“Año del Centenario de Machu Picchu para el Mundo” Universidad Nacional de Ingenierı́a Facultad De Ciencias Periodo 2011 - II Biologı́a(CH-061) TRABAJO PRÁCTICO No 1 TEMA: Observación de Bacterias y la Tinción Gram (tinción diferencial) FECHA: 29 de noviembre de 2011 ALUMNO: CHUQUIANO Agreda, Jesús <[email protected]> (CH-061) - Biologı́a COD: 20032169E 1. Introducción En las últimas décadas se han hecho importantes avances en el estudio de la ultraestructura bacteriana, lográndose una identificación bioquı́mica de muchas fracciones subcelulares; estos avances han permitido ubicar a las bacterias en el reino procariota (pro de primitivo y cariota de núcleo). El conocimiento de las diferentes estructuras y composición ha permitido comprender como muchas bacterias se relacionan con el hombre, ya sea como integrantes de la flora normal o como agresoras para el mismo. Las bacterias se presentan con una morfologı́a definida que está determinada por su pared rı́gida. Se pueden presentar como esféricas, ovaladas, denominándose cocos. Si la forma es cilı́ndrica se denominan bacilos o bastones, estos bastones pueden ser rectos, curvos o con forma de espiral, en este último caso les llamamos espirilos (Figura 1). Figura 1: Clases de bacterias. La morfologı́a bacteriana debe ser observada con el microscopio óptico o el microscopio electrónico, dado el tamaño pequeño de estos microorganismos. El más usado en el laboratorio es el microscopio óptico de campo claro, pero existen otros como el microscopio óptico de campo oscuro en los que los organismos aparecen brillantes en fondo oscuro. Este micros- copio permite la visualización de bacterias difı́ciles de colorear como el Treponema pallidum, agente de la sı́filis. Las tinciones son técnicas que permiten observar microorganismos en función de la capacidad de los mismos para retener o no determinadas sustancias colorantes, lo que depende de la carga de la célula y del colorante. Los colorantes pueden ser de distintos tipos: Catiónicos. Son sustancias que tienen carga positiva. Penetran en el interior de las células y las tiñen. Ejemplos: azul de metileno, cristal violeta, safranina. 1 Aniónicos. Con carga negativa. No penetran en el interior celular, de modo que no tiñen las células, sino el entorno. En este caso se habla de tinción negativa. Ejemplos: eosina, nigrosina. Liposolubles. Se mezclan con los lı́pidos celulares y los tiñen. Ejemplo: negro sudán. Las tinciones pueden ser: Simples. Utilizan un solo colorante. Se basan en el hecho de que las células tienen una composición quı́mica diferente a la de su entorno, de modo que ambos se comportan de forma diferente frente a un colorante. El colorante tiñe las células (azul de metileno, safranina) o no (nigrosina). Diferenciales. Se basan en el hecho de que distintos tipos de células tienen distinta composición quı́mica, y por lo tanto reaccionan de forma diferente frente a una tinción, lo que permite clasificar los microorganismos en diferentes grupos, según su capacidad de tinción. En este apartado están dos tinciones de importancia taxonómica y médica: la tinción de Gram y la de ácido-alcohol resistencia (de Ziehl-Neelsen). Estas tinciones utilizan más de un colorante. Selectivas. Se basan en el hecho de que distintas estructuras celulares tienen distinta composición quı́mica, de modo que se tiñen selectivamente con ciertos colorantes. Ej; tinción de esporas, de flagelos, de paredes celulares, de corpúsculos metacromáticos. Pueden utilizarse uno o más colorantes. 2 2. Objetivos Conocer y aplicar la técnica de Tinción Gram para poder visualizar bacterias Gran positivas y Gram negativas. Emplear técnicas bacteriológicas simples. Conocer el fundamento estructural de la Tinción de Gram. Utilizar colorantes y comprender su utilización. 