REPASO SIST INMUNE. UD 6. APLICACIÓN DE TÉCNICAS INMUNOHISTOQUÍMICAS
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Repaso SISTEMA INMUNITARIO Procesamiento Citológico y Tisular ACTIVIDADES INTRODUCCIÓN https://www.youtube.com/watch?v=NHOiq_wZQOQ Visualiza el vídeo y contesta a las preguntas https://youtu.be/HEY3dUh2dTM 1. ¿Qué otra función, además de la fagocitosis, tienen los fagocitos? 2. ¿Dónde mandan señales de activación los linfocitos T? 3. ¿Qué otras células detectan los linfocitos T, además de las microbianas? Para conservar su identidad biológica, los seres vivos cuentan con una serie de complejos mecanismos defensivos que, en conjunto, se denominan sistema inmunitario. Esto les permiten protegerse de infecciones microbianas y rechazar moléculas extrañas a su organismo o moléculas propias que no son reconocidas como tales al sufrir algún tipo de modificación. Procesamiento Citológico y Tisular 1. ANTÍGENOS Se trata de una identificación de tipo estructural, es decir, existe una complementariedad entre la forma espacial de estos receptores y la de los antígenos correspondientes. ACTIVIDAD Compara y diferencia los términos antígeno, receptor del antígeno y epítopo. Procesamiento Citológico y Tisular ACTIVIDAD-sol Compara y diferencia los términos antígeno, receptor del antígeno y epítopo. Un antígeno es una sustancia que desencadena la formación de anticuerpos y puede causar una respuesta inmune. La definición moderna abarca todas las sustancias que pueden ser reconocidas por el sistema inmune, bien sean propias o ajenas. Procesamiento Citológico y Tisular ACTIVIDAD-sol Compara y diferencia los términos antígeno, receptor del antígeno y epítopo. La zona del antígeno donde este se une al anticuerpo o al receptor antigénico recibe el nombre de epítopo, mientras que el área correspondiente de la molécula del anticuerpo es el parátopo. Procesamiento Citológico y Tisular ACTIVIDAD-sol Compara y diferencia los términos antígeno, receptor del antígeno y epítopo. Los receptores antigénicos son moléculas situadas en la membrana plasmática de algunas células del organismo que tienen una forma espacial específica y complementaria con la de los antígenos y que, cuando se unen con ellos, los reconocen y desencadenan la reacción inmunológica. Procesamiento Citológico y Tisular 2. SISTEMA INMUNITARIO Es un complejo conjunto de mecanismos que utilizan los seres vivos para defenderse y rechazar las sustancias ajenas que penetran en su organismo. Procesamiento Citológico y Tisular • Serie mieloide se forman en la médula ósea. Presentan la capacidad de fagocitosis. • Serie linfoide linfocitos. No poseen capacidad fagocítica, pero desempeñan un papel sumamente importante en la lucha contra los antígenos invasores al producir anticuerpos específicos. Neutrófilos Se tiñen con colorantes neutros Granulocitos polimorfonucleares Eosinófilos Se tiñen con colorantes ácidos. Serie mieloide Basófilos (fagocitos) Se tiñen con colorantes básico. Leucocitos Macrófagos libres Monocitos Serie linfoide (linfocitos) Histiocitos 3. DEFENSAS INESPECÍFICAS/innatas ¿Qué es “quimiotactismo”? 3. DEFENSAS INESPECÍFICAS INFLAMACIÓN Procesamiento Citológico y Tisular 3. DEFENSAS INESPECÍFICAS LOS FAGOCITOS 3. DEFENSAS INESPECÍFICAS LOS FAGOCITOS FUNCIONES • Fagocitosis. Es necesaria la activación previa y se consigue gracias a los mediadores de la inflamación y ciertas sustancias producidas por los linfocitos. La activación consiste en la producción de moléculas glucoproteicas en la membrana celular del fagocito que incrementan su capacidad de adhesión a cualquier estructura extraña. • Liberación de productos tóxicos para los microorganismos localizados en su cercanía. (eosinófilos desgranulación). • Liberación de histamina. (basófilos y mastocitos), que es un mediador de la inflamación. • Los macrófagos cooperan con los linfocitos, produciendo un conjunto de sustancias que los activan, y favorecen el reconocimiento e identificación de los distintos antígenos. ACTIVIDAD ¿Por qué existen abundantes histiocitos