ManualBIOTECNOLOGIA-vegetal

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Manual de Biotecnología Vegetal
Book · November 2013
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3 authors:
Rafael Soltero
Liberato Portillo
University of Guadalajara
University of Guadalajara
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SEE PROFILE
Fernando Santacruz-Ruvalcaba
University of Guadalajara
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Fenologìa y micropropagaciòn de magnolias View project
Desarrollo agroindustrial de opuntia ficus indica View project
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SEE PROFILE
Manual de Biotecnología Vegetal
Segunda edición
Soltero, R., L. Portillo y F. Santacruz-Ruvalcaba
Departamento de Botánica y Zoología
CUCBA
Universidad de Guadalajara
DIRECTORIO
Mtro. Itzcóatl Tonatiuh Bravo Padilla
Rector General de la Universidad de Guadalajara
Dr. Miguel Ángel Navarro Navarro
Vicerrector Ejecutivo
Mtro. José Alfredo Peña Ramos
Secretario General
Dr. Salvador Mena Munguía
Rector del CUCBA
Mtro. Salvador González Luna
Secretario Académico
Mtro. José Rizo Ayala
Secretario Administrativo
Dr. Carlos Beas Zarate
Director de la División de Ciencias Biológicas y Ambientales
Dr. Ramón Rodríguez Macías
Jefe del Departamento de Botánica y Zoología
3
La presentación y disposición en conjunto de:
Manual de Biotecnología Vegetal
Segunda edición
D. R. © 2013, Universidad de Guadalajara
Av. Juárez 976, Guadalajara, Jal., 44100 México
Primera edición 2006
Segunda edición 2013
Es propiedad de los autores
© Soltero, R., L. Portillo y F. Santacruz-Ruvalcaba
Ninguna parte de esta obra puede ser reproducida o transmitida, mediante ningún sistema o
método, electrónico o mecánico (INCLUYENDO EL FOTOCOPIADO, la grabación o cualquier
sistema de recuperación y almacenamiento de información), sin consentimiento por escrito
de los autores.
Diseño y edición:
Rafael Soltero
Ilustraciones y fotografías:
Rafael Soltero
Liberato Portillo
Fernando Santacruz Ruvalcaba
ISBN: 978-607-507-286-9
Impreso en México
Printed in Mexico
PRÓLOGO
A
ntes que nada, quiero agradecer a mis amigos por darme la posibilidad de presentar
esta nueva versión del Manual de Biotecnología Vegetal. Es notable la claridad y
sencillez con que se explican todos los métodos y procedimientos, lo que refleja las
habilidades y destrezas de los autores para describir cada una de las prácticas. De
igual manera se refleja la experiencia acumulada durante su enseñanza teórico-práctica y
la de sus compañeros de trabajo que han aportado conocimientos y enseñanzas para este
manual.
Se incorporan nuevas técnicas en diferentes aspectos teóricos y prácticos de la Biotecnología
vegetal, con la intención de que sean utilizadas por alumnos, profesores e investigadores
interesados en el área. Comprende el conocimiento y las experiencias acumuladas de
los autores, plasmados en la descripción de técnicas y en diversas herramientas para la
micropropagacion y regeneración de diversas especies vegetales, así como para explicar
algunos fenómenos fisiológicos en el control hormonal de las plantas.
Estoy segura que este manual facilitará el aprendizaje de los interesados en el tema y que
al igual que la primera versión, ésta será un éxito.
Aprovecho la oportunidad para felicitar a los autores por su excelente trabajo.
Dra. Antonia Gutiérrez Mora
Director de la Unidad de Biotecnología Vegetal
Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología
y Diseño del Estado de Jalisco, A.C.
5
CONTENIDO
PÁGINA
Reglamento del Laboratorio
de Prácticas de Biotecnología 9
Recomendaciones de seguridad
en el laboratorio 11
PRÁCTICA 1
Preparación de medios de cultivo17
PRÁCTICA 2
Desinfección y establecimiento de cultivos asépticos
PRÁCTICA 3
Propagación de crisantemo (Chrysanthemum sp.) por cultivo de nudos
PRÁCTICA 4
Propagación de cactos por proliferación de brotes axilares
21
25
29
PRÁCTICA 5
Organogénesis en tabaco (Nicotiana tabacum L.)33
FIGURAS
3a, 3b y 3c, correspondientes a las prácticas 3, 4 y 5
37
PRÁCTICA 6
Regeneración por organogénesis de violeta africana
(Saintpaulia ionantha Wendl)39
PRÁCTICA 7
Embriogénesis somática en zanahoria (Daucus carota L.)
43
PRÁCTICA 8
Embriogénesis somática indirecta en Agave tequilana Weber47
FIGURAS
4a, 4b y 4c, correspondientes a las prácticas 6, 7 y 8 51
PRÁCTICA 9
Tinción diferencial de embriones somáticos de diversas
especies vegetales53
PRÁCTICA 10
Eliminación del transporte polar de auxinas
57
7
CONTENIDO
PÁGINA
PRÁCTICA 11
Adaptación de plantas propagadas por cultivo de tejidos
a condiciones de invernadero61
FIGURAS
5a, 5b y 5c, correspondientes a las prácticas 9, 10 y 11 65
Anexos
66
8
REGLAMENTO DEL LABORATORIO
DE PRÁCTICAS DE BIOTECNOLOGÍA
E
l seguimiento del presente reglamento tiene como finalidad guardar la seguridad de los
usuarios, así como optimizar el uso de los espacios físicos, equipos, material y reactivos
del laboratorio.
1. Toda persona, sin excepción, que haga uso del laboratorio deberá acatar el presente
reglamento.
2. El laboratorio se encuentra destinado a las prácticas de las materias de la Academia
de Biología Aplicada.
3. Es obligación de los profesores de este laboratorio dar a conocer el presente
reglamento a sus alumnos.
4. Los alumnos deberán trabajar bajo la supervisión de un profesor, no permitiéndose
por consiguiente que alumnos trabajen solos dentro del laboratorio.
5. Para el trabajo de laboratorio, los usuarios deberán portar bata blanca, de lo
contrario se les negará el acceso a éste.
6. Queda prohibido el consumo y almacenamiento de cualquier tipo de alimento,
bebidas o material voluminoso por tiempo prolongado, así como material biológico
contaminante.
7. Estrictamente prohibido fumar y tomar bebidas embriagantes.
8. El uso de equipo deberá ser notificado previamente al responsable del laboratorio.
Los alumnos deberán leer cuidadosamente las instrucciones de uso que están
colocadas junto a los equipos y utilizarlos bajo la responsabilidad del profesor.
9. El uso de estufas, hornos o incubadoras no deberá ser por más tiempo del necesario,
los usuarios deberán registrarse en las hojas de registro anexos a estos equipos.
10. El material de cristalería deberá ser solicitado al responsable del laboratorio y
deberá ser entregado limpio y seco.
11. En caso de daño o pérdida de material o equipo el alumno deberá reportarlo al
profesor o al encargado del laboratorio y en caso de romper material deberá
reponerlo con otro de iguales características.
12. El uso de solventes y reactivos deberá hacerse bajo la supervisión del profesor de la
materia. Es altamente recomendable usar equipo de protección. Todas las soluciones
que se preparen deberán ir debidamente rotuladas (concentración, nombre de la
solución y de la persona que lo preparó, fecha, etcétera) y almacenadas.
13. Queda prohibido dejar material sucio, reactivos y objetos sobre la mesa de trabajo.
Deberá mantenerse limpia el área de trabajo, limpiando inmediatamente cualquier
derrame.
9
14. En caso de ser el último en dejar el laboratorio deberá asegurarse de desconectar
los equipos que no estén en uso y cerrar con llave la puerta de acceso.
15. Cualquier observación de mal uso del laboratorio, anomalía o desperfecto deberá
ser reportada inmediatamente al profesor responsable.
16. Las llaves de paso para el agua y el gas se encuentran en la parte de abajo de la
tarja frente a la puerta de acceso al laboratorio.
17. Las violaciones al presente reglamento ocasionará sanciones administrativas,
desde económicas hasta el impedimento temporal del uso del laboratorio, de
acuerdo a la reunión efectuada el 18 de diciembre del 2002, por los miembros de
la Academia de Biología Aplicada.
10
RECOMENDACIONES DE SEGURIDAD
EN EL LABORATORIO
Autoclave: Este equipo trabaja a alta presión y en cada proceso de esterilización debe
cuidarse el nivel del agua y cerrar las manivelas correctamente, por lo que nunca se debe
sobrecargar. El tiempo de esterilización se cuenta cuando la presión está entre 18 a 22 lb/
in2 (1.2-1.3 kg/cm2) y 121 °C o cuando la válvula de seguridad empieza a desfogar. Una vez
transcurrido el tiempo de esterilización (15-20 min) y antes de abrir la autoclave, la presión
debe igualarse a la del ambiente abriendo la válvula de desfogue. Es requisito observar que
la aguja del manómetro indique 0 lb/plg2 (0 kg/cm2) además de asegurarse que la válvula
manual haya liberado el vapor acumulado, aun así hay que considerar que al abrir la tapa
saldrá vapor muy caliente por lo que hay que usar bata y guantes de asbesto.
Campana de flujo laminar: Al trabajar en una campana de flujo laminar se debe considerar que
existe un mechero con flama constante y un recipiente con alcohol que se usan para flamear
continuamente el instrumental (pinzas, bisturí, etcétera). Es conveniente observar que ambas
fuentes (flama y combustible) estén en extremos opuestos dentro de la campana; cuando
algún instrumento se lleve a esterilizar a la flama, no se debe regresar inmediatamente
al recipiente con alcohol pues existe el riesgo de encenderlo. Asimismo, el uso de la luz
ultravioleta no debe activarse mientras se trabaja en este equipo. Si el flujo de aire le produce
irritación en los ojos, debe usar lentes protectores.