3. Fundamento Teórico Esta tinción fue desarrollada empı́ricamente por Christian Gram en 1884. A pesar del tiempo transcurrido, la tinción apenas se ha modificado y es uno de los primeros pasos que se realiza para cualquier identificación bacteriana. La tinción de Gram requiere cuatro soluciones: Primer colorante: Es un colorante básico que penetra en todas las células bacterianas(tanto Gram positivas como Gram negativas), y reacciona con ellas coloreándolas. El más utilizado es el cristal violeta. células cargadas. Solución mordiente: Fija las tinciones y aumenta la afinidad entre el colorante y las células. Los mordientes empleados suelen ser sales metálicas, ácidos o bases, como por ejemplo el Lugol, es un compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio), el cual está presente para solubilizar el yodo, y actúa de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad a la pared de la célula bacteriana. Agente decolorante: es un disolvente orgánico, por ejemplo alcohol − acetona (1 : 1), ya que en la misma es soluble el complejo I2 /cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos sı́ lo hacen. Colorante de contraste: Es un colorante básico de distinto color que el primer colorante, como por ejemplo la safranina o la fucsina. 4. Materiales y Reactivos Los Materiales y reactivos a usar son: Laminas portaobjetos. Asa de siembra(asa de kolle). Pinzas para laminas. Mechero. Microscopio. Papel de tissue. Cultivos bacterianos. 3 Alcohol. Aceite de inmersión. La tinción Gram se realizara con los siguientes colorantes y serán usados en estricto orden. Cristal violeta. Lugol. Alcohol acetona. Safranina(fucsina). 5. Procedimiento Fijación. Primero se toma pequeñas cantidades de agua destilada con un gotero y se colocaban sobre una lamina de vidrio, una gota en cada extremo; luego con ayuda de un de una alambre de aluminio se procede a extraer dos grupos de bacterias. La extracción de los dos grupos de bacterias se usa el mechero, para desinfectar el alambre y evitar errores en nuestras observaciones, esto se hace colocando el alambre sobre el mechero hasta que se ponga de rojo el extremo(alambre muy caliente), luego se espera a que enfrı́e y recién se manipulaba las bacterias, una vez ubicadas las bacterias en los extremos de la lamina(en cada gota) estas se tienen que disolver bien , para recién acercar la lamina al mechero esporádicamente y manteniendo una distancia prudencial, una vez seca el agua y fijadas las bacteria en la lamina se procede con la tinción. Tinción. Se le agrega cristal violeta a ambas bacterias durante 60 segundos aprox, después de esto es le enjuaga con abundante agua, y deja secar al aire libre, cuando estén secos se les agrega el lugol y se espera que reaccione durante 20 segundos y luego se enjuaga con abundante agua, se vuelve a secar las muestras al aire libre para después agregarles alcohol-acetona durante 15 segundos mientras se mantiene moviendo la lamina de vidrio como si se estuviera enjuagando,luego de esto se agrega la safranina durante 20 segundos y se enjuaga con agua, se deja secar y luego se llevo al microscopio el cual sera calibrado con 10x ocular y 100x objetivo teniendo un aumento total de 1000, pero antes de la observación se le agrego unas gotas de aceite a la muestra para mejorar la observación. 4 6. Observaciones Se debe sacar una pequeña cantidad de bacterias, para que estas se puedan disolver bien en el agua, para que al momento de empezar el secado al aire libre el agua quede como una pelı́cula delgada y ası́ no se tendrán grumos de bacterias al termino del secado. A simple vista(sin el uso del microscopio) no se pueden diferenciar las poblaciones de bacterias. Para mejorar la observación en el microscopio, se debe limpiar cuidadosamente los objetivos y el ocular del microscopio con papel seda. Cada vez que se realice una manipulación distinta con el alambre de aluminio, esté debe ser desinfectado pasándolo por el mechero. Se debe agregar una gota de aceite al final en la muestra, para ası́ lograr una mejor observación de las bacterias. El cristal violeta tiñe fuertemente a ambos grupos de bacterias(Gram positiva y Gram negativa). Al agregar el lugol,la tonalidad del color violeta disminuye. Cuando se agrega el alcohol la bacterias se destiñeron mas, y luego al agregarle la safranina se tiñen, ya que ambas bacterias eran Gram negativas. Al llevar ambas muestras al microscopio se observo que ambas eran de un color rosado. el otro experimento donde combinamos ambos grupos de bacterias se pudo notar las diferencias entre una bacteria Gram positivas y una Gram negativas por los colores y formas. 