en los alvéolos pulmonares? Procesamiento Citológico y Tisular ACTIVIDAD-sol ¿Por qué existen abundantes histiocitos en los alvéolos pulmonares? Procesamiento Citológico y Tisular 3. DEFENSAS INESPECÍFICAS EL COMPLEMENTO Sistema de proteínas que se encuentra en el plasma sanguíneo. Tiene una función defensiva y es muy rápido. Se llama así por la capacidad que tiene para complementar y potenciar la acción de los anticuerpos. Se activa por una reacción en cascada. FUNCIONES • Actúa como mediador de la inflamación. • Interviene en la opsonización de células extrañas a un organismo para facilitar la acción de los fagocitos y de los anticuerpos. • Provoca la lisis de las células invasoras, por rotura de su membrana. ACTIVIDAD La lisis celular producida por la vía terminal del complemento es más eficaz en bacterias gram negativas que en gram positivas. ¿A qué crees que es debido? Procesamiento Citológico y Tisular ACTIVIDAD-sol La lisis celular producida por la vía terminal del complemento es más eficaz en bacterias gram negativas que en gram positivas. ¿A qué crees que es debido? Procesamiento Citológico y Tisular 3. DEFENSAS INESPECÍFICAS EL INTERFERÓN Las células infectadas por un virus sintetizan y liberan unas proteínas (interferón), que impiden que la infección se propague (es específico de cada especie). FUNCIONES • Impedir la replicación del virus en células infectadas que aún no han sido destruidas por la acción vírica. • Activa unos linfocitos, células NK, capaces de reconocer células infectadas por virus o células cancerosas y eliminarlas. ACTIVIDAD ¿Crees que el interferón producido por las células de una gallina infectadas con el virus de la gripe aviar podría ser utilizado para proteger a las células humanas de este virus? Razona tu respuesta Procesamiento Citológico y Tisular ACTIVIDAD-sol ¿Crees que el interferón producido por las células de una gallina infectadas con el virus de la gripe aviar podría ser utilizado para proteger a las células humanas de este virus? Razona tu respuesta Procesamiento Citológico y Tisular 4. DEFENSAS ESPECÍFICAS Solo se producen frente a un tipo concreto de antígenos. Por lo tanto, presentan especificidad y, además, crean memoria inmunitaria. Las células implicadas en esta respuesta específica son los linfocitos. Neutrófilos Se tñen con colorantes neutros Granulocitos polimorfonucleares Eosinófilos Se tiñen con colorantes básicos. Basófilos Serie mieloide Se tiñen con colorantes ácidos. (fagocitos) Leucocitos Macrófagos libres Serie linfoide (linfocitos) Monocitos Histiocitos 4. DEFENSAS ESPECÍFICAS LOS LINFOCITOS Son los leucocitos de la serie linfoide. A diferencia de los otros, estos no fagocitan ni son móviles, pero tienen la capacidad de reconocer antígenos específicos. https://www.youtube.com/watch?v=kKeXdLAy5tU Linfocitos B Sintetizan anticuerpos ante la presencia de antígenos. Producen la inmunidad humoral. No producen anticuerpos. Provocan la muerte de ciertas células alteradas. LINFOCITOS Linfocitos T Algunos regulan la actuación del sistema inmunitario. Son los responsables de la inmunidad celular. Linfocitos no-B no-T NK Destruyen células diana, pero de una forma inespecífica. 4. DEFENSAS ESPECÍFICAS ÓRGANOS LINFOIDES Las células precursoras de los linfocitos B (al igual que las de todas las células sanguíneas) se originan en la médula ósea y se convierten en linfocitos maduros en los órganos linfoides. Estos son los lugares donde se generan, acumulan e interaccionan los linfocitos. • Órganos linfoides primarios en ellos se produce la diferenciación de los linfocitos. Linfocitos B – médula ósea Linfocitos T – timo • Órganos linfoides secundarios En ellos tiene lugar la acumulación e interacción de los diferentes tipos de linfocitos. Los principales: ganglios linfáticos y el bazo. También el apéndice, las placas de Peyer intestinales, las amígdalas y las adenoides (vegetaciones). 4. DEFENSAS ESPECÍFICAS MECANISMO DE ACCIÓN DE LA INMUNIDAD ESPECÍFICA Es un conjunto de procesos muy complejos en los que participan varios tipos de células y sustancias. Fases: 1. Identificación y reconocimiento del antígeno extraño. 