Fundamentos y técnicas de análisis bioquímicos
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ÍNDICE DE BIOQUÍMICA Tema 1 Tema 2 Tema 3 Tema 4 Tema 5 Tema 6 Tema 7 Tema 8 Tema 9 Tema 10 Tema 11 Tema 12 Tema 13 Tema 14 Tema 15 Tema 16 Tema 17 Tema 18 Introducción a la bioquímica La célula Estudio general del metabolismo de los hidratos de carbono Estudio general del metabolismo de los lípidos Estudio general del metabolismo de las proteínas Productos finales del metabolismo Estudio del equilibrio hidroeléctrico Estudio de la orina Estudio de los cálculos urinarios Técnicas de separación de sustancias Técnicas y métodos instrumentales Cromatografía Electroforesis Estudio de la función hepática Principios básicos de espectroscopia Estudio: líquido pleural, pericárdico y peritoneal La espectroscopia de absorción molecular UV-V-IR La espectroscopia de absorción atómica con atomización de llama ( F-AAS) y electrotérmica (GF-AAS) Espectroscopia de emisión atómica (EEA) Otras espectroscopias analíticas Equilibrio ácido-base Estudio del equilibrio gaseoso Estudio del líquido sinovial Enzimología diagnóstica Refractometría y osmometría Estudio de las heces Estudio del líquido seminal Estudio del líquido cefalorraquídeo Monitorización de fármacos Drogas de abuso Marcadores tumorales Técnicas de biología molecular: hibridación de ácido nucleicos Técnicas electroquímicas Control de calidad en el laboratorio de análisis clínicos Tema 19 Tema 20 Tema 21 Tema 22 Tema 23 Tema 24 Tema 25 Tema 26 Tema 27 Tema 28 Tema 29 Tema 30 Tema 31 Tema 32 Tema 33 Tema 34 Resumen Trabajo sobre las hormonas 1 3 5 15 24 36 40 63 83 92 97 107 116 123 144 158 162 168 176 180 183 191 198 203 208 211 212 213 214 215 216 217 218 233 TEMA 1 INTRODUCCIÓN A LA BIOQUÍMICA Los seres vivos están integrados por moléculas inanimadas que se ajustan a todas las leyes físicas y químicas de la materia inerte pero además poseen unos atributos extraordinarios que no poseen la materia inanimada. El atributo más sobresaliente de los seres vivos es su complejidad y su alto grado de organización. Poseen estructuras internas que contienen muchas clases de moléculas complejas, además de presentarse en una variedad asombrosa de especies diferentes. Por contraste la materia inanimada del contorno (ejemplo: agua, suelo, rocas,...) está formada por mezclas fortuitas de compuestos químicas sencillos de organización estructural escasa. En los organismos vivos es legítimo preguntarse cual es la función de una molécula determinada; pregunta que carece de sentido en la materia inerte, además los primeros seres vivos presentan la capacidad de extraer y transformar la energía de su entorno, a partir de materia primaria sencilla y emplearla para mantener su propias estructuras. Pero el atributo más extraordinario de los seres vivos es su capacidad de producir una réplica exacta de sí mismos, lo que puede considerarse la quinta esencia de la vida y cosa que la materia inanimada no es capaz de realizar. La bioquímica es una ciencia muy joven que deriva de 2 líneas matrices: 1·- De la medicina y fisiología (investigación de sangre, tejidos y orina). 2·- De la química orgánica (estudio a cerca de la estructura de los compuestos orgánicos). Surge como ciencia adulta por derecho propio con métodos experimentales y visión de predicción de los fenómenos biológicos en el último cuarto de siglo. Esto es debido a 2 hechos: A·- El reconocimiento de los sistemas multi-enzimáticos como unidades catalíticas en las rutas metabólicas principales y el desarrollo de una hipótesis unitaria para la transferencia de energía a las células vivas. B·- Reconocimiento de que la herencia descansa sobre base molecular racional. En la actualidad la bioquímica está realizando interesantes pruebas en cierto número de áreas fundamentales de la biología, como son la diferenciación de las células y de los organismos, el origen de la vida y la evolución, el comportamiento y la memoria y las enfermedades humanas. Pruebas que han demostrado que estos problemas básicos pueden ser abordados por métodos bioquímicos. Realmente el éxito de la bioquímica en muchos fenómenos celulares ha sido tan grande que muchos científicos han llegado a la conclusión de que la biología es química. Algunos biólogos no comparten este punto de vista que mantienen que la esencia de los organismos vivos complejos no pueden reducirse ni ahora ni nunca al nivel de moléculas e interacciones moleculares; pero este es un punto de vista minoritario. En la actualidad es más lógico admitir como filosofía de trabajo que todos los fenómenos biológicos descansan en último término sobre una base molecular. La lógica molecular de la vida es un conjunto único de reglas fundamentales que gobiernan la naturaleza, la función y las interacciones de los tipos específicos de moléculas presentes en los organismos vivos y los dotan de capacidad de organizarse y replicarse por sí mismos. Las moléculas halladas en la materia viva o biomoléculas contienen compuestos orgánicos de carbono en los cuales el elemento (carbono) se halla relativamente reducido o hidrogenado aunque también contiene nitrógeno (mientras que estos 2 son abundantes en la materia inanimada). Los compuestos orgánicos presentes en la materia viva presentan enorme variedad y la mayor parte son extraordinariamente complejos. Aún las células más sencillas (bacterias) contienen un elevado número de diferentes moléculas orgánicas; así por ejemplo la Escherichia coli contiene aproximadamente 5.000 compuestos orgánicos diferentes y entre ellos 3.000 clases diferentes de proteínas y 1.000 diferentes tipos de ácido nucleicos. Estas moléculas son macromoléculas (porque tienen un peso molecular muy grande) que paradójicamente estará construidas con pilares o moléculas sencillas, cada una de las cuales desempeñan más de una función en las células vivientes. Ejemplo: los aminoácidos son pilares de moléculas proteicas pero también son precursores de hormonas. De ello, en fin, deducimos un axioma de la lógica molecular de la vida, que es que en la organización molecular de las células existe una simplicidad fundamental, esto quiere decir que, los millares de macromoléculas presentes en las células están construidos con unas pocas moléculas sencillas. Esto nos hace deducir que todos los organismos vivos precedemos de un antepasado común. Debido a que cada organismo vivo posee su propio conjunto distintivo de ácidos nucleicos y proteínas surge otro axioma. La identidad de cada una de las especies de organismo está preservada por su posesión de un conjunto distintivo de ácidos nucleicos y proteínas. En la versatilidad funcional de esas biomoléculas básicas deducimos además la existencia de un principio fundamental de economía molecular. RESUMEN: las células vivas solo contienen las moléculas sencillas posibles en el mínimo número de tipos diferentes, nada más las indispensables para dotarlas del atributo de la vida y de la identidad de especie en las condiciones ambientales en que viven. TEMA 2 LA CÉLULA DIBUJO DE UNA CÉLULA 1·- Núcleo 2·- Aparato de Golgi 3·- Ribosomas 4·- Retículo endoplasmático rugoso 5·- Retículo endoplasmático liso 6·- Mitocondrias 7·- Orgánulos o vesículas secretoras 8·- Centríolos 9·- Cilio 10·- Lisosoma La célula es la unidad fundamental de toda materia viva. Una única célula es una entidad aislada de otras células por una membrana celular (y quizás por una pared celular) y conteniendo dentro de ella una variedad de material químicos y estructuras subcelulares. La membrana celular es la barrera que separa el interior celular del exterior. Dentro de la membrana celular se encuentran las diversas estructuras y sustancias que hacen que la célula funcione. Estructuras claves son: • El núcleo o nucleoide: donde se guarda la información necesaria para hacer más células. • El citoplasma: donde se encuentra la maquinaria para el crecimiento y funcionamiento celular. Aunque cada tipo de célula tiene un tamaño y una estructura definida una célula es un unidad dinámica que constantemente sufre cambios y modifica sus constituyentes. Una célula está constantemente tomando materiales del medio y transformándolo en su propio material. Al mismo tiempo origina productos de deshechos que libera al medio. Una célula, es por tanto, un sistema abierto que está en cambio continuo pero que permanece siendo la misma. Tipos de células: tras cuidadosos estudios de la organización interna de las células se ha puesto de manifiesto la existencia de 2 tipos básicos: procariotas y eucariotas. Son 2 tipos estructuralmente muy diferentes. Las eucariotas contienen un núcleo rodeado por una membrana que encierra varias moléculas de ADN y se divide por el conocido proceso de mitosis. Por el contrario en las células procariotas el núcleo no está rodeado por una membrana, consta de una sola molécula de ADN y su división no es mitótica. Además las células eucariotas contienen normalmente además del núcleo otras estructuras internas rodeadas por membrana como las mitocondrias. En la constitución de toda célula eucariota podemos distinguir 3 partes fundamentales que son: membrana, citoplasma y núcleo. • Membrana celular: es una capa o envoltura que delimita exteriormente las células. No obstante debe tenerse en cuenta que no las aíslan del medio que las rodean pues permite el intercambio de materia y energía entre la célula y el exterior, ya que de lo contrario no podría desarrollarse ninguna actividad en su interior. El aspecto y constitución de la membrana celular varía considerablemente en las células animales y vegetales, ya que las vegetales además de la membrana plasmática suelen poseer por fuera una envoltura muy gruesa y resistente que recibe en nombre de pares celular. • Citoplasma: es aquella parte de la célula contenida entre la membrana y el núcleo. Está constituido por una sustancia semilíquida de aspecto viscoso, sin estructura aparente y en la cual se hallan inmersas unas series de estructuras o formaciones que constituyen los denominados orgánulos y que son los siguientes: 1·- Retículo endoplasmático: está constituido por una amplia red de conductos y cavidades denominadas cisternas distribuidos por todo el citoplasma. A veces establece comunicación con el exterior mediante poros que se abren en la membrana plasmática. 2·- Ribosomas: son pequeñas granulaciones adosadas en su capa externa a la membrana del retículo endoplasmático aunque también se pueden encontrar libres en el citoplasma. Son muy importantes pues es en ellos donde la célula fabrica sus proteínas. Para fabricarlas los ribosomas han de agruparse formando polisomas. 3·- Aparato de golgi: está formado por un conjunto de vesículas o sacos que suelen ocupar una posición fija en la célula y el papel que desempeña está relacionado con las funciones de secreción, es por eso, que está más desarrollado en las células secretoras. Para desempeñar su función se halla en comunicación en el retículo endoplasmático del que recibe las proteínas, las cuales después pasan a los gránulos de secreción, los cuales permanecen en el citoplasma o bien pueden evacuarse al exterior. ~ NOTA: el retículo endoplasmático es el orgánulo recolector de las proteínas elaboradas por lo polisomas adosados a su pared. De aquí las proteínas van al aparato de golgi y de esta pasa a los gránulos de secreción los cuales pueden permanecer en el citoplasma o bien evacuarse al exterior. 4·- Lisosomas: son pequeñas vesículas repartidas por todo el citoplasma que albergan en su interior enzimas digestivas. 5·- Mitocondrias: desempeñan un importantísimo papel ya que en ella se llevan a cabo la respiración celular la cual consta de 3 pasos: glucólisis, ciclo de Krebs, cadena de transporte electrónico. Pueden albergarse en los recodos del retículo endoplasmático y son gránulos de forma alargada. 6·- Plastos: son exclusivos de las células vegetales. 7 ·- Centrosomas: desempeñan un importante papel durante la división celular. Se halla situado en las proximidades del núcleo a veces puede estar rodeado por el aparato de golgi. El centrosoma contiene un par de centríolos que son 2 pequeños cilindros dispuestos perpendicularmente. 8·- Orgánulos vibrátiles: son cilios y flagelos. Pueden utilizarse como órganos locomotores o bien para expulsar células extrañas. 9·- Vacuola: son espacios o cavidades dedicados a la célula. Almacenada sustancias de deshecho ó de reserva. • El núcleo: es un corpúsculo bien definido que se halla inmerso en el citoplasma y que destaca con claridad. Es el centro rector de todas las funciones celulares y el portador de los factores hereditarios. En él distinguimos: membrana nuclear, nucleolos (es un corpúsculo de forma esferoidal que también resulta muy visible debido a su viscosidad y contiene el ARN), los cromosomas y el cario-plasma (que es la sustancia contenida por la membrana nuclear y por donde flotan todos los elementos). PREGUNTAS Describe la función de los siguientes orgánulos: • Centríolos: son 2 cilindros importantes durante la división celular. • Mitocondrias: respiración celular. • Retículo endoplasmático: es el recolector de las proteínas. • Ribosomas: se agrupan formando polisomas para fabricar proteínas. • Lisosomas: son vesículas que contienen enzimas. • Aparato de Golgi: función de secreción. TEMA 3 ESTUDIO GENERAL DEL METABOLISMO DE LOS HIDRATOS DE CARBONO Las sustancias que el organismo recibe del exterior o aquellas que necesita sintetizar para un adecuado funcionamiento orgánico y que van a ser transformadas por las múltiples reacciones metabólicas se conocen como principios inmediatos. Estos principios inmediatos son 3: hidratos de carbono, lípidos y proteínas. HIDRATOS DE CARBONO También denominados ‘azúcares’ son compuestos orgánicos en cuya formación entran a formar parte fundamentalmente el carbono, el oxígeno y el hidrógeno. En función del número de moléculas de azúcares sencillos que entran a formar parte de su estructura estos compuestos pueden ser clasificados en: • Monosacáridos: formados por una molécula de azúcar. • Disacáridos: formados por 2 moléculas de azúcar. • Oligosacáridos: formados por 3-10 moléculas de azúcar. • Polisacáridos: formados por más de 10 moléculas de azúcar. Los monosacáridos se clasifican a su vez en: 1·- Aldosa y cetosas: en función del grupo funcional aldehído o cetona presentes en los carbono terminales de su estructura, 2·- Formas D y L: en funciones de la posición (derecha o izquierda) del grupo funcional –OH en su cadena carbonada. 3·- Formas y : en función de la posición del grupo –OH del carbono número 1 de su molécula. ORIGEN DE LOS HIDRATOS DE CARBONO Los azúcares o hidratos de carbono tienen su origen en la dieta y también en la síntesis endógena. Se digieren en la dieta en forma de polisacáridos (por ejemplo: el almidón que se encuentra en el arroz) o en forma de disacáridos (por ejemplo: la fructosa) o monosacáridos (por ejemplo glucosa o galactosa); y una vez digeridos son absorbidos por la flora intestinal en forma de monosacáridos. Cuando el monosacárido absorbido no es glucosa se transforma en ella en el nivel hepático). El sistema endógena tiene lugar a nivel del hígado y riñón partiendo de aminoácido y ácido láctico mediante el proceso denominado gluconeogénesis (producción de nueva glucosa). FUNCIONES DE LOS HIDRATOS DE CARBONO Las funciones más importantes son: 1·- Fuentes de energía: es la función primordial. 2·- Reserva energética 3·- Servir de base para la síntesis de otras estructuras como por ejemplo de los ácidos nucleicos. La energía para consumo inmediato es obtenida de la degradación de moléculas de glucosa (que es el monosacárido por excelencia) que puede tener lugar por 3 vías: 1·- La glucólisis ó Embden-Meyerhof 2·- Pentosas fosfato 3·- Sorbitol La primera vía o glucólisis es la más importante cuantitativamente y en condiciones de anaerobios finaliza en piruvato. Este en presencia de oxígeno ingresa en el ciclo de Krebs y con un gran rendimiento energético proporciona 36 moléculas de ATP (adenín trifosfato) por cada molécula de glucosa degradada. En la vía de las pentosas aldosas se obtiene ribosa (fundamentalmente en la síntesis de ácido nucleicos) y NADPH (nicotinamida-adenina-di-nucleótido fosfato reducido) es necesario en muchos procesos metabólicos de la célula. El sorbitol proporciona moléculas de fructosa. La función de reserva energética: la función de depósito es realizada por el glucógeno sintetizado a partir de la glucosa por el proceso de gluconeogénesis. El glucógeno se encuentra tanto en el hígado (donde puede ser degradado hasta glucosa y utilizado como fuente energética en todo el organismo) como en la masa muscular (este únicamente puede ser usado como fuente de energía para músculos). Glucosa y glucógeno están íntimamente relacionados a nivel metabólico en virtud de los procesos de glucogeneogénesis y glucogenolisis (escisión de glucógeno liberando glucosa a la sangre). METABOLISMO DE LA GLUCOSA La glucosa es el principal producto de energía del organismo (participa en el ciclo de Krebs de las mitocondrias para generar energía en forma de ATP) por lo que determina la capacidad de este para responder a las demandas de aporte y utilización de la energía. La glucosa presente en la sangre tiene su origen en: • Los hidratos de carbono ingeridos en la dieta • la eventual glucogenolisis de glucógeno hepático. • La gluconeogénesis a partir de las proteína (aminoácidos). Tras la absorción de la glucosa ingerida en la dieta esta pasa a la sangre y entonces los niveles normales en ayunas o basales (de 60-90 mg/dl) se eleva hasta valores de 120-150 mg/dl o incluso más. En personas en cuyo metabolismo de hidratos de carbono funciona adecuadamente estos niveles de glucosa disminuyen enseguida de manera que al cabo de 1 o 2 horas se vuelven a alcanzar los niveles basales. Si una persona se mantiene en ayunas mucho tiempo el nivel de glucosa desciende pero nunca debe descender por debajo de 50-60 mg/dl. La glucosa es filtrada continuamente a nivel glomerular y vuelve en su totalidad a la sangre ya que es reabsorbida en los túbulos renales. En individuos con una función renal normal la glucosa aparece en orina (glucosuria) cuando su nivel en sangre (glucemia) es superior a 160 mg/dl (umbral renal para la glucosa). Sin embargo si el túbulo renal está dañado puede aparecer glucosuria con glucemias normales. El mantenimiento de los niveles de glucosa en sangre entre las comidas se consigue gracias al equilibrio que existe entre 2 procesos que son: • Utilización de la glucosa por los tejidos. • La glucogenolisis. El metabolismo de los hidratos de carbono y el de la glucosa por tanto está regulado a nivel hormonal mediante la insulina (producida por el páncreas) por otro lado un conjunto de sustancias de acción antagónica denominadas contra-insulares: • Glucagón • Glucocorticoides (corteza suprarrenal) • Catecolamina (adrenalina y noradrenalina) • GH (hormona del crecimiento también llamada Somatotropina) Destacar 3 funciones de la insulina (disminuye los niveles de glucosa en sangre) sobre los hidratos de carbono: ~ Aumenta la glucogenogénesis ~ Disminuye la glucogenolisis ~ Disminuye la gluconeogénesis ALTERACIÓN DEL METABOLISMO DE LOS HIDRATOS DE CARBONO Pueden darse alteraciones debido a: 1·- disminución de la glucemia en sangre, es decir, hipoglucemia 2·- Las más importantes son debido a una alteración de la tolerancia a los hidratos de carbono que conduce a un aumento del nivel de glucosa en sangre denominado hiperglucemia, dentro de las cuales la más importante es la diabetes. • Hipoglucemia: estado físico-patológico de etiología muy variada y que consiste en la existencia de glucosa plasmática menor a 45-50 mg/dl acompañada o no de signos clínicos (no siempre aparecen al alcanzarse una misma cifra límite de glucosa en sangre). Una hipoglucemia se produce a consecuencia de un desequilibrio entre la glucosa que llega al torrente sanguíneo (procedente de la absorción intestinal, gluconeogénesis y glucogenolisis) y la que sale del mismo como consecuencia del consumo de glucosa por los tejidos. Es una situación poco frecuente ya que mientras varias hormonas contribuyen al aumento de la glucemia una sola tiene efecto hipoglucemiante (insulina). Los síntomas o manifestaciones clínicas de una hipoglucemia son inespecíficos y debidos a 2 causas: 1·- aumento de la liberación de adrenalina (por una aumento de la actividad del sistema nervioso simpático) cuya finalidad es restablecer los niveles de glucemia normales. Provocan estos síntomas: temblores, taquicardias, hipertensión, sudoración, sensación de ansiedad y de hambre, estos síntomas son precoces. 