PRINCIPIOS DE DISEÑO EXPERIMENTAL Dairo Javier Pérez Polo, M.Sc. [email protected] Docente catedrático Universidad de Córdoba – Montería, Colombia ¿QUÉ ES UN DISEÑO DE EXPERIMENTAL? Según Montgomery (2011), un diseño experimental es una prueba o serie de pruebas en las cuales se hacen cambios deliberados en algunas variables que puedan afectar un proceso o sistema, de tal forma que el investigador tenga la posibilidad de observar las razones que explican los cambios en la respuesta estudiada. El proceso o sistema de un experimento se puede representar mediante el modelo de la figura 1. Este proceso se puede visualizar como entradas o estímulos donde se promueven cambios sobre algún insumo en un producto que tiene una o más salidas (y) o variables respuesta. Algunas variables del proceso son controlables (X1, X2, …, Xn), mientras que otras variables no son controlables (Z1, Z2, …, Zm). Figura 1. Modelo general de un proceso o sistema En experimentos agrícolas, las entradas pueden ser las variedades de un cultivo, las dosis de un fertilizante y los arreglos y/o densidades de siembra. Estas entradas producen un efecto sobre el material experimental, el cual se manifiesta en respuestas que son registradas con variables de tipo cualitativa o cuantitativa. Estas variables están asociadas con el crecimiento y desarrollo, respuesta fisiológica, producción y sanidad. Durante el experimento, la respuesta del material experimental se puede ver afectada por factores controlables y no controlables. Los factores controlables se pueden manejar con el establecimiento del experimento en condiciones de estricto control ambiental y de agentes biológicos como laboratorios, invernaderos y cuartos de crecimiento; también con la formación de bloques. Por otra parte, los factores no controlables pueden obedecer a factores ambientales o no determinados por el investigador, pero si son identificados y medida su respuesta puede usarse un análisis de covarianza para determinar los efectos de este factor sobre la respuesta. APLICACIÓN DEL DISEÑO EXPERIMENTAL Estas son algunas de las aplicaciones del diseño experimental en las ciencias agrícolas: Obtención y liberación de genotipos mejorados Optimización de recursos en sistemas productivos Diseño o rediseño de nuevas tecnologías. BREVE HISTORIA DEL DISEÑO EXPERIMENTAL Han existido cuatro eras en el desarrollo del diseño de experimentos. La primera era fue encabezada por el Estadístico y Biólogo, Sir Ronald A. Fischer enntre la década de 1920 y principios de 1930, quien después de ser responsable de las estadísticas y el análisis de datos en la Estación Agrícola Experimental de Rothamsted (Londres, Inglaterra), se percató de fallas en la forma en que se llevaban a cabo los experimentos. Después de la interacción con múltiples científicos e investigadores de diversos campos, desarrolló las ideas que llevaron a los principios del diseño de experimento, el concepto de diseño factorial y el análisis de varianza, siendo esta última su más importante contribución. La segunda era, o era industrial, se enfocó en la aplicación del diseño estadístico en ambientes industriales en la década de 1930, donde se desarrolló la metodología de superficie de respuestas por Box y Wilson. La tercera era fue influenciada en 1970 por el interés creciente de la industria occidental en el mejoramiento de la calidad. Los actores de esta era fueron Genichi Taguchi y Kackar. Taguchi defendía el uso de experimentos diseñados, para lo que denominó el diseño paramétrico robusto. En la cuarta y última era, se desarrollaron nuevos enfoques para resolver problemas experimentales en el mundo industrial, incluyendo alternativas a los métodos técnicos de Taguchi que permiten que sus conceptos de ingeniería se lleven a la práctica de manera eficaz y eficiente. FASES DEL DISEÑO EXPERIMENTAL Planteamiento del problema Escogencia de los factores y niveles Selección de la variable respuesta Selección del diseño experimental Ejecución del experimento Análisis de datos Interpretación de resultados Conclusiones y recomendaciones