Horno de esterilización por calor seco: El instrumental y cristalería que se introduce en este
aparato para su esterilización, regularmente está en un contenedor metálico o envuelto en
papel aluminio, al tomarlo se debe tener precaución de hacerlo una vez frío o con guantes
de protección para evitar daño por quemaduras, ya que la temperatura que alcanza es de
hasta 250 °C y el metal y vidrio se enfrían lentamente.
Horno de microondas: El uso de este equipo está destinado principalmente para licuar los
medios de cultivo. Se debe tener especial cuidado al extraerlos, para lo cual es conveniente
hacer uso de guantes de asbesto. Asimismo, es recomendable no agitarlos cerca del rostro o
de otra persona, ya que puede proyectarse el líquido en ebullición y resultar en quemaduras
en la piel. El tiempo necesario para calentar líquidos puede variar dependiendo de la marca,
el modelo y el volumen a licuar.
Parrilla de agitación con calentamiento: El principal uso de este equipo está destinado para la
homogenización de los diversos compuestos de un medio de cultivo. Cuando se requiera el
uso de temperatura mayor a la del ambiente, se deberán utilizar recipientes de cristal, así
como evitar tocar la superficie de la parrilla. Para utilizar la barra magnética en recipientes
de vidrio hágalo deslizándola por las paredes. Mantenga una vigilancia constante sobre la
agitación y no lo haga a velocidades muy altas.
11
Botiquín, regadera y lavaojos: El laboratorio cuenta con un botiquín de primeros auxilios,
lavaojos y regadera que se encuentran a la vista. En caso que entre en contacto con sus
ojos alguna sustancia, utilice el lavaojos solamente con la solución especial que contiene
la botella plástica. En caso necesario la regadera esta cerca de la entrada del laboratorio
y siempre funciona, jale fuerte de la cadena metálica y colóquese directamente bajo la
regadera (cualquier uso indebido de los sistemas de seguridad será sancionado).
12
USO DE EQUIPOS DIVERSOS
Potenciómetro
Este aparato permite conocer el pH de diferentes soluciones, expresa el logaritmo negativo de
la actividad del ión hidrógeno en escala de 0 a 14 (ácido a alcalino). Se utiliza principalmente
para ajustar el pH de los medios de cultivo después de agregar todas las sustancias que
requiere excepto el gelificante y el carbón activado. Es conveniente calibrar el potenciómetro
con una solución de pH de referencia (4, 7, ó 10) antes de tomar las lecturas para que sean más
exactas. La lectura de pH puede tardar varios segundos en aparecer estable en la pantalla,
si una lectura cambia constantemente no se puede considerar correcta. Después de haber
conocido el pH de la solución es necesario llevarlo al nivel adecuado que generalmente es
de 5.8 para lo cual se utilizan soluciones ácidas (HCl 0.1 y 1.0 N) o alcalinas (NaOH 0.1 y 1.0
N) para llevar el pH hasta el nivel deseado, estas soluciones ajustadoras se deben agregar
gota a gota en el medio en agitación para que se integren rápidamente, aún así el cambio
en la lectura podría tardar algunos segundos. Después de usar el potenciómetro, lave y
seque el electrodo y coloque nuevamente su cubierta que siempre debe contener buffer.
Las soluciones para ajustar el pH pueden ser irritantes al contacto con la piel, los ojos o la
boca, manéjelas con precaución.
Agitador orbital
Es utilizado para agitar los cultivos de células en suspensión, permitiendo la disolución del
aire en el medio para mantener oxigenado el cultivo. Antes de colocar o retirar cultivos del
agitador debe estar apagado, es importante que los matraces o recipientes estén puestos en
sujetadores o adheridos a la superficie con alguna cinta adhesiva lo suficientemente fuerte
para evitar que los contenedores se caigan durante la agitación, no utilice velocidades de
agitación muy altas al menos que sea estrictamente necesario, la mayoría de las células
vegetales en cultivo requieren entre 100 a 120 rpm. Es conveniente que los matraces que se
utilicen sean de al menos el doble de capacidad del volumen de medio utilizado. Si necesita
modificar la velocidad de agitación y hay otros cultivos en el agitador tiene que preguntar
si esto podría afectarlos.
Balanza analítica
La preparación de reactivos en cultivos de tejidos vegetales requiere del manejo de peso
de gran precisión, por lo que se requiere el uso de balanzas electrónicas con sensibilidad
al menos de cuatro decimales de gramo (0.0000 g). La calibración de balanzas deberá ser
llevada a cabo por el encargado de laboratorio o por el profesor responsable, por ello los
botones de ajuste no serán manejados por los alumnos. Los únicos botones que serán
utilizados por los alumnos son los de encendido/apagado y el de tarar.
Para usar una balanza analítica, quite la cubierta plástica, asegúrese del paso de corriente
eléctrica, oprima el botón de encendido, permita que se inicie el programa y la pantalla
indique 0.0000 g. Enseguida abra la vitrina y coloque sobre la platina de la balanza, una
charola de peso del tamaño adecuado para el volumen del reactivo a pesar. Presione el
botón de tarar para despreciar el peso de la charola y llevar de nuevo a cero la lectura.
13
Utilice espátula para el manejo del reactivo, es conveniente depositarlo gradualmente para
no rebasar el peso buscado y así evitar tener que regresar reactivo manipulado a su depósito
(lo que nunca es recomendable). Si existe alguna corriente de aire, la lectura del peso no se
estacionará hasta que cierre la vitrina. Una vez alcanzado el peso deseado oprima el botón
de apagado y sin hacer presión sobre la platina de la balanza, tome con cuidado la charola
con el reactivo que ha pesado y cierre la vitrina.
Si durante el proceso de pesado, se observan residuos en la platina de la balanza, luego
de cortar la corriente eléctrica y con ayuda de una brocha de pelo suave, retírelo sin hacer
presión.
Al terminar de usar la balanza, limpie cualquier residuo derramado, asegúrese de cubrir
y desconectarla de la corriente eléctrica mediante el apagado del regulador de voltaje o
supresor de picos.
Micropipetas
Algunas sustancias como las auxinas y citocininas, deben disolverse en líquido antes de
utilizarse. Para medir y agregar estas soluciones, se utilizan las micropipetas, ya que permiten
el manejo de pequeños volúmenes de forma muy precisa dependiendo de la capacidad: de
1 a 10 μL, de 10 a 100 μL y de 100 a 1000 μL (recuerde que 1 mL equivale a 1000 μL). Al
presionar el pulsador suavemente se sienten dos topes, el primero es para expeler el aire
que equivale al volumen a tomar del líquido en medición, el segundo se utiliza para expeler
el residuo que quedan en las puntas. La parte superior de las micropiopetas presentan
un botón giratorio con flechas de indicación más o menos volumen, estas se mueven en
dirección del volumen buscado, el cual se podrá leer en los números de la ventana lateral.
Nunca debe rebasar los límites mínimo y máximo de lectura de la micropipeta, ya que si es
forzado el sistema, éste se desajustará e inclusive se puede desarmar su mecanismo, lo que
la inutilizará y hará necesario su reparación en taller calificado. Para tomar la solución en
medición, se utilizan puntas de plástico desechables, mismas que se ajustan perfectamente
a la parte basal de las micropipetas de acuerdo a su capacidad.
Para usar una micropipeta, tómela cuidadosamente de su empaque, coloque la punta
correspondiente para el volumen que va a medir, ajuste los microlitros (μL) requeridos
mediante el botón giratorio, presione hasta sentir el primer tope, introduzca la punta en la
solución a medir, suelte la presión para permitir la succión, luego de tomada la muestra,
cuide de no invertir la micropipeta, llévela hasta donde será expulsada la muestra, lo que
se hará al presionar de nuevo hasta el primer tope, si quedó algún residuo, presione hasta
el fondo para liberarlo. Cambie de punta cada vez que mida un diferente reactivo. Deposite
las puntas usadas en un recipiente sin tocarlas con los dedos, de tal manera que no se
revuelvan con aquellas sin usar.
Al terminar de usar una micropipeta, guárdela en su empaque respectivo.
Refrigerador
Varios reactivos, sustancias y medios de cultivo se deben conservar en refrigeración, pero
antes de introducir cualquier material al refrigerador, éste debe ser rotulado con el nombre,
concentración, fecha de elaboración, etcétera. Es importante conocer a que temperatura
debe ser conservado, si es menor de 0 °C (congelador) o mayor (refrigerador).
El material dentro del refrigerador debe estar colocado en recipientes libre de suciedad,
y cualquier medio contaminado es conveniente desalojarlo y llevarlo a la autoclave para
esterilizarlo.
14
El refrigerador debe limpiarse al menos una vez al mes y cuando algún material se haya
derramado. Para ello debe desconectarse de la corriente eléctrica y usar guantes plásticos
para evitar el contacto con posibles sustancias peligrosas.
Microscopios
Para observar las células, tejidos y estructuras morfogénicas vegetales, es necesario
hacer uso de microscopios, el más utilizado es el de bajos aumentos con enfoque amplio
(estereoscopio), pero también se usa el microscopio compuesto (con objetivo de inmersión).
El microscopio de bajos aumentos es muy útil para observar estructuras morfogénicas
como brotes, raíces y embriones somáticos, en tanto que el microscopio compuesto ayuda
bastante para observar detalles de tejidos y células individuales.
Para usar el microscopio de bajos aumentos primero se conecta a la corriente eléctrica,
posteriormente se enciende y se ajustan los oculares a las dimensiones del rostro del
observador. Las muestras deben ser colocadas siempre sobre una caja de Petri, nunca
directamente sobre la platina del microscopio. Se enfoca luego de cada cambio de aumento,
por lo que existen dos botones giratorios, uno para graduar los aumentos y otro el enfoque.