2·- disfunción del sistema nervioso central (en especial en la zona cortical cerebral) por un déficit de glucosa. Estos síntomas son tardíos y son: mareos, confusión, alteraciones de percepción visual, cefaleas, convulsiones, coma, y si la hipoglucemia es prolongada deterioro mental, con lesiones irreversibles del sistema nervioso central. Según la causa desencadenante de la hipoglucemia hablaremos de 2 tipos: por ayuno y por postprandial. 1·- Por ayuno: se produce porque se va consumiendo progresivamente toda la glucosa (e incluso el glucógeno) y se instaura por: A·- disminución de la producción de glucosa, esto puede ser debido a varias causas: • A las hormonas hiperglucemiantes. • A una insuficiencia hepática grave. • A un elevado consumo de alcohol. B·- Un aumento del consumo de glucosa, este aumento puede ser debido a: • Tumores pancreáticos (se segrega insulina en exceso y abundancia) • Tumores con metabolismo hiper-activo. 2·- Postprandial: son frecuentes en personas que han sufrido la extirpación parcial o total del estómago, ya que el vaciamiento rápido del mismo provoca una absorción brusca de la glucosa (hiperglucemia) seguida de un excesivo aumento de la secreción de insulina (hipoglucemia). • Hiperglucemia: es una elevación anormal de la concentración de glucosa en sangre que conduce a un síndrome clínico denominado diabetes cuyo signo clínico más destacado es el aumento de los niveles plasmáticos de glucosa. La diabetes o diabetes mellitus es una metabolopatía compleja crónica que se origina en consecuencia de un déficit de insulina que puede ser absoluto o relativo. En el absoluto la secreción de insulina es insuficientes para el metabolismo normal de los hidratos de carbono. En el relativo la secreción de insulina es normal o incluso está aumentado pero es insuficiente por estar aumentados las necesidades. Este déficit de insulina altera el metabolismo de los hidratos de carbono, lípidos y proteínas. ~ Déficit de insulina en los hidratos de carbono: Disminuye el consumo de glucosa en el músculo y tejido adiposos, como consecuencia aumenta la gluconeogénesis. Disminuye la síntesis de glucógeno. Aumenta la glucogenolisis. ~ Consecuencias (de las 2 primeras causas del déficit de insulina): se produce hiperglucemia y glucosuria. ~ Consecuencia con respecto a los lípidos: aumenta la lipólisis lo que produce gran cantidad de ácidos grasos que se usan como fuente de energía y en el hígado se transforman en cuerpos cetónicos (cetogénesis) estimulado por el glucagón. Estos cuerpos cetónicos pasan a la sangre y como no se pueden usar al ritmo que se producen se acumulan dando hiper-cetonemia y se eliminan vía urinaria dando cetonuria. Otra alteración es que se altera el metabolismo de las lipoproteínas ~ Respecto a las proteínas (alteración de su metabolismo): aumenta la liberación al torrente sanguíneo de aminoácidos pertenecientes a proteínas musculares (aumenta el catabolismo proteico) los cuales una vez en el hígado aumenta la gluconeogénesis. ~ Déficit de insulina: 1·- Hidratos de carbono (hiperglucemia y glucosuria): A·- Disminución del consumo de glucosa: músculo y/o tejido adiposo B·- Disminución del glucogenogénesis C·- Aumento de glucogenolisis 2·- Lípidos: aumento de lipólisis aumento de ácidos grasos hígado aumento de cuerpo cetónicos sangre hipercetonemia cetonuria 3·- Proteínas: aumento de los aminoácidos musculares en la sangre hígado aumento de gluconeogénesis ~ Tipos de diabetes ó de diabetes mellitus: Primaria ó esencial: o Insulino-dependiente, juvenil ó tipo I. o No insulino-dependiente, diabetes del adulto o tipo II. Secundaria ó sintomática: causa conocida. Si la causa del déficit de insulina es conocida hablamos de diabetes secundaria o sintomática. Si la causa es desconocida hablamos de diabetes primaria o esencial, la cual tiene un elevado componente genético. Esta diabetes primaria a veces se relaciona con defectos en los receptores de insulina y también se relaciona con reacciones autoinmunes (anticuerpos). Esta diabetes primaria se clasifica en: 1·- Diabetes insulino-dependiente, tipo I ó juvenil. 2·- Diabetes no insulino-dependiente, tipo II ó del adulto. Las diferencias entre ellas son: TIPO I ó INSULINO-DEPENDIENTE Juvenil Edades tempranas (Aprox. 30 años) Desaparición de las células de los islotes de Langerhans TIPO II ó NO INSULINO-DEPENDIENTE Adulto Madurez (mayor a 40 años) No se conoce la causa (disfunción de las cél ó resistencia a la insulina debido a defectos en el receptor de la insulina Cursa con cetosis Peso corporal inferior al normal Se detectan anticuerpos contra los islotes Imprescindible uso de insulina Raramente existe cetosis Peso corporal superior al normal Raramente ó no se detectarían Ac anti-islotes de L. No suele ser necesarios el uso de insulina Debemos nombrar que aparte de estos 2 tipos de diabetes existen 2 más: La tolerancia anormal a la glucosa, también denominada diabetes latente ó química: tiene hiperglucemia pero con cifras inferiores a las anteriores, no tiene síntomas de diabetes y son obesos. La diabetes gestacional que aparece por primera vez en el embarazo, da mayor riesgo de morbi-mortalidad perinatal (en los recién nacidos) y se diagnostica por la prueba de tolerancia oral a la glucosa (PTOG). DIAGNÓSTICO DE LA DIABETES Las pruebas diagnósticas más usadas están basadas en la demostración de la tolerancia de la glucosa anormal. En las personas en las que esta tolerancia está muy disminuida la demostración de que padecen hiperglucemia y glucosuria en ayunas es suficiente para establecer un diagnóstico de diabetes, de no ser a sí hay que usar pruebas de provocación. En general para considerar a una persona como diabética a de poder demostrarse cualquiera de estas condiciones: 1·- Un aumento de los niveles plasmáticos de glucosa mayor a 198 mg/dl y la presencia de síntomas de diabetes que son 4 fundamentales (las 4 Pes): • Polidipsia: aumento de la sed. • Poliuria: aumento de las veces del número de micciones • Polifagia: aumento de la sensación de hambre. • Disminución del peso corporal. 2·- Una glucemia en ayunas mayor de 139 mg/dl obtenidas en 2 muestras de sangre. 3·- Una glucemia en ayunas menor de 140 mg/dl (aunque mayor a los valores normales) y 2 PTOG con un nivel de glucosa a las 2 horas mayor a 198 mg/dl y al menos otro valor puntual también mayor a 198 mg/dl. • Pruebas más usadas para el diagnóstico de la diabetes: ~ Las que determinan la glucosuria: para que la glucosa aparezca en orina la glucosa debe ser superior a 160 mg/dl. ~ Las que determina la glucemia: en ayunas, post-prandial y las pruebas de sobrecarga de glucosa (oral, intravenosa, sensibilizada con cortisol). Pruebas que determinan la glucemia en ayunas: valores de glucemia plasmática en ayunas mayor de 120 mg/dl, son indicativos de diabetes mellitus mientras que los comprendidos entre 100-120 mg/dl se consideran valores dudosos que se deben confirmar con alguna prueba de sobrecarga de glucosa. La postprandial es más sensible; se usa si la anterior no es definitiva y consiste en determinar los niveles de glucosa en sangre obtenida 2 horas después de haber ingerido una dosis conocida de glucosa (normalmente 100 gr. De glucosa). Previo al análisis se debe instaurar durante 3 días una dieta rica en hidratos de carbono (mínimo 300 gr. diarios) e interrumpir el tratamiento de fármacos que puedan influir en el metabolismo de los hidratos de carbono. Prueba de sobrecarga oral se usan para establecer un diagnóstico en los siguientes casos: 1·- Personas con glucosuria que no tiene síntomas clínicos y que los niveles de glucosa en ayunas y post-prandial son normales. 2·- Personas que no existe glucosuria pero tiene síntomas y los niveles de glucosa en ayunas y post-prandial son normales. 3·- Personas con antecedentes de diabetes mellitus (para detectar diabetes latentes). 4·- En mujeres que han dado a luz niños con peso elevado (4-4’5 o más). 5·- Mujeres embarazadas que presentan glucosuria. Una de las pruebas más usadas es la prueba de sobrecarga oral (ó PTOG) reservando la prueba de sobrecarga intravenosa a personas con problemas gastrointestinales. Para descubrir pacientes pre-diabéticos se puede realizar una prueba alternativa denominada sobrecarga de glucosa sensibilizada con cortisona (ó cortisol) en ella se evita tener que usar una sobrecarga de glucosa tan grande (que podría desencadenar una diabetes) ya que la cortisona es una hormona que aumenta la intolerancia a la glucosa. PRUEBAS DE TOLERANCIA ORAL DE LA GLUCOSA (ó prueba de sobrecarga oral de la glucosa –PTOG) Existen varios métodos pero en general se realiza así: • Durante varios días (normalmente los 3 días) anteriores a la prueba hay que ingerir una dieta rica en hidratos de carbono. • A de realizarse por las mañanas porque varía la tolerancia a la glucosa a lo largo del día; es mayor por la mañana y menor por la tarde. • Hay que tener una absoluta precisión con el horario de administración de la glucosa (normalmente 75 gr. en ayunas) y con las sucesivas extracciones sanguíneas (normalmente cada 30 minutos hasta un total de 2 horas tras la ingesta de la glucosa). • Durante toda la prueba la sangre debe tener la misma procedencia (o toda capilar o toda venosa). • Algunas personas toleran mal la carga de glucosa con lo cual, si aparecen vómitos o náuseas hay que anotarlo por se varía la interpretación final de resultados. • La tolerancia a la glucosa disminuye con la edad por lo tanto la interpretación de esta prueba en ancianos es difícil. • Sea cual sea el método la interpretación de resultados debe ser por personal especializado. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS 1·- Glucosuria renal: existe glucosa en orina y la glucemia es normal. Esto quiere decir que está alterado el umbral renal. Aparece glucosuria intensa a partir de la primera media hora, sin embargo, no existe cetonuria. 2·- Retraso en el almacenamiento de glucosa: aparece glucosuria pero no intensa y no existe cetonuria. 3·- Diabetes leve: existe glucosuria, pero no es intensa y tampoco existe cetonuria. 4·- Diabetes grave: existe glucosuria muy intensa casi desde el principio y existe cetonuria moderada hora y media después de la ingesta. DETERMINACIONES PARA VALORAR EL FUNCIONAMIENTO DEL METABOLISMO DE LOS HIDRATOS DE CARBONO Conocer el metabolismo de los hidratos de carbono (sobretodo la glucosa) permite valorar las alteraciones en la concentración plasmática de la glucosa, que pueden ser: • Primarias: reflejan alteraciones del metabolismo de los hidratos de los hidratos de carbono. • Secundarios: son manifestaciones que acompañan a otras enfermedades. De todos aquellos proceso diagnósticos, adecuados para valorar el funcionamiento del metabolismo de los hidratos de carbono, los más importantes son: 1·- Determinación de la glucemia basal (en ayunas) 2·- Determinación de la glucosuria. 3·- Determinación de la cetonemia y de la cetonuria. 4·- Prueba de sobrecarga oral de la glucosa. 5·- Análisis de hormonas relacionados con el metabolismo de los hidratos de carbono. 6·- Determinación de enzimas y sustratos hidro-carbonados en células y tejidos 7·- Otros 1·- Determinación de la glucemia basal: a temperatura ambiente la glucosa presente en una muestra de sangre entera sufre glucólisis (debido a los glóbulos rojos o eritrocitos) de tal importancia que al cabo de 6 horas puede desaparecer totalmente, proceso que puede verse aumentado por la presencia de leucocitos en elevado número y contaminación bacteriana. Por ello debemos tener en cuenta: A·- Siempre que la muestra sea sangre total debemos realizar el análisis de la glucosa durante la media hora después de la extracción. B·- Si la anterior no es posible debemos añadir un conservador que inhiba la glucólisis, por ejemplo fluoruro sódico. C·- Se recomienda usar plasma o suero par evitar la glucólisis. Los métodos de determinación de la glucosa basal son: • Métodos basados en el poder reductor de la glucosa son: ~ Método de la orto-toluidina: es colorímetro, por lo tanto espectrofotómetro. La cantidad de color es directamente proporcional a la cantidad de glucosa que aparece en la muestra. Casi no se usa debido a que la orto-toluidina es corrosiva y no se puede automatizar y es cancerígena y es un técnica con muchas interferencias. ~ Método de la reducción del cobre: son métodos antiguos. El más conocido es el de Benedict que detecta glucosa e hidratos de carbono reductores totales. Se siguen usando para la determinación semi-cuantitativa de azúcares reductores totales en orina y determinación de efecto genéticos de los hidratos de carbono en niños. Cu+2 + Glucosa calentamientoCu2O + CuOH • Métodos enzimáticos: ~ Método de la glucosa oxidasa (GOD): es la enzima que cataliza la reacción de la glucosa presente en la muestra. La cuantificación de resultados se puede realizar por 2 métodos que son: mediante polarografía y el otro por determinación de peróxido de hidrógeno (H2O2) formado. Para la polarografía realizamos la medida del consumo de oxígeno con un electrodo de oxígeno. La cantidad de glucosa de la muestra es directamente proporcional a la cantidad de oxígeno consumido. Glucosa + O2 ácido glucónico + H2O2 Determinación de peróxido de hidrógeno: mediante la acción de una peroxidasa, un cromógeno pasa de su forma reducida (que es incolora) a su forma oxidada (coloreada). El más usado son los método de Trinder en el cual la intensidad de color es directamente proporcional a la cantidad de glucosa de la muestra. Glucosa + O2 ácido glucónico + H2O2 H2O2 + cromógeno compuesto coloreado (oxidado) ~ Hexoquinasa: este método proporciona el máximo grado de especificidad. La hexoquinasa cataliza el paso de glucosa a glucosa-6-fosfato. En una segunda reacción se produce la reducción de NADP a NADPH (sustancia que absorbe el ultravioleta próximo visible). La reacción se mide en el espectrofotómetro a 340 nanómetros y el incremento de absorbancia es directamente proporcional a la concentración de glucosa. Glucosa + ATP Glucosa-6-P + ADP Glucosa-6-P + NADP NADPH + (a los UV próximos visibles) • Interpretación de estos resultados: Los valores normales de glucemia basal en ayunas 80 mg/dl y valores mayores de 140 mg/dl de glucosa en 2 muestras califica a la persona como diabética. 2·- Determinación de glucosa en orina: valores normales; glucosuria negativa, debemos recordar que la glucosa aparece en orina si se supera el umbral renal, es decir, la glucemia es mayor de 160-180 mg/dl. 3·- Determinación de cuerpos cetónicos: la determinación se realiza en sangre (cetonemia) y en orina (cetonuria) aunque derivan de los ácidos grasos informan indirectamente sobre el metabolismo de los hidratos de carbono. 4·- Prueba de sobrecarga oral de la glucosa ó PTOG: nos permite diferenciar la intolerancia a la glucosa y la diabetes. • La intolerancia a la glucosa: cuando obtenemos en la curva un valor de 200 mg/dl y él obtenido a las 2 horas está entre 140-200 mg/dl. • Diabetes: si en 2 valores uno de los cuales es obtenido a las 2 horas la glucemia es mayor a 200 mg/dl. 5·- Análisis de hormonas relacionados con el metabolismo de los hidratos de carbono: se determina especialmente la insulinemia, se suele usar 2 métodos: • RIA (Radio inmuno ensayo): se uso como marcadores isotópicos radiactivos. • Enzimo-inmuno análisis (el más usado es el test de Elisa): que utiliza marcadores enzimáticos. A parte de determinar insulinemia también se puede determinar las hormonas contrainsulares como el glucagón y a veces se determina el péptido-C. 6·- Determinación de enzimas y sustratos hidro-carbonados en células y tejidos: estos métodos determinan enzimas del metabolismo de los hidratos de carbono o sustratos. Se realizan en células y tejidos de biopsias de órganos. Son importantes para determinar ciertas metabolopatías. • Método de la hemoglobina glicosilada: es una fracción de la hemoglobina A unida por enlaces covalentes a la glucosa. Su aparición es directamente proporcional a la aparición de glucosa en sangre por lo tanto sirve para control de la diabetes en periodo prolongado. Pero en cambio no es útil para el diagnóstico de la diabetes. Es muy específico pero con sensibilidad escasa. • Método cromatográficos inmunológicos 7·- Otras determinaciones: • Determinación de micro-albuminuria: es la excreción de pequeñas cantidades de albúminas (menos de 20 mg/dl). Si la cantidad de albúmina en orina es aproximadamente 20 mg/dl sería detectada mediante tiras reactivas. Esta determinación sirve de control de personas diabéticas. Se determina mediante métodos inmuno-químicos: tienen buena sensibilidad (detectan de 2-20 mg/dl), buena especificidad y son automatizables. La cuantificación de resultados es mediante tubidimetría y nefelometría. • Determinación inmunológicas: consisten en la determinación de anticuerpos específicos frente a la insulina o a las célula pancreáticas productoras de insulina. Los métodos más usados son: enzimo-inmuno-análisis e inmuno-fluorescencia indirecta. • Determinación de receptores: la cantidad de receptores de insulina determina la efectividad y absorción como hormona hipoglucemiante. PREGUNTAS 1·- Nombrar las 3 vías por la cual utilizamos la glucosa como fuente de energía. Glucólisis glucosa con oxígeno (ciclo de Krebs) a ATP, sin oxígeno a piruvato. Pentosas fosfatos glucosa a ribosa-5-P (ADN y ARN) y NADPH Sorbitol glucosa a fructosa 2·- ¿Qué orígenes tiene la glucosa presente en la sangre? Tejido adiposo (triglicéridos) Hígado de la glucogenolisis del glucógeno hepático Músculos de la gluconeogénesis a partir de las proteínas (aminoácidos) Intestino delgado de los hidratos de carbono ingeridos en la dieta. 3·- Regulación hormonal ¿Por qué hormonas está regulado el metabolismo de los H de C? Insulina Sustancias de acción antagónica denominadas contra-insulares :glucagón, glucocorticoides, catecolamina (adrenalina, noradrelina) y GH ó somatotropina. 4·- Diferencias entre la diabetes tipo I y tipo II TIPO I ó INSULINO-DEPENDIENTE TIPO II ó NO INSULINO-DEPENDIENTE Juvenil Adulto Edades tempranas (Aprox. 30 años) Madurez (mayor a 40 años) Desaparición de las células de los islotes No se conoce la causa (disfunción de las cél ó de Langerhans resistencia a la insulina debido a defectos en el receptor de la insulina Cursa con cetosis Peso corporal inferior al normal Se detectan anticuerpos contra los islotes Imprescindible uso de insulina Raramente existe cetosis Peso corporal superior al normal Raramente ó no se detectarían Ac anti-islotes de L. No suele ser necesarios el uso de insulina 5·- ¿Cuál es el método de referencia de determinación de glucosa basal? Método de la hexoquinasa perteneciente al método enzimático de la glucosa basal. Se mide por el espectrofotómetro. TEMA 4 ESTUDIO GENERAL DEL METABOLISMO DE LOS LÍPIDOS Los lípidos son moléculas insolubles en agua. Son un grupo complejo y diverso que está formado por: 1·- Las grasas propiamente dichas entre las cuales estarían los triglicéridos y ácidos grasos. 2·- El colesterol. 3·- Los fosfoglicéridos 4·- Los esfingolípidos Entre los lípidos existen moléculas ‘esenciales’ (no pueden ser sintetizadas por el organismo) otras que requieren ciertas modificaciones para ser ‘funcionales’ y otras muchas ‘no esenciales’ cuya síntesis potencialmente posible para la mayor parte de las células se localiza fundamentalmente en un órgano ‘el hígado’. Entre las variadas funciones de los lípidos destacan los siguientes: 1·- Fuente energética: tienen mayor valor calórico que el resto de los principios inmediatos. 2·- Forma de almacenamiento de energía (al poder ser almacenados sin agua ocupan menos espacio que los hidratos de carbono y proteínas). 