Tecnológico Nacional De México Instituto Tecnológico De La Paz Metabolismo la bacteria Carboxydothermus hydrogenoformans Departamento De Ingenierías Ingeniería Bioquímica Mauricio Salvador Rodríguez Ojeda Bioquímica Grupo D Hernandez Hernández Yesenia Patricia, 17310328 [email protected] Hernández Rodríguez Víctor Emmanuel, 17310387 [email protected] La Paz BCS, A Lunes 27 De Mayo Del 2019 TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICO «Ciencia es verdad, técnica es libertad» Enero-Junio 2019 (S4) Instituto Tecnológico de La Paz Departamento de Ingenierías, Ingeniería Bioquímica [Proyecto asignatura] Resumen La bacteria Carboxydothermus hydrogenoformans es un organismo anaerobio y acuático que vive en entornos de agua dulce y experimenta un crecimiento óptimo arriba de los setenta grados centígrados; esta bacteria de la familia Thermoanaerobacteraceae y del genero Carboxydothermus cuenta con un metabolismo que consiste en procesos fermentativos, realiza la acetogénesis debido a que su ultimo aceptor de electrones es una molécula inorgánica; genera la conversión de CO y H 2O a H2 y CO2. La bacteria primeramente fija el CO2 produciendo acetil-CoA para la síntesis de materia celular a través de la ruta de Wood-Ljungdahl para después utilizar el acetil-CoA junto al gliceraldehido-3-fosfato intermediario saliente de la glucolisis, formando la ruta heterofementativa para la transformación de piruvato en otros precursores, por medio de fermentaciones, como etanol y lactato quienes serán mandados a la cadena junto con el NAD+ formado en el proceso a la cadena transportadora de electrones para la síntesis de ATP por la ATPas, teniendo como último aceptor de electrones al CO2. A partir de las variaciones en el metabolismo es que la importancia de esta bacteria termofílica se da principalmente por su capacidad de convertir el monóxido de carbono venenoso en dióxido de carbono e hidrógeno; desempeñando de esta forma un papel importante en la desintoxicación del medio ambiente brindando una fuente de carbono no tóxico, así como gas hidrógeno. Palabras clave: Carboxydothermus, acetogénesis, Wood-Ljungdahl, fermentación, anaerobio. 2 ITLP – Ingeniería Bioquímica [2019] TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICO «Ciencia es verdad, técnica es libertad» Enero-Junio 2019 (S4) Instituto Tecnológico de La Paz Departamento de Ingenierías, Ingeniería Bioquímica [Proyecto asignatura] Índice Introducción 4 Objetivo 5 Taxonomía y clasificación 6 Metabolismo de carbohidratos y formación de ácidos grasos 6 Ruta de Wood–Ljungdahl 7 Ciclo del ácido cítrico y Glucolisis 8 Fermentación 9 Fosforilación oxidativa 10 Acarreadores de electrones 10 Cadena transportadora de electrones 11 Regulación de síntesis de ATP. 13 Regulación del metabolismo 13 Conclusión 14 Referencias 15 Índice de figuras Figura 1 Micrografía electrónica de una endospora de C. hidrogenoformans 5 Figura 2 12 Fosforilación Oxidativa de bacteria C. hydrogenoformans Índice de Tablas Tabla 1 Taxonomía y morfológica de bacteria Carboxydothermus Hydrogenoformans, 6 clasificación y fisiología. 3 ITLP – Ingeniería Bioquímica [2019] TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICO «Ciencia es verdad, técnica es libertad» Enero-Junio 2019 (S4) Instituto Tecnológico de La Paz Departamento de Ingenierías, Ingeniería Bioquímica [Proyecto asignatura] Introducción Las bacterias son los organismos más pequeños que cuentan con la capacidad de crecimiento y replicación; se encuentran provistos de una única célula procariota la cual contrasta de la eucariota por la falta de un núcleo definido y de orgánulos internos, sin embargo si cuenta con estructuras complejas como son la membrana citoplasmática y pared celular de peptidoglicano compuesta por proteínas, polisacáridos, lípidos y ácidos nucleicos (Audesirk,, Audesirk, & Byers, 2013; Alberts, Wilson & Hunt, 2009). Las bacterias junto con las algas y algunos hongos protozoos son los organismos que representan la mayor parte de los seres vivos de la tierra, algunos estudios estiman que durante los primeros 2000 a 2500 millones de años de vida en la tierra esta se encontró poblada exclusivamente por comunidades de bacterias que a través de la evolución lograron cambiar las condiciones de la tierra favoreciendo así, la posterior aparición de organismos más complejos (Audesirk,, Audesirk, & Byers, 2013; Karp, Patton, Pinto & Ruiz, 2014). La diversidad bacteriana es tan amplia que el conocer tanto su fisiología como metabolismo nos ha abierto las puertas a diversas aplicaciones prácticas. El metabolismo bacteriano es similar al de la mayoría de los seres vivos, siendo el anabolismo la manera en que la bacteria sintetiza sus propios componentes resultando en la producción de nuevo material celular y el catabolismo el conjunto de reacciones degradativas para la obtención de nutrientes ya sea con fines de producción de energía o de unidades precursoras de la biosíntesis. De esta forma es que para las bacterias, existe una gran diversidad metabólica que depende de las características