Esterilización y preparación de medios de cultivo Modo de acción • Biocida o germicida: “mata” a los microbios • Bacteriostático o fungistático: inhibe el crecimiento y multiplicación; una vez eliminado el mismo podría reanudarse el crecimiento. La destrucción o inhibición del crecimiento microbiano por parte de un agente antimicrobiano es afectada por diversos factores: Esterilización AUTOCLAVE Recipiente metálico de doble pared, con una tapa que ajusta a presión por medio de tornillos, un manómetro que indica la presión a la que llega el vapor, una espita que regula la salida del vapor, una válvula de seguridad, una rejilla de bronce donde se coloca el material a esterilizar, un depósito de agua y una fuente de calor. La duración y temperatura del tratamiento usado, para lograr una esterilización adecuada es: 121º C (1atmósfera) durante 15 minutos o 115º C (3/4 atmósfera) durante 20 minutos. Principales aplicaciones del calor húmedo Aplicaciones del calor seco Radiaciones Propagación de energía por el espacio. Medios de cultivo M.Sc. Estefanía Peña Objetivos de aprendizaje Distinguir entre medios de cultivo químicamente definidos y complejos. Justificar el empleo de cada uno de los siguientes elementos: técnicas anaerobias, células huésped viables, frascos con vela, medios de cultivo selectivos y diferenciales, medio de enriquecimiento. • Gran parte de los estudios en microbiología depende de la capacidad de cultivar y mantener microorganismos en un laboratorio, y esto es sólo posible si se dispone de los medios de cultivo adecuados. Medio de cultivo Material nutritivo preparado para el crecimiento de microorganismos en laboratorio. Es un complejo de sustancias que aportan nutrientes en concentraciones óptimas que permiten un buen desarrollo de los microorganismos. Un medio de cultivo es una preparación líquida o sólida utilizada para el crecimiento, transporte o mantenimiento de microorganismos. Algunas bacterias crecen bien en casi cualquier medio de cultivo; otras requieren medios especiales y otras no pueden crecer en ninguno de los medios inertes existentes hasta ahora. La variedad de medios de cultivo es también amplia, y no existe un medio de cultivo universal adecuado para todos los microorganismos. La diversidad metabólica de los microorganismos es enorme. Aislamiento e identificación Evaluación de sensibilidad antibiótica Aplicaciones Análisis de agua y alimentos Microbiología industrial etc. El conocimiento del hábitat normal de un microorganismo es menudo útil para elegir un medio de cultivo apropiado porque sus necesidades de nutrientes reflejan su ambiente natural. 1. Contener los nutrientes adecuados para el microorganismo específico que se desea desarrollar. ¿Qué criterios debe satisfacer el medio de cultivo? 2. Contener humedad suficiente, pH ajustado de manera apropiada y una concentración conveniente de oxígeno, tal vez ausente por completo. 3. El medio debe estar estéril, es decir en un principio no debe contener microorganismos viables. 4. El medio de cultivo sembrado debe incubarse a temperatura correcta. 5. Fuente de carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y varios minerales. La composición química de las células refleja cuáles son los principales materiales requeridos para el crecimiento. Requerimientos nutricionales elementales MACRONUTRIENTES: carbono, oxígeno, hidrogeno, nitrógeno, azufre, fósforo, potasio, sodio, calcio, magnesio, hierro (C, 0, H, N, S, P, K, Na, Ca, Mg, Fe) contenidos en todos los microorganismos. El agua representa entre el 80% y el 90% del peso total. MICRONUTRIENTES u OLIGOELEMENTOS: manganeso, molibdeno, zinc, cobre, níquel, vanadio, boro, cloro, selenio, silicio, wolframio entre otros, que no los necesitan todos los organismos. ELEMENTOS TRAZA: Manganeso, cobre, cobalto y zinc. Constituyente habituales de los medios de cultivo • Fuente de carbono y sales: en muchos casos, la glucosa, la lactosa u otras dextrosas se emplean como fuente de carbono. Algunos medios de cultivo se complementan con sales como el NaCl o diversos fosfatos y/o sulfatos de potasio, magnesio, amonio, etc. • Agar: Se utiliza como agente gelificante para dar solidez a los medios de cultivo. El componente dominante en el agar bacteriológico es un polisacárido al que acompañan algunas impurezas que obtiene de ciertas algas marinas (rodofitas). • Es un polímero de alto peso molecular, asilado de un alga marina. • Funde a los 100°C y se mantiene en estado líquido hasta aproximadamente 45°C lo que permite repartirlo en cajas antes de su solidificación. Agar-agar • Extractos: Para su preparación, ciertos órganos o tejidos animales o vegetales (ejemplo: carne, hígado, cerebro, semillas) son extraídos con agua y calor , y posteriormente concentrados hasta la forma final de pasta o polvo. Ejemplo: extracto de carne, extracto de levadura, de malta, etc. • Peptonas: Son mezclas complejas de compuestos orgánicos nitrogenados y sales minerales que se obtienen por digestión enzimática o química de proteínas animales o vegetales (soya, carne, gelatina, caseína, etc.) Fluidos corporales: Sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero sanguíneo son frecuentemente añadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos patógenos. Sistemas amortiguadores (solución tamponadas) → para mantener el pH dentro del rango óptimo del crecimiento bacteriano. Indicadores de pH: Para detectar variaciones del pH. Agentes reductores: Cisteína, tioglicolato y otros son agentes reductores que se añaden a los medios de cultivo para crear condiciones que permitan el desarrollo de microorganismos microaerófilos y anaerobios. Agentes selectivos: La adición de determinadas sustancias al medio de cultivo puede convertirlo en selectivo. Cristal violeta, sales biliares, etc. • Algunos heterótrofos quimioorganotróficos pueden crecer también en medios definidos con glucosa como fuente de carbono y una sal de amonio como fuente de nitrógeno. Clasificación de los medios de cultivo Tipos de medios de cultivo por su función • 1. Medios generales: Permiten el desarrollo de una gran variedad de microorganismos • 2. Medios de enriquecimiento: Favorecen el crecimiento de un determinado tipo de microorganismo , sin llegar a inhibir totalmente el crecimiento del resto. • 3. Medios selectivos: Permiten el crecimiento de un tipo microbiano determinado, inhibiendo el desarrollo de los demás. • 4. Medios diferenciales: Son aquellos en los que se ponen de relieve propiedades que posee un determinado tipo de microorganismo. Medios de cultivo por su consistencia Medios sólidos Medios Semisólidos Medios líquidos • Se usan en tubos o cajas Petri, para el aislamiento y purificación de microorganismos. • Llevan baja concentración de solidificante por ejemplo con 0,2 % de agar, son empleados para estudios de microorganismos microaerófilos. Comportamiento de los microorganismos frente al O2 y su movilidad. • También se llaman caldos de cultivo, no tienen agar y se preparan en matraces pequeños. Permiten aumentar el número de microorganismos. Clasificación de los medios de cultivo por su composición Complejo: no se conoce su composición, puede tener, sangre, leche, extracto de levadura o carne; se utiliza cuando no se conocen los microorganismos o no se conocen sus requerimientos nutricionales. Ejemplo: Medio manitol-salado Mínimo: Es un medio definido que proporciona solo los nutrientes necesarios. Enriquecidos: Se adicionan compuestos como sangre, leche, yema de huevo, factores de crecimiento. Ejemplo: agar sangre. Comunes: Se adicionan sustancias que aporten factores de crecimiento y se utilizan para el aislamiento de microorganismos poco exigentes. Ejem: Agar nutritivo Naturales: Preparados a partir de sustancias naturales Ejemplo: Agar papa, agar zanahoria. • Son medios en los que se conocen todos los componentes. Medios sintéticos o definidos • Los autótrofos fotolitotróficos como las cianobacterias y algas eucariotas pueden crecer en medios relativamente sencillos, que contienen CO2 como fuente de carbono ( a menudo incorporado como carbonato o bicarbonato sódico), nitrato o amonio como fuente de nitrógeno, sulfato, fosfato y diversos minerales. • Otros medios son aptos para el desarrollo de los hongos: sales minerales, sacarosa, nitratos, acidificados por ácidos orgánicos y con antibióticos que inhiben la proliferación de bacterias. Condiciones para un medio de cultivo No incorporar nutrientes en exceso, mucho de los cuales resultarían inhibidores de crecimiento o tóxicos. Las actividades metabólicas de la población microbiana en crecimiento, llegarán a cambiar el medio ambiente hasta hacerlo muy desfavorable (acumulación de metabolitos orgánicos tóxicos, agotamiento del oxígeno, cambio de pH). ¿Cómo se preparan los medios de cultivo? • La base para su elaboración es un medio deshidratado, un medio que está en polvo al cual hay que disolver en agua y esterilizar. • 1. Pesar los medios de cultivo: • Bacterias: 23gramos de agar nutritivo por cada litro de agua destilada • Hongos: agar, dextrosa , extracto de levadura para un litro de agua. 2. Colocar el medio de cultivo en polvo en el matraz y agregar el agua destilada. 3. Calentar en la parrilla de agitación hasta que el medio este totalmente cristalino. 4. Retirar de la parrilla y colocar un tapón hecho con algodón envuelto en gasas. El tapón debe quedar fijo pero no apretado. 5. Colocar el medio en el autoclave y esterilizar a 121°C por 20 minutos 6. Pasados los 20 minutos sacar el medio de cultivo y dejar enfriar. Inóculo • Microbios que se introducen en un medio de cultivo para que comiencen a crecer. • Para realizar un cultivo de bacterias es necesario preparar un medio de cultivo. • Un medio de cultivo es una mezcla de nutrientes, por ejemplo, de azúcares, proteínas, sales, vitaminas, agua, etc. Ejemplo de un cultivo sólido • Para conseguir un cultivo sólido, se añade a la mezcla de nutrientes y agua una sustancia que le de una consistencia gelatinosa. • El medio se prepara en las llamadas placas petri, que son unas cajas de vidrio o cristal. Placa petri Células Medio de cultivo sólido Medio de cultivo sólido En este medio de cultivo, las células crecen adheridas a la superficie. Bibliografía • Schlegel, H. , & Zaaborosch, C. 1992. Microbiología General. Ediciones Omega, S.A., Barcelona.