3·- Componentes estructurales de las membranas celulares y de las lipoproteínas plasmáticas. 4·- Son agentes emulsificantes. 5·- Son compuestos funcionales de sustancias como las hormonas, prostaglandinas, vitaminas. CLASIFICACIÓN • Triglicéridos: son compuestos formados por la esterificación de la glicerina con 3 ácidos grasos: Los triglicéridos presentes en el organismo cuyos valores normales son inferiores a 160 mg/dl. Pueden tener un doble origen: los que proceden de la absorción intestinal de las grasas digeridas (origen exógeno) y aquellos que son sintetizados en el hígado (origen endógeno): ~ Síntesis en el hígado: directamente a partir de los ácidos grasos disponibles o mediante la transformación de los hidratos de carbono. La mayor parte de los lípidos que se ingieren en la alimentación son triglicéridos (triacilgliceroles). En el tubo digestivo los enlaces tipo ester de los triglicéridos se rompen, por acción de las lipasas (especialmente la pancreática) dando origen a ácidos grasos y glicerol. Su principal función es la de transportar la energía hasta los órganos de depósitos y su destino final es que sus ácidos grasos sean almacenados o utilizados como fuente de energía. Los lípidos almacenados en el organismo principalmente como triglicéridos constituyen la principal reserva energética del cuerpo. En estados de inanición, frío, ejercicio, etc se produce una rápida movilización de los triglicéridos que se hidrolizan pasando el glicerol y los ácidos grasos formados a la sangre. • Colesterol: presente en el organismo tiene también un doble origen: el que proviene de la alimentación (exógeno) (colesterol se encuentra en su mayor parte libre no esterificado). El colesterol esterificado es hidrolizado por la colesterol esterasa pancreática dando lugar a colesterol libre y ácido grasos. El colesterol endógeno aunque potencialmente puede ser sintetizado por todas las células se va a formar principalmente a nivel hepático e intestinal. Va a ser eliminado por el hígado bien por la bilis o bien utilizándose en la síntesis de ácido biliares. Las funciones principales de colesterol circulante son: 1·- Componente estructural fundamental de las membranas celulares. 2·- Precursor de unas hormonas sexuales y de las de la corteza suprarrenal. 3·- Participa en la síntesis de los ácidos biliares. El colesterol circula en la sangre unido a las siguientes lipoproteínas: A·- Las LDL: transportan el 70% del colesterol B·- Las HDL: transportan de 15-20% del colesterol C·- El resto circula unido a las VLDL y los quilomicrones Las lipoproteínas son biomoléculas lipídicas que contienen lípidos y proteínas con lo cual las propiedades físicas y químicas características de sus componentes están fusionadas para cumplir funciones biológicas especializadas. El aumento de la concentración plasmática de colesterol se asocia a un incremento del riesgo de sufrir enfermedades cardiovasculares, por lo que su regulación en la población en general tiene un alto interés epidemiológico. • Ácidos grasos libres: son los únicos lípidos que circulan por el plasma sin estar unidos a una lipoproteína se denominan también ácidos grasos no esterificados. Los ácidos grasos libres proceden de la lipólisis que tiene lugar en el tejido adiposo y de los triglicéridos circulantes. Los valores normales en plasma son entre 10-20 mg/dl. Tienen como principal función la de servir como fuente inmediato de energía, para ello los ácidos grasos son degradados en las mitocondrias para obtener energía mediante un proceso que se llama -oxidación que en última instancia este proceso nos proporcionará unidades de 2 átomos de carbono (Acetil coenzima A –Acetil CoA) más energía para los distintos procesos metabólicos. Cuando existe una intensa formación de unidades de acetil CoA estas unidades se van a utilizar para formar ácido aceto-acético y ácido -hidroxi-butírico, los cuales pueden ser utilizados por otros tejidos como fuente de energía. Estos compuestos junto con la acetona van a formar los denominados cuerpos cetónicos. Los cuerpos cetónicos sintetizados en el hígado pasan a la sangre que los transportan a los tejidos periféricos donde son utilizados. Su concentración en sangre es normalmente baja, sin embargo, en algunas situaciones metabólicas como puede ser el ayuno prolongado y la diabetes mellitus aumenta los niveles plasmáticos de estos compuestos, lo cual ocasiona una disminución del pH sanguíneo que se conoce como acidosis. • Fosfoglicéridos: procedentes de la alimentación son compuestos lipídicos que por la acción de las fosfolipasas pancreáticas dan lugar a glicerol. Fosfato. Ácido graso y bases nitrogenadas. LAS LIPOPROTEÍNAS La relativa especialización de los diversos tejidos en el manejo de los lípidos hace necesaria la existencia de un transporte plasmático de los mismos de un lugar u otro. Para este transporte es necesaria su incorporación en unos complejos que permiten su solubilización y que posean además información necesaria para su correcta metabolización. Aunque existe una gran cantidad de proteínas transportadoras específicas de moléculas lipídicas concretas cuantitativamente destacan aquellas partículas destinadas al transporte del colesterol, triglicéridos y fosfolípidos que son los lípidos mayoritarios del organismo y estas partículas se conocen como lipoproteínas. Las lipoproteínas son macromoléculas que poseen una estructura interna compuesta por triglicéridos y ésteres de alcohol. En su superficie tiene colesterol y fosfolípidos además de proteínas (apoproteínas). La proporción en que se encuentra cada uno de sus componentes determina las propiedades físico-química de las lipoproteínas, lo cual es de gran utilidad para proceder a su reparación y a su posterior estudio. Las apoproteínas designadas (con letras desde la A a la F y algunas con varios subíndices por ejemplo APO-BI). Desempeñan diversas funciones: 1·- Son componentes estructurales de las lipoproteínas y por tanto contribuyen a la solubilización de los lípidos. 2·- Actúan como cofactores de diversas enzimas (los cofactores son aquellas sustancias cuya presencia en pequeñas cantidades es necesaria para la reacción enzimática 3·- Permite que las distintas lipoproteínas sean reconocidas por receptores de la superficie celular. Las lipoproteínas son sintetizadas en el hígado y en el intestino grueso y posteriormente sufren numerosas transformaciones, tanto en la sangre como en los tejidos. En general en función de su contenido lipídico y del tipo de APO presentes en su superficie las lipoproteínas se pueden clasificar en: • Quilomicrones • Lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) • Lipoproteínas de baja densidad (LDL) • Lipoproteínas de alta densidad (HDL) • Lipoproteínas “a” 1·- Quilomicrones: son partículas grandes que aparecen en el plasma tras la ingestión de grasas y son sintetizadas en las células intestinales a partir de: triglicéridos colesterol y fosfolípidos. Su vida en sangre es muy corta (menos de 30 minutos) y su principal función es transportar los triglicéridos exógenos a los tejidos donde son hidrolizados por la lipoproteína lipasa par dar glicerol y ácidos grasos. Estos ácidos grasos son utilizados o bien pueden ser almacenados en los adipositos. Los residuos de los quilomicrones (tras perder los triglicéridos) son eliminados vía hepática. 2·- Las VLDL (very low density lipoprotein): las lipoproteínas VLDL son sintetizadas en el hígado y en el intestino a partir de los lípidos exógenos y endógenos fruto del catabolismo de los hidratos de carbono. Su función es la de transportar los triglicéridos endógenos. Sus triglicéridos son también degradados por la lipoproteína lipasa y el resultado son unos residuos muy ricos en colesterol, que bien pueden ser retirados de la circulación o bien pueden ser utilizados para sintetizar LDL. 3·- Las LDL (low density lipoprotein): las lipoproteínas de baja densidad se originan como consecuencia de la degradación de las VLDL en el torrente circulatorio. Su función principal es la de transportar el 80% del colesterol circulante hacia las células de lo tejidos, las cuales tienen receptores específicos para las LDL. Aquí el colesterol es utilizado para la síntesis de las membranas celulares y los sintetizan de hormonas esteroideas. Las partículas de LDL son metabolizadas en los lisosomas de las células de los tejidos periféricos originando colesterol libre que una vez suelto en el citoplasma celular va a ejercer una triple acción: A·- Inhibe la síntesis endógena del colesterol. B·- Impide la entrada de colesterol a las células (por inhibición de la síntesis de receptores de LDL). C·- Estimula el proceso de esterificación de colesterol libre en el citoplasma. Las lipoproteínas de LDL son sintetizadas por el hígado a partir del: colesterol libre, de los lípidos y de las apo-proteínas C y E. 4·- Las HDL (high density lipoprotein): captan el colesterol libre de las células de los tejidos periféricos y este por acción de la enzima CLAT (lecitina-colesterol-acetil-transferasa) es esterificado, dando lugar a una molécula hidrofóbica que se sitúa en el interior de las HDL. Le lugar periférico que ha quedado libre es ocupado nuevamente por una nueva molécula de colesterol libre que también procede de las células de los tejidos y así sucesivamente. De esta manera se va eliminando el colesterol en exceso de los tejidos. 5·- Lipoproteína “a”: esta se caracteriza por poseer en su estructura una apoproteína peculiar que se llama APO-B100. Su concentración en el plasma es baja y su síntesis –a nivel hepático- está regulada genéticamente. Su marcado interés reside en su carácter aterogénico (la aterogénesis) es el mecanismo por el cual se origina la placa de ateroma en el organismo. Esta lipoproteína se la relaciona con la formación de ateroma en los vasos sanguíneos. La alteración de las distintas fracciones de lípidos circulantes en el torrente sanguíneo es un fiel reflejo de una serie de alteraciones orgánicas de diversas etiologías y gravedad, cuya importancia clínica está relacionada fundamentalmente con la ateroesclerosis. En general dichas alteraciones pueden estar relacionas con: 1·- Aumento de las fracciones lipídicas circulantes (hiperlipemias) 2·- Disminución de las fracciones lipídicas circulantes (hipolipemias) 3·- Aparición en la sangre de lipoproteínas de estructuras anormal que es una dislipoproteinemias. ALTERACIONES DE LAS FRACCIONES LIPÍDICAS CIRCULANTES Las alteraciones más importantes son la que hacen referencia a un incremento de la concentración plasmática de las diferentes fracciones lipídicas. Son las denominadas hiperlipemias. Cuando se hace referencia a las lipoproteínas que las transportan se habla de hiperlipoproteínemias. Las hiperlipemias se clasifican en: • Hipertrigliceridemia: el aumento del nivel de triglicéridos puede ser consecuencia del aumento de la síntesis o una disminución de la degradación de los mismos. Puede estar causados por dietas inadecuados, trastornos hereditarios o ser una manifestación secundaria de otras enfermedades. Cuando el problema es que hay un aumento en la síntesis de los triglicéridos las causas que lo provocan pueden ser: 1·- Porque hay un aporte calórico excesivo, con lo cual los hidratos de carbono no son utilizados como fuente de energía y en el hígado dan lugar a triglicéridos y ácidos grasos. 2·- El alcoholismo: debido a que el alcohol estimula la síntesis hepática de ácidos grasos 3·- La diabetes: debido al déficit de insulina aumenta la lipólisis en tejido adiposo, liberándose ácidos grasos que hacen que aumenten las VLDL. 4·- Trastornos hereditario: son mecanismo de actuaciones complejos y en ocasiones no totalmente precisados. Cuando el problema es que hay una disminución de la degradación de los triglicéridos, las causas que lo provocan pueden ser: 1·- La diabetes: la lipoproteína lipasa ve disminuida su acción por defecto de insulina. 2·- Trastornos hereditarios: existe una alteración de los mecanismos de degradación de los triglicéridos. Las consecuencias de ambas anomalías pueden ser: 1·- Dolor abdominal: el aumento de los órganos produce un aumento de liberación de enzimas del páncreas el cual puede sufrir inflamación dando lugar a pancreatitis. 2·- Hepatoesplenomegalia: es debido al acumulo de macrófagos repletos de triglicéridos que hacen aumentar de tamaño el hígado y el bazo. 3·- Formación de Xantomas: son pequeños nódulos amarillos o rosados que aparecen bruscamente por acumulo de los triglicéridos en los macrófagos de la piel. 4·- Debido al aspecto opalescente que presenta el plasma de las personas afectadas. La retina aparece con aspecto blanquecino. • Hipercolesterolemia: el aumento de los niveles de colesterol puede deberse a: un aumento de la síntesis y a una desviación de la degradación de las lipoproteínas que se ocupan de su transporte. Por lo tanto es mayoritariamente un aumento de colesterol de las LDL. Puede estar causado por dietas poco equilibradas, herencia o ser una manifestación secundaria de otras enfermedades. Cuando el problema es un aumento en la síntesis las causas que lo provocan pueden ser: 1·- Síndrome nefrótico (al existir déficit de albúmina aumento la síntesis de LDL) 2·- Ciertas enfermedades hereditarias. Cuando el problema es una disminución de la degradación de las lipoproteínas las causas que las provocan pueden ser: 1·- Dietas ricas en ácidos grasos y colesterol: que van a provocar una disminución en la afinidad en los receptores de las LDL o bien inhiben la síntesis de las propias receptores. 2·- Déficit de hormona tiroideas que hacen que disminuya el catabolismo de las LDL. 3·- Trastornos hereditarios como al hipercolesterolemia familiar, las LDL se acumulan en el plasma debido a una deficiencia de los receptores para las LDL. Las consecuencia son: 1·- La Ateroesclerosis: es la consecuencia más importante del aumento del colesterol. La lesión más característica es la formación de placas de ateroma (estas placas pueden estar formadas por lípidos, monocitos, fibras musculares y tejido conjuntivo). Estas placas se forman debido a: A·- Adhesión al endotelio vascular de plaquetas por la acción de las LDL B·- Debido a una agresión hacia el endotelio de los vasos sanguíneos. C·- Monocitos y macrófagos presentes en las zona captan las LDL. 2·- Alteraciones cornéales 3·- Formación de nódulos o placas: similares a los xantomas en los párpados y piel por el aumento de macrófagos cargados de colesterol. • Aumento de las HDL: 1·- Hiper-alfa-hiperproteinemia familiar 2·- Personas que realizan ejercicio físico de forma regular. 3·- Personas que beben alcohol moderadamente 4·- Mujeres (debido a la mayor cantidad de estrógenos) Las consecuencias son: es que se ha demostrado que un aumento de HDL protege del desarrollo de la ateroesclerosis ya que las HDL retiran el colesterol de los tejidos y también de la pared arterial hasta el hígado para proceder a su eliminación. • Aumento de los ácidos grasos libres: los ácidos grasos libres son transportados por la albúmina, aumentan cuando hay hipersecreción de hormona que al igual que las catecolamina activan la lipólisis en el tejido adiposo. Las causas que la provocan son: 1·- Situaciones de estrés (aumenta la secreción de catecolamina) 2·- Feocromocituma (es una neoplasia de la médula que debuta con secreción de catecolamina) 3·- Ayuno y diabetes que pueden provocar un aumento de los ácidos grasos también van a ser captados por hígado y se va a producir una aumento de los cuerpos cetónicos y de las VLDL. Las hipolipemias: los trastornos o alteraciones por disminución de las fracciones lipídicas circulantes son las hipolipemias. Son menos frecuentes y normalmente se producen a consecuencia de: 1·- Una disminución en el aporte de nutrientes (personas mal nutridas que padecen síntomas de malabsorción) 2·- Por una síntesis insuficiente de apoproteínas 3·- Un aumento en la degradación de la lipoproteínas. La Abetalipoproteinemia: es un trastorno hereditario poco frecuente que se caracteriza porque las personas que lo padecen no pueden sintetizar la APO-B. Debido a ello tampoco pueden sintetizar las lipoproteínas que la contienen, quilomicrones, LDL y VLDL. Esta enfermedad cursa con descenso plasmático de los niveles de colesterol y triglicéridos. Cuando hay catabolismo de un tipo de lipoproteínas está aumentado la concentración de las fracciones lipídicas que transportan estas lipoproteínas en sangre disminuidas, así por ejemplo un catabolismo acelerado de las LDL puede ser el responsable de una hipocolesterolemia. TRASTORNOS POR EL DEPÓSITO ANORMAL DE LOS LÍPIDOS EN EL ORGANISMO A·- Lipodistrofias: son atrofias más o menos localizadas del tejido adiposo asociadas a diversos trastornos metabólicos. Como puede ser una reducida respuesta a la acción de la insulina. B·- Hígado graso: cuando la síntesis de triglicéridos supera la capacidad del hígado para transformarlos en VLDL los hepatocitos se cargan de triglicéridos. Esto ocurre en el alcoholismo y/o diabetes. C·- Lipoidosis: son raras enfermedades hereditarias de tipo metabólico caracterizadas por un déficit de algunas enzimas encargadas de la degradación lipídicas. En general la acumulación de aquellos lípidos que no son degradados afectan a la funcionalidad celular. Si tiene lugar en las neuronas y en las primeras etapas de la vida puede dar lugar a manifestaciones neurológicas diversas e incluso mental. El acumulo en otros órganos aumenta su volumen. INVESTIGACIÓN EN EL LABORATORIO DE LAS DISLIPEMIAS Con el nombre de dislipemias se conoce el conjunto de alteraciones patológicas que afectan al metabolismo de los lípidos. Caracterizadas por uno niveles anormales de los lípidos circulantes. En la actualidad a quedado bien establecido que las alteraciones en el metabolismo de lípidos y lipoproteínas constituyen el factor casual más importante en el origen de las enfermedades cardiovasculares. El diagnóstico y tratamiento de la población que presenta dislipemias conduce q una clara disminución de la incidencia y gravedad de las enfermedades cardiovasculares. Aún a sí actualmente no existe unanimidad acerca del método más adecuado para identificar a la población que sufre alteración del metabolismo lipídico y poder así reducir el elevado riesgo que estas enfermedades suponen. La realización de estudios masivos de screning a la población en general, aunque probablemente serían de gran interés sería factibles dadas las grandes dificultades que podrían acarrear (dificultad para estandarizar las pruebas, elevado coste,...). Así que aparte de la detección ocasional de una dislipemia en aquellas personas que acuden por primera vez a la consulta médica, puede recurrirse a métodos de exploración selectiva que básicamente consiste en el estudio de aquellas personas que: • Son consideradas de alto riesgo en base a sus antecedentes familiares, de enfermedades cardiovasculares o a la presencia d una hipercolesterolemia en un familiar de primer grado. • Presentan una gran habilidad de sufrir una hiperlipemia personas que padecen alteraciones metabólicas, como: diabetes, enfermedad renal crónica, o una hipertensión arterial (HTA) Sea cual sea el camino seguido a la hora de realizar en el laboratorio un estudio analítico fiable de lípidos hay que tener en cuenta algunas fuentes de error que podrían impedir un diagnóstico correcto y en consecuencia un tratamiento inadecuado a la persona tratada. Algunas causa de error más importancia previas a la determinación analítica son: 1·- Biológicas: existen diferencias apreciables en los niveles lipídicos en función del sexo, de la edad, de la raza, ... 2·- Socio-ambientales: dieta, obesidad, consumo de sustancias tóxicas (como tabaco y alcohol), ejercicio físico, ... 3·- Manipulación de la muestra: ayuno previo a la recogida, la muestra con anticoagulante, almacenaje, el transporte,... 4·- De tipo clínico: tratamiento farmacológico, embarazo y enfermedades concurrentes (crónicas). Estas fuentes de variación pueden minimizarse adoptando las siguientes precauciones generales: 1·- Ayuno mínimo de 12 horas previo a la extracción 2·- Mantener al paciente en su dieta y estilo de vida habitual durante 2 ó 3 semanas previas al estudio analítico. 