de la especie de bacteria (Gama. 2009; Esterl, & Brandt, 2011). Por ejemplo, el tipo de bacteria de los hydrogenoformans, son organismos acuáticos que viven en entornos de agua dulce y experimentan un crecimiento óptimo a temperaturas de alrededor de setenta grados centígrados. Esta bacteria es única e importante porque vive a temperaturas muy altas, por lo que reciben el nombre de termófilas; lo que le permite crecer rápidamente en ambientes acuáticos con alto contenido de monóxido de carbono, vive completamente de monóxido de carbono y también convierte el agua en hidrógeno a través de la oxidación del monóxido de carbono para formar dióxido de carbono (Henstra & Stams, 2011). Un derivado de este tipo de organismo es la Carboxydothermus hydrogenoformans, quien es una bacteria Gram positiva, esto quiere decir que cuenta con una gruesa pared celular compuesta por peptidoglicano; a su vez este organismo es una bacteria termófila que crece a grandes temperaturas, en tierra lo hace a temperaturas mayores de 65°C mientras que en ambiente acuático a mayores de 45°C. Se aisló por primera vez de aguas termales de agua dulce en la isla volcánica rusa de Kunashir; es una bacteria anaerobia obligada, que no se puede desarrollar en presencia de oxígeno, razón por la cual es común encontrar en el fondo de lagos o en lo alto de las montañas específicamente, en las que cuentan con fuentes termales, donde se alimente de CO2 y H2O, desechando como producto H2 (Henstra & Stams, 2011). 4 ITLP – Ingeniería Bioquímica [2019] TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICO «Ciencia es verdad, técnica es libertad» Enero-Junio 2019 (S4) Instituto Tecnológico de La Paz Departamento de Ingenierías, Ingeniería Bioquímica [Proyecto asignatura] Esta es una bacteria que al ser anaerobia cuenta con un metabolismo del tipo fermentativo debido a que su último aceptor de electrones es una molécula inorgánica, por esta característica es que se considera como bacteria acetogénica, por el tipo de fermentación que lleva a cabo (Ferrier, Ortiz & Salazar, 2018; Mckee, 2014). El genoma de Carboxydothermus hydrogenoformans ha sido completamente secuenciado, y se considera muy singular porque tiene genes que codifican cinco complejos distintos de monóxido de carbono deshidrogenasa. Esto, en comparación con un complejo que se encuentra en bacterias similares que crecen en ambientes de monóxido de carbono, puede ser la razón por lo cual la C. hydrogenoformans crece mucho más rápida y eficientemente. Además, la secuenciación y el análisis del genoma de la bacteria han demostrado que incluye genes para producir esporas, que carece de plásmidos y que en situaciones de estrés produce endosporas, como en casos de daño en ADN, niveles bajos de ATP o de densidad celular (Wu, Ren & et al; 2011). Figura 1. Micrografía electrónica de una endospora de C. hidrogenoformans . (Gottschalk, 2012). Los complejos de monóxido de carbono deshidrogenasa de la C. hydrogenoformans tienen distintas funciones, uno de ellos se utiliza en la conservación de energía, otro en la respuesta al estrés oxidativo, mientras que otro participa en la fijación de carbono. A diferencia de la mayoría de los organismos que utilizan una vía de fijación de dióxido de carbono, esta bacteria utiliza una vía de fijación de monóxido de carbono como fuente de carbono (Constanza, Antolinez, Bohórquez & Corredor, 2015). Objetivo Entender y evaluar el metabolismo de la bacteria Carboxydothermus hydrogenoformans; las relaciones de sus rutas catabólicas y anabólicas, así como sus regulaciones; principalmente para la síntesis de ATP, considerando el metabolismo de carbohidratos, la digestión de ácidos grasos, las excepciones del ciclo de Krebs y fosforilación oxidativa de la bacteria anaerobia. 5 ITLP – Ingeniería Bioquímica [2019] TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICO «Ciencia es verdad, técnica es libertad» Enero-Junio 2019 (S4) Instituto Tecnológico de La Paz Departamento de Ingenierías, Ingeniería Bioquímica [Proyecto asignatura] Taxonomía y clasificación Tabla 1. Taxonomía y morfológica de la bacteria Carboxydothermus Hydrogenoformans, clasificación y fisiología. (Foster & Slonczewski 2017). Dominio Bacteria Filo Firmicutes Clase Clostridia Orden Clostridiales Familia Thermoanaerobacteraceae Genero Carboxydothermus Especie Nombre científico completo Designación de la cepa Compuesto producido Tolerancia al Oxigeno Carboxydothermus hydrogenoformans Carboxydothermus hydrogenoformans Svetlichny et al. 1991 Z-2901 H2 Anaerobia Metabolismo de carbohidratos y formación de ácidos grasos El Carboxydothermus hydrogenoformans, es una bacterias anaerobia estrictas, por lo tanto su metabolismo consiste en procesos fermentativos lo cual resulta ser menos eficiente que la respiración, ya que la fermentación no aprovecha toda la energía del sustrato orgánico para la producción del combustible universal de la célula (ATP) ni, por tanto, para la síntesis de material celular (Brooks, Carroll, Butel, Morse & Mietzner, 2011). Una particularidad del