Cuide de no tocar los objetivos con la muestra, si esto sucede limpie inmediatamente con
papel y solución limpiadora de microscopios.
Puede cambiar la fuente e intensidad de luz para mejores contrastes, incluso muchas veces
al modificar el color del fondo de la platina, hace que la muestra tenga mejor resolución
visual.
El microscopio compuesto es de uso delicado, por lo que debe ser manejado con mayor
precaución. Luego de encenderlo y ajustar los oculares al rostro del observador, la muestra
que siempre debe ir en un portaobjetos y con cubreobjetos, se desliza y sujeta sobre la
platina. De inicio se hace una exploración del campo visual con el objetivo más pequeño
disponible, generalmente el de diez aumentos (10x), para ello se gira el revólver que contiene
hasta ubicar el objetivo deseado. El lado derecho del microscopio presenta varios botones
giratorios, cerca de la platina existen dos que sirven para moverla en ambos sentidos, de
izquierda a derecha y de atrás hacia adelante; otros dos ajustan el enfoque, el mayor de ellos
realiza enfoques con amplios movimientos, en tanto que el pequeño los hace de una manera
más fina. Los avances hacia mayores aumentos (20, 40 ó 100x) se hace de manera gradual,
luego de ubicar en cada paso el campo visual de interés. El único objetivo de inmersión es
el de 100x, después de haber ubicado el campo a observar, se coloca una gota de aceite
de inmersión sobre el portaobjetos de la muestra, se baja con el botón giratorio de enfoque
fino, hasta que entren en contacto el objetivo de 100x y el aceite de inmersión. Siempre
se debe cuidar que ningún objetivo toque el cubreobjetos, ya que puede mover la muestra
debajo de él, e incluso llegar a romper el portaobjetos.
La luz se puede modificar en intensidad y reflexión, para ello haga uso del diafragma y del
botón regulador, con ello podrá ubicar la mejor resolución visual.
Adaptador de video
Este equipo es de uso delicado y sólo debe hacerlo bajo la supervisión de un profesor, la
cámara de video está conectada al tubo triocular de un microscopio óptico para observar
preparaciones planas en portaobjeto con su respectivo cubreobjeto. Es importante revisar
las conexiones de la cámara de video a la pantalla para que se transfiera la imagen, la
pantalla debe estar en formato de video para recibir la señal.
15
Nota: Todo equipo que necesita energía eléctrica, debe de tomarla a través de un regulador de
voltaje con clavijas de tres puntas (con descarga a tierra). Después de usar el equipo antes
de guardarlo debe limpiar cualquier resto de suciedad. Para el caso de los microscopios use
papel especial para este tipo de aparatos.
MANEJO DE SUSTANCIAS PELIGROSAS
Son pocas las sustancias peligrosas que se manejan en las prácticas de Biotecnología
vegetal pero no por eso se debe descuidar su manejo. Los reguladores de crecimiento
sintéticos como el 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético) y el TDZ (tidiazurón) se consideran
sustancia peligrosas y nunca deben manejarse sin equipo de protección como mascarilla o
cubrebocas en el momento de pesarlos y guantes para manejarlos. Nunca se debe permitir
el contacto con la piel u otras partes del cuerpo, tampoco los medios de cultivo que los
contengan deben tocarse, a pesar de que se utilizan en concentraciones muy bajas es
conveniente tener en cuenta el riesgo que representan, ya que pueden ser mutagénicos y
potencialmente cancerígenos.
El uso del hipoclorito de sodio (blanqueador comercial) debe hacerse con sumo cuidado,
ya que es una sustancia corrosiva e irritante al contacto con partes sensibles del cuerpo, es
recomendable usar guantes y cubreboca para su manejo y es obligatorio utilizar perilla de
extracción si va a ser manejado con pipeta (ninguna sustancia de debe pipetear con la boca).
Las sustancias que se utilizan para ajustar el pH del medio (HCl y NaOH 0.1 ó 1.0 N) pueden
ser irritantes al contacto con la piel o mucosas, de llegar a ocurrir se debe lavar con agua
abundante.
Algunas sales minerales también pueden ser irritantes al contacto e inhalación, es conveniente
leer las etiquetas para tener información sobre su manejo.
Manejo seguro de azul de Evans (práctica 9). Este reactivo viene previamente preparado en
viales, su manejo debe hacerse mediante pipetas Pasteur con uso de guantes desechables
y lentes protectores sobre un área cubierta de papel absorbente. El colorante ya usado
y los materiales (guantes, papel, instrumental, viales, etcétera) que tuvieron contacto con
el reactivo, deberán ser sumergidos por 10 min en una solución de detergente con cloro
comercial, para luego desecharse o lavarse de manera convencional.
16
PRÁCTICA 1
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
Introducción. El manejo de cualquier organismo dentro del laboratorio implica necesariamente
su cultivo y en algunos casos su propagación, para lo cual se requiere un medio que
sustente a la planta, tejido o célula y le proporcione los nutrimentos, agua, vitaminas,
azúcares, etcétera, indispensables para mantenerlos con vida y realizar diferentes procesos
morfogénicos que son altamente demandantes de energía y nutrientes, además, que son
mediados por sustancias reguladoras del crecimiento. Normalmente, las plantas absorben
esos nutrientes del suelo, casi todos como iones; un Ion es un átomo, o grupo de átomos,
los cuales tienen carga positiva (catión) y carga negativa (anión). En cultivo in vitro, los
macro y micronutrientes son proveídos por los medios de cultivo preparados con sales, las
cuales en solución acuosa se disocian en cationes y aniones. De acuerdo a George (1993),
un medio de cultivo básico está compuesto por macro y micronutrientes, vitaminas, fuentes
de carbono y un agente gelificante (si el medio es semisólido). Entre los elementos más
importantes se considera el Nitrógeno (Clarkson y Hanson, 1980), muy importante para el
desarrollo y mofogénesis en cultivo in vitro; el fósforo porque interviene en los procesos de
transferencia de energía y producción de ácidos nucleicos y proteínas (George 1993), y el
potasio como catión principal porque permite el balance de las cargas así como la regulación
del potencial osmótico de las células. El medio de cultivo más exitoso (MS) es el formulado
por Murashige y Skoog (1962), del cual se han derivado el resto, al hacer las modificaciones
de acuerdo a los requerimientos de las especies estudiadas.
Objetivo. Preparar medios de cultivo que serán utilizados en otras prácticas.
Metodología.
Preparación de concentrado del medio de cultivo MS:
1. Multiplicar las cantidades de los componentes del medio (sales minerales) por 10 para
obtener concentrado para 10 L de medio.
2. Pesar y disolver cada una de las cantidades (excepto el Na2 EDTA y el FeSO4) en
aproximadamente 500 mL de agua destilada o desionizada en constante agitación.
3. Disolver por separado el Na2 EDTA y el FeSO4 para obtener la forma quelatada y
asimilable del hierro.
4. Adicionar el compuesto quelatado al resto de los componentes.
5. Adicionar las vitaminas si éstas son requeridas.
6. Adicionar la sacarosa o azúcar, disolver y aforar a 1 L.
7. Vaciar en diez frascos con 100 mL de concentrado cada uno, que contendrá los
componentes de 1 L de medio. Mantenerlos en congelación.
17
Preparación del medio de cultivo a partir de concentrado (Figura 1):
1. Descongelar el concentrado en horno de microondas por 1 min.
2. Agregar los reguladores de crecimiento u otros aditivos si los requiere (excepto el agar
o gelificante).
3. Aforar a 1 L con agua destilada o desionizada.
4. Ajustar el pH de la solución a 5.8 ± 0.03
5. Separar la solución en dos matraces de 1 L de capacidad con 500 ml en cada uno.
6. Agregar el agar u otro gelificante y fundir en horno de microondas por aproximadamente
5 min (dependiendo del horno) hasta antes de ebullición, el medio debe tornarse
cristalino.
7. Dejar enfriar por unos minutos y verter aproximadamente 25 mL en cada frasco
(menos volumen para tubos de ensaye), tapar y poner a esterilizar en autoclave entre
18 y 22 lb/in2 (1.2-1.3 kg/cm2), 121 ºC durante 15 min.
8. Si el medio se va a verter en cajas de Petri (ya sean de vidrio o de plástico previamente
esterilizadas) éste se esteriliza en el matraz tapado con papel aluminio y posteriormente
se vierte en los recipientes en la cámara de flujo laminar.
9. Se deja enfriar de preferencia en la campana de flujo laminar, ya gelificado se puede
utilizar o refrigerar para su posterior uso.
Nota: es necesario rotular los recipientes para saber el tipo de medio que contienen.
8
pH 5.8
1,2 y 3
4
5y6
7
Figura 1. Diagrama de flujo que muestra la secuencia en la preparación del medio de cultivo.
Literatura citada
Clarkson, D. T. y Hanson, J. B. 1980. The mineral nutrition of higher plants. Ann. Rev. Plant
Physiol. 31: 239-298.
George, E. F. 1993. Plant Propagation by Tissue Cultures. The Technology. Exegetics Ltd.
(Eds.). Edington, Inglaterra. pp.: 274-243.
Murashige, T. y Skoog, l. 1962. A revised medium for rapid growth and bio-assays with
tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473-497.
18
RESULTADOS
19
CUESTIONARIO
1. Describa con sus propias palabras que es un medio de cultivo:
2. ¿Cuales son los componentes del medio MS y los aditivos que contiene el concentrado?
Nombre del compuesto
Fórmula
mg/L
Aditivos: Nombre de la mezcla
cantidad
Fuente de carbono
cantidad
3. ¿Qué relación mantiene el EDTA con la asimilación del Fe?