3·- Suspender cualquier medicación al menos 1 mes antes que puede interferir en el resultado del análisis como por ejemplo estrógenos, anticonceptivos orales, salicilatos,... 4·- Debemos retrasar la extracción 3 semanas después de una enfermedad leve y 3 meses después d una enfermedad grave (infarto) 5·- Confirmar el diagnóstico repitiendo la determinación 2 ó 3 veces en un intervalo de 2 ó 3 semanas. 6·- realizar la determinación d colesterol y triglicéridos totales en las 48 horas posteriores a la extracción. 7·- Para la separación de lipoproteínas debe añadirse a la muestra una solución conservante. En este caso la determinación y procesamiento se llevará a cabo en lo 2 ó 3 días posteriores a la extracción 8·- Conservar todas las muestras refrigeradas. MÉTODOS DIAGNÓSTICOS Los métodos de laboratorio que se utilizan en el estudio de las lipoproteínas pueden clasificarse en 2 grupos: 1·- Métodos generales: determinan alteraciones orgánicas generales de una dislipemia. 2·- Métodos específicos: su objetivo es el diagnóstico genético d una dislipemia. En general las determinaciones más importantes a realizar para el estudio de los lípidos son los siguientes: • Análisis de colesterol • Determinaciones de triglicéridos • Determinaciones de fosfolípidos • Determinaciones de lipoproteínas A·- Métodos generales de diagnóstico: que pueden ser realizado en el laboratorio, general y especializado. Los resultados en el laboratorio general son: 1·- Análisis de colesterol y triglicéridos totales: estas determinaciones se realizan por métodos enzimáticos. 2·- Análisis del colesterol: se determina tras la precipitación del resto d las lipoproteínas mediante reactivos. El colesterol HDL se determina en el sobrenadante por métodos enzimáticos. 3·- Detección de quilomicrones: puede sospecharse su presencia en el suero por el aspecto lechoso y opalescente del mismo. En estos casos se confirma su presencia dejando el suero toda la noche a 4ºC de forma que formen una capa cremosa flotante. 4·- El análisis de colesterol-LDL: puede determinarse mediante l fórmula de friedlwald. Siempre y cuando los triglicéridos sean inferior a 200 mg/dl. En caso de que los triglicéridos sean mayores de 200 mg/dl puede dar errores. Ch-LDL = Ch-total – TG/5 – Ch-HDL. 5·- Determinación de las apolipoproteínas AI y B: esta prueba se ha incluido recientemente debido a que existe una fuerte relación entre la presencia entre las apolipoproteínas y las enfermedades cardiovasculares. Se ha descubierto que un aumento de la APO-B aumenta el riesgo de enfermedades cardiovasculares. Mientras que una APO-AI es un factor de riesgo en la cardiopatía isquémica. Métodos generales de diagnóstico en el laboratorio especializado: en ellos el estudio de los lípidos se realiza mediante la separación de las diferentes fracciones de lipoproteínas. Las diferentes fracciones obtenidas por cualquiera de los métodos se determina colesterol, triglicéridos, fosfolípidos y proteínas. Existen 3 métodos básicos de separación: 1·- Método combinado es el recomendado para la separación rutinaria. Tiene 2 fases: A·- Ultra-centrifugación sin ajuste de densidad, en esta fase se separa la fracción VLDL en el sobrenadante. B·- Se precipitan las LDL del infranadante quedando las HDL en el sobrenadante. 2·- La centrifugación secuencial: se separan las distintas familias de lipoproteínas mediante ultra-centrifugación sucesivas, ajustando en el infranadante la densidad de aquella que se quiere separar. En las fracciones separadas se llevan a cabo las determinaciones que corresponden. 3·- La ultra-centrifugación en gradiente de densidad: la separación de las lipoproteínas se lleva a cabo en un único ciclo de ultra-centrifugación gracias a un gradiente continuo de densidad a lo largo del tubo. Cada lipoproteína flota a la altura correspondiente a su densidad. B·- Los métodos específicos son determinaciones muy específicas encaminadas al diagnóstico de una dislipemia concreta. PREGUNTAS 1·- Definición básica de lípidos Los lípidos son moléculas orgánicas insolubles en agua. 2·- Valores normales de triglicéridos en el organismo Son inferiores a 160 mg/dl 3·- Principales funciones de colesterol circulante Componente estructural fundamental de las membranas celulares Precursor de unas hormonas sexuales y de las de la corteza suprarrenal Participa en la síntesis de los ácidos biliares 4·- Principal función (explicando) de los ácidos grasos libres Su principal función es la de servir como fuente inmediato de energía, para ello los ácidos grasos son degradados en las mitocondrias para obtener energía mediante un proceso que se llama -oxidación que en última instancia este proceso nos proporcionará unidades de 2 átomos de carbono (Acetil CoA) más energía para los distintos procesos metabólicos. 5·- Las LDL Son lipoproteínas de baja densidad se originan como consecuencia de la degradación de las VLDL en el torrente circulatorio. Su función principal es la de transportar el 80% del colesterol circulante. 6·- Consecuencias de una hipertrigliceridemia Dolor abdominal: el aumento de los órganos produce un aumento de liberación de enzimas del páncreas el cual puede sufrir inflamación dando lugar a pancreatitis. Hepatoesplenomegalia: es debido al acumulo de macrófagos repletos de triglicéridos que hacen aumentar de tamaño el hígado y el bazo. Formación de Xantomas: son pequeños nódulos amarillos o rosados que aparecen bruscamente por acumulo de los triglicéridos en los macrófagos de la piel. Debido al aspecto opalescente que presenta el plasma de las personas afectadas. La retina aparece con aspecto blanquecino. 7·- Consecuencias de un aumento de las HDL Protege del desarrollo de la ateroesclerosis ya que los HDL retiran el colesterol de los tejidos y también de la pared arterial. 8·- Menciona las fuentes de variación que pueden ser causa de error a la hora de determinar en el laboratorio una dislipemia Biológicas: diferencias en los niveles lipídicos en función de sexo, edad, raza, ... Socio-ambientales: dieta, obesidad, consumo de sustancias tóxicas, ejercicio físico, ... Manipulación de la muestra: ayuno, anticoagulante, almacenaje, el transporte,... Tipo clínico: tratamiento farmacológico, embarazo y enfermedades concurrentes,... 9·- Para que sirven los métodos específicos. Diagnóstico genético de una dislipemia. TEMA 5 ESTUDIO GENERAL DEL METABOLISMO DE LAS PROTEÍNAS Son macromoléculas constituidas por la polimerización de las unidades estructurales básicas denominadas aminoácidos (a veces compuestos derivados de los mismos) que se unen entre sí mediante enlaces peptídicos (tipo Amida). Dos aminoácidos unidos entre sí por un enlace peptídico forman un dipéptido, sin son 3 serían un tripéptido y así sucesivamente. Los compuestos así formados por menos de 100 aminoácido se denominan péptidos (o polipéptidos) cuando el número de aminoácidos es mayor de 100 el compuesto se denomina proteína. Aminoácidos: son compuestos químicos caracterizados por poseer un grupo funcional amino (-NH2) y otro ácido (-COOH) unidos a una cadena lateral (-R). [Si el grupo –R es un hidrógeno se habla de glicocola –R = H) De todos los aminoácidos conocidos (más de un centenar) simplemente 20 son componentes naturales de las proteínas, el resto son productos intermedios o finales del metabolismo. Los aminoácidos básicamente se diferencian entre sí, por la naturaleza de la cadena lateral y es debido a ella que cada aminoácido tenga propiedades únicas y características. Las diferentes cadenas –R se diferencian entre sí en función de: • Su forma y tamaño • La carga • Por la reactividad • Por la capacidad de formar enlaces puentes de hidrógeno (puentes de H) De entre los 20 aminoácidos naturales algunos no pueden ser sintetizados por el propio organismo y se denomina aminoácidos esenciales. Los aminoácidos no esenciales pueden ser sintetizados mediante una reacción de transaminación. La eliminación renal de los aminoácidos es inapreciable porque aunque se filtre a través del glomérulo (por su pequeño tamaño) son reabsorbidos en el túbulo proximal. Su catabolismo (destrucción) sucede mediante transaminación o desaminación oxidativa y tiene lugar en el hígado y en el músculo. El destino de la cadena hidrocarbonas (-R), es la síntesis de glucosa mediante gluconeogénesis o el ingreso en el ciclo de Krebs para la obtención de energía. El grupo amino cuando no es utilizado para la transaminación es degradado hasta amoniaco (NH3) que en el hígado se transforma en urea y glutamina. Algunos aminoácidos son utilizados en la síntesis de gran interés biológico (por ejemplo hormona). CARACTERÍSTICAS DE LOS AMINOÁCIDOS 1·- Los aminoácidos son compuestos anfóteros ya que en función del pH del medio pueden comportarse como ácido (dador de protones) ó como bases (aceptor de protones). 2·- Cada aminoácido tiene su punto isoeléctrico (PI) característico a cuyo pH tiene un carácter neutro, es decir, no presenta carga neta alguna. El carácter básico de su grupo amino (NH3+) es suficiente para hacerlo reaccionar con el grupo carboxilo (COO-) formándose un ión dipolar también denominado Zwitterion cuya carga total es nula. Este proceso se denomina neutralización. 3·- En disolución acuosa en los aminoácidos existe un equilibrio entre la forma catiónica y aniónica. • Los principales aminoácidos: los 20 aminoácidos que forman parte de las proteínas son: ESENCIALES FENILALANINA (PHE) LEUCINA (LEU) VALINA (VAL) TRIPTOFANO (TRP) METIONINA (MET) LISINA (LIS) ARGINIA (ARG) HISTIDINA (HIS) TREONINA (THR) ISOLEUCINA (ILE) NO ESENCIALES ALANINA (ALA) GLICOCOLA (GLY) PROLINA (PRO) SERINA (SER) TIROXINA (TIR) CISTEINA (CYS) GLUTAMINA (GLN) ÁCIDO GLUTÁMICO (GLU) ASPARAGINA (ASM) ÁCIDO ASPÁRTICO (ASP) • Las alteraciones de los aminoácidos: son errores metabólicos congénitos y se conocen como aminoácidopatías. Son debido 2 causas: 1·- Debido a un déficit enzimático: A·- Fenil-cetonuria: es un acumulo de fenilalanina y sus derivados (tóxicos para el cerebro) en sangre y orina debido a un déficit de fenilalanina-hidroxilasa. B·- Son trastorno del ciclo de la urea: sería hiperamoniemia (que significa un aumento de amoniaco) por déficit de enzimas implicados. C·- Albinismo: falta de pigmentación en la piel debido a que la tiroxina no puede ser transformada en melanina debido a la falta de la enzima tiroxinasa. 2·- Un fallo en el transporte de aminoácidos: puede ser tanto a nivel renal (falla la reabsorción tubular), como a nivel intestinal (falla la absorción). La alteración más conocida es la cistinuria que consiste en que alguno aminoácidos al no ser reabsorbidos en el túbulo pasan a orina, uno de ellos, la cistina puede precipitar formando cálculo renales LAS PROTEÍNAS La secuencia de aminoácidos de una proteína (estructura primaria) le confiere una identidad propia que es responsable de la función biológica que lleva a cabo. Pero esta función biológica para que se lleve a cabo las proteínas deben estar dotadas de una estructura tridimensional que puede ser secundaria, terciaria y cuaternaria. • La estructura secundaria: las cadenas d aminoácidos se pliegan sobre sí mismas dando estructuras de hélice (alfa) o de lámina plegada (beta) • Estructura terciaria: las estructuras anteriores se pliegan sobre si mismas. • La estructura cuaternaria: es a consecuencia de la forma en que las distintas cadenas polipeptídicas se unen entre sí. Las proteínas son compuestos nitrogenados en los cuales entre también a formar parte el carbono, el oxígeno, el hidrógeno y a veces el azufre o el yodo. Son coagulables por el calor y por los aminoácidos minerales. Son insolubles en éter y en alcohol. Los mecanismos mediante los cuales las proteínas son incorporadas y metabolizadas en el organismo son: • Clasificación de las proteínas: las proteínas se clasifican según varios criterios: A·- Atendiendo a su composición: pueden ser: ~ Simples: compuestas solo por aminoácidos ~ Conjugadas: formadas por un componente proteico (aminoácidos) y un componente no proteico (grupo prostético). Según este grupo prostético se dividen a su vez en: o Nucleoproteínas: formadas por la asociación con ácidos nucleicos. o Fosfoproteínas: asociadas con fósforo. o Cromoproteínas: tiene como grupo prostético un colorante (Hb) o Glucoproteínas: unidas a un compuesto hidrocarbonado. o Lipoproteínas: unidas a lípidos en proporción variable. B·- Según su disposición espacial: se clasifican en fibrosas y globulares. Las proteínas formadas por cadenas polipeptídicas paralelas a un eje y unidas por un puente disulfuro y de hidrógeno recibe el nombre de proteínas fibrosas (colágeno). Aquellas formadas por una ó más hélices alfa enrolladas sobre sí mismas sobre una estructura compacta se denomina globulares (la mayor parte de los enzimas, de las hormonas y de los anticuerpos). C·- Según su función biológica: se clasifican en: ~ Proteína estructural: mantienen unidas las estructuras. Por ejemplo el colágeno ~ De transporte: transportan moléculas o iones en el organismo. P.E.: albúmina. ~ Catalizadores biológicos: son enzimas. P.E.: catalasa, fosfato deshidrogenasa. ~ Mensajeros químicos: hormonas como la calcetonina ó insulina ~ Defensa inmunológico: son proteínas que activan como anticuerpos como por ejemplo la Ig G e Ig M. D·- Localización: pueden ser de 2 tipos: hísticas (tejido) y hemáticas (sangre) PROTEÍNAS PLASMÁTICAS Son las proteínas presentes en el plasma. Son más de 125 diferentes y tienen distintas funciones en el organismo que son: 1·- fuentes de nutrición para los tejidos, ejemplo albúmina 2·- participación activa en el mantenimiento del equilibrio osmótico, es decir, mantiene la adecuada distribución hídrica en los distintos compartimentos del organismos, ejemplo albúmina 3·- importante función como amortiguadores o tampones (mantiene el equilibrio del pH) 4·- importantes funciones de transporte, ejemplo albúmina y fármacos 5·- funciones defensivas, ejemplo gammaglobulinas 6·- otras funciones: A·- factores de coagulación (fibrinógeno) B·- inhibidores enzimáticos • Definición de proteínas plasmáticas: es la suma de las concentraciones de todas y cada una de las proteínas presentes en el plasma. Su valor normal en el organismo es de 7-8 gr/dl. El aumento de la cifra de proteínas totales suele deberse a una disminución relacionada con el volumen plasmático debido a: hipovolemia (disminución del líquido circulante) y deshidratación (lo que varía no es la cantidad de proteínas sino la proporción entre estas y el nivel hídrico del organismo). La disminución de la cantidad de proteínas totales tiene también varias causas: 1·- el aumento del volumen plasmático a consecuencia de una retención excesiva de líquidos. 2·- la disminución de síntesis de albúmina por ejemplo en desnutrición o alteraciones hepáticas 3·- la disminución en la producción (hipogammaglobulinemias) de las gammaglobulinas o aumento en las pérdidas de la fracción de las globulinas, por ejemplo: quemaduras • Clasificación de proteínas plasmáticas: ~ Pre-albúmina: Tiene poca utilidad a la hora de valorar el estado nutricional. Es reactante en fase aguda negativa. Es transportadora de vitamina A. Disminuyen su valor en desnutrición proteica y hepatopatía. ~ Albúmina: Es esencial en los mecanismos de nutrición del organismo Es fácilmente metabolizable Tiene todos los aminoácidos esenciales Es la principal responsable de la presión osmótica (retiene agua) Interviene en la regulación del equilibrio ácido-base, es decir, actúa como tampón Es transportadora de múltiples sustancias (fármacos) Se une a los lípidos formando lipoproteínas Sus valores normales son 3’5-5’2 gr/dl. Su vida media es de 15 días Las causas de su aumento son: deshidratación lo que produce volemia Las causas de su disminución son: desnutrición, hepatopatías, enfermedades renales, neoplasias e enfermedades crónicas. ~ Globulinas: Las globulinas son un grupo muy heterogéneo constituido por proteínas y proteínas conjugadas. (Con hidratos de carbono serían glucoproteínas y con lípidos, lipoproteínas). Mediante electroforesis se separan básicamente en 3 grupos: globulinas, globulinas y globulinas. globulinas: Son un 15% del total. Su concentración normal es de 0’3-0’7 gr/dl. Tienden a aumentar cuando hay daño hístico activo. Su hallazgo en plasma es inespecífico ya que aparece en traumatismos, procesos malignos, inflamatorios,... Se divide en 2 fracciones: 1 : 1 anti-tripsina: Es la sub-fracción mayoritaria. Su función es que inhibe la tripsina Está aumentado en reacciones inflamatorias agudas Está disminuido en enfisema pulmonar y en cirrosis hepática infantil. 1 lipoproteínas: Transportan colesterol y vitaminas liposolubles Está aumentado en enfermedades hepáticas Transcobalamina: Transportan vitamina B12 Está disminuida en la mala nutrición Protrombina: Es un factor de coagulación ya que es precursor de la trombina Está disminuida en hepatopatías y en tratamientos con dicumarínicos 2 : Ceruloplasmina: Es transportadora de cobre Está aumentada en la gestión, es reactante en fase aguda Haptoglobina: Transporta la hemoglobina Está aumentada en procesos inflamatorios agudos y crónicos, es reactante en fase aguda Está disminuida en hepatopatías y en algunas anemias 2 lipoproteínas: Son transportadoras de lípidos Están aumentados en hiperlipemias Está disminuido en insuficiencia hepática Eritropoyetina Intervienen en la formación de eritrocitos Está aumentada en ciertos tipos de anemias Está disminuida en nefropatías (riñón), enfermedades autoinmunes e insuficiencia renal Alfafetoproteína: Es la proteína principal del feto Está aumentada en el embarazo y en neoplasias hepáticas globulinas: Representan un 12% de las globulinas totales. Su concentración normal es de 0’4-0’8 gr/dl. Esta fracción no suele aparecer alterada. Las globulinas se sub-dividen en: Transferrina: Es transportadora de hierro. Está aumentada en las anemias ferropénicas. Está disminuida en hepatopatías y neoplasias -lipoproteínas: Es transportadora de colesterol, fosfolípidos y hormonas Está aumentado en el síndrome nefrótico e hiperlipemias Está disminuido en casos de nutrición. C3 y C4 : Son componente del sistema del complemento Está aumentado en procesos infecciosos agudos e infarto de miocardio Está disminuido en la anemia hemolítica autoinmune y en el curso eritematoso. Hemopexina: Transporta el grupo ‘hemo’ de la hemoglobina Es reactante en fase aguda por tanto está aumentada en inflamaciones agudas. Está disminuida en hepatopatías. globulinas: Se divide en: Ig G, Ig A, Ig M, Ig D e Ig E (anticuerpos): Constituyen la mayor parte de las inmunoglobulinas. Su composición química es semejante. Su movimiento electroforético es variable, por lo tanto, forman una banda ancha en el proteinograma. Son anticuerpos que constituyen la inmunidad humoral Los valores normales son de 0’6-1’1 gr/dl. Están aumentados en procesos inflamatorios crónicos y en enfermedades autoinmunes Están disminuidos en casos de hipogammaglobulinemia en edad avanzada, en inmuno-supresión. Proteína C reactiva: Es reactante de fase aguda, es altamente sensible Está aumentada en inflamaciones agudas y en necrosis hísticas (muerte de tejidos). ~ Fibrinógeno: La concentración normal es de 0’3 gr/dl. En electroforesis migra entre las fracciones b y c. Es reactante de fase aguda. La función más importante es la coagulación, es precursor de la fibrina Está aumentada en el embarazo y durante el uso de anovulatorios Está disminuida en hepatopatías y coagulopatías por consumo. DETERMINACIÓN DE LAS FRACCIONES PROTEICAS Aparte de la determinación de proteínas totales es importante clínicamente la determinación cualitativa y cuantitativa de los diferentes tipos proteicos de plasma, es decir, la cuantificación de las fracciones proteicas. Se usan los siguientes métodos: electroforesis, inmuno-electroforesis o inmuno-difusión radial. • Electroforesis: es una técnica físico-química relativamente sencilla que va a permitir separar y posteriormente cuantificar las fracciones más importantes de proteínas presentes en el plasma. Obteniendo así lo que se conoce como patrón electroforético o proteinograma. Mediante una electroforesis normal es posible separar aquellas fracciones de proteínas plasmáticas cuyo peso molecular oscila entre 66.000-700.000. Cuando el soporte usado para llevar a cabo el desarrollo electroforético es acetato de celulosa las principales fracciones proteicas son: la fracción albúmina y las fracciones , , globulinas y globulinas. Cada fracción está formado por un conjunto de proteínas con un movimiento electroforético semejante aunque muy diferente en cuanto a estructuras y funciones. El fibrinógeno puede aparecer cuando la muestra usada es plasma. En cambio no aparecerá en el suero (porque se consume en el proceso de coagulación). • Inmuno-electroforesis: tiene mayores niveles de sensibilidad y especificidad consiste en combinar la separación electroforética con la provocación de reacciones inmunológicas entre las proteínas y anticuerpos específicos frente a ellas. Las diferentes fracciones proteicas se detectan mediante la aparición de arcos de precipitación. Tiene gran utilidad ya que permite detectar gran número de fracciones proteicas y además permiten detectar inmunoglobulinas anormales • Inmuno-difusión radial: es una técnica únicamente de tipo inmunológico. Consiste en colocar el suero a analizar en un orificio (pocillo) practicado en una palca de agar impregnado de anticuerpos dirigidos específicamente contra la proteína que se desea valorar. La reacción proteína-anticuerpo forma un anillo de precipitación cuyo diámetro es proporcional a la cantidad de proteína presente en la muestra que se pretende valorar. La técnica se puede cuantificar mediante el uso de patrones. ALTERACIONES DE LAS PROTEÍNAS PLASMÁTICAS Por la gran diversidad de funciones de las proteínas plasmáticas son muchas las alteraciones que pueden aparecer. Se clasifican en: • Disproteinemias: son alteraciones en las fracciones obtenidas tras una electroforesis. • Paraproteinemias: presencia en el plasma de alguna inmunoglobulina anormal y/o alguno de su fragmentos. • Crioglobulinemias: es la circulación en el plasma de inmunoglobulinas que precipitan al descender la temperatura. • Alteraciones de alguna banda: son defectos aislados de alguna fracción. • Alteraciones de la proteinemia total: son alteraciones en la cantidad total de las proteínas totales. 