Carboxydothermus hydrogenoformans, es que para su metabolismo general realiza tres rutas, una es la conversión de CO y H2O a H2 y CO2, la segunda es la conversión de CO2 y H2O a CO2 y acetato, mientras que la tercera es la conversión de H2 y CO2 a acetato, llamándose a estas rutas acetogénesis (Henstra & Stams, 2011). El ecosistema donde ocurre la acetogénesis comprende pantanos, arrozales, sedimentos de lagos, estanques y estuarios, digestores de aguas residuales, el rumen y el intestino (Ivanov, 2011). En tales ambientes anaeróbicos los sustratos orgánicos son fermentados por diversos microorganismos a acetato, CO2 e H2 y. Estos productos son utilizados por las arqueobacterias formadoras de metano, tal como Methanomicrobium y Methanobrevibacter que se encuentran en el rumen. Dado que el CO2 es usado como un aceptor de hidrógeno generando energía, misma razón por la cual el proceso ha sido llamado respiración del carbonato (Constanza, Antolinez, Bohórquez & Corredor, 2015). 6 ITLP – Ingeniería Bioquímica [2019] TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICO Instituto Tecnológico de La Paz Departamento de Ingenierías, Ingeniería Bioquímica «Ciencia es verdad, técnica es libertad» Enero-Junio 2019 (S4) [Proyecto asignatura] Esta bacteria acetogénica, se enfoca en un esfuerzo por combinar la reducción de gases de efecto invernadero y el calentamiento global con la producción de biocomodidades, puede convertir CO2, H2 y CO en acetil coenzima A (acetil-CoA) como ya se mencionó, la cual es una molécula iniciadora para diversos productos químicos como etanol, acetato, 2,3 butanodiol y butanol. De manera que el CO2, H2 y CO son los componentes principales del gas de síntesis (gas de síntesis) (Henstra & Stams, 2011). Ruta de Wood–Ljungdahl La Carboxydothermus hydrogenoformans se encarga de fijar CO2 produciendo acetil-CoA para la síntesis del material celular, la cual es una bacteria termofílica, y que utiliza la vía reductora del acetil-CoA para la síntesis de glúcidos (Miranda & Rojo, 2013). La vía reductora del acetil-CoA, o también llamada ruta de Wood–Ljungdahl, es un conjunto de reacciones bioquímicas que permite utilizar el hidrógeno como donante de electrones y dióxido de carbono como aceptor, así como principio elemental para la biosíntesis (Tortora, Funke & Case, 2017). Por lo tanto, la capacidad de utilizar CO de la Carboxydothermus hydrogenoformans se basa en el funcionamiento de la vía metabólica de Wood-Ljungdahl. Es una ruta metabólica no cíclica en la que el CO obtenido del ambiente, por medio de la enzima monóxido de carbono deshidrogenasa (ferredoxina)(EC.1.2.7.4) forma el dióxido de carbono (CO2) quien alimenta las ramas de metilo (este) y carbonilo (oeste) de la vía, lo que da como resultado la formación de acetil-CoA, que sirve como el precursor central de todos los procesos catabólicos y anabólicos (Köpke, Mihalcea, Liew, Tizard, Ali, Conolly, Al-Sinawi & Simpson, 2011). En la rama de metilo, el CO2 se fija en una secuencia de tetrahidrofolato (THF) y reacciones dependientes de cobalamina en un grupo metilo, es decir se reduce a metilo; que luego se combina con CO, usado directamente o después de la reducción enzimática a metilo, para formar acetil-CoA catalizada por la enzima monóxido de carbono deshidrogenasa CODH para formar la reducción a grupo carbonilo(C=O) quien se combina con el grupo metilo por la acetil-CoA sintasa (ACS), que juntas ambas enzimas forman la enzima bifuncional acetil-CoA sintasa / monóxido de carbono deshidrogenasa (ACS / CODH) (EC. 2.3.1.169), requiriendo de H2 (gas) como donador de electrones; es muy eficaz dado a que solo requiere de 4H2 por molécula de acetato (Köpke, Mihalcea, Liew, Tizard, Ali, Conolly, Al-Sinawi & Simpson, 2011). Los equivalentes requeridos para los procesos metabólicos reductores se generan a partir de CO por medio de la enzima CODH o de H2 por enzimas hidrogenasas. En ausencia de H2 en el gas de entrada, los equivalentes reductores se proporcionan únicamente a partir de CO a través de la reacción biológica de desplazamiento de agua y gas (CO + H2O → CO2 + 2H+ + 2e-). Si el H2 está presente en el gas, hay equivalentes reductores adicionales disponibles (H2 → 2H+ + 2e-), lo que permite un aumento proporcional en la asimilación de carbono (Köpke, Mihalcea, Liew, Tizard, Ali, Conolly, AlSinawi & Simpson, 2011). 