VOCABULARIO DEL DISEÑO EXPERIMENTAL A continuación, se definen algunos términos fundamentales para el desarrollo del curso, estos son: Unidad experimental (UE): Es la parte más pequeña del material experimental a la cual se le puede aplicar un tratamiento. Es por tanto, el objeto sobre el que se realiza una medición u observación. En agronomía, una UE puede ser una matera, una parcela, una caja de Petri, una finca o una región geográfica. En medicina, puede ser una persona, un animal, un hospital, un grupo de diez camas con enfermos, etc. La UE puede subdividirse en unidades de muestreo (UM) o unidades observacionales (UO). Si una parcela tiene varios cientos de plantas, la unidad de muestreo podría ser un conjunto de diez plantas seleccionadas al azar o la cosecha de tres surcos centrales de una unidad experimental de cinco surcos para estimar el rendimiento. Variables independientes: Son las variables explicativas, es decir, los factores o elementos responsables de explicar las variables dependientes. Variable dependiente o respuesta: Es la característica observada o medida en cada unidad experimental. En resumen, el cambio de los valores de una variable dependiente es el resultado directo de la manipulación de los valores de una o varias variables independientes. Una variable independiente puede ser un genotipo y la dependiente su rendimiento. Factor: Es una variable independiente dentro de la investigación. Es un conjunto de tratamientos que se pueden aplicar a las unidades experimentales, generalmente se pueden denotar con las letras mayúsculas (A, B, C, …, Z) o con las iniciales de los factores a probar. Los factores pueden ser cualitativos (variedades, razas, métodos de aplicación de un producto, etc.) o cuantitativos (cantidad de fertilizante, insecticida u hormona; temperatura, etc.). Existen experimentos unifactoriales y multifactoriales. En los multifactoriales se pueden evaluar simultáneamente dos factores, como genotipo y fertilización; o tres factores como genotipo, fertilización y época de aplicación. Niveles del factor: Un nivel es cada uno de los atributos o estados en que se descompone un factor. Por lo general se denotan con la letra minúscula. Si el factor es nitrógeno (N), los niveles serían las dosis de 0, 50 y 100 kg/ha: n0, n50 y n100. Tratamiento: Es el procedimiento cuyo efecto se mide y se compara con otros tratamientos. Un tratamiento es un nivel de un factor cuando el experimento es unifactorial y la combinación de los niveles de un factor en estudios multifactoriales. Testigo, tratamiento patrón o control: Es un tratamiento de referencia usado para comparaciones con los tratamientos de interés. Existen diferentes tipos de testigo: absoluto, relativo, positivo y negativo. El testigo absoluto se caracteriza por la ausencia de un factor (dosis cero de un abono). El testigo relativo es un tratamiento definido a partir de la información de otras investigaciones o de la tecnología disponible en la zona de estudio; por ejemplo, variedades tradicionales, espaciamiento común usado por los agricultores, plan de fertilización de los productores, etc. El testigo positivo y negativo son tratamientos de comprobada respuesta; por ejemplo: en un cultivo de bacterias en cajas de Petri, se usa como testigo positivo un antibiótico para comprobar la eficacia de los tratamientos y como testigo negativo una caja de Petri sin antibióticos. Bloque: Es un grupo de unidades experimentales homogéneas, con el fin de reducir el error experimental. Dato: Es el resultado de las observaciones o mediciones hechas en cada UE y su conjunto conforman la base de datos para hacer los cálculos estadísticos. Residuales: Son las diferencias entre los valores de las repeticiones y su respectivo promedio. PRINCIPIOS BÁSICOS DE DISEÑO EXPERIMENTAL La obtención de resultados validos en la experimentación depende de la aplicación de algunos principios básicos, que ignorados por el investigador podrían conducir a resultados atribuidos a causas distintas de los tratamientos. Estos principios son: repetición, aleatorización y control local o bloqueo. Repetición: Los tratamientos deben disponer de repeticiones, ya que sin los datos que estas suministran, será imposible realizar pruebas de significancia e intervalos de confianza sobre los tratamientos, siendo los resultados atribuidos a fuentes distintas a los tratamientos (Pimentel-Gomes, 2009; Montgomery, 2011). Por ejemplo, en un estudio sobre el comportamiento de dos variedades de algodón, donde se estableció una parcela para cada material, los resultados señalan diferencias sobre el rendimiento de las variedades, sin embargo, esta respuesta más allá de la genética, puede ser atribuida a la fertilidad del suelo o cualquier otro factor. Ahora, estos resultados se pueden mejorar si en lugar de una parcela por cada variedad se establecen varias parcelas o repeticiones, haciendo posible estimar y comparar el rendimiento promedio de cada variedad. Entre otras aplicaciones de la repetición, se resalta su papel en la estimación del error experimental y de los intervalos de confianza (Steel y Torrie, 1985). El error experimental es la variación de la respuesta de unidades experimentales bajo el mismo tratamiento (Steel y Torrie, 1985). En el ejemplo de las variedades de algodón, el rendimiento de las repeticiones o parcelas de un material pueden ser: 2,9; 3,1; 3,2 y 2,7 t ha-1. Estos valores nunca serán exactamente iguales, ya que según Steel y Torrie (1985) su variabilidad proviene de la variabilidad intrínseca del material experimental y de la falta de uniformidad en el manejo del experimento. Con el fin de ganar precisión en la estimación de la media de tratamientos e intervalos de confianza más estrechos (mayor poder), se recomienda aumentar el número de repeticiones. Así mismo, tratamientos con igual número de repeticiones para una mayor potencia, es decir, la seguridad de encontrar diferencias significativas entre tratamientos cuando la hipótesis alternativa es verdadera (Steel y Torrie, 1985; Díaz, 2009). Aleatorización: La asignación de los tratamientos a las unidades experimentales, así como el orden de estos dentro del experimento, debe ser realizado mediante la aleatorización; si este procedimiento es practicado por conveniencia del investigador, los resultados del experimento pueden ser explicados por factores distintos a los tratamientos (Pimentel-Gomes, 2009). En el experimento de algodón, si las parcelas de cada variedad fueron establecidas en sitios diferentes, la respuesta del rendimiento se puede explicar por la diferencia en la fertilidad del suelo. En experimentos agrícolas, existe una fuerte dependencia en el error experimental de observaciones de parcelas adyacentes, situación prevenida con la aleatorización de los tratamientos, dado que este procedimiento distribuye el error experimental de forma independiente entre las unidades experimentales (Steel y Torrie, 1985). La aleatorización también asegura la distribución homogénea entre los tratamientos de las pequeñas variaciones de las unidades experimentales (Gutiérrez y De la Vara, 2012). El procedimiento de aleatorización se puede realizar con el apoyo de números aleatorios, programas estadísticos o cualquier otro mecanismo que determine el investigador. La aleatorización puede experimentar algunas restricciones cuando se identifican factores perturbadores, como en el caso del bloqueo. Control local o bloqueo: En algunos casos, el investigador identifica un factor perturbador que puede influir sobre la respuesta del experimento (Montgomery, 2011). En experimentos agrícolas, este factor puede estar asociado con la heterogeneidad del suelo y el tiempo. El bloqueo aumenta la precisión de la comparación de tratamientos, mediante la agrupación de unidades experimentales en bloques de condiciones uniformes, que varían entre los niveles del factor de bloqueo (Montgomery, 2011). En el caso del ejemplo de algodón, se pueden establecer bloques de igual nivel de fertilidad, donde se establecen parcelas con los niveles de los tratamientos. En el bloqueo, la aleatorización es restringida a los