1·- Disproteinemias: A·- Hipo-albuminemia: es la disminución de la concentración de la albúmina. Puede ser debido a: ~ Una síntesis insuficiente, por ejemplo mal nutrición, insuficiencia hepática. ~ Una eliminación y degradación excesivas. Por ejemplo: síndrome nefrótico, alteraciones intestinales, quemaduras extensas,... B·- Hipogammaglobulinemia: es una disminución de las globulinas pro déficit en el sistema inmunitario. C·- Hiper-globulinemia: ~ Un aumento de las globulinas. Por ejemplo: inflamaciones aguda , tumores,... ~ Un aumento de las a y b globulinas. Por ejemplo: síndrome nefrótico ~ Aumento de las globulinas. Por ejemplo: inflamaciones y enfermedades del colágeno. 2·- Paraproteinemias ó gammapatías monoclonales: se consideran inmunoglobulinas anormales. Son productos de una actividad espontánea (sin estímulo antigénico previo) y excesiva de un clon proliferante d linfocitos B. Se observaría en: A·- Mieloma múltiple B·- Leucemias y linfomas C·- Lesiones renales D·- Síndrome de hiper-viscosidad de la sangre. 3·- Crioglobulinemias: las crioglobulinas son un grupo de inmunoglobulinas que precipitan al disminuir la temperatura pueden dar lugar a trastornos circulatorios en las regiones distales de las extremidades cuando se exponen al frío o también inflamaciones de los vasos (vasculitis). 4·- Alteraciones de alguna banda: reflejan defectos de los protoplasmáticos. Son debidas a trastornos de la síntesis proteico tanto de tipo hereditario como adquirido: 5·- Alteración de la proteinemia total: A·- Hiper-proteinemia auténtica: no a consecuencia de la hemo concentración) es siempre debida a un aumento de las inmunoglobulinas. B·- Hipo-proteinemia es debida a la disminución de las 2 fracciones electroforéticas más importantes y son la albúmina y las globulinas. MÉTODOS DE DETERMINACIÓN DE LAS PROTEÍNAS PLASMÁTICAS Existen gran variedad de métodos. Los más usados son: • Los que determinan la cantidad de proteínas totales • Los que determinan alguna de las fracciones proteicas más importantes en el plasma Podemos tener 2 tipos de muestras: sangre y orina • Sangre: puede usarse suero, plasma (dará resultados mayores que en el suero por el fibrinógeno). La sensibilidad de las proteínas en suero y plasma es de: ~ Una semana si la conservación de la muestra esa temperatura ambiente ~ Un mes si se conserva la muestra refrigerada ~ Dos meses si se conserva congelada * Determinaciones de proteínas totales en sangre: 1·- Kjeldahl 2·- Biuret 3·- Métodos refractométricos 4·- Otros A·- Absorción en el ultravioleta B·- Lowry * Albúmina: método de fijación de colorantes. Determinaciones de proteínas totales en sangre: 1·- Kjeldahl: Determinar el nitrógeno proteico. Es poco usado porque es lento y complejo. 2·- Biuret: Es el método de referencia. Es colorimétrico tiene gran especificidad y precisión. Tiene una gran capacidad para los resultados y pocas interferencias. Permite su automatización. Consiste en la formación de un compuesto coloreado en presencia de sales de cobre y en medio básico. 3·- Método refractométricos: Son bastantes usados ya que tienen bastante precisión y exactitud y elevada rapidez. El inconveniente es que está sujeto a interferencias. Por ejemplo muestras hemolizadas y lipémicas. Consiste en la determinación del índice de refracción de la muestra el cual varía en función de la variedad de proteínas totales. 4·- Otros: A·- Absorción en el ultravioleta: Consiste en que al enlace peptídico las proteínas presentan absorción en el ultravioleta que se puede medir a 260 nanómetros. Es un método muy preciso, muy sensible y muy exacto. B·- El método Lowry: Es el más usado en orina. Tiene gran sensibilidad pero muchas interferencias. Consiste en la determinación del color producido a consecuencia de la adición de reactivos en medio básico. Determinación de la albúmina: son métodos de fijación de colorantes que permiten determinar sólo albúmina. Tiene gran importancia clínica. Consiste en la fijación más o menos específica de ciertos colorantes concretamente el verde de bromocresol, únicamente o la fracción de la albúmina. • Orina: la proteinuria es un índice del estado del riñón concretamente de la lesión renal. La determinación de proteínas en orina es más compleja que en sangre y la sensibilidad del método depende del tipo de proteínas presentes en la muestra y de la cantidad de sustancias no proteicas interferentes. Existen 3 métodos de determinación de proteínas totales de orina: ~ Biuret: Es colorimétrica. Está basado en la formación de un compuesto coloreado en presencia de sales de cobre y medio básico. Tiene escasa sensibilidad y bastantes interferencias. ~ Métodos turbidimétricos: El más usado es el método de tricloroacético. Es muy usado por su gran exactitud y precisión. Consiste en determinar espectroscópicamente la turbidez debida a las presencias de proteínas. ~ Métodos que fijan colorantes: El colorante más usado es el azul brillante de coomasie (menos usados es el rojo de ponceau) Es un método muy usado por su gran rapidez y consiste en que el colorante se une + al grupo NH3 de las proteínas. PREGUNTAS 1·- ¿Qué es la fenil-cetonuria? Es un déficit enzimático de las alteraciones de los aminoácidos. Es un acumulo de fenilalanina y sus derivados en sangre y orina debido a un déficit de fenilalanina-hidroxilasa. 2·- ¿Qué son las proteínas conjugadas? Tipos. Son proteínas formadas por un componente proteico (aminoácidos) y un componente no proteico (grupo prostético). Según este grupo prostético pueden ser: nucleoproteínas, fosfoproteínas, cromoproteínas, glucoproteínas y lipoproteínas. 3·- Funciones de las proteínas plasmáticas 1·- fuentes de nutrición para los tejidos, ejemplo albúmina 2·- participación activa en el mantenimiento del equilibrio osmótico, es decir, mantiene la adecuada distribución hídrica en los distintos compartimentos del organismos, ejemplo albúmina 3·- importante función como amortiguadores o tampones (mantiene el equilibrio del pH) 4·- importantes funciones de transporte, ejemplo albúmina y fármacos 5·- funciones defensivas, ejemplo gammaglobulinas 6·- otras funciones: factores de coagulación (fibrinógeno) e inhibidores enzimáticos 4·- Tres funciones de la albúmina Es la principal responsable de la presión osmótica (retiene agua) Interviene en la regulación del equilibrio ácido-base, es decir, actúa como tampón Es transportadora de múltiples sustancias (fármacos) 5·- Clasificación de las -globinas (sólo nombrar) Transferrina: transportadora de hierro -lipoproteínas: transportadora de colesterol, fosfolípidos y hormonas C3 y C4: componentes del sistema de complemento Hemopexina: transporta el grupo ‘hemo’ de la hemoglobina 6·- Proteinograma normal. PREGUNTAS DE REPASO DE LOS TEMAS 3, 4 Y 5. 1·- Definición de hiperglucemia y de hipoglucemia Hiperglucemia: es una elevación anormal de la concentración de glucosa en sangre que conduce a un síndrome clínico denominado diabetes Hipoglucemia: estado físico-patológico de etiología muy variada y que consiste en la existencia de glucosa plasmática es menor a 45-50 mg/dl acompañada o no de signos clínicos. Es una consecuencia de un desequilibrio entre la glucosa que llega al torrente sanguíneo y la que sale del mismo 2·- ¿Cómo afecta la diabetes al metabolismo de los lípidos? Aumenta la lipólisis lo que produce gran cantidad de ácidos grasos que se usan como fuente de energía y en el hígado se transforman en cuerpos cetónicos. Estos cuerpos cetónicos pasan a la sangre, hiper-cetonemia y se eliminan vía urinaria dando cetonuria. 3·- Interpretación de los resultados de la PTOG Glucosuria renal: existe glucosa en orina y la glucemia es normal. El umbral renal está alterado. Aparece glucosuria intensa a partir de la primera media hora, pero no existe cetonuria. Retraso en el almacenamiento de G: aparece glucosuria no intensa y no existe cetonuria Diabetes leve: existe glucosuria, pero no es intensa y tampoco existe cetonuria. Diabetes grave: existe glucosuria muy intensa casi desde el principio y existe cetonuria moderada hora y media después de la ingesta. 4·-Catabolismo proteico Sucede mediante transaminación o desaminación oxidativa y tiene lugar en el hígado y en el músculo. El destino de la cadena hidrocarbona (-R), es la síntesis de glucosa mediante gluconeogénesis o el ingreso en el ciclo de Krebs para la obtención de energía. El grupo amino cuando no es utilizado para la transaminación es degradado hasta amoniaco (NH3) que en el hígado se transforma en urea y glutamina. 5·- ¿En qué consiste el método Biuret? Es el método de referencia. Es colorimétrico. Consiste en la formación de un compuesto coloreado en presencia de sales de cobre y en medio básico. 6·- Principal función de los triglicéridos Su principal función es la de transportar la energía hasta los órganos de depósitos 7·- Definición de lipoproteínas Son macromoléculas que poseen una estructura interna compuesta por triglicéridos y ésteres de alcohol. Son proteínas transportadoras específicas de moléculas lipídicas, entre las que destacan aquellas partículas destinadas al transporte del colesterol, triglicéridos y fosfolípidos que son los lípidos mayoritarios del organismo. 8·- Valores normales de los ácidos grasos libres en sangre Los valores normales en plasma son entre 10-20 mg/dl. 9·- Quilomicrones Son partículas grandes que aparecen en el plasma tras la ingestión de grasas y son sintetizadas en las células intestinales a partir de: triglicéridos, colesterol y fosfolípidos. Su vida en sangre es muy corta. Su principal función es transportar los triglicéridos exógenos . 10·- ¿Qué es la ateroesclerosis? Es la consecuencia más importante del aumento del colesterol. La lesión más característica es la formación de placas de ateroma (estas placas pueden estar formadas por lípidos, monocitos, fibras musculares y tejido conjuntivo). TEMA 6 PRODUCTOS FINALES DEL METABOLISMO LA UREA Constituye el principal compuesto de excreción del amoniaco y que se forma en el transcurso de metabolismo de aminoácidos y proteínas (producto final del catabolismo proteico). Es sintetizada en el hígado a partir de aminoácidos y de allí pasa a la sangre, finalmente se elimina a nivel renal. La expresión nitrógeno-ureico procede del echo de que tradicionalmente la urea se ha venido determinando a partir de nitrógeno contenido en el amoniaco, el cual se forma por la acción de una enzima que es la ureasa sobre la propia urea de la sangre, aunque es un término similar no es equivalente al de urea y se puede establecer una correlación entre ambos mediante la siguiente expresión: UREA (mg) = nitrógeno-ureico (mg) X 2’14. La urea es eliminada por vía renal siendo filtrada fácilmente a nivel glomerular. Una vez filtrada se reabsorbe en un 40% en los túbulos proximales. La concentración de urea en el filtrado glomerular es igual a la del plasma (aunque existen pequeñas variaciones en función del sexo y de la edad los valores normales oscilan entre 10’7-36’5 mg/dl) y sobre el nivel plasmático de urea influyen otros factores: 1·- Grado de ingesta proteica 2·- Efectividad de la función hepática 3·- Nivel de catabolismo proteico endógeno El aumento de la concentración de urea en sangre está estrechamente relacionado con alteraciones en su eliminación (la concentración de urea en sangre es la uremia) y por tanto es un claro indicador de insuficiencia renal aunque no tan claro como la creatinina, la cual detecta esta situación muy rápidamente. Tiene además una gran utilidad como método sencillo de una insuficiencia renal ya instaurada. Dicho aumento puede ser debido a causas extra-renales o nefropatías. Cuando la funcionalidad renal está asegurada el origen del aumento de urea en sangre puede ser debido a: 1·- alteración hepática 2·- hemorragia digestiva 3·- aumento en la formación de urea (a consecuencia de un catabolismo aumentado o bien a un exceso proteico en la dieta). Si descartamos la posibilidad extra-renal de la uremia la causa renal más frecuente es la insuficiencia renal la cual puede ser aguda ó crónica. La insuficiencia renal aguda puede estar causada por necrosis tubular, enfermedad renal (píelo-nefritis aguda), neoplasias, enfermedades generales (diabetes lesión del riñón) y obstrucción de las vías urinarias por cálculos renales, etc. La insuficiencia renal crónica puede ser consecuencia de glomérulo nefritis, hipertensión arterial, diabetes y neoplasias. • La determinación de urea: como la urea es degradada rápidamente por la acción bacteriana las muestras tomadas para proceder a su determinación deben ser refrigeradas (aproximadamente 4ºC) hasta su procesamiento. Dicha determinación puede ser realizada tanto en sangre como en orina por el método Berthelot-Searcy. Este es un método enzimático colorimétrico, basado en la siguiente reacción: UREA + H2O CO2 + 2NH3 2NH3 + SALICILATO + HIPOCLORITO DERIVADO INDOFENÓLICO (COLOR) La intensidad del color es proporcional a la cantidad de urea presente en la muestra problema. ÁCIDO ÚRICO Es el producto final de la degradación de las purina que son la adenina, guanina e hipoxantina, procedentes de catabolismo de los ácidos nucleicos (ADN y ARN) por acción de la enzima xantin-oxidasa. Las purinas pueden tener una doble procedencia por un lado exógeno (a través del consumo de proteínas) y por otro lado endógeno (la más importante). Las purinas al combinarse con un azúcar da lugar a los nucleósidos que al unirse a una ó más moléculas de fosfato forman los nucleótidos como el ADN, el ARN, el ATP, etc están formados por nucleótidos. En el organismo existen alrededor de 1.200 mg de ácido úrico de los cuales son eliminados diariamente unos 700 mg. El 60% posteriormente es reabsorbido en los túbulos renales al 90% del total. El resto es filtrado con la bilis (vía hepática) y los jugos pancreáticos y gástricos. • La determinación de ácido úrico: se lleva a cabo tanto en sangre (uricemia) como en orina (uricuria) y los trastornos de su metabolismo se van a manifestar con hiperuricemia o hipouricemia. Los trastornos del metabolismo de ácido úrico se expresan en una alteración por exceso o por defecto de los niveles séricos de ácido úrico. Los valores normales en sangre son entre 3’6-7’7 mg/dl para el hombre siendo para la mujer un 20% más bajos. • Hiperuricemia: es el aumento de los niveles séricos de ácido úrico y puede tener un doble origen: A·- Hiperuricemia metabólica: las causas pueden ser: ~ Una dieta rica en purinas: cualquier dieta rica en proteínas de origen animal sobre todo vísceras que aportan núcleos celulares). Es una fuente de ácido úrico de escasa importancia. ~ Aumento de la lisis celular: así el ácido úrico que procede del catabolismo de los nucleótidos aumenta si el número de células desintegradas aumenta. ~ Aumento del consumo de ATP ~ Ciertos trastornos metabólicos hereditarios del metabolismo de las purinas B·- Hiperuricemia renal: las causas pueden ser: ~ Insuficiencia renal: disminuye la cantidad de ácido úrico filtrado en los glomérulos. ~ Niveles aumentados de otros metabolitos como puede ser el ácido láctico y los cuerpos cetónicos. Los cuales inhiben competitivamente la secreción tubular. Las consecuencias de la hiperuricemia son: 1·- El depósito en forma de uratos que provocan una reacción inflamatoria en diversas localizaciones: ~ Si es en las partes blandas de las articulaciones da un cuadro de gota aguda. ~ Si se da en el cartílago articular y hueso subyacente da un cuadro de gota crónic ~ Otras localizaciones que pueden tener se denomina TOFOS. Pueden ser cartílago de la oreja, tendones ó bajo la piel. 2·- Insuficiencia renal aguda por obstrucción de los túbulos. 3·- Cálculos de las vías urinarias. • Hipouricemia: pueden ser debido a: 1·- Disminución de la síntesis de ácido úrico debido a una deficiencia en xantín-oxidasa. Esto constituye un rato trastorno hereditario en el que hay un déficit de la enzima encargada del paso de hipo-xantina a xantina. Si esto no ocurre hay déficit de ácido úrico 2·- Aumento de la eliminación renal debido a: secreción inadecuada de la hormona antidiurético (ADH). También puede ser debido a una lesión del túbulo proximal de la nefrona lo que provoca que no haya reabsorción. 3·- Forma esencial :debido a un fallo de la reabsorción tubular o una excesiva secreción a nivel renal. NOTA importante: cuando la síntesis de ácido úrico es insuficiente disminuye de forma paralelo la uricemia y la uricuria. Cuando la causa de la hipouricemia es un aumento de la eliminación renal la uricuria es desproporcionadamente elevada con respecto a la uricemia. Uno de los métodos mas utilizados par ala determinación de ácido úrico tanto en sangre como en orina es el enzimático colorimétrico (por ejemplo uricasa-PAP). Este compuesto e convertido en una sustancia coloreada cuya intensidad de color es proporcional a la concentración de ácido úrico en la muestra problema. AMONIACO Es uno de los productos finales por la acción de las bacterias sobre las proteínas y por la hidrólisis de la glutamina (proteína) en el riñón. Normalmente el hígado elimina la mayor parte del amoniaco en sangre, que fluye por la vena porta y la convierte en urea. Una elevación considerable de los niveles de amoniaco en sangre podría afectar seriamente al equilibrio ácidobase y a la función cerebral, para evitar, este compuesto es transformarlo a nivel hepático en urea y posteriormente es eliminado por el riñón. La determinación de amoniaco en laboratorio es útil para: 1·- Evaluar el metabolismo hepático 2·- Determinar la evolución de una hepatopatía grave. 3·- Valorar el grado de respuesta al tratamiento instaurado Se presentan cifras aumentadas de amoniaco en las siguientes situaciones: A·- Una enfermedad hepática B·- Un coma hepático (causado por hepatitis grave o cirrosis). C·- Insuficiencia cardiaca grave. A la hora de determinar este compuesto en el laboratorio es importante saber que: 1·- El ejercicio previo al análisis puede causar un aumento de la concentración de amoniaco. 