7 ITLP – Ingeniería Bioquímica [2019] TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICO Instituto Tecnológico de La Paz Departamento de Ingenierías, Ingeniería Bioquímica «Ciencia es verdad, técnica es libertad» Enero-Junio 2019 (S4) [Proyecto asignatura] Ciclo del ácido cítrico y Glucolisis. Una consideración importante sobre las bacterias fermentativas (anaerobias) en general, es que no realizan el ciclo del ácido cítrico, puesto que este es clave solo de organismos con respiración aeróbica, es decir, que ocurre en presencia de oxígeno ya que se encarga de oxidar el piruvato producido en la glucolisis hasta CO2 y H2O . Su función en este tipo de organismos es el de tomar el acetil-CoA de la oxidación del piruvato a través de una serie de reacciones rédox que lo transforma en moléculas de alta energía como NADH, FADH2, ATP, siendo el poder reductor NADH y FADH2 los cuales pasaran a la cadena transportadora para donar sus e- y a través de fosforilación oxidativa generar una mayor cantidad de ATP (Voet, Voet, & Pratt, 2016; Rivera & Pertierra, 2010). A diferencia del ciclo del ácido cítrico la glucolisis es una ruta que ocurre, en presencia o no de oxígeno; por ello, es que el piruvato Sin embargo, cuando se trata de un organismo anaerobio obligado o facultativo, se encuentra en un ambiente sin oxígeno, este mandara el piruvato sintetizado de la glucolisis a fermentación la cual será dependiente del ultimo aceptor de electrones del organismo ya sea orgánico o inorgánico (Esterl & Brandt, 2011). La glucolisis por su parte, no se ve afectada por este tipo de proceso y sigue cumpliendo su función para la formación de piruvato, dado a que es una ruta que ocurre en presencia o no de oxígeno, razón por la cual el piruvato formado es, de la misma forma, indiferente a la presencia de oxígeno por lo que se tienen diversos caminos o rutas para el producto de acuerdo al tipo de organismo (Voet, Voet, & Pratt, 2016). Sin embargo, si se realiza una modificación al proceso de glucolisis, llevando a cabo una ruta heterofementativa (Gottschalk, 2012). Por esta razón es que la bacteria Carboxydothermus hydrogenoformans, quien es un microorganismos anaerobio obligado no realiza el ciclo del ácido cítrico, y en su lugar realiza una fermentación especifica que lo ayuda a sintetizar diversos productos para luego ser mandados a la cadena transportadora de electrones (Mckee, 2014). En general, la bacteria termofílica Carboxydothermus hydrogenoformans al igual que muchos otros organismos lleva a cabo la glucolisis para pasar los hidratos de carbono a piruvato; sin embargo, en el caso de esta bacteria necesita llevar a cabo una ruta heretofermentativa para poder unirse a la vía reductora de acetil-CoA, llevando a cabo la acetogénesis y que se forme el acetil-CoA, como material celular. De esta forma el piruvato formado por la glucolisis y el formado por la vía reductora de acetilCoA prosigan a realizar un tipo de fermentación como por ejemplo la fermentación láctica, quien sustituye la tarea del ciclo de Krebs (Tortora, Funke & Case, 2017) (Gottschalk, 2012). Principalmente, se lleva a cabo con el transporte de la glucosa de la bacteria Carboxydothermus hydrogenoformans, quien es transportada por una permeasa, dicha glucosa es fosforilada pasando a glucosa-6-fosfato utilizando un ATP y generando un ADP por acción de la enzima hexoquinasa (EC 2.7.1.1). La glucosa-6-P sufre dos deshidrogenaciones consecutivas catalizadas por la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (EC 1.1.1.49) y la 6-fosfogluconato deshidrogenasa, utilizando NAD+ y liberando NADH, pasando de esta forma a 6-fosfogluconato (Gottschalk, 2012). 8 ITLP – Ingeniería Bioquímica [2019] TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICO Instituto Tecnológico de La Paz Departamento de Ingenierías, Ingeniería Bioquímica «Ciencia es verdad, técnica es libertad» Enero-Junio 2019 (S4) [Proyecto asignatura] En el tercer paso, la deshidrogenación del 6-fosfogluconato va acompañada de su descarboxilación, dando como resultado ribulosa-5-fosfato y la liberación de CO2, utilizando de la misma manera NAD+ y produciendo NADH por la enzima 6-fosfogluconato deshidrogenasa (EC 1.1.1.44). La ribulosa-5-P generada pasa a xylulosa-5-P por la acción de la enzima ribulosa-5-fosfato3-epimerasa (EC 5.1.3.1) en esta ocasión sin la presencia de algún cofactor, esto ocurre de la misma manera en el último paso, no se requiere de ningún cofactor al pasar de xylulosa-P a gliceraldehido-3-P por la acción de la enzima xylulosa-5-fosfato fosfocetolasa (EC 4.1.2.9), finalmente el gliceraldehido3-fosfato entra como intermediario con el acetil-CoA proveniente de la fermentación acetogenica para degradarse hasta piruvato (Gottschalk, 2012). El gliceraldehído-3-fosfato de la glucólisis da como resultado dos moléculas de ATP, una de NADH y una de piruvato. En sus reacciones consecutivas, se deben reoxidar tres moléculas de NADH para mantener el balance rédox, de manera que el lactato deshidrogenenasa reduce el piruvato a lactato con la oxidación simultánea de un NADH a NAD+. Para reoxidadar las otras dos moléculas de NADH se emplean al acetil-P producido. La fosfotransacetilasa transfiere el grupo acetilo del acetil-P a una molécula de coenzima A para dar acetil-CoA. Por acción de la acetaldehído deshidrogenasa y la alcohol deshidrogenasa se pasa el acetil-CoA a etanol en dos reducciones sucesivas que oxidan un NADH cada una, dando como resultado la regeneración de dos NAD+, sustituyendo de esta forma el ciclo de Krebs (Tortora, Funke & Case, 2017). Fermentación. Es un proceso productor de energía en el que los compuestos orgánicos actúan como donadores y aceptores de electrones. Los procesos fermentativos siempre mantienen un estricto control