2. Activación de los linfocitos. 3. Desencadenamiento de la respuesta inmunitaria. 4. DEFENSAS ESPECÍFICAS MECANISMO DE ACCIÓN DE LA INMUNIDAD ESPECÍFICA 1. Identificación y reconocimiento del antígeno extraño. Presencia de sustancias extrañas, se realiza mediante el contacto de los antígenos con determinadas moléculas existentes en la membrana de los linfocitos. Linfocitos B – anticuerpos Linfocitos T – receptores de antígenos (TCR). El mecanismo de identificación consiste en un acoplamiento espacial entre los determinantes antigénicos y los receptores de los linfocitos. Aunque en algunos casos los antígenos pueden ser reconocidos directamente, lo habitual es que sea necesaria la intervención de las llamadas células presentadoras de antígenos, que fagocitan estructuras antigénicas y, tras su digestión intracelular sitúan determinados fragmentos de los antígenos en su superficie. Estas células se dirigen entonces a los órganos linfoides, donde se encuentran los linfocitos. De esta forma, los antígenos son “presentados” a estos linfocitos para un reconocimiento más rápido y eficaz. 4. DEFENSAS ESPECÍFICAS MECANISMO DE ACCIÓN DE LA INMUNIDAD ESPECÍFICA 2. Activación de los linfocitos. Tras el reconocimiento del antígeno, los linfocitos sufren unos cambios metabólicos y fisiológicos y comienzan a dividirse activamente. Se produce entonces un importante aumento en el número de linfocitos y se pone en marcha una serie de mecanismos para activarlos. En esta activación también participan los macrófagos. 4. DEFENSAS ESPECÍFICAS MECANISMO DE ACCIÓN DE LA INMUNIDAD ESPECÍFICA 3. Desencadenamiento de la respuesta inmunitaria. Una vez activados, los linfocitos llevan a cabo su función defensiva. Los linfocitos B - se transforman en las llamadas células plasmáticas, que producen gran cantidad de anticuerpos específicos contra el antígeno correspondiente. Los linfocitos T – atacan a las células portadoras del antígeno (células diana) y causan su destrucción. La respuesta inmunitaria debe estar perfectamente regulada para evitar una actuación defensiva deficitaria o excesiva, lo que se consigue mediante la acción de otros tipos de linfocitos T. 4. DEFENSAS ESPECÍFICAS INMUNIDAD HUMORAL Conjunto de mecanismos inmunitarios en los que intervienen proteínas específicas fabricadas contra los antígenos extraños que se difunden por los fluidos del organismo. Estas proteínas son los anticuerpos, que son sintetizados por los linfocitos B, y su difusión se realiza por la sangre, la linfa, los líquidos intersticiales y las secreciones donde llevan a cabo su acción. LINFOCITOS B Se forman y diferencian en la médula ósea. Allí adquieren la capacidad para producir los anticuerpos. 4. DEFENSAS ESPECÍFICAS INMUNIDAD HUMORAL En la médula ósea se generan millones de linfocitos B, genéticamente diferentes, cada uno de los cuales fabricará distintos anticuerpos, capaces de unirse a la enorme cantidad de antígenos diferentes que entran en un organismo. Esto se consigue mediante la fragmentación de parte del ADN. Esto produce una gran variedad. Se calcula que se pueden sintetizar unos mil millones de anticuerpos diferentes, aunque cada linfocito (y sus descendientes) produce un único tipo de anticuerpo específico. Dada la enorme variedad de anticuerpos, siempre hay alguno capaz de reconocer a un antígeno concreto. 4. DEFENSAS ESPECÍFICAS INMUNIDAD HUMORAL Teoría de la selección clonal Tras el reconocimiento del antígeno, los linfocitos B se activan. Esto consiste en una rápida división que da lugar a una serie o clon de células iguales producturas del mismo anticuerpo (aparición de antígenosel. Clonal). - Algunos anticuerpos permancen fijos en la membrana de los linfocitos B. - Otros se liberan. La mayor parte de los linfocitos B activados se convierten en las llamadas células plasmáticas (grandes). Otros quedan como linfocitos B de memoria. Tanto las células plasmáticas como las de memoria se acumulan en la zona cortical