2·- Los niveles de amoniaco varían con la ingestión de proteínas. 3·- Hay muchos fármacos que pueden afectar a estos niveles en sangre. CREATINA Es un compuesto nitrogenado no proteico cuya síntesis tiene lugar en los riñones, intestino delgado, páncreas e hígado. A partir de los aminoácidos: metionina, arginina y glicocola. Tras su síntesis la creatina pasa inicialmente a la sangre y posteriormente va a ir hacia las células del tejido muscular. El contenido de creatina es proporcional a la masa muscular. Este compuesto es importante para metabolismo muscular porque constituye un importante mecanismo de almacenamiento de fosfato de alta energía mediante la formación de fosfo-creatina. Mediante la hidrólisis de fosfo-creatina se obtiene :creatinina y fosfato energético, el cual puede aportar energía directamente o a través de su acoplamiento con una molécula de ADP para formar ATP. Del total de creatina presente en el organismo la mayor parte se encuentra a nivel muscular en forma de fosfo-creatina. Una pequeña parte se encuentra en el plasma y en los glóbulos rojos (2%). CREATININA Es un producto final del metabolismo muscular. Se forma a partir de la creatina mediante una reacción espontánea e irreversible y su formación tiene relación directa con la masa muscular. Tras pasar a la sangre se elimina en su mayoría vía renal mediante filtrado glomerular y solo una pequeña cantidad se elimina por las heces. Su nivel plasmático es bastante constante de manera que no se modifica ni con el ejercicio ni con las variaciones del catabolismo. Además es mucho menos dependiente del aporte dietético de la urea (la cantidad de creatinina ingerida con la dieta (exógeno) es insignificante). La producción endógena de creatinina se mantendrá constante tanto tiempo como la masa muscular se mantenga constante. En general todo incremente del nivel sérico de este compuesto indica insuficiencia renal y este aumento es paralelo aunque más lento al de la urea. Todas las causas de lesión renal, pre-renal, sistémicas o vasculares con afectación del riñón u obstructivas, pueden ser responsables de la elevación de la creatinina ya que evitan su excreción. La determinación de la eliminación de la creatinina es una medición muy específica y muy útil para determinar la función renal, especialmente la filtración glomerular. En realidad lo que se mide es la velocidad con lo que la creatinina es depurada o aclarada de la sangre por el riñón. Se define a “aclaración de una sustancia” como el volumen imaginario en ml/minutos de plasma del cual dicha sustancia debe ser extraída por completo par que el riñón excrete es a cantidad en 1 minuto. DETERMINACIÓN ANALÍTICA DE CREATINA Y CREATININA Una gran parte de los métodos analíticos utilizados para la determinación de creatina y creatinina están basadas en la reacción de Jaffe en la cual a partir de la creatinina presente en al muestra analizada se obtiene un compuesto coloreado que puede ser cuantificado fotométricamente. Aunque es un método de gran sencillez presenta como inconvenientes: 1·- Estar sujeto a gran cantidad de interferencias (glucosa, proteínas, y otros cromógenos no derivados de la creatinina). 2·- La reacción es muy sensible a la temperatura y variaciones del pH destinadas a una mejoría en la sensibilidad y especificidad del ensayo para la creatinina. Adoptando esta reacción a un método cinético de determinar (tiempos) se consigue una gran especificidad ya que la creatinina reacciona con mayor rapidez que los posibles cromógenos interferentes presentes en la muestra. El incremento de color detectado al poco tiempo de iniciarse la reacción será debido únicamente a la concentración de creatinina presente y por tanto no valorará las interferencias presentes. Puesto que los eritrocitos poseen cantidades considerables de cromógeno no derivados de la creatinina, es preferible utilizar como muestra para su determinación en plasma o suero siempre que no estén hemolizados en lugar de sangre total. Por su parte la creatina se determina previa conversión en creatinina, APRA lo cual se procede acidificando y calentando la muestra problema. TEMA 7 ESTUDIO DEL EQUILIBRIO HIDROELÉCTRICO INTRODUCCIÓN El agua es el componente más importante del cuerpo humano. Constituye entre el 60-70% del peso corporal total, en función de factores tan diversos como el sexo, la edad y la cantidad de grasa presente en el organismo del individuo. En condiciones normales el total de agua en el organismo se mantiene bastante constante debido a un ajuste entre ingestión y eliminación. Así: • Ingestión (diaria): 1.000 ml que proceden de los líquidos ingeridos 800 ml que están contenidos en los alimentos sólidos. 400 ml que se producen en diferentes reacciones metabólicas. 2.200 ml • Eliminación (diaria): 1.000 ml que perdemos a través de la piel y de la respiración 1000 ml con la orina 200 ml con las heces 2.200 ml El agua corporal total se distribuye equilibradamente en distintos compartimentos. Son básicamente 2: el intracelular y el extracelular. Separados entre sí por una membrana semipermeable que es la membrana celular. El intracelular es el más grande con un 40% del peso corporal total y presenta neutralidad eléctrica (las sustancias disueltas con cargas negativas es igual a las sustancias disueltas con carga positivas). El extracelular supone sólo el 20% y se encuentra rodeando a las células, proporcionándoles un ambiente externo constante. Posee también neutralidad eléctrica y a su vez está formado por 3 componentes principales: 1·- El plasma: es la fracción de sangre del organismo libre de células. Ocupa el espacio intracelular y posee un elevado contenido en proteínas. 2·- Líquido intersticial: está localizado entre las membranas de las células y la pared de los vaso. Supone aproximadamente el 15% del peso corporal total (en función de la edad y del contenido en grasa del organismo). Transporta las sustancias entre las células y el plasma sanguíneo(es un compartimento amortiguador entre el plasma y el líquido intracelular) tiene una concentración escasa de proteínas. 3·- El líquido trascelular: representa el 1% del peso corporal total aunque en diversas situaciones patológicas se puede incrementar de manera importante. Está formado principalmente por secreciones digestivas, líquidos: intraocular, céfalo-raquídeo, pleural, pericárdico, peritoneal, seminal, xenobial (articulaciones) y líquido sinovial. El intercambio de líquido entre plasma y líquido intersticial se produce a través de las paredes de los vasos capilares, e influyen en el volumen total de líquido extracelular y depende principalmente de los siguientes factores: 1·- La presión hidrostática de la sangre en los capilares (mayor en el extremo arteriolar que en el venoso). 2·- La permeabilidad capilar: es la rapidez por la cual una sustancia disuelta atraviesa una membrana. Las paredes del endotelio capilar actúan como una membrana semipermeable. Permitiendo el paso del agua y de soluciones difusibles, pero no de compuestos de gran peso molecular (como las proteínas) 3·- La diferencia de presión oncótica entre el plasma y el líquido intersticial (debida básicamente a la proteína plasmática). NOTA: la presión oncótica es la presión osmótica de las sustancias coloides. ¿Qué es una solución coloide? Es un estado de subdivisión de la materia en que las partículas individuales son de tamaño sub-microscópico y consiste en moléculas pequeñas. Estas partículas representan en su conjunto una fase dispersa más ó menos uniformemente distribuido en un medio de dispersión. La presión osmótica es el exceso de presión que se debe aplicar a una solución para impedir que penetre en ella el disolvente, cuando este último se halla separado de la solución por una membrana impermeable. 4·- EL drenaje linfático: (el drenaje de líquido intersticial será de gran importancia cuando existan trastornos del equilibrio hídrico entre este y el plasma). NOTA: El sistema linfático es el sistema conductor de la linfa constituido en el hombre por los ganglios y los vasos linfáticos, además de formaciones linfoides diversas como el timo (es un órgano del cual no está muy clara su función, está situado detrás del esternón, entre ambos pulmones, y delante del corazón, se relaciona con el sistema inmunológico), el bazo (se ocupa de la formación de linfocitos y monocitos guardando relación con la inmunidad además posee afinidad selectiva por determinadas bacterias fijan las toxinas y producen los anticuerpos). Todos los órganos que reciben vasos sanguíneos poseen vasos linfáticos porque son sistemas paralelos. Por su parte los sistemas respiratorios y renal regulan la composición del fluido extracelular que a su vez influye en gran medida en la composición del líquido intracelular. Dicha composición debe mantenerse dentro de unos límites ajustados. Con el fin de que los procesos metabólicos intracelulares alcancen la máxima eficacia. EQUILIBRIO HIDROELÉCTRICO Inmersas en los diferentes compartimentos corporales, están presentes, una gran cantidad de sustancias. En general la distribución de líquidos en los diferentes compartimentos dependen sobre todo de la cantidad y concentración de esas sustancias, tanto de las que pueden difundir (iones) como las que no pueden hacerlo. Un ión es un átomo o grupo de átomos que ha ganado o perdido 1 ó varios electrones con lo que adquieren 1 ó varias cargas eléctricas que pueden ser más ó menos. El ión cargado positivamente se denomina catión y el ión cargado negativamente es un anión. De todas las sustancias disueltas, los iones libres que existen en los líquidos corporales, (electrolitos) contribuyen de forma decisiva al mantenimiento de la composición del medio interno (homeostasis : es un término que expresa la tendencia de los organismos a mantener en equilibrio su masa anatómica, composición y metabolismo, y también sus niveles funcionales mediante el empleo de mecanismos especiales de regulación), en aspectos tan importantes como la osmolaridad, el estado de hidratación y el pH, de manera que: 1·- Los iones y el agua del organismo están en continuo intercambio con el exterior, y aunque no están distribuidos uniformemente se mantiene en un equilibrio fundamental para la vida 2·- Existe una igualdad entre el total de aniones y cationes en los compartimentos líquidos corporales. En condiciones normales existe un estado de neutralidad eléctrica de manera que todo aumento de un determinado anión va acompañado de la disminución de otro o de un aumento de uno ó más aniones. Los principales electrolitos disueltos en el organismo son: Cationes Aniones Ca+2 Cl- Mg+2 Na+ HCO-3 (bicarbonato) HPO-3 (Bifosfato) K+ Aunque la naturaleza de las sustancias disueltas (iones-moléculas) es diferente para cada compartimiento, en ausencia de actividad funcional la presión osmótica es uniforme en todos sus líquidos corporales. Cuando localmente en alguna zona del organismo se presenta actividad (por ejemplo: un determinado órganos) aparece variaciones que se denomina gradientes de presión osmótica que desaparece cuando dicha actividad cesa. En general una alteración en la carga de solutos o en la cantidad de agua hace que esta difunda de uno u otro compartimiento de forma proporcional al tamaño del mismo., hasta equilibrar las fuerzas osmóticas. El mantenimiento del equilibrio hidroeléctrico depende sobre todo del equilibrio entere el ingreso y pérdida., agua y electrolitos ingresan normalmente en el organismo con la bebida y la comida que son excretadas con la orina, las heces, exudados y el aire espirado. Las alteraciones del equilibrio hidroeléctrico se presenta en clínica frecuentemente como resultados de un complicación de una enfermedad de base. No debe por ello considerarse como identidades aisladas sino que han de ser estudiadas en el ámbito físico-patológico en el que se desarrolla par cada situación concreta. 2·1·- Osmolaridad de los líquidos corporales: es una propiedad de las soluciones que puede definirse como: ‘el número de partículas de soluto, por unidad de volumen de una disolución expresada en miliosmoles de soluto en un litro de solución (mOsm/L) En condiciones normales la concentración osmolar delos líquidos corporales es de 290+ 10 mOsm/L. No obstante esta osmolaridad puede variar en función de: A·- La cantidad de partículas disueltas. B·- El grado de hidratación del organismo. En principio independientemente de su tamaño y carga cada partícula disuelta proporciona una osmolaridad de 1 mOsm. Sin embargo en las sustancias ionizables cada ión contribuye a la osmolaridad en igual medida que una molécula de una sustancia no ionizable (por ejemplo la glucosa). De entre los electrolitos orgánicos más importantes tenemos: ~ El sodio y los aniones que lo acompañan (principalmente cloro y bicarbonato) constituyen entre el 90-95% de los solutos osmóticamente activos del líquido extracelular. ~ El potasio, magnesio y fosfato orgánicos los son pero del líquido intracelular. Hasta el momento las teorías físico-químicas de la difusión no han explicado adecuadamente esta desigual distribución de la mayoría de los solutos, entre los compartimientos intra y extracelulares. Pero está ampliamente demostrado que: ~ Las membranas celulares no se comportan únicamente como barreras semipermeables, en las cuales los diferentes solutos se distribuyen mediante un mecanismo de difusión simple. ~ Algunos membranas celulares tienen permeabilidad selectiva para ciertas moléculas. ~ En muchos casos hay mecanismo de transporte activo que actúan a través de las membranas celulares, ligados íntimamente a procesos metabólicos de estas (gasto de energía). La importancia de la osmolaridad delos fluidos corporales radica en su papel regulador de la distribución del agua entre los diferentes compartimientos del organismo. El agua difunde en general, de una zona de menos concentración osmolar a uno de mayor concentración para igualar osmolaridad. Empíricamente se demuestra que la osmolaridad de una disolución influye sobre su punto de ebullición (aumentándolo) y sobre su punto de congelación (disminuyéndolo). En base a ello la determinación de osmolaridad se realiza mediante un osmómetro, dispositivo que mide el descenso del punto de congelación de una disolución. MANTENIMIENTO DEL EQUILIBRIO HIDROELÉCTRICO En el tubo digestivo desembocan diariamente 9 litros de líquido: ~ Ingesta ---------- 1’5 litros ~ Saliva ------------ 1’5 litros ~ Jugo gástrico --- 3 litros ~ Bilis -------------- 0’5 litros ~ Jugo pancreático 1-2 litros ~ Jugo intestinal un volumen no determinado La absorción de esto líquidos se realiza sobre todo en el intestino delgado y una pequeña parte en el colon, pasando unos 100 cc diarios a las heces. Las necesidades de electrolitos en la dieta son muy variables pero en general: ~ Deben ingerirse en pequeñas cantidades (Na+, K+, Mg+2) ~ Cuando el consumo es escaso, pueden acumularse ~ Algunas como el calcio y el potasio se eliminan continuamente por lo que han de consumirse de forma regular par evitar su carencia. ~ El exceso en su consumo normalmente es compensado por unas mayor eliminación, generalmente con la orina. En general estos electrolitos se absorben por un mecanismo de transporte activo (con gasto energético) con difusión pasiva debida a una diferencia de gradiente (sin gasto energético) acompañando al agua en una respuesta a una diferente del gradiente osmótico y esto se denomina arrastre por solvente (llamado difusión facilitada). En la regulación del equilibrio hidroeléctrico interviene el aparato respiratorio que actúa variando las velocidades de la respiración y los riñones que son los principales responsables de mantener el equilibrio hidroeléctrico del organismo existiendo un equilibrio entre sustancias excretadas e ingeridas. Si este equilibrio se rompe aparecen trastornos bioquímicos. El riñón es el principal órgano encargado de regular la osmolaridad de los líquidos corporales. Es el órgano que elabora la orina, fluido biológico cuya concentración varía en función de las necesidades de forma que: si el organismo necesita retener agua los mecanismos de reabsorción entran en funcionamiento y por lo tanto aumenta la osmolaridad de la orina. Si hay un exceso de agua el flujo urinario aumenta y disminuye la osmolaridad. Mediante estos mecanismos de concentración y aumentación del flujo urinario, en condiciones fisiológicas de normalidad, el riñón regula la concentración de solutos y pese a las grandes fluctuaciones en la ingestión de agua y sales, mantienen la osmolaridad de los líquidos orgánicos dentro de unos límites estrictos. En última estancia la absorción y secreción de agua y electrolitos son procesos mediados por hormonas y neurotransmisores, de manera que : ~ Un aumento de la osmolaridad del suero o plasma estimula la secreción de hormona anti-diurética. La reabsorción de agua aumenta y la orina se concentra. ~ Una disminución de la osmolaridad del suero inhibe o incluso llega a suprimir la liberación de la hormona anti-diurética. La reabsorción de agua disminuye y la orina se diluye. NOTA: hormona anti-diurética (ADH): ↑ la P.O. del plasma debido a que provoca un ↑ en la reabsorción de agua disminuyendo así la cantidad de orina y aumenta la [] de esta. EVALUACIÓN DEL EQUILIBRIO HIDROELÉCTRICO Una forma de evaluar la capacidad del riñón como regulador del equilibrio electrolítico es determinar cualitativa y cuantitativamente los solutos presentes en la orina: A·- Calculando la densidad de la muestra B·- Midiendo su osmolaridad (la osmolaridad urinaria, la densidad urinaria suelen coincidir siempre que no halla ninguna patología que contribuya a eliminar por la orina sustancias de alto peso molecular. C·- Determinando los electrolitos presentes. En general consiste en valorar el estado del equilibrio hidroeléctrico y poder determinar así aspectos tan importantes como: 1·- El estado de hidratación 2·- La funcionalidad de la hormona anti-diurética. 3·- La gravedad de un estado de ‘coma’ en un paciente. ESTUDIO DE LOS ELECTROLITOS ORGÁNICOS MÁS IMPORTANTES Por su gran accesibilidad el suero o plasma ese el fluido biológico de elección a la hora de evaluar la composición en cationes y aniones del organismo. De entre todos los electrolitos orgánicos tanto cationes como aniones, vamos a describir a los más importantes: 1·- EL SODIO (Na+): es el electrolito sanguíneo más abundante con unas necesidades mínimo de 15 miliequivalentes/día. Existe una estrecha relación entre el metabolismo del sodio y del agua. El nivel del sodio orgánico depende de la relación entre la cantidad ingerida más cantidad excretada con la orina. Es el principal catión extracelular (al 90% del sodio está fuera de la célula) siendo el contenido del sodio el que rige el volumen del compartimiento. La natremia normal es entre 135-148 miliequivalentes/litro. A·- HIPERNATREMIA: concentración de sodio en suero superior a 150 mEq/L. Ocurre con poca frecuencia y solo se consideran graves los niveles que superan los 160 mEq/L. Las causas que la provocan pueden ser: 1·- Incremento del aporte: elevada ingesta de sal o de bicarbonato sódico, etc. 2·- Disminución de la eliminación renal: esto ocurre en la diabetes insípida. 