en su balance de óxido-reducción. El nivel promedio de oxidación de los productos finales es igual al del sustrato. La principal contribución de la fermentación es la producción de ATP. La única forma de producir ATP durante la fermentación es por fosforilación a nivel del sustrato (Madigan, Martinko, Bender, Buckley & Stahl, 2015). Las bacterias anaerobias fermentativas utilizan rutas catabólicas de polisacáridos, aminoácidos y glicerol para la producción de glucosa, la cual puede ser utilizada en las rutas de fermentación, misma que engloba a la bacteria Carboxydothermus hydrogenoformans que resulta ser de un tipo acetogénica (Miranda & Rojo, 2013). Como resultado de esta fermentación se obtienen alcoholes y ácidos grasos. Entre los principales productos de la fermentación de los acetógenos, de carbohidratos, se encuentran los ácidos grasos volátiles, como acetato, etanol, butirato y butanol, todos los cuales se sintetizan directamente a partir de acetil-CoA. En la acetogénesis, estos ácidos grasos volátiles se convierten en ácido acético, dióxido de carbono e hidrógeno (Carrillo, 2013). El ácido acético es producido por el mecanismo de acetogénesis por hidrogenación, en la cual se produce acetato (CH3COO-) como producto final de la reducción de dióxido de carbono (CO2) más hidrogeno (H). La reducción del dióxido de carbono se produce por la vía reductora de la acetil-CoA, esta ruta es útil para la fijación de carbono y para producir acetato como producto final (Varela & Grotiuz, 2010). 9 ITLP – Ingeniería Bioquímica [2019] TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICO «Ciencia es verdad, técnica es libertad» Enero-Junio 2019 (S4) Instituto Tecnológico de La Paz Departamento de Ingenierías, Ingeniería Bioquímica [Proyecto asignatura] Los protozoos anaeróbicos con metabolismo estrictamente fermentativo carecen de mitocondrias y contienen hidrogenosomas donde el piruvato proveniente de la glicólisis es oxidado con producción de acetato, CO2 e H2, y la ganancia adicional de ATP. El hidrógeno es aprovechado por metanógenos intracelulares (Madigan, Martinko, Bender, Buckley & Stahl, 2015). Fosforilación Oxidativa La fermentación y la respiración celular (anaerobia) comienzan del mismo modo, con la glucólisis. Sin embargo, en la fermentación, el piruvato producido en la glucólisis no continúa su oxidación hacia el ciclo del ácido cítrico, y por ende no funciona la cadena de transporte de electrones. Dado que la cadena de transporte de electrones no es funcional, el NADH que se produce en la glucólisis no puede entregar allí sus electrones para regresar a NAD+ (Brooks, Carroll, Butel, Morse & Mietzner, 2011). La respiración por su parte, es la obtención de energía por oxidación de sustratos reducidos DH2, pero las coenzimas reducidas (como el NADH) transfieren los electrones a un aceptor final oxidado a través de una cadena transportadora de electrones al final de la cual existe un aceptor exógeno oxidado, que se reduce (Varela & Grotiuz, 2010). Acarreadores de electrones En la fermentación de la Carboxydothermus hydrogenoformans, quien utiliza carbono orgánico en vez de oxígeno como receptor terminal de electrones, no utilizan la cadena de transporte de electrones para oxidar NADH a NAD+; por lo tanto deben tener un método alternativo para usar esta energía reductora y mantener una fuente de NAD+ para el funcionamiento apropiado de las rutas metabólicas normales. Entonces, el propósito de las reacciones extras en la fermentación es regenerar el acarreador de electrones NAD+ a partir del NADH producido en la glucólisis. Por lo que para evitar la superproducción de NADH, la bacteria del género Clostridium generalmente no tienen un ciclo completo del ácido cítrico, por lo que el ATP es producido por la fosforilación a nivel de sustrato donde un grupo fosfato se transfiere de un compuesto orgánico de gran energía al ADP para formar el ATP (Constanza, Antolinez, Bohórquez & Corredor, 2015). Dentro de los aspectos que benefician a la formación de ATP es la vía reductora del acetil-CoA, esta vía se usa no solo para la fijación de CO2 sino también para la conservación de energía, de manera que la acetogénesis está acoplado a la síntesis de ATP mediante un proceso quimiosmótico que involucra una bomba de ión dependiente de ferredoxina (Na+, H+) (Rnf, Ech) y una Na+ , H+, ATP sintasa (Köpke, Mihalcea, Liew, Tizard, Ali, Conolly, Al-Sinawi & Simpson, 2011). Las reacciones adicionales de la fermentación logran esto dejando que el NADH entregue sus electrones a una molécula orgánica (como el piruvato, producto final de la glucólisis). Esta entrega permite que continúe la glucólisis al asegurar un suministro constante de NAD+. De manera, que al realizar esta ruta alternativa, los acarreadores de electrones pueden impulsar la generación de ATP, a partir de la cadena de transporte de electrones (Ivanov, 2011). 