de los ganglios linfáticos del organismo, desde donde pasan a la linfa y de esta a la circulación saguínea. Teoría de la selección clonal ACTIVIDAD ¿Por qué las células plasmáticas presentan un retículo endoplásmico rugoso muy desarrollado? Procesamiento Citológico y Tisular 2018/2019 ACTIVIDAD-sol ¿Por qué las células plasmáticas presentan un retículo endoplásmico rugoso muy desarrollado? Procesamiento Citológico y Tisular 2018/2019 4. DEFENSAS ESPECÍFICAS LOS ANTICUERPOS Conocidos como inmunoglobulinas o gammaglobulinas, los anticuerpos son proteínas con una pequeña parte glucídica. CARACTERÍSTICAS: Consta de cuatro cadenas polipeptídicas (dos de mayor tamaño, cadenas pesadas o H y dos más pequeñas, cadenas ligeras o L). 4. DEFENSAS ESPECÍFICAS LOS ANTICUERPOS Región variable - diferente en cada anticuerpo específico. En esta zona existe una secuencia de aminoácidos que se denomina parátopo, y ahí es donde se produce la unión al antígeno (en el epítopo). Región constante – igual para cada uno de los tipos de inmunoglobulina, pero diferentes entre ellos. En esta región se une a la membrana de los linfocitos B, a los fagocitos o al complemento. Cada anticuerpo puede unirse a dos moléculas de antígeno. 4. DEFENSAS ESPECÍFICAS LOS ANTICUERPOS ¡¡ Unión a mayor número de antígenos !! 4. DEFENSAS ESPECÍFICAS LOS ANTICUERPOS Según la composición y la estructura de las cadenas peptídicas, su localización y su función, se distinguen cinco clases de anticuerpos: 4. DEFENSAS ESPECÍFICAS LOS ANTICUERPOS FUNCIONES Efectos directos unión antígeno - anticuerpo. Se desencadenan las reacciones antígeno-anticuerpo o reacciones serológicas. Efectos indirectos La unión permite una acción posterior que facilita su eliminación mediante una serie de efectos, entre los que se encuentran la opsonización y la activación del complemento. Proceso por el cual un patógeno se marca para la ingestión y se elimina por un fagocito. 4. DEFENSAS ESPECÍFICAS LOS ANTICUERPOS Efectos directos Neutralización. La unión elimina los efectos negativos que el antígeno tiene sobre el organismo invadido. Precipitación Se produce un gran agregado porque el antígeno tiene dos o más sitios de unión a los anticuerpos. Esto permite que los antígenos solubles precipiten. Aglutinación Cuando los antígenos forman parte de una célula o de una partícula, la unión con los anticuerpos origina puentes entre ellas. Como consecuencia, se forman agregados, lo que facilita su destrucción. 4. DEFENSAS ESPECÍFICAS LOS ANTICUERPOS POLICLONALES Son colecciones de inmunoglobulinas producidas por distintos linajes de linfocitos B, que aunque reconocen un mismo antígeno, reaccionan con distintos epítopos del mismo. MONOCLONALES Son producidos por un único clon de linfocitos B, y presentan una afinidad monovalente, es decir, no solo reconocen un mismo antígeno, sino que también se unen al mismo epítopo del mismo. UD 6. APLICACIÓN DE TÉCNICAS INMUNOHISTOQUÍMICAS. • Módulo: Procesamiento citológico y tisular. • Ciclo: Anatomía patológica y citodiagnóstico. • Profesora: Sara García Gallardo. [email protected] Objetivos de esta unidad • Conocer y diferenciar los anticuerpos monoclonales y policlonales. • Interpretar y reconocer los fundamentos de los métodos inmunohistoquímicos directos e indirectos. • Clasificar las técnicas en función del marcador utilizado. • Identificar los procesamientos histológicos. • Identificar las técnicas de recuperación antigénica. • Reconocer y determinar los procedimientos de las técnicas inmunohistoquímicas y controles. • Diferenciar los distintos marcadores tumorales: marcadores histoquímicos, inmunohistoquímicos y ultraestructurales La inmunohistoquímica es un método que permite la localización de antígenos específicos en tejidos o células (inmunocitoquímica) gracias a un reconocimiento antígeno-anticuerpo. Hoy en día es una técnica imprescindible en anatomía patológica para el diagnóstico, pronóstico y tratamiento, identificando moléculas, principalmente proteicas, que ofrecen claves diagnósticas, lo que permite