bloques, es decir, los niveles de los tratamientos son aleatorizados dentro de cada uno de estos. PRINCIPIOS DEL ANÁLISIS DE VARIANZA El análisis de varianza (ANAVA) es una técnica que descompone la variabilidad de los datos de un experimento en diferentes fuentes (cuadrados medios), donde con la aplicación de una prueba F se determina la relación entre la variabilidad de las fuentes de interés y el error experimental, con la cual se toman decisiones que conducen a aceptar o rechazar una hipótesis. El ANAVA se clasifica de acuerdo al número de factores experimentados en análisis de varianza de una o varias vías. En una vía, se experimenta un solo factor. En dos vías, se analizan dos factores, siendo un factor experimental y el otro de bloqueo, como en el diseño en bloques completos al azar. En tres vías, se analizan tres factores, siendo uno experimental y dos de bloqueo, como en el caso del diseño cuadrado latino; también aplica para un diseño completamente al zar con arreglo trifactorial. En el análisis de varianza existen dos modelos: tipo I y tipo II. En el modelo tipo I, los tratamientos de una población son escogidos a conveniencia del investigador; por ejemplo, en una región se disponen de 20 variedades de maíz, sobre las cuales el investigador escoge para el estudio los materiales más susceptibles a un patógeno y al menos un material tolerante como testigo. Por otra parte, en el modelo tipo II (o de efectos aleatorios), los tratamientos son escogidos al azar de una población; en el ejemplo de maíz, los materiales son escogidos al azar de la población de las 20 variedades. La escogencia del modelo se traduce en el alcance de las conclusiones, dado que en modelo tipo I estas se limitan a los tratamientos seleccionados y en el modelo tipo II, a cualquier tratamiento de la población en estudio. En este documento se hará énfasis sobre el análisis de varianza simple o de una vía, cuyo objetivo es la comparación de dos o más tratamientos y hace parte del diseño completamente al azar (DCA). En este análisis de varianza, la hipótesis a probar es la siguiente: H 0 : 1 2 3 ... n Hi : i 0 La hipótesis nula (H0), establece que no existe ningún efecto de los tratamientos (τ i) sobre la respuesta. En contraste, la hipótesis alternativa (Hi) establece que por lo menos un tratamiento influyó sobre la respuesta. Existen otras formas de plantear las hipótesis, donde se toma como referencia la media poblacional (μ) de los tratamientos. Antes de realizar el análisis de varianza es importante entender el arreglo de los datos, los cuales se disponen bajo una estructura matricial, tal como se aprecia en la siguiente tabla: Repetición 1 2 . . . j . . . r Totales Medias Varianzas T1 y11 y21 . . . yj1 . . . yr1 y1. 𝑦̅1. 𝑠12 T2 y12 y22 . . . yj2 . . . yr2 y2. 𝑦̅2. 𝑠22 Tratamientos … Ti … y1i … y2i . . . . . . … yij . . . . . . … yri … yi. … 𝑦̅𝑖. 𝑠𝑖2 … … … … . . . … . . . … … … … Tk y1k y2k . . . yjk . . . yrk yk. 𝑦̅𝑘. 𝑠𝑘2 Como ejemplo de un análisis de varianza de una vía, se tomarán los datos (no mostrados) de un estudio sobre la respuesta de la masa seca de albahaca (Ocinum bacilicum L.) en función de cuatro tratamientos o mezclas de N y K (Combatt et al. 2020), cuya hipótesis a probar es la siguiente: H 0 : 1 2 3 ... 14 Hi : i 0 En el análisis de varianza de la siguiente tabla, se descompone la variabilidad de los datos en dos fuentes: cuadrado medio de los tratamientos (CMTrat.) y cuadrado medio del error experimental (CMEE), cuyos valores fueron 2723,0 y 33,2, respectivamente. Fuente de Grados de variación libertad Tratamiento 3 Error experimental 8 Total 11 Fuente: Combatt et al. (2019). Suma de Cuadrado F cuadrados medio 2723,0 907,7 218,8* 33,2 4,1 2756,2 F0,05 4,07 Mediante una prueba F se determina la relación entre estos cuadrados medios (218,8), la cual se confronta con el valor tabulado de esta distribución. En este caso, el valor de la tabla con un nivel de significancia del 5% fue de 4,07. Ahora, esta confrontación se debe realizar bajo la siguiente regla de decisión: Rechazar H0, si F F (v1,v 2) Dónde: : Nivel de significancia; 1 : Grados de libertad de los tratamientos; 2 : Grados de libertad del error experimental. Con base en los resultados, se rechaza la hipótesis nula (H0), ya que F 218,8 F0,05(3,8) 4,07 . Es decir, que por lo menos una combinación de N y K produjo un efecto diferente sobre la masa seca de albahaca, o bien, la masa seca de la albahaca respondió a los efectos de las combinaciones de las dosis de N y K. En el capítulo de diseño completamente al azar se darán más detalles sobre el cálculo de las fuentes de variación. En cuanto a los niveles de significancia, en agronomía es común tomar como referencia los niveles del 1% ( F0,05 ) y 5% ( F0, 01 ) para la toma de decisiones. Sin embargo, al momento de utilizar los programas estadísticos, el ANAVA no reporta los valores tabulados si no un p-valor, la cual es la mínima probabilidad de detectar diferencias significativas en las pruebas. Los criterios para tomar una decisión con base al p-valor se muestran a continuación: p-valor p>0,10 Decisión Representación No existen diferencias significativas en la ns prueba. 0,05≤p≤0,10 Diferencias al 10% en la prueba. · 0,01<p<0,05 Diferencias significativas al 5% en la * prueba. 0,001<p< 0,01 Diferencias altamente significativas al 1% ** en la prueba. p<0,001 Diferencias altísimamente significativas al *** 0,1% en la prueba. Fuente: Elaboración propia. Supuestos del análisis de varianza La validez de los resultados del análisis de varianza y de las pruebas posteriores, como la comparación de medias y la estimación de intervalos de confianza, dependen del cumplimiento de varias condiciones (Steel y Torrie, 1985; Díaz, 2009). Estas condiciones reciben el nombre de supuestos del análisis de varianza y son las siguientes: normalidad, homogeneidad de varianzas e independencia del error experimental. Normalidad: En este supuesto, los residuales de las observaciones se distribuyen de forma normal (forma de campana). La normalidad de los residuales se puede comprobar mediante la prueba de Shapiro-Wilks, Kolgomorov- Smirnov y Lilliefors. H0: Los datos proceden de una distribución normal Hi: Los datos no proceden de una distribución normal 1 k W X n i 1 X i 2 n 1S i 1 2 Con el ejemplo de albahaca se debe iniciar calculando la siguiente tabla para k calcular X i 1 n i 1 X i : ai i 1 2 3 4 5 6 W 0,5475 0,3325 0,2347 0,1586 0,0922 0,0303 X ( ni ) 1 X (i ) 39,02 35,81 30,52 27,22 24,00 20,29 Suma ai X ( ni )1 X (i ) 21,36 11,91 7,16 4,32 2,21 0,61 47,58 1 47,582 0,82 12 1250,56 W1 W10,05 W0,95 0,979 Como W es menor que W 0,95=0,979, se acepta H0, lo que indica que los datos proceden de una distribución normal. Homogeneidad de varianzas (homocedasticidad): Como su nombre lo indica, es la igualdad de las varianzas de los tratamientos experimentados. Esta condición no siempre se cumple en experimentos agrícolas, afectando la estimación de los intervalos de confianza y las pruebas de comparación de medias. Los procedimientos sugeridos para verificar la homogeneidad de las varianzas son: la prueba de Bartlett, Levene modificada y Hartley. A continuación, se describe el procedimiento de la prueba de Bartlett para el ejemplo de albahaca: H 0 : 12 22 ... k2 2 H 1 : 12 2j para algún i ≠ j 0,46 0,88 1,21 q c 02 2,3026 2,3026 k q N k log 10 S p2 (ni 1) log 10 S i2 i 1 k S p2 n i 1 1 S i2 1 i N k 2(5,42) 2(3,81) 2(5,95) 2(1,42) 4,15 12 4 q 8 log 10 (5,42 ) 2log 10 (3,81) log 10 (5,95 ) log 10 (1,42 ) 0,46 c 1 1 k ni 11 N k 1 1 1 1 4 1 1,21 3k 1 i 1 3(3) (3 1) 8 (2 ,k 1) (20,05,3) 7,81 Como 02 0,88 (20,05,3) 7,81 , se acepta H0, por lo tanto las varianzas de los tratamientos son homogéneas. Independencia de los residuos: En este supuesto, no debe existir dependencia o correlación entre los residuales de observaciones de parcelas adyacentes o en el orden de su recolección. Esta condición se alcanza cuando se cumple con el principio de aleatorización y se puede verificar con la prueba de Durwin-Watson. Los supuestos deben ser verificados antes de realizar el análisis de varianza. Cuando alguno de estos es violado (normalidad