10 ITLP – Ingeniería Bioquímica [2019] TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICO Instituto Tecnológico de La Paz Departamento de Ingenierías, Ingeniería Bioquímica «Ciencia es verdad, técnica es libertad» Enero-Junio 2019 (S4) [Proyecto asignatura] En los organismos procarióticos, como lo es la bacteria Carboxydothermus hydrogenoformans, se encuentran en la membrana citoplasmática. Por lo que la energía representada en la forma de coenzimas reducidas es recuperada como ATP a través de la cadena de transporte de electrones y el bombeado de protones del interior al exterior de la membrana citoplasmática en la célula de la bacteria (Ivanov, 2011). Este paso de acarreadores de electrones, se da a partir del piruvato, producto final de la glucolisis, el cual da formación a dos productos, uno se da a partir de la vía reductora del acetil-CoA para la formación de acetil-CoA mientras que la otra ruta es catalizada por la enzima formato Cacetiltransferasa para la formación de formato; este último es quien entrara a la cadena transportadora de electrones, junto con el NAD+ obtenido de la catálisis del alcohol deshidrogenasa sobre el acetaldehído, y la acetaldehído deshidrogenasa sobre el acetil-CoA, para la formación de ácidos grasos volátiles, como el etanol (Brenda, 2019). La transferencia de electrones se da ordenadamente y en la dirección de mayor potencial rédox positivo, con la consiguiente liberación de energía libre. Dicha energía libre se va a traducir en un potencial electroquímico de protones, cuya disipación a través de ATP-asas de membrana origina el ATP, formando entonces el proceso de fosforilación oxidativa (Madigan, Martinko, Bender, Buckley & Stahl, 2015). Cadena transportadora de electrones Estos sistemas están compuestos por transportadores de electrones, asociados a la membrana plasmática y tienen dos funciones básicas, una de ellas es el de aceptar electrones de un donador y cederlos a un aceptor y conservar energía liberada durante ese transporte en forma de ATP por fosforilación oxidativa (Madigan, Martinko, Bender, Buckley & Stahl, 2015). Para que la fosforilación oxidativa se lleve a cabo, necesita que la cadena transportadora de electrones tenga ciertas enzimas de oxidación reducción y proteínas transportadoras de electrones, entre los que se destacan las NAD-deshidrogenasas, las flavoproteínas y los citocromos. Las flavoproteínas contienen un derivado de la riboflavina como grupo prostético que se reduce y se oxida alternativamente, son quienes transfieren los electrones y protones (H+) (Brooks, Carroll, Butel, Morse & Mietzner, 2011). Los citocromos son proteínas que tienen anillos porfirínicos con hierro y también se oxidan y se reducen alternativamente, acarreando electrones, del que en el caso de la batería en estudio, utiliza el citocromo b quien se distingue su potencial de reducción. También están las quinonas, sustancias liposolubles relacionadas con la vitamina K, que participan en el transporte de electrones, pero más específicamente para el caso de la bacteria termofílica estudiada, se hace uso de la menaquinona, quien es característica de las bacterias Gram-positivas, transfieren los electrones y protones (H+) (Carrillo, 2013). Ahora bien, para entender cómo se genera el ATP durante el transporte de electrones, debemos recodar su orientación con respecto a la membrana plasmática de la célula bacteriana, puesto que como ya se mencionó, en la bacteria Carboxydothermus hydrogenoformans al igual que en el resto de 11 ITLP – Ingeniería Bioquímica [2019] TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICO Instituto Tecnológico de La Paz Departamento de Ingenierías, Ingeniería Bioquímica «Ciencia es verdad, técnica es libertad» Enero-Junio 2019 (S4) [Proyecto asignatura] bacterias, la cadena transportadora de electrones se encuentra en la membrana plasmática, de tal modo que durante el proceso de transporte hay una separación física entre protones y electrones, donde los protones quedan fuera de la célula, mientras que los electrones quedan dentro de ésta. Este proceso de secuencia del transporte de electrones va desde la flavoproteína hasta el aceptor de electrones terminal que es el CO2, en la cual entra el NAD+, esta proteína se encarga de que los H+ sean bombeados fuera de la cadena mientras que los electrones tiendan a entrar al interior. Dichos electrones, serán transportados hacia la proteína Fe-S para la entrada y salida de protones por medio de la menaquinona, sustancia liposoluble, donde se transportaran electrones al citocromo b556 para la reducción de CO2, ultimo aceptor de electrones. Cuando el CO2 se reduce, requiere protones del citoplasma para completar la reacción, los que se originan por la disociación del agua (Carrillo, 2013). En consecuencia se genera un gradiente de pH y un potencial eléctrico a través de la membrana plasmática, estando el lado externo ácido y cargado positivamente y el interno alcalino y cargado negativamente. Dicho gradiente, es compuesto de gradiente osmótico de esos iones H+ y un gradiente de carga eléctrica, que puede ser usado por la célula para realizar un trabajo útil, como movilidad o síntesis de ATP. Este estado energizado de la membrana se expresa