4. ¿Por qué se debe ajustar el pH del medio?
5. Bibliografía consultada
20
PRÁCTICA 2
DESINFECCIÓN Y ESTABLECIMIENTO DE CULTIVOS ASÉPTICOS
Introducción. El establecimiento del cultivo en forma aséptica es una de las etapas cruciales
y más difíciles en la micropropagación de plantas, consiste en la desinfección superficial
(en algunas ocasiones sistémica) del material vegetativo que se pretende establecer in
vitro. Las plantas provenientes del campo, de vivero o de invernadero están expuestas a
una gran cantidad y variedad de gérmenes que se encuentran en el aire, suelo o hasta en la
misma planta, estos microorganismos son capaces de proliferar rápidamente en los medios
de cultivo, ya que contienen agua, azucares y nutrientes favorables para su desarrollo.
Al establecer un cultivo se debe evitar la aparición de cualquier microorganismo, ya que
además de interferir el crecimiento de la planta, liberan toxinas al medio de cultivo que
pueden llegar a matar a la planta. La calidad de las plantas propagadas se puede ver
disminuida por el efecto de los contaminantes. Las etapas que son necesarias para una
efectiva descontaminación dependen de la naturaleza del vegetal y del tipo de explante a
utilizar (George, 1993). El desinfectante más utilizado es el hipoclorito de sodio o calcio por
su actividad bactericida y fungicida a un pH entre 6 y 7 (Dychdala, 1977). Utilizar alcohol
etílico con esos propósitos algunas veces es efectivo (Higuchi y Amaki, 1989), excepto para
las semillas de cactáceas. También se han utilizado otras soluciones como cloruro de
mercurio, sin embargo, por su efecto tóxico y daños en el ambiente, no se recomienda a
pesar del éxito en algunos procesos como desinfectante de semillas de betabel (Powling y
Hussey, 1981). También se ha utilizado peróxido de hidrógeno o permanganato de potasio.
Objetivo. Conocer los diferentes métodos de desinfección para establecer plantas en
condiciones de asepsia.
Metodología. Como se mencionó anteriormente existen diferentes sustancias que pueden
utilizarse en la desinfección de material vegetativo, como el hipoclorito de calcio, hipoclorito
de sodio, cloruro de mercurio y otros, de los cuales el más utilizado es el hipoclorito de
sodio (NaOCl) o blanqueador comercial que generalmente contiene 6 % de cloro activo, el
cual es muy eficaz y fácil de remover al final del proceso.
Se utilizan diferentes concentraciones y tiempos de exposición dependiendo del material
que se va a desinfectar, por ejemplo, las semillas pueden exponerse a concentraciones
del 50 % v/v de hipoclorito de sodio y agua estéril, hasta por 15 min, en el caso de tejidos
delicados y frágiles se recomiendan concentraciones de 10 % v/v pero se aumenta el
tiempo. Es recomendable agregar unas gotas de tween o detergente líquido para romper la
tensión superficial del agua, esto ayuda en la desinfección de semillas y tejidos rugosos.
Es necesario realizar tres o cuatro enjuagues con agua estéril para remover los residuos del
desinfectante. El material frágil como las hojas de violeta africana se manejan con cuidado
ya que pueden ser lastimadas con las pinzas si se presionan con fuerza. Las semillas o
21
tejidos pequeños se deben colocar en una malla de tela y cerrar con pinzas Kelly para evitar
que se dispersen en la solución (Figura 2). Todo el proceso anteriormente descrito debe
hacerse dentro de la camara de flujo laminar y con las medidas asépicas pertinenetes.
Alcohol
96 %
Solución de
NaOCl + humectante
T
res enjuagues con agua
d estilada estéril
Siembra
o cultivo
Figura 2. Secuencia en el proceso de desinfección.
Nota: a los 3 ó 4 d de cultivo se observa si los explantes fueron desinfectados exitosamente. Detectar la
aparición de microorganismos como bacterias y hongos (mohos y levaduras). Si las colonias de bacterias u
hongos (sin esporular) no tienen contacto con el explante, éste, pueden ser transferido a un nuevo medio.
Literatura citada
Chalupa, D. 1979. In vitro propagation of some broad-leaved forest trees. Common. Inst.
Forest. Cechoslov. 11,159-170.
Dychdala, G. R. 1977. Densinfectation, sterilization and preservation. Block S.S. (Ed.). Lea
and Fchiger, Philadelphia. EUA. pp. 167-195.
George, E. F. 1993. Plant Propagation by tissue cultures. The Technology. Exegetics Ltd
(Eds.). Edington, Inglaterra. pp: 117-129.
Higuchi, H. y Amaki, W. 1989. Effects of 6-bencylaminopurine on the organogenesis of
Asplenium nidus L. through in vitro propagation. Scientia Hort.37: 351-359.
Powling, A. y Hussey, G. 1981. Establishment of aseptic cultures of sugar beet. Ann. Rep.
John Innes Inst. 1980. p. 60.
22
RESULTADOS
23
CUESTIONARIO
1. ¿Puede ser esterilizado el material vegetal? _______, ¿Por qué?
2. ¿Cómo explica la aparición de contaminantes en:
b) en la superficie del medio, c) en el explante?
a) dentro del medio de cultivo,
a)
b)
c)
3. ¿Pueden ser eliminados los virus mediante desinfección superficial?____, ¿por qué?
4. ¿A qué se le llama contaminación sistémica y como se elimina?
5. Bibliografía consultada
24
PRÁCTICA 3
PROPAGACIÓN DE CRISANTEMO (Chrysanthemum sp.)
POR CULTIVO DE NUDOS
Introducción. Cuando se requiere clonar plantas sin correr el riesgo de la aparición de
variaciones genéticas en el material, se recomienda aplicar métodos en los cuales se utilicen
yemas meristemáticas vegetativas preexistentes, las cuales se encuentran en los ápices
de crecimiento y en las axilas de las hojas, estas yemas tienen la capacidad intrínseca de
desarrollarse en brotes con o sin el estímulo de los reguladores de crecimiento; los brotes
ya formados deben pasar por una fase de enraizamiento para poder obtener las plantas
completas que son consideradas como clones genéticamente uniformes. Una de las
desventajas de este sistema es que, si el material madre está contaminado con virus, los
clones de nuevas plantas eventualmente también podrían estarlo. No obstante el proceso ha
sido muy largo desde los primeros intentos por micropropagar brotes de maíz y algodón por
Robbins (1922), quién los colocó en medio líquido con azúcar y en la oscuridad, los brotes
desarrollaron raíces. Loo (1945; 1946) presentó las siguientes observaciones: El crecimiento
depende de la concentración de sacarosa, la cual es más necesaria en condiciones de
oscuridad. Los explantes pueden crecer en medio con 0.5 % de agar. El desarrollo in vitro
puede continuar indefinidamente; el cultivo de brotes es una manera de propagar material
vegetal a gran escala, lo cual es una realidad demostrada con el cultivo de papa (Akita y
Takayama, 1988), plátano (Mante y Tepper, 1983) o caña de azúcar (Taylor y Dukic, 1993),
los cuales son los métodos de mayor uso comercial.
Objetivo. Demostrar la capacidad de los meristemos axilares de crisantemo para generar
plantas con uniformidad genética.
Materiales y métodos. Se utilizarán plantas asépticas de crisantemo previamente establecidas
in vitro, de las cuales se cortarán fragmentos de tallo (nudos) que contengan una hoja con
su correspondiente meristemo axilar, serán sembrados cinco nudos por frasco en medio MS
suplementado con las vitaminas L2 (ver anexos) y MS con 4 g/L de carbón activado.
Nota: Es necesario mantener la polaridad de los explantes, por lo tanto no se debe remover la hoja para saber
cual es su posición correcta.
Incubación. Se colocan a 27 °C con fotoperiodo de 18 h a 2000 lux de intensidad.
Nota: a los 7 d de cultivo se inicia la formación de estructuras radiculares estimulada por la síntesis de auxinas
de la hoja. A los 15 d aparece el brote y las raíces se encuentran completamente desarrolladas, en ese momento
se considera que se tiene la planta completa. A los 30 d de cultivo se puede calcular la tasa e propagación y
las plantas pueden ser transferidas a condiciones de invernadero o resembradas para multiplicar el material
hasta tener la cantidad de plantas deseada (Figura 3a, pág. 37).
Nota: La transferencia de plantas de crisantemo a condiciones de invernadero se presenta en la práctica
número 11.
25
Literatura citada
Akita, M. y Takayama, M. 1988. Mass production of potato tubers using jar fermentor
techniques. Acta Hort. 230: 55-61.
Loo, S. W. 1945. Cultivation of excised stem tips of Asparagus in vitro. Am. J. Bot. 32: 13-17.
Loo, S. W. 1946. Further experiments on the culture of the excised Asparagus tips in vitro.
Am. J. Bot. 33: 156-159.
Mante, S. y Tepper, H. B. 1983. Production of Musa textiliis Nee plants from apical meristem
slices in vitro. Plan Cell Tiss. Org. Cult. 2: 151-159.
Robbins, W. J. 1922. Cultivation of excised root tips and stems tips under sterile conditions.
Bot. Gaz. 73: 376-390.
Taylor, P. W. J. y Dukic, S. 1993. Development of an in vitro culture technique for conservation
of Saccharum officinarum spp. hybrid germoplasma. Plan Cell Tiss. Org. Cult. 34: 217222.
26
RESULTADOS
27
CUESTIONARIO
1. ¿Cuáles son las dos razones por las que no se removió la hoja de los explantes?
1)
2)
2. Calcule la tasa de propagación de crisantemo a 6 meses
3. ¿Se espera variabilidad genética en los clones obtenidos de crisantemo? __________
¿por qué?