7. Resultados y conclusiones Se logro conocer y aplicar la técnica de Tinción de Gram. Los dos grupos bacterianos que distingue esta técnica difieren en el color con el que finalmente adquieren. Las bacterias Gram negativas pierden la coloración inicial del cristal violeta en los siguientes pasos y son teñidas de rosa debido a la safranina. Usando el microscopio se logro observar y diferenciar las bacterias estudiadas: La Escherichia coli y La speudomona aeruginosa.. 5 8. Cuestionario 1. ¿ Qué es un bacteria ? Las bacterias son organismos unicelulares microscópicos, sin núcleo ni clorofila, que pueden presentarse desnudas o con una cápsula gelatinosa, aisladas o en grupos y que pueden tener cilios o flagelos. La bacteria es el más simple y abundante de los organismos y puede vivir en tierra, agua, materia orgánica o en plantas y animales. Tienen una gran importancia en la naturaleza, pues están presentes en los ciclos naturales del nitrógeno, del carbono, del fósforo, etc. y pueden transformar sustancias orgánicas en inorgánicas y viceversa. Son también muy importantes en las fermentaciones aprovechadas por la industria y en la producción de antibióticos. Desempeñan un factor importante en la destrucción de plantas y animales muertos. En efecto, la vida en nuestro planeta no existirı́a sin bacterias, las cuales permiten muchas de las funciones esenciales de los ecosistemas. Una bacteria de tamaño tı́pico es tan pequeña que es completamente invisible a la vista. 2. ¿ Qué partes tiene una bacteria ? La organización bacteriana representa las principales estructuras de las bacterias aunque no todas ellas se encuentran en cada grupo bacteriano. Según la importancia que tengan para la supervivencia de la célula, estas estructuras se dividen en: Elementos obligados a) Pared celular La pared que poseen la mayorı́a de las bacterias explica la constancia de su forma. En efecto, es rı́gida, dúctil y elástica. Su originalidad reside en la naturaleza quı́mica del compuesto macromolecular que le confiere su rigidez. Este compuesto, un mucopéptido, está formado por cadenas de acetilglucosamina y de ácido murámico sobre las que se fijan tetrapéptidos de composición variable. Las cadenas están unidas por puentes peptı́dicos. Además, existen constituyentes propios de las diferentes especies de la superficie. b) Membrana citoplasmática La membrana citoplasmática, situada debajo de la pared, tiene permeabilidad selectiva frente a las sustancias que entran y salen de la bacteria. Es soporte de numerosas enzimas, en particular las respiratorias. Por último, tiene un papel fundamental en la división del núcleo bacteriano. Los mesosomas, repliegues de la membrana, tienen una gran importancia en esta etapa de la vida bacteriana. c) Citoplasma Es un elemento obligado de las bacterias. Comprende todo lo que hay dentro de la membrana citoplasmática a excepción de las regiones en la que se encuentran el ADN cromosómico. El citoplasma contiene inclusiones de reserva 6 las inclusiones de reserva constituyen almacenamiento de nutrientes; las hay de dos tipos: - Orgánicas, como las de glucógeno y almidón (reserva de hidratos de carbono) y las de reserva de lı́pidos. - Inorgánicas, como los polifosfato, polı́meros lineales de ortofosfatos, que son reserva de fósforo. Se le conoce como granulaciones metacromáticas, ya que se tiñen de rojo con colorantes azules. Los ribosomas son elementos granulosos que se hallan contenidos en el citoplasma bacteriano; esencialmente compuestos por ácido ribonucleico, desempeñan un papel principal en la sı́ntesis proteica. d ) Genoma bacteriano Es un nucleoide con muchos lazos superdesarrollados. Elementos facultativos a) Glicocálix Se suele denominar ası́ a todo polı́mero situado fuera de la pared celular comprende dos estructuras: La capsula y la capa mucosa (capa mucilaginosa, limo) ayuda a configurar la denominada biopelı́cula bacteriana, constituidas por diversos tipos de microorganismos que crecen juntos formando microcolonias embebidas en un material adherente. b) Flagelos fimbrias o Pili Los cilios, o flagelos, no existen más que en ciertas especies. Filamentosos y de longitud variable, constituyen los órganos de locomoción. Según las especies, pueden estar implantados en uno o en los dos polos de la bacteria o en todo su entorno. Constituyen el soporte de los antı́genos ”H”. En algunos bacilos gram negativos se encuentran pili, que son apéndices más pequeños que los cilios y que tienen un papel fundamental en genética bacteriana. c) Esporas Elemento esférico u ovalado por el que un numero pequeño de bacterias adquieren resistencia al ambienten circunstancias que le son desfavorables. Ası́ gracias a esta estructura pueden sobre vivir incluso durante años hasta que las condiciones le sean favorables. Figura 2: Estructura de una bacteria. 