además localizarlas morfológicamente en las distintas células o componentes del tejido. Procesamiento Citológico y Tisular 1. ANTICUERPOS MONOCLONALES Y POLICLONALES. MARCAJE DE ANTICUERPOS Procesamiento Citológico y Tisular ANTICUERPOS Los anticuerpos pertenecen a un grupo de proteínas llamadas “inmunoglobulinas”, sintetizadas por las células plasmáticas. Estructuralmente se caracterizan por tener dos unidades básicas: • Un par de cadenas ligeras (ҡ o λ) • Un par de cadenas pesadas idénticas (α, δ, ε o µ). Serán las cadenas pesadas las que determinen la clase de inmunoglobulina (IgA, IgG, IgD, IgE, IgM). 1.1. Anticuerpos monoclonales y policlonales Procesamiento Citológico y Tisular LOS ANTICUERPOS POLICLONALES Son colecciones de inmunoglobulinas producidas por distintos linajes de linfocitos B, que aunque reconocen un mismo antígeno, reaccionan con distintos epítopos del mismo. MONOCLONALES Son producidos por un único clon de linfocitos B, y presentan una afinidad monovalente, es decir, no solo reconocen un mismo antígeno, sino que también se unen al mismo epítopo del mismo. LOS ANTICUERPOS TIPOS DE ANTICUERPOS POLICLONALES Proceden de la activación de distintos clones de linfocitos B. Al proceder de células diferentes reaccionan con distintos epítopos en el mismo antígeno, con diferente afinidad y especificidad. Cada célula B produce un solo tipo de anticuerpo, así diferentes linfocitos B producirán anticuerpos estructuralmente diferentes que se unirán a distintas partes del antígeno. Esta mezcla fisiológica natural de anticuerpos es conocida como antisuero policlonal. LOS ANTICUERPOS TIPOS DE ANTICUERPOS POLICLONALES Ventajas - Su alta sensibilidad menor susceptibilidad a las alteraciones del tejido durante el procesamiento. Inconvenientes - Su especificidad variable, con posibilidad de que acontezcan reacciones cruzadas; problemas de reproducibilidad y disponibilidad limitada. Se inyecta un antígeno en un animal (generalmente un conejo) y alguna de las células B de su sistema inmune se transformarán en células plasmáticas y empezarán a producir anticuerpos que se unirán a ese antígeno. TIPOS DE ANTICUERPOS MONOCLONALES Proceden de un clon individual de células plasmáticas. Al proceder de una misma célula que ha sido clonada reaccionan con un único epítopo del antígeno. Ventajas - Su mayor especificidad, su mayor reproducibilidad, la mayor disponibilidad respecto de los anticuerpos policlonales, ausencia de reacciones cruzadas con otras proteínas. Inconvenientes - Su menor sensibilidad, con mayor probabilidad de obtener un resultado falso negativo y su menor estabilidad en las mismas condiciones que los anticuerpos policlonales. LOS ANTICUERPOS 1.2. Marcaje de anticuerpos La reacción antígeno - anticuerpo es útil porque permite visualizarla, y esta visualización puede llevarse a cabo gracias al marcaje de los anticuerpos mediante diferentes técnicas. En función del marcador utilizado podrán clasificarse las técnicas de inmunohistoquímica, como se verá en el apartado “Clasificación de las técnicas en función del marcador utilizado”. Procesamiento Citológico y Tisular 2. FUNDAMENTOS DE LOS MÉTODOS INMUNOHISTOQUÍMICOS: DIRECTOS E INDIRECTOS Procesamiento Citológico y Tisular El marcaje de los anticuerpos puede realizarse de forma directa o indirecta. Directa: se marca el anticuerpo primario que va a reaccionar con el antígeno. La técnica es muy rápida pero poco sensible. El principal inconveniente es que exige que se marquen tantos anticuerpos como antígenos se quieran detectar. Indirecta: se marca un anticuerpo secundario que se unirá al anticuerpo primario. Las ventajas del método indirecto es que permiten solo se tenga que marcar un anticuerpo, la versatilidad (un mismo anticuerpo secundario puede unirse a varios anticuerpos primarios), es un método más sensible que el anterior. Su principal inconveniente es que pequeñas cantidades de antígeno pueden no ser detectadas. Los ensayos directos, donde el anticuerpo primario, el que se une directamente al antígeno, es el que va