4. ¿Qué importancia tiene el crisantemo?
5. Bibliografía consultada
28
PRÁCTICA 4
PROPAGACIÓN DE CACTOS POR PROLIFERACIÓN
DE BROTES AXILARES
Introducción. La dominancia apical es el fenómeno mediante el cual el ápice principal de
crecimiento suprime el desarrollo de los meristemos axilares, de tal manera que las plantas
con fuerte dominancia apical no desarrollan ramificaciones lo que dificulta su propagación
vegetativa. Se ha probado eliminar ese meristemo de crecimiento para incrementar la
producción de brotes, por ejemplo en rosa (Versan y col., 1982), manzana (Yae y col.,
1987). La dominancia apical es frecuente en las cactáceas, para su micropropagación se
requiere la adición de citocininas al medio de cultivo, las cuales tienen la capacidad de
romperla al permitir el desarrollo de brotes múltiples a partir de las areolas que contienen los
meristemos axilares. Se considera que el cultivo de tejidos en cactos es un método eficiente
de propagación a gran escala para variedades ornamentales, además de su aplicación en
la conservación de especies amenazadas. En la mayoría de las especies de cactáceas, la
rizogénesis se logra de manera espontánea sin reguladores de crecimiento. Este método de
micropropagacion se ha aplicado con éxito a varias especies como Strombocactus disciformis,
Turbinicarpus pseudomacrochele (Soltero, 1996), Epithelantha micromeris (Velásquez, 1997) y
Pelecyphora strobiliformis (Arias, 2002).
Objetivo. Comprobar el efecto de rompimiento de dominancia apical mediante el uso de
citocininas.
Materiales y métodos.
-Explantes. Se utilizarán ápices de brote de 2 cm de longitud provenientes de cultivos
asépticos (Figura 3b, pág. 37).
-Medio de cultivo. Medio MS-C (ver anexos).
-Establecimiento. Los tallos se colocan sobre una caja de Petri estéril, se cortan los ápices
y éstos se colocan en posición vertical en el medio.
Incubación. Se colocan en el incubador a 27 °C con fotoperiodo de 18 h a 2000 lux de
intensidad.
Nota: a los 20 d de cultivo se inicia el proceso de formación de nuevos brotes a partir de las areolas en la parte
basal del tallo. A los 30 d los brotes son evidentes y puede calcularse la tasa de propagación, a los 35 d pueden
ser separados para su enraizamiento o subcultivados para una producción a gran escala (Figura 3b, pág. 32).
Literatura citada
Arias, A. A. 2002. Micropropagación de Pelecyphora strobiliformis (Wandermann) Fric et
Cheelle (Cactacea) especie mexicana en peligro de extinción. Tesis de licenciatura.
Universidad de Guadalajara. pp. 31-39.
Bressan, P. H.; Kim, Y. J., Hyndmann, E., Hasegawa, P. M. y Bressnan R. A. 1982. Factor
affecting in vitro propagation of Rose. J. Am. Soc. Hort. Sci. 107: 979-990.
29
Soltero, Q. R. 1996. Micropropagación de dos especies de la línea “B” Strombocacti
(Cactaceae). Tesis de Maestría. Universidad de Guadalajara. pp. 12-18.
Velásquez, E. L. E. 1997. Micropropagación de Epithelantha micromeris (Eng.) Weber ex
Britton et Rose, var. micromeris, Cactácea. Tesis de licenciatura. Universidad de
Guadalajara. Pp.: 26-33.
Yae, B. W.; Zimmerman, R. H.; Fordham, I. y Ko, K. C. 1987. Influence of photoperiod, apical
meristem, and explant orientation on axillary shoot proliferation of apple cultivars in
vitro. J. Am. Soc. Hort. Sci. 112: 588-592.
30
RESULTADOS
31
CUESTIONARIO
1. Describa el fenómeno de dominancia apical
2. ¿Por qué se adicionaron citocininas al medio de cultivo?
3. ¿Se espera variación genética en los clones obtenidos por este método? ¿por qué?
4. Calcule la tasa de propagación a 6 meses de la especie propagada
5. Bibliografía consultada
32
PRÁCTICA 5
ORGANOGÉNESIS EN TABACO (Nicotiana tabacum L.)
Introducción: La organogénesis se refiere a la producción de brotes y raíces que pueden ser
inducidos a partir de callo (organogénesis indirecta) o sobre el tejido del explante original
(organogénesis directa) en el que normalmente no se generan tales órganos (Figura 3c,
pág. 37). En general, para obtener plantas por esta vía se requiere la inducción de brotes,
el desarrollo y multiplicación de los mismos, así como su enraizamiento y trasplante a
tierra. Este proceso resulta muy atractivo, al lograr una propagación rápida con pequeñas
secciones de tejido (Hurtado y Merino, 1987).
La primera indicación de que la organogénesis in vitro se podría regular químicamente,
fue dada por Skoog (1944), quien encontró que la adición de auxinas al medio servía
para estimular la formación de la raíz, mientras que la iniciación de los brotes se inhibía,
para tal efecto se requiere la adición de citocininas en combinación con bajas o nulas
concentraciones de auxina.
Es conveniente aclarar que el resultado típico de la relación entre el balance que guardan las
auxinas y citocininas no siempre es el mismo para todas las especies (George y Sherrington,
1984), y también se puede presentar una respuesta diferente por efecto del genotipo.
Objetivo: Inducir la respuesta morfogenética de organogénesis en explantes de tabaco
mediante diferentes dosis de auxina-citocinina.
Metodología: Obtener plántulas asépticas a partir de semillas de tabaco en condiciones in
vitro de acuerdo a la práctica número 2. Luego de 15 d de la germinación, se toman las
plántulas con ayuda de pinzas y se colocan en cajas de Petri estériles para cortar con un
bisturí y obtener los hipocotilos. Los explantes se llevarán a cajas de Petri con medio MS
(Murashige y Skoog, 1962) suplementado con las vitaminas de Phillips y Collins (1979),
30 g/L de sacarosa con dos diferentes tratamientos de reguladores de crecimiento: T-3
que contiene 0.3 mg/L de AIA y T-14 que contiene 1.0 mg/L de AIA y 0.3 mg/L de KIN,
posteriormente se llevan a cultivo por espacio de 30 d.
Nota: durante el cultivo se deben registrar todos los cambios, así como la presencia de cualquier órgano (raíz
o brote aéreo). Registre cuantitativa y cualitativamente los cambios observados. En la figura 3c (pág. 32) se
aprecian las posibles vías de regeneración por organogénesis.
33
Literatura citada
George, E. F. y Sherrington, P. D. 1984. Plant propagation by tissue culture. (Handbook and
directory of commercial laboratories). Exegetic Limited, England. 709 p.
Hurtado, D. V. M. y Merino, M. E. 1987. Cultivo de tejidos vegetales. Ed. Trillas, México. p. 151.
Murashige T. y Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco
tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473-479.
Phillips, G. C. y Collins, G. B. 1979. In vitro tissue culture of selected legumes and plant
regeneration from callus cultures of red clover. Crop. Sci. 19: 59-64.
Skoog, F. 1944. Growth and organ formation in tobacco tissue cultures. Am. J. Bot. 31:
19-24.
34
RESULTADOS
35
CUESTIONARIO
1. ¿Cuál es la razón de haber utilizado hipocotilos de tabaco como explantes?
2. ¿Qué sistema de regeneración se utilizó en esta práctica?
3. ¿En qué zonas de los explantes aparecen los nuevos órganos?, ¿por qué?
4. ¿Por qué en una misma caja de cultivo hubo explantes que sólo formaron raíces, otros
solamente produjeron brotes y otros generaron ambos órganos, al estar en las mismas
condiciones de cultivo?
5. Bibliografía consultada
36
Figura 3a. Procedimiento para obtener los explantes (nudos) y su cultivo.
Explante
Proliferación de brotes
Adaptación a invernadero
Figura 3b. Proceso de micropropagación de cactos por proliferación de brotes axilares.
Figura 3c. Corte de explantes (hipocotilos) y proceso de organogénesis directa en tabaco.
37
PRÁCTICA 6
REGENERACIÓN DE VIOLETA AFRICANA
(Saintpaulia ionantha Wendl.) POR ORGANOGÉNESIS
Introducción. Una de las técnicas utilizadas en la micropropagación masiva de plantas es
el cultivo de órganos, como pueden ser hojas, tallos, peciolos e incluso partes florales, las
cuales, al ser transferidos a un medio con las concentraciones y tipo de reguladores de
crecimiento adecuados, producen nuevos brotes sin ocurrir desdiferenciación del tejido,
a este método de regeneración se le llama organogénesis directa (Figura 4a, pág. 51). Se
sabe que los brotes o yemas adventicias se originan mediante divisiones celulares sucesivas
de tal manera que se forman nuevos primordios meristemáticos que no existían y que
posteriormente se convertirán en brotes y finalmente en plantas. El origen de los nuevos
meristemos es generalmente pluricelular, pero se han reportado casos de organogénesis
de origen unicelular (Arisumi y Frazier, 1968; Pierik y col.,1982). Se han reportado casos
de variación somaclonal utilizando este método de regeneración en violeta africana como
la aparición de variegaciones que generalmente son epigenéticas por lo tanto reversibles
(Pierik, 1990).
Objetivo. Observar los diferentes estados de desarrollo en la formación de brotes adventicios
producidos en secciones de hoja de violeta africana.
Materiales y métodos.
-Explante: Se utilizarán hojas jóvenes de violeta africana (que no estén dañadas)
-Medio de Cultivo: MS-VA (ver anexos).
-Desinfección de explantes:
-Lavar las hojas con agua y jabón.
-Inmersión en alcohol por 5 s.