7 3. Qué diferencias estructurales existe entre la pared celular de una bacteria gram negativa y gram positiva ? La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglucano, además de dos clases de ácidos teicoicos: Anclado en la cara interna de la pared celular y unido a la membrana plasmática, se encuentra el ácido lipoteicoico, y más en la superficie, el ácido teicoico que está anclado solamente en el peptidoglucano (también conocido como mureı́na) Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior (de composición distinta a la interna) por medio de lipoproteı́nas. Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoproteı́nas. La membrana exterior está hecha de proteı́na, fosfolı́pido y lipopolisacárido. Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tiñen diferencialmente debido a estas direrencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporción que las Gram negativas. La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración, se debe a que la membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgánicos, como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglucano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se formó previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdiéndose la coloración azul-violácea. Pero por el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular más resistente y con mayor proporción de peptidoglicanos, no son susceptibles a la acción del solvente orgánico, sino que este actúa deshidratando los poros cerrándolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloración azul-violácea. Figura 3: Pared Bacteriana: Gram positiva a la derecha y gram negativa a la izquierda. 8 4. ¿ Comó es la fijación del colorante en la pared celular bacteriana ? Es probable que la diferencia entre las bacterias gram positivas y gram negativas se deba a la naturaleza fı́sica de sus paredes celulares. El peptidoglicano no se tiñe por sı́ mismo, más bien parece actuar como barrera de permeabilidad para evitar la pérdida de cristal violeta. Durante el proceso de coloración las bacterias se tiñen primero con cristal violeta y luego se tratan con yoduro para favorecer la retención del colorante. En la decoloración con etanol, se cree que el alcohol contrae los poros de la capa gruesa de peptidoglicano y se retiene el complejo colorante yoduro; ası́ las bacterias adquieren color violeta. Por el contrario, la capa de peptidoglicano de las bacterias gramnegativas es muy fina, con menos enlaces y con poros de mayor tamaño. Además, es posible que le tratamiento con alcohol extraiga suficientes lı́pidos de la membrana externa como para aumentar su porosidad. Por estos motivos el alcohol elimina más fácilmente el complejo cristal violeta yoduro en las bacterias gramnegativas. 5. ¿ Qué bacterias observo durante el desarrollo de la práctica ? Durante el desarrollo de la practica se observaron dos bacterias: La Escherichia coli y La speudomona aeruginosa. (a) Escherichia coli (b) Pseudomonas aeruginosa Figura 4: Tinción de Gram negativa de las bacterias observadas durante el desarrollo de la práctica 9 Referencias [1] Schlegel, H. G, Microbiologı́a general. Barcelona : Editorial Omega 1997. [2] Benjamin Lewin y Andrés Aguilera López, GENES. Barcelona: Editorial Reverté, segunda edición. [3] http://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid= S0716-10182002000300004 [4] http://www.rnw.nl/informarn/html/cienciapenicilina990902.html [5] http://www.ilustrados.com/tema/10808/Tincion-Gram.html [6] http://tinciondegram-v6.blogspot.com/ [7] http://www.rnw.nl/informarn/html/cienciapenicilina990902.html [8] http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm [9] http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Gram [10] http://www.revistaciencias.com/publicaciones/EElpZEVkykPMncqxmd.php 10