como fuerza Figura 2. Fosforilación Oxidativa de bacteria motriz de protones (Carrillo, 2013). Carboxydothermus hydrogenoformans Sin embargo, la bacteria Carboxydothermus hydrogenoformans necesita equivalentes de reducción como el NADPH para reducir el CO2, quien funciona como fuente exclusiva de C, hasta material orgánico celular. Este NADPH se logra a partir de un flujo invertido de electrones a través de la cadena transportadora, usando para ello como energía parte del potencial de protones generado por el flujo normal (Henstra & Stams, 2011). De manera que con esto, la síntesis de ATP prosigue y ocurre gracias al complejo ATPasa, funcionando como ATPsintetasa; enzima que cataliza la reacción reversible entre difosfato de adenosina (ADP) y ATP. Como se mencionó anteriormente, se hace uso el gradiente de protones generado durante el transporte, dicha enzima cataliza la formación de ATP a partir de ADP y fosfato inorgánico. El ATPasa consta de varios polipéptidos que conforman dos porciones: la hidrofóbica BF0, que inserta en la membrana citoplásmica, y la BF1 a modo de tallo que se proyecta hacia el interior celular. Más específicamente, la porción BF0 forma un canal a través de la membrana, por donde pueden pasar H+ desde el exterior al interior, y agua desde dentro hacia afuera, mientras que la porción BF1 es la parte enzimáticamente activa del complejo (Varela & Grotiuz, 2010). 12 ITLP – Ingeniería Bioquímica [2019] TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICO «Ciencia es verdad, técnica es libertad» Enero-Junio 2019 (S4) Instituto Tecnológico de La Paz Departamento de Ingenierías, Ingeniería Bioquímica [Proyecto asignatura] Es importante considerar, que la bacteria Carboxydothermus hydrogenoformans es un organismo con respiración anaerobia, por lo tanto los aceptores de electrones y sus productos reducidos consistirán en CO2 y CO o acetato (Henstra & Stams, 2011). Regulación de síntesis de ATP. Existe una variedad de agentes químicos llamados desacopladores que inhiben la síntesis de ATP durante el transporte de electrones sin alterar el propio proceso de transporte. Ejemplos de estos agentes son el dicumarol y el dinitrofenol. Son sustancias liposolubles que impiden la formación del gradiente de pH y el eléctrico, favoreciendo el pasaje de protones a través de la membrana; de este modo inhiben la síntesis de ATP. La polimixina B se adhiere específicamente a la superficie externa de la membrana, alterando su estructura y propiedades osmóticas. Se produce entonces la pérdida de metabolitos y la inhibición de algunos procesos bioquímicos que tienen lugar a ese nivel, como el transporte de electrones y la síntesis de ATP, entre otros. Otras sustancias, por ejemplo: cianuro o azida de sodio, bloquean el propio sistema de transporte, considerándose como inhibidores. (Carrillo, 2013) (Varela & Grotiuz, 2010). Regulación del metabolismo Cada reacción metabólica está regulada no sólo con respecto a otras reacciones sino también con respecto a la concentración de nutrientes en el medio. La regulación se realiza a diferentes niveles como la regulación de la actividad enzimática a través de enzimas alostéricas, inhibición por retroalimentación, activación alostérica, y cooperatividad. En la bacteria Carboxydothermus hydrogenoformans quien es una anaerobia facultativa; la fermentación que lleva a cabo como única vía de generación de energía, es bloqueada en presencia de oxígeno, asegurando de esta forma que el suministro de energía se produzca por la respiración, que consume menos glucosa y acumula menos lactato. En este fenómeno, conocido como efecto Pasteur, la enzima fosfofructoquinasa es activada o inhibida según la relación ATP/ADP, regulando así el consumo de glucosa; de forma que esta bacteria lleva a cabo la regulación de la actividad enzimática por una enzima alostérica (Carrillo, 2013) (Varela & Grotiuz, 2010). 13 ITLP – Ingeniería Bioquímica [2019] TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICO «Ciencia es verdad, técnica es libertad» Enero-Junio 2019 (S4) Instituto Tecnológico de La Paz Departamento de Ingenierías, Ingeniería Bioquímica [Proyecto asignatura] Conclusión Tras la información recopilada, se determinan las implicaciones del metabolismo de la bacteria Carboxydothermus hydrogenoformans para la formación de productos que participan en la generación de energía, a través de relaciones entre sus rutas catabólicas y anabólicas, englobando los metabolismos de glúcidos, la digestión de ácidos grasos, las excepciones del ciclo de Krebs y la fosforilación oxidativa de la bacteria. Esto se explica de acuerdo al metabolismo anaerobio que presenta la Carboxydothermus hydrogenoformans, la cual realiza excepciones en sus rutas al llevar a cabo la fermentación acetogénica, la cual se va a dar a partir de la ruta heterofermentativa que junto con la vía reductora del acetil-CoA sustituyen a al ciclo de Krebs; y el uso de CO2 como último aceptor de electrones en la fosforilación oxidativa. Por esta razones, es que la importancia de esta bacteria termofílica