-Inmersión en solución de hipoclorito de sodio (blanqueador comercial) al 50 % v/v
durante 15 min y agitar ocasionalmente.
-Enjuagar tres veces en agua estéril, durante 3 min en cada enjuague.
Establecimiento del cultivo. Las hojas desinfectadas se colocan sobre una caja de Petri
estéril, se eliminan los bordes y extremos dañados y se cortan fragmentos de hoja de
aproximadamente 1.5 x 1.5 cm de preferencia que contengan parte de la nervadura central,
se siembran de tres a cinco fragmentos por caja con el haz de la hoja hacia arriba.
Incubación. Se colocan en el incubador a 27 °C con fotoperiodo de 18 h con 2000 lux de
intensidad.
39
Literatura citada
Arisumi, T. y Frazier, L. C. 1968. Cytological and morphological evidence for the single-cell
origin of vegetatively propagated shoots in thirteen species of Saintpaulia treated with
Colchicine. Proc. Am. Soc. Hort. Sci. 93: 679-685.
Pierik, R. L. M.; Steegmans, H. H. M.; Verhaegh, J. A. M. y Wouters, A. N. 1982. Effect of
cytokinin and cultivar on shoot formation of Gerbera jamesonii in vitro. Neth. J. Agric.
Sci. 30: 341-346.
Pierik, R. L. M. 1990. Cultivo in vitro de las plantas superiores. Ediciones Mundi-Prensa.
Madrid España. pp. 227-234.
40
RESULTADOS
41
CUESTIONARIO
1. El proceso de organogénesis observado en violeta es:
a) directa,
b) indirecta
¿por qué?
2. ¿Qué estructura se origina durante el proceso de organogénesis?
3. ¿En qué casos se recomienda aplicar el proceso de organogénesis?
4. ¿Qué condiciones se requieren para que células diferenciadas formen un meristemo?
5. Bibliografía consultada
42
PRÁCTICA 7
EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA EN ZANAHORIA (Daucus carota L.)
Introducción: La embriogénesis somática es un proceso semejante a la generación de
embriones cigóticos que proceden de la fusión sexual de gametos. La diferencia radica en
que los embriones somáticos se producen a partir de una célula somática (Haccius, 1978).
Ambos pasan por similares estados de desarrollo (Goldberg y col., 1994; Dodds y Roberts,
1982). La embriogénesis somática se debe a la totipotencia celular (Liu y col., 1993), la cual,
es una característica que teóricamente tienen todas las células vegetales (Carman, 1990)
para desarrollar nuevos individuos a partir de la planta de origen (George, 1993).
Los embriones somáticos al igual que los brotes adventicios, se pueden obtener directa
e indirectamente. En la forma indirecta, los embriones son generados en células que
se localizan en la superficie del callo asociadas con células desorganizadas altamente
vacuoladas, que no toman parte en la embriogénesis (Evans y Sharp, 1981). Por su parte
los embriones somáticos directos se producen de células de un tejido diferenciado, sin que
haya una desorganización previa (callo).
Estos embriones, no tienen conexión vascular con el tejido de origen (Haccius, 1978); por lo
tanto se pueden distinguir fácilmente de los brotes y raíces producto de la organogénesis
(Evans y Sharp, 1981); también se pueden diferenciar de los brotes adventicios por que
presentan dos polos definidos de crecimiento, uno hacia la raíz y otro hacia el brote
vegetativo (Tautorus y col., 1991).
El proceso de embriogénesis somática se ha llevado a cabo con éxito en algunas plantas
como zanahoria (Figura 4b, pág. 51), palma, apio, café y espárrago entre otras (Pierik, 1990),
actualmente su aplicación es común en diversas especies.
Objetivo: Desarrollar un protocolo para la obtención de embriones somáticos de zanahoria y
documentar el comportamiento de los explantes durante todo el proceso así como cualquier
otra manifestación de respuesta morfogénica.
Metodología: Se establece el cultivo de zanahoria mediante la germinación aséptica de
semillas, previamente desinfectadas de acuerdo a la práctica número 2 de este manual. Una
vez desarrolladas las plántulas en medio MS (Murashige y Skoog, 1962) aproximadamente
dos semanas después de la germinación, se toman trozos de hipocotilo de aproximadamente
1 cm mediante cortes con bisturí sobre una caja de Petri de vidrio estéril. Estos explantes
deben ser transferidos al medio de cultivo de inducción formulado con las sales MS,
suplementado con las vitaminas PC-L2 (Phillips y Collins, 1979), 30 g/L de sacarosa y 1.5
mg/L de 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético ), el pH ajustado a 5.8. Los cultivos en cajas
de Petri desechables se llevan a incubación a 27 °C y fotoperiodo de 16 h. Se deben
hacer observaciones cada semana para localizar zonas de crecimiento con una aparente
43
desorganización celular hasta que aparezcan los primeros embriones somáticos, proceso
que puede tardar hasta 60 d.
Nota: la práctica No. 9 puede ser desarrollada utilizando embriones somáticos de zanahoria en estado de
inducción, aproximadamente a los 30 d de cultivo.
Literatura citada
Carman, H. J. 1990. Embryogenic cells in plant tissue cultures: Occurrence and behavior. In
Vitro Cell. Dev. Biol. 26: 746-753.
Dodds, J. H. y Roberts, R. W. 1982. Experiments in plant tissue culture. Cambridge University
Press, Nueva York. p. 282
Evans, D. A. y Sharp, W. R. 1981. Growth and behavior of cell cultures: Embryogenesis and
organogenesis (pp 45-113). En: Thorpe, T. A. (ed.) Plant tissue culture. Methods and
applications in agriculture. Academic Press. Chicago.
George, E. F. 1993. Plant propagation by tissue culture. 2nd. Ed. Exegetics, Londres. p.: 5.
Goldberg, R. B., De Pavia, G. y Yadegari, R. 1994. Plant embryogenesis: Zygote to seed.
Science 266: 605-614.
Haccius B. 1978. Questions of unicellular origin of non-zygotic embryos in callus cultures.
Phytomorph. 28: 74-81.
Liu, C.-M., Xu, Z.-H. y Chua, N. H. 1993. Auxin polar transport is essential for the establishment
of bilateral symmetry during early plant embryogenesis. Plant Cell 5: 621-630.
Murashige, T. y Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with
tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473-497.
Phililips, G. C. y Collins, G. B. 1979. In vitro tissue culture of selected legumes and plant
regeneration from callus culture of red clover. Crop Sci. 19: 59-64.
Pierik, R. L. 1990. Cultivo in vitro de las plantas superiores. Ediciones Mundi-Prensa, Madrid,
España. p.220.
Tautorus, T. E., Fowke, L. C. y Dunstan, D. I. 1991. Somatic embryogenesis in conifers. Can.
J. Bot. 69: 1873-1899.
44
RESULTADOS
45
CUESTIONARIO
1. El proceso de embriogénesis somática observado en zanahoria es vía:
a) directa,
b) indirecta, ¿por qué?
2. ¿Qué diferencias hay entre un embrión somático y un brote adventicio?
3. ¿Qué utilidad tiene la embriogénesis somática?
4. ¿Cuál es el primer evento en la embriogénesis somática?
5. Bibliografía consultada
46
PRÁCTICA 8
EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA INDIRECTA EN
Agave tequilana Weber
Introducción: La embriogénesis somática es un proceso morfogénico que necesita ser inducido
mediante reguladores de crecimiento a partir de explantes previamente seleccionados, los
cuales posteriormente deben ser trasferidos a un medio de expresión que regularmente
carece de reguladores de crecimiento, pero adicionado de fuentes de nitrógeno orgánico.
Este proceso también conocido como embriogénesis asexual (Sharma y Thorpe, 1995), in
vitro o adventicia (Halperin, 1995; Merkle y col., 1995), induce embriones somáticos, que
son estructuras parecidas a un embrión sexual denominados embrioides (Rudall, 2007). Un
embrioide es un nuevo individuo que proviene de una sola célula no sexual (Haccius, 1978),
presenta las mismas etapas de desarrollo que un embrión cigóticos y un eje con polos de
crecimiento bien definidos, uno hacia la raíz y otro hacia el brote aéreo (Tautorus y col.,
1991).
En plantas monocotiledóneas, la embriogénesis somática pasa por los estados globular,
escutelar y coleoptilar (Quiroz-Figueroa y col., 2006), las dos últimas análogas a los estados
de corazón y torpedo de las dicotiledóneas.
Los embrioides al igual que los brotes adventicios, se pueden obtener de forma directa
e indirecta, sin embargo, los embrioides no se clasifican como órganos, porque estas
estructuras tienen una existencia independiente del cuerpo de la planta o callo de origen
(Dodds y Roberts, 1985), sin conexión vascular con los tejidos de donde se generó (Haccius,
1978).
Es oportuno aclarar que un embrión asexual no proviene del cigoto (fusión de gametos),
pero puede venir de una célula somática diploide, una célula sexual haploide (masculina
o femenina), incluso de una célula triploide del endospermo o alguno de los núcleos del
saco embrionario (Sharma y Thorpe, 1995). La embriogénesis somática tiene aplicación
en el fitomejoramiento, en la propagación de plantas, en la producción masiva de semillas
sintéticas (Onishi y col.,1994) y para realizar estudios de morfogénesis y diferenciación
celular (Acosta-García y Vialle-Calzada, 2004; Quiroz-Figueroa y col., 2006).
Objetivo. Inducir callo embriogénico a partir de hojas y raíces de plantas de A. tequilana
establecidas previamente in vitro para generar embriones somáticos.
