhibición irreversible de la COX de las plaquetas, por lo que se mantiene
durante toda la vida de las mismas (entre 8 y 10 días). Esa propiedad anticoagulante hace que la
aspirina sea útil en la reducción de la incidencia de infartos en algunos pacientes. Una dosis de
40 mg de aspirina al día es suficiente para inhibir una proporción adecuada de tromboxano A2, sin
que tenga efecto inhibitorio sobre la síntesis de prostaglandina I2, por lo que se requerirán mayores
dosis para surtir efectos antiinflamatorios. (Praveen, 2008)
Además, hay estudios epidemiológicos que sugieren que el uso a largo plazo de la aspirina a
bajas dosis se asocia con una reducción en la incidencia del cáncer colorrectal (tiene capacidad de
inhibir la COX de manera irreversible, siendo especialmente importante la COX-2, la cual se
encuentra sobreelevada en esta neoplasia, evitándose así la producción de PGs implicadas en la
carcinogénesis) (Graciani, 2007) así como el cáncer de pulmón, posiblemente por su asociación con
efectos inhibitorios sobre la COX producida por adenocarcinomas, efectos supresores de
prostaglandinas o incluso efectos directamente antimutagénicos.( Moysich, 2002 )

Producción industrial de ácido salicílico
Antaño, el ácido salicílico, se extraía de la corteza del sauce como ya se ha comentado, pero
dado el periodo de generación de esta planta y la facilidad de su síntesis química, es ésta última la
que se emplea para su producción.
35
Producción industrial de ácidos orgánicos
La producción de ácido salicílico se suele llevar a cabo en discontinuo, aunque también puede
hacerse en continuo, trabajando con una solución de fenolato de sodio en fenol, alcoholes, dialquil
cetonas o nitrobenceno y usando gasolina como dispersante.
En primer lugar, el fenol se mezcla con una disolución acuosa de hidróxido sódico caliente (12% en exceso molar), calentándose la mezcla del producto de reacción resultante a temperaturas por
encima de los 165 º C, evaporándose en un autoclave, o bien en un molino de bolas especial. Así se
produce fenolato sódico, en forma de polvo muy seco. (Wolff, 1988)
Después de un riguroso secado la temperatura se reduce a unos 100ºC, y se introduce al
autoclave CO2 seco (con menos de 0'1% de O2, para evitar decoloración),a una presión de 5 bares.
Cuando la cantidad apropiada se ha absorbido, la carga se calienta a 150 - 170ºC durante varias
horas, para convertir el fenolato en salicilato sódico. . (Wolff, 1988)
Se deja enfriar el producto de la reacción y se lleva a un tanque de tratamiento, donde se
disuelve con una cantidad aproximadamente igual de agua, se filtra, y se decolora con carbón activo
que contiene partículas de zinc. Se lleva a otro tanque de precipitación, añadiéndole sulfúrico para
precipitar el ácido salicílico.
36
Producción industrial de ácidos orgánicos
El precipitado se centrifuga y a continuación seca, obteniéndose ácido salicílico de alta
pureza.
Imagen 9.: Diagrama de flujo de la producción del Ác. Salicílico realizado con el programa Aspen Plus
Para la producción industrial de Ácido Acetilsalicílico, el modo de operación sigue siendo
principalmente discontinuo. El ácido salicílico y el anhídrido acético se alimentan a un reactor de
acero inoxidable. La temperatura debe mantenerse a menos de 98ºC, con buen control de
temperatura y la presión a lo largo del ciclo. Tras dos o tres horas, la masa de reacción se bombea a
un filtro, y de allí a un cristalizador, donde se mantiene a 0ºC. La suspensión obtenida se centrifuga,
y el producto se cristaliza, se lava y se seca (0'5% humedad). De este modo, el rendimiento de la
reacción alcanza valores de aproximadamente el 90%. (Handal-Vega, 2001)
37
Producción industrial de ácidos orgánicos
Imagen 10: Diagrama de flujo de la producción de Aspirina realizado con Aspen Plus
38
Producción industrial de ácidos orgánicos
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