marcado y por lo tanto el que producirá la señal, son mucho más sencillos de ejecutar (con un menor número de incubaciones y lavados), y evitan posibles uniones inespecíficas que pueda dar el anticuerpo secundario. Sin embargo, hay casos en los que los bajos niveles de proteína de interés en la muestra, nos obligan a recurrir a métodos que nos permitan amplificar la señal para poder detectarla. En estos casos, optaremos por un ensayo indirecto, utilizando un segundo anticuerpo que reconozca al anticuerpo primario unido al antígeno. En este caso, es este anticuerpo secundario el que deberá conjugarse para transformar la señal. Si bien es cierto que los ensayos indirectos proporcionan una mayor sensibilidad al generar una señal más intensa, tienen el inconveniente de que, en general, la especificidad de los anticuerpos secundarios es mucho menor, pudiendo dar lugar a uniones inespecíficas no deseadas, por lo que en estos casos es necesario prestar especial atención a los pasos de bloqueo, lavado y controles adicionales. Figura 3. Métodos de marcaje de los anticuerpos 3. CLASIFICACIÓN DE LAS TÉCNICAS EN FUNCIÓN DEL MARCADOR UTILIZADO Procesamiento Citológico y Tisular 3. 1. Inmunofluorescencia La inmunofluorescencia es un proceso que consiste en una reacción antígeno-anticuerpo que se hace visible mediante el marcaje del anticuerpo con un colorante fluorescente, que se manifiesta tras su exposición a la luz ultravioleta emitida por el microscopio. Los fluorocromos más utilizados son la fluoresceína (emite fluorescencia color verde manzana) y la rodamina (emite fluorescencia color roja-anaranjada). Limitaciones La principal limitación de la inmunofluorescencia es el denominado fotobleaching. Se trata de una degradación irreversible del fluorocromo excitado debido a su interacción con oxígeno. Este efecto se puede reducir utilizando la iluminación más baja posible dentro del intervalo de excitación adecuado de ese fluorocromo. La inmunofluorescencia puede ser directa o indirecta, como se ha visto en apartados anteriores. Inmunofluorescencia directa Ventajas: los tiempos de incubación son cortos y los protocolos de tinción doble o triple más sencillos. Inconvenientes: la señal es menor; mayor coste económico; protocolo menos flexible. Inmunofluorescencia indirecta: Ventajas: mayor sensibilidad que la inmunofluorescencia directa; los anticuerpos secundarios son relativamente más baratos; suelen ir acoplados a una gran variedad de fluorocromos de diversos colores y tienen una buena calidad. La expresión de la endonucleasa DFF40/CAD en glioblastoma es inferior a la expresión que se observa en tejido sano. En la izquierda se muestra tejido cerebral no tumoral. A la derecha, zona de GB en el mismo individuo. En azul se muestra el ADN, en verde la proteína glial GFAP y en rojo la endonucleasa DFF40/CAD. Una vez obtenidos estos resultados, los investigadores realizaron un estudio histológico mediante inmunohistoquímica. Después de analizar la expresión de DFF40/CAD en diferentes muestras de gliomas concluyeron que los niveles de expresión de la endonucleasa en los gliomas son inferiores a los observados en tejido cerebral de personas sanas. De hecho, estos resultados también se observaron al comparar los niveles de expresión de la proteína en tejido tumoral y no tumoral dentro de un mismo paciente, lo cual parecería indicar que la bajada de expresión de DFF40/CAD podría estar relacionada con el proceso de gliomagénesis. 3. 2. Inmunoenzimáticas Para el marcaje del anticuerpo se utiliza una enzima. La reacción antígenoanticuerpo se visualiza añadiendo, al final de la reacción, una sustancia denominada “cromógeno”. Al actuar la enzima sobre el anticuerpo interacciona a su vez sobre el cromógeno y da lugar a un precipitado insoluble y coloreado. Como marcadores pueden utilizarse diferentes tipos de enzimas, siendo la más utilizada la peroxidasa. Otra de las más usadas es la fosfatasa alcalina. Procesamiento Citológico y Tisular 3. 