Metodología. Elaborar un medio de inducción con sales MS-AT (ver anexos) con 8 g/L de
agar, el cual se colocará en cajas de Petri. Sobre estos medios se colocarán trozos de hojas
y raíces de plantas de diversos genotipos previamente establecidas in vitro. Cada 7 d se
hará una evaluación cuantitativa y cualitativa del callo embriogénico en formación (color,
textura, disposición espacial, etcétera). A los 30 d se pasarán los explantes inducidos a
47
medio de expresión LOG-AT (Castro-Concha y col.,1990) (ver anexos) con 6 g/L de gelificante
Phytagel®. Cada 7 d se hará una evaluación cuantitativa de los embrioides obtenidos del
callo embriogénico, cuyos datos servirán para realizar análisis estadísticos. Conforme los
embriones somáticos puedan ser removidos, pueden ser transferidos a nuevo medio para
su posterior germinación o subsiguiente desarrollo hasta plántulas (Figura 4c, pág. 51).
Literatura citada
Acosta-García, G. y J-P. Vialle-Calzada. 2004. A classical arabinogalactan protein is essential
for the initiation of female gametogenesis in Arabidopsis. Plant Cell 16: 2614-2628.
Castro-Concha, L., V. M. Loyola-Vargas, J. L. Chan y M. L. Robert. 1990. Glutamate
dehydrogenase activity in normal and vitrified plants of Agave tequilana Weber propagated
in vitro. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 22: 147-151.
Dodds, J. H. y R. W. Roberts. 1985. Experiments in plant tissue culure. Cambridge University
Press, Nueva York. 232 p.
Haccius, B. 1978. Questions of unicellular origin of non-zygotic embryos in callus cultures.
Phytomorphology 28:74-81.
Halperin, W. 1995. In vitro embryogenesis: Some historical issues and unresolved problems.
En: In vitro Embryogenesis in plants (Thorpe, T. A. ed.). Kluwer Academic Publishers.
Netherlands. pp. 1-16.
Merkle, S. A., W. A. Parrott y B. S. Flinn. 1995. Morphogenic aspects of somatic embryogenesis.
En: In vitro Embryogenesis in plants (Thorpe, T. A. ed.). Kluwer Academic Publishers.
Netherlands. pp. 155-204.
Onishi, N., Y. Sakamoto y T. Hirosawa, 1994. Synthetic seeds as an application of mass
production of somatic embryos. Plant Cell, Tiss. Org. Cult. 39: 137-145.
Quiroz-Figueroa, F. R., R. Rojas-Herrera, R. Galaz-Avalos y V. M. Loyola-Vargas, 2006. Embryo
production through somatic embryogenesis can be used to study cell differentiation in
plants. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 86: 285-301.
Rudall, P. 2007. Anatomy of flowering plants. An introduction to structure and development.
Cambridge University Press. 145 p.
Sharma, K. K. y T. A. Thorpe. 1995. Asexual embryogenesis in vascular plants in nature.
En: In vitro embryogenesis in plants (Thorpe, T. A. ed.). Kluwer Academic Publishers.
Netherlands. pp. 17-72.
Tautorus, T. E., L. C. Fowke y D. I. Dunstan. 1991. Somatic embryogenesis in conifers. Can
J. Bot. 69: 1873-1899.
48
RESULTADOS
49
Cuestionario
1. ¿Es la embriogénesis somática un proceso de regeneración?, ¿por qué?
2. ¿Qué tipo de mitosis inicia el proceso de embriogénesis somática?
3. ¿Qué características presentó el callo embriogénico vs no embriogénico?
4. ¿Es la embriogénesis somática de origen multicelular?, 5. Bibliografía consultada
50
¿por qué?
Figura 4a. Planta y brotes múltiples de violeta africana generados a partir de fragmento de hoja.
INDUCCIÓN
Célula competente
GERMINACIÓN
Plántula
PRE-EMBRION
Estado globular
MADURACIÓN
Estado de torpedo
MADURACIÓN
Estado de corazón
MADURACIÓN
Estado corazón-torpedo
Figura 4b. Proceso completo de regeneración por embriogénesis somática en zanahoria.
Figura 4c. Proceso de embriogénesis somática en Agave tequilana desde la inducción hasta la germinación.
51
PRÁCTICA 9
TINCIÓN DIFERENCIAL DE EMBRIONES SOMÁTICOS
DE DIVERSAS ESPECIES VEGETALES
Introducción: Un proceso morfogénico que se practica cada vez más en el cultivo de tejidos
vegetales, lo constituye la embriogénesis somática (generación de embriones asexuales),
pues se ha observado que la producción de embriones no está restringida solamente al
desarrollo del cigoto (Dodds y Roberts, 1982). Un embrión somático es un nuevo individuo
que proviene de una célula no sexual (Haccius, 1978), la cual presenta un eje con extremos
definidos que le confiere una estructura bipolar (Quatrano, 1978). En la embriogénesis
cigótica, el cigoto se divide de forma transversal para formar al embrión propiamente dicho
y a una célula basal vacuolada la cual se convertirá en una estructura conocida como
suspensor (Yeung y Meinke, 1993); este mismo proceso sucede en la embriogénesis somática
(Haccius, 1978). El suspensor aparte de soportar y fijar a la cabeza embrional, juega un papel
importante en el continuo desarrollo y crecimiento del propio embrión (Yeung y Meinke,
1993).
Sin embargo, al observar las estructuras embriogénicas al microscopio se hace necesario
realizar algún tipo de contraste por tinción, ya que resultan prácticamente invisibles (García,
1990), en este sentido la tinción diferencial o contra tinción hace posible revelar diferencias
en las estructuras bajo el microscopio (Curtis-Patiño, 1986).
Debido a la naturaleza alcalina del suspensor por la presencia de sales en las vacuolas, es
posible diferenciarlo de la cabeza embrional que tiende a ser ácida por la alta concentración
de ácidos nucleícos y proteínas (Dodds y Roberts, 1982).
Objetivo. Teñir grupos de células con estructuras bipolares que resultan transparentes
al observarse al microscopio óptico, para comprobar la fase inicial de la embriogénesis
somática.
Metodología. Tomar una muestra muy pequeña del grupo de células a analizar con ayuda
de una aguja o pinza. La muestra debe tomarse de preferencia de células provenientes de
callo en medios de inducción y/o expresión o del tejido en inducción directa y se deposita
en el fondo de un vial.
Agregar una o dos gotas de acetocarmín y dejar en baño María hasta observar un ligero vire.
Lavar la muestra dos veces como se indica a continuación: Se añaden 1.5 mL de agua tibia,
luego se lleva a centrifugación la muestra de 1,500 a 2,000 rpm, con esto se facilitará retirar
el exceso de tinte y agua con ayuda de una pipeta Pasteur.
53
Añadir una gota de azul de Evans (contratinción o tinte diferencial) e inmediatamente repetir
el proceso de lavado como en el caso del acetocarmín.
La muestra se deposita en una caja de Petri y se observa al microscopio estereoscópico para
ubicar las células teñidas (Figura 5a, pág. 65).
Nota: registre las formas teñidas diferencialmente. Ubique las cabezas embrionales y el área
de las células suspensoras.
.
Literatura citada
Curtis-Patiño, J. 1986. Microtecnia vegetal. Editorial Trillas, México. p. 106.
Dodds, J. H. y Roberts, R. W. 1982. Experiments in plant tissue culture. Cambridge University
Press, Nueva York. p. 232.
García, A. V. 1990. Técnicas y procedimientos de citogenética vegetal. 3ra. Edición. Colegio
de Postgraduados, México. p. 144.
Haccius B. 1978. Questions of unicellular origin of non-zygotic embryos in callus cultures.
Phytomorph. 28: 74-81.
Quatrano, S. R. 1978. Development of cell polarity. Ann. Rev. Plant. Physiol. 29: 487-510.
Yeung, E. y Meinke, D. W. 1993. Embryogenesis in angiosperms: Development of the suspensor.
Plant Cell 5: 1371-1381.
54
RESULTADOS
55
CUESTIONARIO
1. ¿Porqué las células de la cabeza embrional tienen afinidad al acetocarmín y las
supensoras al azul de Evans?
2. ¿Qué estados de desarrollo del embrión se encontraron durante la observación al
microscopio?
3. ¿Qué relación mantiene la coloración adquirida por las células con el tipo de mitosis
observado?
4. ¿En qué etapa de la embriogénesis somática se da la división asimétrica (cuantal) de la
célula?
5. Bibliografía consultada
56
PRÁCTICA 10
ELIMINACIÓN DEL TRANSPORTE POLAR DE AUXINAS
Introducción. El transporte polar de las auxinas es esencial para dar la simetría bilateral en
las plantas desde la embriogénesis temprana, influenciando en gran medida el proceso
de aparición de los primordios cotiledonares; una auxina casi siempre es requerida para
promover el crecimiento inicial del meristemo apical (Figura 5b, pág. 65). Es necesario que
la auxina endógena (ácido indolácetico- AIA) se presente en la cantidad requerida para la
producción de diferentes procesos morfogénicos en la planta, como pueden ser: la polaridad
inicial del cigoto, la aparición de los primordios cotiledonares en el etapa de corazón durante
la formación de un embrión, la dominancia apical y la formación de raíces, entre otros
(George y col., 2008).
Se ha observado que el transporte polar de las auxinas puede ser inhibido por la aplicación
de compuestos como el ácido transcinámico, el ácido 9-hidroxifluoren-9-carboxílico (HFCA)
y el ácido 2,3,5-triyodobenzoico (TIBA). Se ha reportado que estos compuestos inhiben la
dominancia apical y elongación de tallos, produciendo subsecuentemente un incremento
en la producción de brotes axilares (Van Doorn y col., 2013), incrementan la producción de
callo (Kaparakis y Anderson, 2003) e inducen a la formación de cotiledones fusionados en
callos embriogénicos (Liu y col., 1993). Por todos los anteriores efectos en la morfogénesis
son conocidos estos compuestos como antiauxinas.