3·- Una alteración endocrina como puede ser la enfermedad de Cushing (es una afección que afecta sobre todo a mujeres jóvenes, caracterizada por adiposidad exagerada en cara, cuello y tronco, aspecto pletórico, hipertensión y retención de agua entre otros síntomas), 4·- Secundaria a una pérdida relativa de agua, bien por disminución de aporte o por pérdida excesiva. B·- HIPONATREMIA: valores de sodio en suero inferiores a 130 mEq/L que normalmente refleja un exceso ‘relativo’ de agua en el organismo más que un valor disminuido del total de sodio. Una hiponatremia se considera grave con valores inferiores a 125 mEq/L y la rapidez con la cual se alcanza este valor es un dato muy significativo a la hora de valorar la gravedad del cuadro más que la cifra alcanzada, la hiponatremia relativa (falsa hiponatremia) es la consecuencia de un aporte excesivo de agua que se traduce en un dilución del sodio plasmático. Las causas que la pueden originar son: ~ Disminución en el aporte de sodio. ~ Aumento de las pérdidas intestinales y gástricas (vómitos y diarreas) ~ Aumento de las pérdidas renales (diuréticos salinos, fracaso renal agudo) ~ Alteración endocrina, enfermedad de Adisson cursa con astenia física, psíquica, coloración bronceado de piel, mucosas, con trastornos digestivos, anorexia, dolor de estómago (epigastralgia), vómitos y diarrea, hipotensión arterial y adelgazamiento analíticamente habrá hiponatremia). ~ Otras: quemaduras grave, sudoración excesiva acompañada de ingestión masiva de agua. El diagnóstico se realiza atendiendo a las pruebas complementarias de laboratorio y permite clasificar las hiponatremias en: 1·- Isovolémicas: disminuye en la ingesta de sodio. 2·- Hipovolémicas: vómitos y diarreas 3·- Hipervolémicas: síndrome nefrótico C·- MECANISMOS DE INCORPORACIÓN Y ELIMINACIÓN: ~ La filtración: el sodio se transporta a través de las membranas celulares mediante un sistema de transporte activo (bomba de sodio) que consume energía. ~ La excreción: se excreta filtrando a través del glomérulo siendo una excreción renal regulada con gran exactitud y que se adapta al contenido de la dieta; siendo la excreción extrarenal de sodio rarísima en individuos sanos. ~ La reabsorción: es reabsorbido en su mayoría a nivel del asa de ‘Henle’ gracias a un proceso regulado por la Aldosterona (umbral renal = 11-130 mEq/L). La cantidad de sodio ingerida con al dieta sufre graves variaciones, sin embargo el organismo tiene tendencia a mantener constantes los niveles de sodio en el plasma y en los líquidos extracelulares. Por ello, aún en condiciones patológicas solo se observan pequeños cambios. Su concentración es controlada por los riñones y por el sistema nervioso central que actúa a través del sistema endocrino. D·- FUNCIONES BIOLÓGICAS MÁS IMPORTANTES: 1·- Conservación química de la presión osmótica 2·- Mantenimiento del equilibrio ácido-base 3·- Participa en la transmisión de impulsos nerviosos. E·- MECANISMOS DE REGULACIÓN DE SODIO EN EL ORGANISMO: ~ Flujo de sangre renal: si el flujo de sangre en el glomérulo aumenta, aumenta la excreción renal de sodio. Si el flujo de sangre en el glomérulo disminuye, disminuye la excreción renal de sodio. ~ Anhidrasa carbónica: la inhibición de la actividad de este enzima provoca un aumento de la reabsorción de sodio en los túbulos renales. ~ Aldosterona: es una hormona que actúa: 1·- Aumentado la reabsorción de sodio y cloruro 2·- Disminuyen la concentración de potasio La secreción de aldosterona está en función de el sistema Renina-angiotensina y de concentración de sodio y potasio. NOTA: sistema renina-angiotensina: la renina es una sustancia capaz de transformar el angiotensinógeno en angiotensina (es una sustancias que produce vasoconstricción periférica e hipertensión). ~ Otros esteroides: especialmente aquellos cuya concentración plasmática es regulada por la hipófisis y pueden causar retención de agua y sal. Por ejemplo: progesterona y estrógenos que provocan cambios en la retención de agua y sodio durante el ciclo menstrual. ~ Renina: esta enzima regula el flujo de sangre en el riñón. La filtración glomerular y la excreción de sodio y agua, es un estímulo potente para la secreción de aldosterona. En enfermedades renales cantidades excesivas de renina excretadas dentro del plasma originan retención de agua y sal lo que da lugar a una hipertensión. ~ Hormona anti-diurética, ADH ó vasopresina: su secreción es causa de cambios en el volumen de líquido extracelular. Regula la reabsorción de agua en los túbulos distales del riñón. F·- Clínica de la hipernatremia e hiponatremia: 1·- Hipernatremia: aumento del volumen de agua lo que nos va a dar un estado hipertónico. Los síntomas son: hipertensión (aumento del volumen), edema, sed, fiebre y alteraciones del sistema nervios central (como por ejemplo: agitación, excitación, neuromuscular,...) 2·- Hiponatremia: entrada masiva de agua en el interior de las células. Esto va a dar lugar a un estado hipotónico. Las posibles enfermedades patológicas son: edema cerebral, fibrilación muscular, calambre, estupor, desorientación, coma,... G·- Determinación: 1·- A nivel plasmático permite valorar cambios bruscos en el equilibrio hidroeléctrico. Cuando los cambios son leves la utilidad de esta determinación es relativa. 2·- A nivel urinario: el sodio urinario es un indicador más sensible que el plasmático para descubrimiento precoz de pequeños cambios. Observaciones: ~ La concentración de sodio puede realizarse en suero (plasma) ~ La sangre heparinizada puede dar resultados erróneos si se utiliza heparina sódica. ~ Es necesario procesar las muestras antes de 3 horas (evitando así desplazamientos del ión entre el interior y el exterior de la célula). ~ Hay muchos fármacos que pueden ser causa de concentración falsamente aumentada o disminuida de sodio en sangre. 3·- Métodos analíticos: ~ Químicos: han sido muy utilizados los colorimétricos, hoy en desuso. ~ Absorción atómica o fotométrico de llama: se utilizan 2 tipos de fotometría de llama: la de lectura directa y la de patrón interno. Es una de los métodos más utilizados. ~ Potenciometría: utiliza el método del electrodo ión –selectivo; hoy por hoy es uno de los más utilizados y se han adoptados para sistemas automatizados (autoanalizadores). 2·- EL POTASIO (K+): es como el sodio, un catión especialmente importante en la regulación del equilibrio ácido-base. Las necesidades de potasio en una persona adulta oscila entre 80-200 mEq/día, siendo la dosis máxima tolerable de 400 mEq/día incluso aunque o halla ingestión de potasio, por lo que una ingestión diaria insuficiente de potasio puede ocasionar graves patologías. La localización del 90% de este catión está dentro de la célula, es decir, intracelular. La porción extracelular es en pequeñas cantidades situada en los huesos y en la sangre. La determinación de nivel plasmático de este ión que es la potasemia, es un mal indicativo de su contenido total, en el cuerpo humano ya que solo el 0’4% del potasio presente en el organismo está en el plasma. Los valores normales son entre 3’5-5 mEq/L. A·- HIPERPOTASEMIA ó HIPERKALEMIA: se considera hiperpotasemia a valores mayores a 5’5 mEq/L. Las causas pueden ser: ~ Aumento del aporte (cuando hay una destrucción celular como el caso de los aplastamientos, quemaduras, intervención quirúrgicas,... se libera mucho potasio a la sangre). ~ Perfusiones de potasio ~ Disminución de la excreción renal (por una insuficiencia renal). ~ Acidosis metabólica (el potasio sale de las células) B·- HIPOPOTASEMIA ó HIPOKALEMIA: se considera hipopotasemia con valores de 3’5 mEq/L. Las causas que lo provocan pueden ser: ~ Aporte de potasio disminuido (malnutrición, síndrome de malabsorción,...) ~ Abundantes pérdidas gastro-intestinales (vómitos, diarreas) ~ Alteraciones endocrinas (síndrome de Cushing) ~ Determinados tratamientos farmacológicos. La excreción urinaria de potasio varía en función de la dieta, dentro de varios límites, siendo la potasuria normal entre 1’5-3’5 g/24 horas (menos de 90 mEq/día). C·- REGULACIÓN DE LA INCORPORACIÓN Y ELIMINACIÓN: el nivel plasmático de potasio está regulado por su excreción renal, diariamente se pierden aproximadamente 50 mEq/día. 1·- Absorción: el potasio es reabsorbido a nivel intestinal, filtrado por el glomérulo y generalmente es reabsorbido en los túbulos casi en su totalidad. 2·- Excreción: a continuación se elimina por la orina de un modo eficaz a nivel de los túbulos distales. Normalmente entre el 80-90% de las células es excretadas con la orina tras filtrar por el glomérulo, el resto es excretado por el sudor y las heces, siendo esta una pérdida pequeña que puede verse sensiblemente aumentada en estados diarreicos. NOTA IMPORTANTE: no existe umbral renal para el potasio. Esto implica que incluso en estados carenciales de potasio, podamos seguir eliminando este catión. Se necesita por tanto una ingestión diaria y regular de este alimento. D·- FUNCIONES BIOLÓGICAS: el potasio intervine en: ~ Conducción nerviosa. ~ Contracción muscular. ~ Regulación de la presión osmótica ~ Regulación junto con el calcio y el magnesio del gasto cardiaco (es la velocidad y fuerza con que se contrae el corazón). Es fundamental saber evaluar los cambios de potasio en el organismo y reconocer excesos o deficiencias aunque la concentración en sangre sea casi normal. A menudo los signos y síntomas de la hiperpotasemia y de la hipopotasemia suelen ser de tipo nervioso y/o muscular. Además suelen ser muy inespecíficos. E·- CLÍNICA: 1·- Hiperpotasemia: se consideran valores por encima de 65’5 mEq/L. Esta cifra es normalmente indicativa de problemas cardiacos, con una hiperpotasemia grave se puede producir la muerte por fallo cardiaco. La clínica se divide en: ~ Alteraciones cardiacas /bradicardia (despacio). ~ Fibrilación (alteración del ritmo) ~ Paro cardiaco ~ Encontramos también cambios significativos en el electrocardiograma. ~ Por otro lado va a dar lugar a alteraciones neuromusculares (debilidad muscular, contracciones y/o temblores, parálisis,...) 2·- Hipopotasemia: aparece muy frecuentemente en personas que reciben líquidos intravenosos sin proceder a compensar la pérdida de potasio que se produce por la orina. Con valores menores a 2’5 mEq/L pueden aparecer problemas cardiacos e incluso la muerte. La clínica se divide en: ~ Alteraciones neuromusculares: debilidad y dolor muscular, en general débil en los músculos respiratorios, una hipotensión, apatía, mareo, incluso náuseas y coma. ~ Alteraciones cardiacas: básicamente arritmias y cambios en el electrocardiograma. Suele aparecer sudoración intensa. F·- DETERMINACIONES DE POTASIO: la utilidad es el diagnóstico de alteraciones del equilibrio ácido-base y del equilibrio hidroeléctrico. Observaciones: ~ Si utilizamos sangre venosa hay que evitar la hemólisis al extraerla. ~ Utilizar material desechable (ya que cualquier resto de detergente o lejía puede alterar considerablemente los valores obtenidos). ~ Evitar errores de dilución de la muestra (si la persona tiene suero hay que pincharle en el otro brazo). ~ Separar las células del suero centrifugando y procesar la muestra lo antes posible. Si puede ser antes de 4 horas. Así se evita que el potasio salga del interior de las células y de un resultado falsamente aumentado. ~ Determinados fármacos intervienen en la determinación de este catión de penicilina potásica por vía intravenosa puede provocar hiperpotasemia. F·1·- Métodos analíticos: gravimétricos, turbidimétricos, absorción atómica, fotometría de llama y electrodos selectivos. METABOLISMO FOSFO-CÁLCICO: el hueso participa en el proceso de homeostasis fosfocálcica por ellos está sometido a la influencia de diferentes factores que regulan el metabolismo del calcio y del potasio. Los metabolismo de ambos electrolitos y también del magnesio están estrechamente relacionados, ya que: 1·- Todos son parte integrante del hueso, que es su principal reservorio, así el 99% del calcio, el 81% del fosfato y el 65% del magnesio se encuentran en los huesos. 2·- Existen numerosos mecanismos homeostáticos comunes a ellos. 3·- Siempre existe entre ambos iones (calcio y fósforo) una reacción inversa, de forma que cuando las concentraciones de calcio disminuyen las de potasio aumentan y viceversa. Un exceso de las cifras séricas de una de las dos hace que los riñones excrete al otro, esta es la explicación de porque están inversamente proporcionados (las cifras de fósforo siempre son evaluadas con las de calcio). En el hueso estos elementos se encuentran como cationes intra y extra celulares ejerciendo importantes funciones orgánicas: tampones ácido-base y factores de coagulación, etc. Por todo ellos las alteraciones del metabolismo de estos elementos causa alteraciones orgánicas que se traduce en enfermedades óseas muy frecuentes ,tales como: • Osteoporosis: en ella está disminuida la masa ósea. Los niveles de calcio, los de fósforo y la PTH van a ser normales. Sin embargo el calcitriol ó vitamina D3 activa está disminuida. • Osteomalacia: en ella está disminuida la mineralización ósea. El calcio, el fósforo van a estar disminuidos. La PTH está aumentada y el calcitriol puede estar normal o disminuido. • Osteítis fibrosa: inflamación óseas. El calcio va a estar normal o aumentada. El fósforo va a estar aumentado ó disminuido. La PTH va a estar aumentada y el calcitriol puede estar aumentado o disminuido. REGULACIÓN HORMONAL DEL CALCIO (Dibujo): a nivel endocrino los niveles de calcio y fosfato se encuentran regulado por 3 hormona: la paratohormona, la calcitonina o tirocalcitonina y calcitriol ó vitamina D3 activado. • Paratohormona (PTH): es una hormona sintetizada y secretadas por las glándulas paratiroides (son glándulas de 8 mm redondeadas y situadas en la cara dorsal del tiroides). Tanto la síntesis como la secreción de PTH sucede mediante un “mecanismo Feed-Back” de la concentración de calcio iónica plasmática de forma que si la concentración de calcio iónica plasmática disminuye, aumenta la síntesis y secreción de PTH y viceversa. ~ Funciones de la PTH: 1·- Mantenimiento de los niveles plasmáticos de calcio por su acción sobre el hueso a nivel renal e intestinal: Aumenta la reabsorción de calcio en los huesos. Aumenta la reabsorción tubular de calcio Aumenta la absorción intestinal de calcio Disminuye la reabsorción de fosfato renal Disminuye la reabsorción de sodio, potasio, agua y aminoácidos. Aumenta la producción del 1,25-(OH)2CC. 2·- Interviene en la formación de tejido óseo nuevo. ~ Su regulación es en función de la concentración plasmática de calcio ~ Efectos sobre el metabolismo fosfo-cálcicos de la PTH: 1·- Regular la concentración de calcio extracelular 2·- Actúa sobre el hueso y el riñón produciendo 3 efectos básicos: Aumenta la concentración sérica de calcio Disminuye la concentración sérica de fosfato Aumenta la forma activa de la vitamina D3. • Calcetonina ó tirocalcetonina: es una hormona producida por la tiroides. Sus funciones son: Tiene una función contraria a la PTH, por tanto, inhibe la reabsorción de calcio y facilita el depósito de calcio nuevo (su acción es a nivel óseo fundamentalmente), por tanto disminuye la calcemia. Su regulación es debida al nivel de calcio plasmático total. Así, si existe hipercalcemia aumenta su secreción y viceversa. Los efectos sobre el metabolismo fosfo-cálcico son: A·- Disminuye la reabsorción tubular de calcio, fosfato, sodio, potasio y magnesio. B·- Disminuye la secreción de gastrina (se produce en el estómago) C·- Aumenta la secreción en el intestino delgado de sodio, potasio, cloro y agua. • Calcitriol, vitamina D3 activa ó 1,25-(OH)2CC: es la forma activa de la vitamina D3 en algunos productos animales y en algunas plantas existen precursores de la vitamina D3 que requieren la incidencia de los rayos ultravioletas par sintetizarse. Esta síntesis es completada en el hígado y en el riñón (por 2 hidroxilaciones sucesivas) obteniendo un hidrógeno, el calcitriol que no es más que la forma activa de la vitamina D3. ~ La función del calcitriol es aumentar los niveles plasmáticos de calcio. Por lo tanto es una acción sinérgica (ayuda) y paralela a la PTH. ~ La regulación del calcitriol es mediante un mecanismo de Feed-Back, es decir, cuando el mecanismo requiere calcio (hipocalcemia) aumenta la síntesis de vitamina D3 (aumentaría su activación en el riñón). Sin embargo cuando el calcio no es necesario su activación en el riñón disminuye. ~ Los efectos sobre el metabolismo fosfo-cálcico son: 1·- Aumenta la absorción de calcio en el intestino delgado. 2·- Aumenta la reabsorción de calcio del tejido óseo (sinérgicamente con la PTH) 3·- Aumenta la reabsorción tubular del calcio en el riñón. 4·- Aumenta directamente la reabsorción intestinal de fosfatos con independencia de su acción sobre el calcio 5·- Aumenta la velocidad de excreción urinaria de calcio 6·- Interviene en la diferenciación de las células óseas. 3·- EL CALCIO (Ca): es el catión más cuantioso del organismo. De todo el calcio plasmático (calcio libres) es la función iónica (Ca+2) la que puede ser usada en los procesos vitales del organismo. La localización del calcio es: • 98% en el esqueleto óseo (incluido los dientes) • 2% calcio plasmático, del cual: ~ 46% calcio iónico (Ca+2 ó activo) (reacciones biológicas) ~ 40% calcio unido a proteínas: o Albúminas 80% o Globulinas 20% ~ 20% Calcio formando complejos solubles de: bicarbonato, citrato, fosfato, sulfato. La concentración sérica de calcio total ó calcemia total los valores normales son 8’5-10’5 mg/dl. El calcio total debe expresarse siempre con el nivel de proteínas plasmáticas ya que cuando estas disminuyen, sobre todo la albúmina, pueden obtenerse el valor real del calcio aplicando la siguiente fórmula: Ca+2 (mg/dl) = Calcio total – 0’8 X [albúmina]sérica (mg/dl). Los valores normales de calcio iónico son: 4’48-4’92 mg/dl. Estos valores están influenciados por el pH, así si existe acidosis se favorece la disociación por lo que se favorece el calcio iónico. Las alteraciones más frecuentes de la calcemia total son hipercalcemia e hipocalcemia. A·- HIPERCALCEMIA: cuando el calcio es mayor a 10’5 y si es mayor a 13’5 mg/dl es grave. Las causas de hipercalcemia son: 1·- Un aporte elevado, que es en el caso de hipervitaminosis A y D. 2·- Tumoral 3·- Endocrina 4·- Secundaria a hipertiroidismo 5·- Otras: enfermedades en las que exista un aumento de la reabsorción ósea (inmovilización prolongada). B·- HIPOCALCEMIA: sucede cuando la calcemia es menor a 8’5 mg/dl. Las causas son: 1·- Aporte disminuido, por ejemplo en la malabsorción. 2·- Endocrina, por ejemplo hipotiroidismo. 3·- Secundaria a hiperfosfatemia 4·- Otras causas: por ejemplo un error analítico. C·- El CALCIO IÓNICO: también puede estar aumentado ó disminuido en diversos proceso así el calcio iónico está disminuidos en: hipoparatiroidismo primario o con el uso de diuréticos tiacídicos. Las causas de aumento de calcio iónico son hiperparatiroidismo primario, ingestión excesiva de vitamina D, diversas enfermedades malignas y hormona paratiroidea ectópica (fuera de lugar). D·- CALCIURIA: es la concentración de calcio en orina. Tiene gran interés clínico. Los valores de referencia son de 50-200 mg/24 horas. 1·- Causas de hipocalciuria: raquitismo y en general cualquier enfermedad en la que está disminuida la absorción de calcio a nivel intestinal. 2·- Causas de hipercalciuria: hiperparatiroidismo, hipertensión y mieloma múltiple. E·- MECANISMO DE INCORPORACIÓN Y ELIMINACIÓN DEL CALCIO: en la homeostasis del calcio intervienen el intestino, el hueso, el riñón y el sistema endocrino, sobretodo la PTH y la calcitonina. El hueso intercambia calcio con la sangre aunque sólo una pequeña parte de este está disponible para un intercambio rápido. Se encuentra en un proceso constante de remodelación resultante del equilibrio entre formación y reabsorción (equilibrio que puede inclinarse hacia un lado u otro según la situación del organismo). La absorción del calcio sucede a nivel intestinal y se realiza por un mecanismo de transporte activo, dependiente del calcitriol. La eliminación del calcio sucede por 2 vías: ~ Es elevada a nivel renal sobretodo en forma de fosfato cálcico y regulado por la PTH. ~ Es baja por las heces. La regulación de la incorporación y eliminación del calcio se lleva a cabo mediante las siguientes sustancias: 1·- PTH: elevados niveles del calcio (estimulada por el calcitriol). 2·- Calcitonina: disminuye los niveles del calcio. 3·- Calcitriol: aumenta los niveles de calcio 4·- Estrógenos: aumenta los depósitos de calcio en el hueso. 5·- Andrógenos: estimulan la corteza suprarrenal o bien la glándula tiroides y pueden causar descalificación de huesos e hipocalcemia. 6·- Ciertos alimentos: algunos hidratos de carbono como por ejemplo la lactosa aumenta la absorción intestinal del calcio (leche) F·- FUNCIONES BIOLÓGICAS DEL CALCIO: 1·- Es el constituyente principal del esqueleto óseo. 2·- Intracelularmente influye en los mecanismos de regulación hormonal. 