e independencia), el investigador puede aplicar transformaciones sobre los datos y nuevamente verificar los supuestos. Si las transformaciones no son efectivas, el investigador puede recurrir a pruebas no paramétricas, que tienen como desventaja una menor potencia, también a técnicas permutaciones que se basan en remuestreo. TAXONOMIA DE DISEÑO EXPERIMENTAL Woodward et al. (1990) establecen una taxonomía de diseño experimental definida por la combinación de tres arreglos de los tratamientos y tres asignaciones de diseño, para un total de ocho diseños experimentales genéricos, tal como se aprecia en la siguiente tabla: Arreglo de los tratamientos Factor Simple Factorial Completo Factorial Incompleto (FS) (FC) (FI) Completamente Completamente al Completamente al Completamente al aleatorio (CA) azar con factorial azar con factorial azar con factorial simple (CA-FS) completo (CA-FC) incompleto (CA-FI) Bloque aleatorio Bloques completos Bloques completos Bloques completos al (BA) al azar con al azar con factorial azar con factorial factorial simple completo (BA-FC) incompleto (BA-FI) (BA-FS) Parcelas divididas Parcelas divididas Parcelas divididas con ------(PD) con factorial factorial incompleto completo (PD-FC) (PD-FI) Asignación de diseño Los arreglos de tratamientos pueden ser los siguientes: Factorial simple (FS): Se refiere a un solo factor con varios niveles o tratamientos. Factorial completo (FC): Consiste en todas las posibles combinaciones de dos o más factores, donde cada factor tiene al menos dos niveles. Factorial incompleto (FI): En este arreglo se excluyen algunas combinaciones de tratamientos definidas en el arreglo factorial completo. En cuanto a la asignación del diseño, se definen los siguientes: Completamente al azar (CA): Los tratamientos son asignados aleatoriamente, sin ninguna restricción, siendo las unidades experimentales consideradas un solo bloque. Bloques al azar (BA): Las unidades experimentales son agrupadas en dos o más bloques homogéneos, donde la aleatorización de los tratamientos se restringe a cada uno de los niveles del factor de bloqueo. Los bloques pueden representar los niveles de un simple factor de bloqueo o la combinación de los niveles de dos o más factores de bloqueo. En este sentido, si existen dos factores de bloque se habla de un cuadrado latino y de tres de un grecolatino. Parcelas divididas (PD): En este diseño, la aleatorización se realiza en dos pasos. En el primer paso, se aleatorizan los niveles del primer factor, llamado parcela principal; y en el segundo paso, dentro de cada nivel se aleatorizan los niveles del segundo factor, llamado subparcela. El diseño de parcelas divididas puede ser aplicado a un simple factor de bloqueo o múltiples bloques. BIBLIOGRAFÍA Combatt-Caballero, E., Pérez-Polo, D., Villalba-Arteaga, J., Mercado-Lázaro, J., & Jarma-Orozco, A. (2020). Macronutrientes en el tejido foliar de albahaca Ocimum basilicum L. en respuesta a la aplicación de nitrógeno y potasio. Revista UDCA Actualidad & Divulgación Científica, 23(2). Díaz, A. 2009. Diseño estadístico de experimentos. Segunda edición. Editorial Universidad de Antioquia. Medellín. Escobar, J., Amézquita, M., Muñoz, J., García, J. 2009. Manual de capacitación en Biometría para la experimentación en frijol. Universidad Nacional de Colombia sede Palmira. Gutiérrez, H., De la Vara, R. 2012. Análisis y diseño de experimentos. Tercera edición. McGraw Hill. México D.F. Martínez, O. 2009. Técnicas estadísticas y diseño de experimentos para la investigación agropecuaria. Produmedios. Bogotá. Montgomery, D. 2011. Diseño y análisis de experimentos. Segunda edición. Limusa – Wiley. México D.F. Pimentel-Gomes, Frederico. (2009). Curso de estatística experimental. Piracicaba: Biblioteca de Ciências Agrárias Luiz de Queiroz. 15ª edicao Steel, R. y Torrie, J. 1988, Bioestadística: Principios y Procedimientos. Segunda edición. McGraw Hill. México D.F. Woodward, J., Bonett, D., Brecht, ML. (1990). Introduction to linear models and experimental design. San Diego: Harcourt Brace Jovanovich.