Objetivo. Demostrar el efecto de los inhibidores del transporte de auxinas en las plantas.
Metodología. Establecer en macetas la propagación de Kalanchoe daigremontiana a partir
de esquejes de tallo o de los embriones somáticos que se producen en los bordes de las
hojas. Una vez que las plantas alcanzan una altura de 10-15 cm y poseen de ocho a diez
hojas, se realiza una descripción de cada una de las plantas: número de hojas, número de
ramificaciones, altura de la planta, número, forma y tamaño de los embriones y número de
cotiledones por embrión.
Posteriormente, se preparan las soluciones de ácido triyodobenzoico (TIBA) a concentraciones
de 0.25, 0.5 y 1.0 mM, disolviendo el reactivo primeramente con etanol al 75 % y enseguida
aforar con agua desionizada para ajustar la concentración. A cada uno de los tratamientos
de TIBA se les adiciona unas gotas de surfactante Tween 20®. Se realiza la aplicación a
cada una de las plantas asperjando con un atomizador el tratamiento respectivo, hasta
humedecer completamente las hojas y tallos, esta operación de asperjado se recomienda
repetirla a los 7 d. Es importante dejar un tratamiento control con solamente la aplicación
de agua. A los 15 d de la primera aplicación y después a cada semana se evalúa el efecto
del TIBA en cada uno de los tratamientos, volviendo a realizar una descripción de cada una
de las plantas.
Se recomienda preparar varias plantas para hacer al menos cuatro repeticiones por cada
uno de los tratamientos.
57
Literatura citada
George, E. F., M. A. Hall y G. J. De Klerk. 2008. Plant propagation by tissue culture, The
Background. Vol. 1. Springer. Dordrecht, Netherlands. p. 501.
Kaparakis, G. y P. G. Anderson. 2003. Differential callus type formation by auxins and
cytokinin in in vitro cultures of pepper (Capsicum annum L.) Plant Biosystems. 137:
275-280.
Liu, C. M., Z. H. Zu y N. H. Chua. 1993. Polar transport is essential for the establishment of
bilateral symmetry during early plant embryogenesis. Plant Cell. 5:621-630.
Van Doorn, W. G., I. Dole, F. G. Celikel y H. Harkema. 2013. Opening of Iris flowers is
regulated by endogenous auxins. Journal of Plant Physiology. 170: 161-164.
58
RESULTADOS
59
CUESTIONARIO
1. Definir el concepto de polaridad en las células vegetales.
2. ¿Qué diferencias en las funciones fisiológicas existen entre una citocinina y un
inhibidor del transporte de auxinas?
3. Al trabajar con embriogénesis somática in vitro, ¿En qué cree que favorecería el proceso
morfogénico la aplicación de un inhibidor del transporte de auxinas?
4. ¿Qué características importantes posee Kalanchoe daigremontiana para observar el
efecto regulatorio de estos compuestos?
5. Bibliografía consultada
60
PRÁCTICA 11
ADAPTACIÓN DE PLANTAS PROPAGADAS POR CULTIVO
DE TEJIDOS A CONDICIONES DE INVERNADERO
Introducción. Las condiciones de cultivo in vitro modifican en cierta medida la fisiología de la
planta, sobre todo el proceso de fotosíntesis, ya que los azúcares son tomados directamente
del medio y el proceso fotosintético en la planta se ve disminuido. La disponibilidad de agua
y nutrientes produce ligeros cambios en la estructura física de los tejidos que se hacen más
sensibles a la deshidratación, además, las condiciones de asepsia e iluminación artificial hace
que las plántulas sean más sensibles de lo normal a las condiciones externas o ex vitro. Al
proceso de adaptación a condiciones de invernadero también se le llama de endurecimiento
(Conover y Pooler, 1984), un paso crítico en la micropropagación, ya que en algunas especies
como las orquídeas se considera un proceso difícil, pero en otras es relativamente fácil como
en las cactáceas. Las plantas enraizadas in vitro, deben tener el desarrollo proporcional en
ambas partes (Sommer y Caldas, 1981). Las condiciones indispensables para la adaptación
son humedad ambiental alta y una adecuada temperatura (Zimmerman, 1988). Esta es la
etapa cuando un sistema de micropropagación o regeneración prueba su eficiencia.
Objetivo. Practicar la fase de adaptación de plantas de crisantemo a condiciones de
invernadero.
Materiales y métodos. Se utilizarán plantas de crisantemo previamente propagadas in vitro.
Las plántulas serán extraídas del medio de cultivo y serán sumergidas en agua tibia (± 40 °C)
para eliminar los residuos de agar que pueden ocasionar contaminación posterior, después
se tratan las raíces con polvo enraizador (opcional) y luego se plantan en el sustrato.
- Sustrato: Se utilizará una proporción 1:1 de turba (peat-moss) y agrolita de grano pequeño,
previamente mezclados y humedecidos. Cuando se utilizan sustratos diferentes como
arena o tierra de hoja es recomendable esterilizarlos en autoclave antes de usarlos.
- Plantación: En charolas de unicel ó plástico con celdas medianas que serán cubiertas con
plástico a manera de mini-invernadero (Figura 5c, pág. 65) y colocadas en un lugar fresco
y sombreado o bajo condiciones de invernadero.
Después de 3 d se debe aplicar riego ligero y se empieza a dar ventilación para evitar el
ataque de hongos, en esta etapa se recomienda la aplicación de fungicida como medida
preventiva.
Nota: Es recomendable remover inmediatamente las plantas que no han sobrevivido la etapa
de adaptación, ya que pueden ser fuente de infección. A los 30 d se considera como tiempo
suficiente para evaluar el porcentaje de sobrevivencia. Después, las plantas pueden ser
transferidas a suelo o maceta y ser tratadas en forma convencional.
.
61
Literatura citada
Conover, C. A y Pooler, T. 1984. Acclimatization of indoor foliage plants. Hort. Rev. 6: 119154.
Sommer, E. y Caldas, L. S. 1981. In vitro methods applied to forest trees. Thorpe T.A (eds.).
pp. 349-358.
Zimmerman, R. H. 1988. Micropropagation of woody plants: post tissue cultures aspects.
Acta Hort. 227: 489-499.
62
RESULTADOS
63
CUESTIONARIO
1. ¿Porqué es conveniente esterilizar el sustrato para la adaptación de plantas?
2. ¿Qué papel juega el control de la humedad en la adaptación de vitroplantas?
3. ¿Qué sucedería si no son removidos los restos de agar de las raíces de las
vitroplantas?
4. ¿Es necesaria la presencia de raíces en las vitroplantas para su adaptación?
5. Bibliografía consultada
64
Figura 5a. Tinción diferencial de callo embriogénico con presencia de células
suspensoras y cabezas embrionales.
Figura 5b. Plantas de Kalanchoe daigremontiana con embriones somáticos
en el borde de las hojas.
Figura 5c. Plantas de crisantemo en proceso de adaptación, es necesario cubrir la charola con un capelo o
plástico para evitar la deshidratación, la floración se presenta 3 meses después.
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ANEXOS
Medio MS (Murashige y Skoog, 1962)
mg/L
Nitrato de amonio (NH4)NO3 ......................................................................1,650
Nitrato de potasio KNO3 ............................................................................... 900
Cloruro de calcio CaCl2 .2H2O .................................................................. 440
Sulfato de magnesio MgSO4 .6H2O ........................................................ 370
Fosfato de potasio KH2PO4 ………………………….……….…................... 170
EDTA sal disódica Na2EDTA ......................................................................... 33.6
Sulfato ferroso FeSO4 .7H2O ...................................................................... 27.8
Sulfato de manganeso MnSO4 .4H2O .................................................... 22.3
Sulfato de zinc ZnSO4.4H2O ......................................................................... 8.6
Ácido bórico H3BO3 .......................................................................................... 6.2
Yoduro de potasio KI ........................................................................................ 0.83
Molibdato de sodio Na2 MoO4.2H2O ....................................................... 0.25
Sulfato cúprico CuSO4.5H2O ........................................................................ 0.025
Cloruro de cobalto CoCl2.6H2O .................................................................. 0.025
Sacarosa ................................................................................................................. (30 g/L)
Vitaminas L2 (Phillips y Collins, 1979) mg/L
Medio MS-C para propagación de cactos
mg/L
Inositol ..................................................................................................................... 250
Tiamina .................................................................................................................... 2.0
Piridoxina ................................................................................................................ 0.5
Cinetina ……………………………………………………………............................ 5.0
ANA (ácido naftalenacético) ....................................................................... 0.02
Medio MS-VA para propagación de violeta africana mg/L
Cinetina ……………………………………………………………........................... 10
AIA (ácido indolacético) …………………………………………………........ 0.1
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Medio MS-ZAN para embriogénesis somática en zanahoria mg/L
2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético) …………………………………................... 1.5
Medios MS-AT mg/L
Inducción
2,4-D (2,4-diclorofenoxiacético) ...................................................................................
2.0
BA (6-bencilaminopurina) .................................................................................................. 0.6-0.9
Expresión
Usar medio MS modificado (LOG)
Hidrolizado de caseína ………………………………….…………………….…………
Glutamina ………………………………………………………….……………………………
250
500
Medio LOG-AT
Es un medio MS modificado, el NH4NO3 se reduce a 5 mM.
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Manual de Biotecnología Vegetal
Segunda edición
Departamento de Botánica y Zoología
CUCBA, Universidad de Guadalajara
Se terminó de imprimir en noviembre de 2013
En los talleres de
AmatEditorial
Madero #616, Col. Centro
Guadalajara, Jal., México
www.amateeditorial.net
La edición consta de 500 ejemplares
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