3. Oro coloidal El oro coloidal se puede utilizar como marcador de inmunoglobulinas, ya sea de forma directa o indirecta (ligando el oro coloidal a la proteína A, que tiene la capacidad de unirse mediante un mecanismo no inmune a las inmunoglobulinas). Esta técnica tiene sus limitaciones, que pueden aminorarse utilizando iones de plata para intensificar la coloración (técnica de oro coloidal-plata). Procesamiento Citológico y Tisular 4. Procesamiento histológico y restablecimiento de la inmunorreactividad tisular. Procesamiento Citológico y Tisular El procesado es igual que en cualquier tejido, pero con una serie de cuidados para evitar daños en los epítopos del antígeno a detectar. Pasos críticos: Decalcificación: puede alterar la inmunorreactividad e incluso hacer que desaparezca al cabo de unas pocas horas de tratamiento, sobre todo si se utilizan soluciones fuertes que contengan ácido nítrico. Inclusión: El empleo de acetona o de cloroformo en lugar de etanol mejora la inmunotinción y reduce la tinción de fondo. A su vez la inclusión en parafina da lugar a mayor tinción de fondo que la obtenida en aquellas muestras a las que se le realizan secciones criostáticas. Por ello, antes de realizar una inmunotinción es muy importante que se lleve a cabo la desparafinación completa de la preparación histológica. Inmunotinción para C4d; tejido fijado en formalina e incluido en parafina. Anticuerpo policlonal (Biomedica Gruppe, Viena, Austria), X400. 4.1. Técnicas de recuperación antigénica Pérdida de la antigenicidad por los fijadores formación de enlaces que enmascaran los antígenos (epítopos), y el anticuerpo no puede unirse. Recuperación romper esos enlaces. ¿Cómo? Digestión enzimática: se utilizan enzimas proteolíticas que producen la ruptura de enlaces cruzados. Su estabilización es difícil y en caso de ser excesiva puede llegar a destruir el tejido o puede desenmascarar fragmentos proteicos comunes a diversos antígenos incrementando la tinción no específica. Inducción por calor: la inducción de calor para romper los enlaces cruzados es el método más utilizado actualmente para la recuperación antigénica. Pueden utilizarse distintos aparatos (horno microondas, olla a presión, autoclave) y diferentes soluciones de desenmascaramiento (el citrato sódico se considera la mejor hasta la fecha) Procesamiento Citológico y Tisular 4.2. Bloqueo de la actividad enzimática endógena Cuando se utiliza una enzima como marcador sustrato (suele ser el DAB diamino bencidina), debemos inhibir su actividad endógena (RECORDAR INMUNOENZIMÁTICA). No necesario en enzimas que no tengan actividad en tejidos humanos. Entre los métodos utilizados para el bloqueo de la actividad endógena de las enzimas se encuentran los siguientes: -Incubación en metanol absoluto con peróxido de hidrógeno: esta técnica se emplea en el bloqueo de la actividad endógena de la peroxidasa. -Levamisol: se utiliza en el bloqueo de la actividad endógena de la fosfatasa alcalina, exceptuando la de tipo intestinal, que por su parte es sensible a otros tratamientos como el realizado con ácido acético, peróxido de hidrógeno o ácido periódico. Procesamiento Citológico y Tisular 4.3. Bloqueo de la tinción de fondo La tinción de fondo engloba toda tinción inespecífica de una preparación inmunohistoquímica. Puede producirse de forma directa: presencia del antígeno en lugares diferentes al que se quiere detectar. - Antisueros primarios de anticuerpos frente antígenos distintos al que quiere determinarse - Atrapamiento del antígeno o difusión del mismo hacia lugares donde no suele encontrarse. También puede producirse de forma indirecta: - unión no inmune de un antisuero a los componentes de los tejidos. ¿Cómo reducirlo? -Bloqueando los lugares con afinidad no inmune por las inmunoglobulinas añadiendo suero bloqueante al antisuero primario -Utilizando antisuero primario en diluciones muy altas y añadiendo grandes concentraciones de sal al tampón - Mediante digestión enzimática. Procesamiento Citológico y Tisular 4.4. Controles Sirve para determinar falsos positivos y negativos para concretar si la