se basa en su metabolismo debido principalmente a su capacidad de convertir el monóxido de carbono venenoso en dióxido de carbono mientras que al mismo tiempo produce hidrógeno; desempeñando de esta forma un papel importante en la desintoxicación del medio ambiente brindando una fuente de carbono no tóxica, así como gas hidrógeno. Otro aspecto importante de la Carboxydothermus hydrogenoformans es que su metabolismo le permite ser una bacteria con gran potencial para el futuro en cuanto al uso de gas hidrógeno como biocombustible potencial en el futuro. Por otro lado, en la actualidad, se está tomando mayor relevancia al complejo enzimático ACS / CODH quien realiza la conversión de CO. Además, la secuenciación y el análisis del genoma de la bacteria han demostrado que incluye genes para producir esporas. Sin embargo, parece que la C. hydrogenoformans carece de muchos genes para la producción de esporas que contienen otras bacterias, lo que significa que esta bacteria podría servir como modelo para el estudio de la esporulación mínima. 14 ITLP – Ingeniería Bioquímica [2019] TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICO «Ciencia es verdad, técnica es libertad» Enero-Junio 2019 (S4) Instituto Tecnológico de La Paz Departamento de Ingenierías, Ingeniería Bioquímica [Proyecto asignatura] Referencias 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 15 Alberts, B., Wilson, J. y Hunt, T. (2010). Biología molecular de la célula. Nueva York: Garland Science. Audesirk, T., Audesirk, G. y Byers, B. (2013). Biología: la vida en la tierra con fisiología. Nauclapan de Juárez, México: Pearson. Brenda (2019). Technische Universitat Braunschweig. Brenda: the Comprenhesive Enzyme Information system: https://www.brenda enzymes.org/pathway_index.php?site=pathway&organism=Carboxydothermus%20hydrogeno formans&pathway=ubiquinone_biosynthesis Brooks G, Carroll K, Butel J, Morse S. & Mietzner T. (2011).Jawetz, Melnick Y Adelberg. Microbiología. 25a Edición. México: McGraw-Hill LANGE. Carrillo L. (2013). Manual de Microbiología Agrícola. 2da Edición. Argentina. Facultad de Ciencias Agrarias Universidad Nacional de Jujuy. Constanza L, Antolinez D, Bohórquez J. & Corredor. (2015). Bacterias anaerobias: procesos que realizan y contribuyen a la sostenibilidad de la vida en el planeta. NOVA. 2015; 13 (23): 55-81. Esterl, W. & Brandt, U. (2011). Bioquímica: fundamentos para medicina y ciencias de la vida. Barcelona: Reverte Ferrier, D., Ortiz, M. y Salazar, L. (2018). Bioquímica. Barcelona, España: Wolters Kluwer. Foster J. & Slonczewski J. (2017). Microbiología una ciencia en evolución. 4ta Edición. New York: Norton Company. Gama. (2009). Biología I: un enfoque constructivista. México: Pearson Educación. Gottschalk, G. (2012). Bacterial Metabolism. Springer-Verlag. New York. Henstra A. & Stams J. (2011). Deep Conversion of Carbon Monoxide to Hydrogen and Formation of Acetate by the Anaerobic Thermophile Carboxydothermus hydrogenoformans. Hindawi Publishing Corporation International Journal of Microbiology. Volume 2011, Article ID 641582, 4 pages doi:10.1155/2011/641582. Ivanov V. (2011). Microbiología Ambiental para Ingenieros. 2da Edición. Florida: Prensa CRC. Karp, G., Patton, J., Pinto, J. y Ruiz, A. (2014). Biología celular y molecular: Conceptos y experimentos. México: Mc Graw Hill Interamericana. Köpke M, Mihalcea C, Liew F, Tizard J, Ali M, Conolly J, Al-Sinawi B. & Simpson S. (2011). 2,3-Butanediol Production by Acetogenic Bacteria, an Alternative Route to Chemical Synthesis, Using Industrial Waste Gas. American Society For Microbiology. 10.1128 / AEM.00355-11. Madigan M, Martinko J, Bender K, Buckley D. & Stahl D. (2015). Brock. Biología de los microorganismos. 14va Edición. México: Pearson. Mckee, T. y Kee, J. (2014). Bioquímica: las bases moleculares de la vida . México: Educación McGraw-Hill. ITLP – Ingeniería Bioquímica [2019] TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICO Instituto Tecnológico de La Paz Departamento de Ingenierías, Ingeniería Bioquímica 18. 19. 20. 21. 22. 23. 16 «Ciencia es verdad, técnica es libertad» Enero-Junio 2019 (S4) [Proyecto asignatura] Miranda C. & Rojo M. (2013) Clostridium perfringens: infecciones de piel y tejidos blandos. España: Control Calidad SEIMC (Servicio de Microbiología. Hospital Universitario Virgen de las Nieves). Rivera, J. y Pertierra, A. (2010). Fundamentos de bioquímica metabólica. Madrid: Tébar Tortora G, Funke B. & Case C. (2017). Introducción a la microbiología. 12va Edición. Buenos Aires: Médica Panamericana. Varela G. & Grotiuz G. (2010). Temas de bacteriología y virología. 3ra Edición. Uruguay. Universidad de la República Facultad de Medicina (FEMUR). Voet, D., Voet, J. y Pratt, C. (2016). Fundamentos de bioquímica: la vida a nivel molecular: 4a edición. Buenos Aires: Médica Panamericana. Wu M, Ren Q & et al. (2011). Life in Hot Carbon Monoxide: The Complete Genome Sequence of Carboxydothermus hydrogenoformans Z-2901. PLoS Genet 2(4): e60. DOI: 10.1371/journal.pgen.0020060. ITLP – Ingeniería Bioquímica [2019]