técnica se ha desarrollado correctamente. Control negativo: tejido que carece del antígeno de un determinado anticuerpo y que por tanto no debe dar señal de positividad a una tinción inmunohistoquimica. En caso de producirse tinción en el control negativo no se debe considerar la técnica como buena, ya que indica que han existido reacciones cruzadas o contaminación de reactivos. Control positivo: se utiliza una sección de tejido de la que se tiene la certeza que contiene el antígeno que se quiere detectar. El mejor control positivo es el control interno, es decir, células o componentes del tejido normal/no patológico, en las que exista el antígeno que se quiere estudiar. Si el resultado es negativo en la preparación a estudiar se deberá a cualquier fallo técnico. Inmunohistoquímica para receptor de progesterona en endometrio. A): Oveja prepuber. B) Oveja adulta C) Control negativo. Las flechas de color rojo indican células inmunorreactivas en glándulas endometriales y las azules en células del estroma endometrial. Procesamiento Citológico y Tisular 4.5. Tipos de anticuerpos y diluciones El anticuerpo primario es el reactivo responsable de otorgar especificidad a la reacción inmunohistoquímica, ya sea en su forma concentrada o prediluida. Es una molécula que de manera natural no está marcada, de modo que su localización en la sección de tejido se detecta directamente marcándolo o indirectamente, mediante la aplicación de anticuerpos secundarios marcados. Las soluciones de anticuerpos policlonales contienen muchos clones de anticuerpos con diferentes especificidades por los distintos antígenos, pero se suelen enriquecer los anticuerpos de más afinidad y eliminar selectivamente los de baja afinidad por columnas de absorción. La dilución óptima de un mismo anticuerpo será muy distinta de un laboratorio a otro, entendiendo por concentración óptima aquella que proporciona la intensidad-especificidad más alta con la mínima tinción de fondo inespecífica. Los diluyentes de anticuerpos son soluciones tamponadas. Actualmente, las soluciones tamponadas confieren una mayor estabilidad a la dilución del anticuerpo y favorecen la optimización del mismo. El tampón más utilizado en la actualidad es el PBS. En el caso de los reactivos listos para usar se debe tener en cuenta que ya están prediluidos y testados por el proveedor. 5. PROCEDIMIENTOS DE LAS TÉCNICAS INMUNOHISTOQUÍMICAS Y CONTROLES. - Peroxidasa - Fosfatasa alcalina - Oro coloidal 6. MARCADORES TUMORALES lo veremos pero no entra en examen Procesamiento Citológico y Tisular ACTIVIDAD Define los siguientes términos: - Anticuerpo - Anticuerpo monoclonal - Anticuerpo policlonal - Anticuerpo primario - Anticuerpo secundario - Antígeno - Antisuero o suero policlonal - Control negativo - Control positivo - Epítopo - Inmunohistoquímica - Reacción cruzada - Recuperación antigénica Procesamiento Citológico y Tisular PUNTOS CLAVE Los anticuerpos pueden ser policlonales (activación de distintos clones de linfocitos B) y monoclonales (proceden de un clon individual de células plasmáticas). Para el marcaje del anticuerpo se utiliza una enzima. La reacción antígeno-anticuerpo se visualiza añadiendo, al final de la reacción, una sustancia denominada cromógeno. Al actuar la enzima sobre el anticuerpo interactúa a su vez sobre el cromógeno y da lugar a un precipitado insoluble y coloreado. La inmunohistoquímica permite la localización de moléculas en tejidos. La inmunofluorescencia es un proceso que consiste en una reacción antígenoanticuerpo. Los fluorocromos son moléculas que emiten luz visible cuando se las ilumina con una determinada longitud de onda. El fundamento de los enzimoinmunoensayos es evidenciar la interacción de antígenoanticuerpo utilizando alguno de los inmunorreactantes marcados con una enzima capaz de desarrollar una reacción colorimétrica. La recuperación antigénica es un método que permite recuperar la inmunorreactividad de los tejidos, pérdida por los procesos de fijación. Todos los equipos utilizados implementan calor o humedad.