3·- Extracelularmente activa el paso de fibrinógeno a fibrina, y además tiene un papel importante como estabilizador de la membrana celular (interviene en la excitabilidad neuromuscular y es trasmisión nerviosa). G·- DIAGNÓSTICO DE HIPERCALCEMIA E HIPOCALCEMIA: 1·- Diagnóstico de hipercalcemia: se define como el aumento de la concentración de calcio total en sangre. Para valorar la hipercalcemia es necesario conocer los niveles de albúmina: ~ En caso de hiperalbuminemia: por cada mg/dl de albúmina sérica disminuye el calcio en 0’8 mg/dl. ~ En caso de hipoalbuminemia: por cada mg/dl de albúmina sérica aumenta el calcio en 0’8 mg/dl. NOTA: hipoalbuminemia: no altera la concentración de calcio iónico. 2·- Diagnóstico de hipocalcemia: se define como la disminución de la concentración de calcio total en sangre. Existen pseudo-hipercalcemias o hipercalcemias falsas que se observan en personal con hipoalbuminemia, pero en realidad la disminución de las proteínas es la que causa los bajos niveles de calcio. Así también un uso excesivo de líquido por vía intravenosa puede disminuir la concentración de albúmina y por tanto la de calcio. H·- CLÍNICA DE LA HIPERCALCEMIA E HIPOCALCEMIA: si los niveles de calcio total son normales y si otras pruebas complementarias dan normales podemos decir que el metabolismo del calcio s normal. Si la absorción de fósforo es anormal significa que hay problemas en la absorción de calcio ya que va a ver una alteración de la actividad o de la secreción de la PTH. Si hay hipoalbuminemia va a existir hipercalcemia Los síntomas clínicos de la hipercalcemia son: 1·- Trastornos del electrocardiograma 2·- Trastornos neuromusculares con debilidad y confusión 3·- Trastornos digestivos con náuseas y vómitos En la hipocalcemia existen los siguientes síntomas: 1·- Tetania 2·- Espasmos 3·- Calambres (contracciones pequeñas hasta la convulsión y muerte) 4·- Hipotensión 5·- Alteraciones del electrocardiograma 5·- Cuadro sicótico y depresión. I·- DETERMINACIÓN DEL CALCIO: la utilidad de la determinación del calcio: 1·- Medir la actividad de la PTH. 2·- Para valorar la funcionalidad del metabolismo del calcio. 3·- Para valorar determinadas enfermedades malignas (destrucciones óseas). En los métodos de determinación de calcio podemos hacer estas observaciones que son: 1·- Las muestras a analizar, generalmente de venas. 2·- Muchos fármacos puede aumentar o disminuir los niveles de calcio, por lo tanto dan valores erróneos si se administran poco antes de la toma de la muestra. 3·- Ante la sospecha de que la persona tiene alguna alteración del equilibrio ácido-base se solicitará paralelamente el análisis de calcio iónico y del pH. 4·- Utilizar material de un solo uso (plástico) ó vidrio químicamente limpio (Tratado con ácido) 5·- No utilizar como anticoagulantes: oxalato (precipitante del calcio) ni EDTA (salvo métodos complexométricos) ni en la muestra no esté disponible para análisis. Los métodos analíticos del calcio son: 1·- Métodos tradicionales: están basados en que el calcio precipita mediante la adición de determinados aniones. Después se hace una determinación del calcio precipitado mediante métodos volumétricos, espectrofotométricos, etc Las características de estos métodos es que tiene poca precisión, exactitud. Poca sensibilidad por lo que hoy están en desuso. Por ejemplo método de Clark y Collip (método volumétrico) 2·- Métodos espectrofotométricos: el principio de estos métodos es la formación de compuestos coloreados entre el calcio y diversas moléculas orgánicas. Características tienen poca precisión poca exactitud pero son muy sencillos. Se usan en la actualidad ya que han sido adaptados para autoanalizadores. Ejemplos: ~ Ortocresolftaleina: es colorimétrico el calcio se une al reactivo formándose un cromógeno cuya intensidad de color se mide en el espectrofotómetro. Sirve también para determinar calcio en muestra de orina. El inconveniente es que la presencia de magnesio puede producir interferencias. ~ Otros: todos tienen el mismo fundamento que el anterior variando el reactivo usado. Los más usados son: métodos de la Alisarían y el método del azul de metiltimol. 3·- Métodos complexométricos: se utiliza un indicador fluorescente y una sustancia acomplejante del calcio. Cuando la muestra entra en contacto con una sustancia fluorescente emite luz fluorescente de una determinada longitud de onda dependiendo de la sustancia elegida. La desaparición de la fluorescencia indica que todo el calcio presente en la muestra que formado un complejo. Muestra (calcio) + sustancia aquelante (EDTA) + fluoresceína. Las características del métodos son: determinar el calcio de forma directa. Tiene elevada sensibilidad y rapidez. La utilidad es para análisis de sangre y orina sobretodo en urgencias y pequeños laboratorios. Ejemplos: método que usan EDTA como agente acomplejante y fluoresceína como indicador fluorescente. 4·- Método de fotometría de llama: es una técnica de espectroscopia de emisión atómico que estudia la emisión de radiación que produce una muestra que ha sido previamente atomizada por diversos sistemas. Características: tiene gran exactitud, precisión y rapidez. Se puede usar tanto en suero, como en orina. Es el mejor método después del de espectroscopia de masa con difusión isotópica. 5·- Método del electrodo ión-selectivo: se usan electrodos de membrana que permiten mediante medidas potenciométricas directas determinaciones rápidas y selectivas de muchos aniones y cationes (también del pH). Se usa para determinar el calcio iónico. 6·- Métodos de espectroscopia de masas con dilución isotópica: es el método definitivo frente al cual se deben comparar todas las demás. Se basa en la posibilidad de separar sustancias mezclados debido a sus compartimiento en le suero de un gas y después incidir sobre ellas con un haz de electrones de elevada energía. Las moléculas se descomponen en fragmentos y esta fragmentación es la huella característica de moléculas. 4·- EL FÓSFORO (P): su presencia en el plasma es el resultado del equilibrio mediado por PTH, calcitonina y vitamina D entre los siguientes aspectos: 1·- Aporte con la dieta. 2·- Capacidad del tubo digestivo para variar su absorción. 3·- Distribución de los diferentes compartimientos del organismo 4·- Los mecanismos de reabsorción tubular y excreción a nivel renal. Se distribuye por igual entre los compartimientos intra y extra-celulares pero se considera que es el principal anión intracelular: A·- LOCALIZACIÓN: • Intracelular: ~ Aumento del porcentaje del fosfato orgánico, forma parte de macromoléculas, fundamentalmente los fosfolípidos y fosfoproteínas. ~ Disminuye el porcentaje de fosfato inorgánico, forma parte de ATP. • Extracelular: ~ El 15% del plasma: de este un 12% está unido a proteínas, un 10% como ión hidrógeno fosfato (PO4H-2), un 75% como ión monohidrógeno fosfato (HPO4-2), NaHPO4-) ~ En cuanto a la concentración sérica de fósforo los valores normales son: o En niños: 4-6’5 mg/dl o En adultos: 3-5 mg/dl Revisten especial gravedad, valores mayores a 9 y menores a 1 mg/dl. En general, la concentración plasmática de fosfato varían en función de: o pH o Del momento del día, es decir, existe un ritmo circadiano, concretamente por la noche, los valores disminuyen o Aspectos fisiológicos concretos, por ejemplo: embarazo y menopausia está disminuidos los valores de fósforo. Las alteraciones de las concentraciones séricas de fósforo son: B·- HIPERFOSFATEMIA: ~ Un aporte elevado. ~ Alteración endocrina, por ejemplo hipoparatiroidismo. ~ Aumento de procesos catabólicos, por ejemplo quemaduras. ~ Insuficiencia renal. ~ Neoplasias (carcinomas osteolíticas). ~ Usos de fármacos como esteroides anabolizantes. ~ Otras: alcalosis. C·- HIPOFOSFATEMIA: ~ Alcoholismo crónico. ~ Disminución del aporte (mal nutrición, maladsorción). ~ Trastorno del equilibrio hidroeléctrico (hipocalcemia). ~ Alteraciones renales (por pérdida renal). ~ Alteraciones endocrinas. ~ Otras: como embarazo. D·- FOSFATURIA ó concentración urinaria de fósforo: la concentración urinaria normal de fósforo es de 0’5-3 g/24 horas, varía en función de límites amplios en función de la dieta. En la práctica más que su cuantificación se procede al examen microscópico del sedimento y en él el fósforo se presenta en forma de: ~ Fosfato bicálcico ~ Fosfato tricálcico ~ Fosfato amónico-magnesio La fosfaturia generalmente no suele deberse a una pérdida excesiva de fosfatos sino a su precipitación en la orina ya emitida. Al alcalinizarse por fermentación amoniacal de la urea. La absorción de fósforo sucede a nivel intestinal mediante un mecanismo de transporte regulado por la vitamina D. En cuando a la excreción es por vía urinaria y es mediante un mecanismo regulado por la PTH. E·- FUNCIONES DEL FÓSFORO: 1·- Forma parte de diferentes estructuras del organismo. Como por ejemplo: la matriz, ósea, el sistema nervioso y la célula (forma parte de proteínas celulares y membrana celular). 2·- Colabora en el mantenimiento del equilibrio ácido-base por el tampón fosfato que es el sistema HPO4-2/ H2PO4- presente en el plasma 3·- Participa en los mecanismos de absorción y en el metabolismo de los principios inmediatos. 4·- Interviene en la contracción muscular F·- SÍNTOMAS CLÍNICOS: 1·- Hipofosfatemia: ~ Fracturas óseas ~ Acidosis metabólica ~ Insuficiencia cardiaca ~ Hemólisis ~ Irritabilidad a nivel muscular ~ Parestesia (parálisis) ~ Obnubilación (Ido) ~ Convulsiones ~ Si los valores son menores de 2 mg/dl se producen alteraciones en la musculatura respiratoria con insuficiencia respiratoria. 2·- Hiperfosfatemia: cuando los niveles de fósforo aumenta rápidamente (por encima de 9 mg/dl) los de calcio disminuyen. Entonces es necesario vigilar al paciente por si aparecen arritmias o contracciones musculares. G·- DETERMINACIONES DEL FÓSFORO: los métodos de determinación del fósforo no miden el fósforo elemental (que se encuentra en una cantidad inapreciable en el organismo) sino los fosfatos inorgánicos: PO4H2-, PO4H-2. En la determinación del fósforo intervienen: ~ La edad: aumenta en los niños. ~ Hemólisis de la muestra. Nos daría valores falsos aumentados (valor aumentado) ~ Presencia de vitamina D (valores aumentados) ~ Fármacos (valores disminuidos) ~ Uso de laxantes y enemas que contengan elevada cantidad de fosfato sódico. Entonces para evitar falsos resultados debemos tener en cuenta ciertos aspectos prácticos: 1·- Para evitar la salida de fosfato (principal anión intracelular) el suero usado como muestra debe separarse lo antes posible de las células. 2·- Evitar la contaminación de tubos y pipetas, usando material desechable y dispensadores automáticos para los reactivos. Los métodos analíticos más usados están basados en la espectrofotometría y destacan dos tipos: ~ Método del fosfomolibdato: consiste en la reacción de iones fosfato con el reactivo molibdato y se forma el fosfomolibdato que puede ser medido bien directamente en el espectrofotómetro o bien reduciéndolo con diferentes agentes reductores en azul de molibdeno, leer el color formado con el espectrofotómetro. ~ Métodos enzimáticos: están basados en una serie de reacciones enzimáticas en cadena, cuyo resultado final es la formación de un compuesto cromógeno cuya intensidad de color se mide por espectrofotómetro. 5·- EL MAGNESIO (Mg): el estudio del magnesio tiene escaso valor clínico. El tratamiento para apaliar la disminución de los niveles del mismo es administrar sales de este catión. Es después del potasio el catión intracelular más importante. Los valores normales de magnesio son: 1’8-2’9 mg/dl (1’5-2’5 mEq/L). Las alteraciones de las concentraciones séricas del magnesio son: A·- HIPERMAGNESEMIA: es poco frecuente y se considera que existe cuando la concentración de magnesio es mayor de 3’5. puede ser debida a diversas causas: ~ Excesivo aporte ~ Deshidratación ~ Trauma tisular ~ Insuficiencia renal ~ Diabetes controladas B·- HIPOMAGNESEMIA: las causas son: ~ Diarrea crónica ~ Malnutrición ~ Alcoholismo crónico ~ Hemodiálisis ~ Fármacos como ciertos diuréticos o el citrato ~ Pancreatitis aguda ~ Hipoparatiroidismo C·- SÍNTOMAS CLÍNICOS: 1·- Hipermagnesemia : ~ Hipotensión ~ Náuseas ~ Vómitos ~ Pérdidas de reflejos ~ Obnubilación (a partir de 7 mg/dl) ~ Coma ~ Depresión respiratoria si las cifras superan los 12 mEq/L. 2·- Hipomagnesemia: ~ Alteraciones cardiacas tales como taquicardia, fibrilaciones ~ Reflejos hiperactivos. ~ Alteraciones musculares tales como convulsiones, temblores y tetania ~ Insomnio ~ Intolerancia al calcio y al potasio ~ Vómitos D·- REGULACIÓN DE LA INCORPORACIÓN Y ELIMINACIÓN DEL MAGNISMO AL ORGANISMO: todos los alimentos naturales son ricos en magnesio por tanto es difícil que aparezca deficiencia con una dieta normal. Así por ejemplo en una dieta rica en leche y legumbres quedan cubiertas todas las necesidades. Cuando se produce una disminución de la función renal se retienen mayor cantidad de magnesio y por tanto aumenta su concentración en le suero. Un aumento de la cantidad de magnesio absorbido trae consigo un aumento paralelo del calcio absorbido. La aparición de un exceso de magnesio en el suero no es frecuente debido a la capacidad que posee el riñón para excretar su exceso. Una dieta pobre en potasio dificulta el proceso de absorción del magnesio y también del calcio. Una deficiencia del magnesio provoca descalificación ósea., La absorción del magnesio se produce en el intestino delgado concretamente en le duodeno y el ileon (animal) y dicha absorción no depende de la vitamina D. La excreción del magnesio se produce a través del riñón. Prácticamente el 95% del magnesio filtrado a nivel glomerular se reabsorbe en el túbulo y el exceso es eliminado vía renal por medio de la regulación de la PTH. E·- FUNCIONES BIOLÓGICAS DEL MAGNESIO: todas están relacionadas con las funciones del calcio en el organismo: 1·- Participa en el mantenimiento de una baja concentración de calcio a nivel intracelular 2·- Ejerce un importante papel en el equilibrio neuromuscular (junto al calcio). 3·- Participa en forma de ATP en los procesos de interferencias de energía de las células. 4·- Actúa como cofactor en varios sistemas enzimáticos. Por ejemplo el de la ATPasa. (Cofactor: es una molécula de peso molecular pequeño termo-estable, orgánico ó inorgánico, que se necesita para la acción de enzimas). 5·- Es necesario para el metabolismo de hidratos de carbono, síntesis de proteínas y síntesis de ácidos nucleicos). G·- MÉTODOS DE DETERMINACIÓN DEL MAGNESIO: la utilidad de estas determinaciones es: ~ Para valorar la actividad metabólica del organismo ~ Para valorar la funcionalidad renal Hay que tener en cuenta 2 factores: 1·- La hemólisis de la muestra invalida la prueba ya que ¾ del magnesio presenta en al sangre están dentro de los eritrocitos. 2·- Algunos fármacos alteran los resultados. Así los salicilatos y las sales de litio o magnesio dan concentraciones elevadas que son falsas. Otros fármacos serían gluconato de calcio que darían concentraciones disminuidas. La cuantificación del magnesio no refleja el contenido real del organismo ya que solamente entre el 1-5% del magnesio es extracelular. Métodos analíticos: 1·- Métodos tradicionales: destacan 3: • Precipitación: el magnesio precipita en forma de sales insolubles las cuales se determinan por gavimetría (peso). • Complexometría: es la determinación de un complejo formado entre el reactivo usado y el magnesio. Se usan reactivos quelantes por ejemplo el EDTA. • Fluorimetría: es la formación de complejos fluorescente. Por ejemplo con fluoresceína 2·- Método espectrofotométrico: se usan diversos método pero todos están adaptados para su uso en autoanalizadores. Son bastantes usados. Se van a usar 2: • Método de azul de metiltimol: consiste en la reacción entre el magnesio y el reactivo. De un compuesto coloreado cuya intensidad de color se mide en el espectrofotómetro. La cantidad de color es proporcional a la cantidad de magnesio. • Método de calmagite: es un colorante usado para determinar directamente el magnesio (sin desproteinización previa). El reactivo (de color azul) forma un compuesto rosado (cuando reacciona) cuyo color se mide en el espectrofotómetro. La cantidad de color es proporcional a la cantidad de magnesio de la muestra. 3·- Método de absorción atómica: es el método de referencia. Consiste en someter la materia a irradiación con una longitud de onda capaz de ser absorbida por sus átomos. Los electrones de los átomos se vuelven inestables y por lo tanto. Van a emitir energía para poder volver a su estado fundamental, se forma así el espectro electromagnético que es propio de cada sustancia. 4·- Otros métodos: • Activación neutrónica con dilución isotópica: es el método definitivo. • Método enzimáticos: usan reacciones enzimáticas acopladas. Se mide la formación de NADPH cuya lectura se hace a 340 nm. TRATAMIENTO DE LA DEFICIENCIA DE AGUA Y ELECTROLITOS Cualquier tratamiento a personas afectadas de alteraciones de homeostasis del agua y/ electrolitos debe estar basado en aspectos tales como: • El estado clínico inicial • Un análisis plasmático que determina: la concentración de sodio, potasio, bicarbonato fundamentalmente, las proteínas plasmáticas y la urea en sangre. Dicho tratamiento debe tener como objetivo la reposición inmediata de agua y electrolitos suministrando las cantidades necesarias, para ellos usaremos líquidos diferentes en composición y cantidad. A·- DEFICIENCIAS DE AGUA: el primer síntoma que indica deficiencia de agua es la sed. La confirmación en el laboratorio se obtiene cuando: • El nivel de electrolitos en el suero está aumentado. • la concentración proteica en el plasma también va a estar aumentada • El índice del hematocrito está aumentada Un tratamiento eficaz frente a una deficiencia hídrica puede considerar: 1º·- Debe ser ingerida una cantidad de líquido suficiente para que el volumen de orina eliminada diariamente sea mayor a 1 litro. 2º·- Aunque no es conveniente cuando no sea posible dicha ingesta (imposibilidad para tragar) puede usarse terapéuticamente la inyección intravenosa de una solución de glucosa en agua del 5%. Las calorías que aporta la glucosa generalmente benefician a las personas con deficiencia hídrica. 3º·- Nunca debe administrarse soluciones salinas (cloruro sódico al 9%) a un deficiente hídrico. Esto es debido a que el cloruro sódico aumenta la hipertonicidad del líquido extracelular. Para eliminar este cloruro sódico por vía renal se necesita agua por lo que la deshidratación se acentúa aún más. 4º·- Es imprescindible determinar diariamente la concentración de electrolitos en plasma hasta alcanzar el nivel de hidratación adecuada. B·- EXCESO DE AGUA: una intoxicación debido a un exceso de agua (esto puede suceder en caso de oliguria –poca orina-) se manifiesta clínicamente con estos síntomas: 1·- Anemia 2·- Bradicardia (disminución de la frecuencia del corazón) 3·- Letargo 4·- Delirio 5·- Convulsiones El tratamiento adecuado es administrar la cantidad necesaria de solución salina hipertónica. C·- DEFICIENCIAS DE ELECTROLITOS: 1·- SODIO: la deficiencia de sodio es la más frecuente y cuando aparece vemos que: • La persona se encuentra mal y está aletargada • La concentración de sodio y de cloro en el plasma está disminuida. • Las proteínas plasmáticas van estar aumentadas • En ocasiones aparece sed. ~ Tratamiento: a·- Controlar constantemente el estado clínico de la persona: La pérdida moderada de sodio de líquido extracelular provoca vómitos Una pérdida intensa (más de 1/3 del sodio del líquido extracelular) puede desencadenar la muerte. b·- Instaurar cuanto antes la administración vía oral de una solución salina (9 gr/l de cloruro sódico con sabor a limón y glucosa), evitando los problemas de sobre-tratamiento. c·- Cuando no se puede por vía orla se administra solución salina intravenosa de forma totalmente empírica (a ojo) y se controla haciendo determinación frecuentes de los diversos electrolitos. También se debe vigilar el estado clínico del paciente. d·- En todos los casos es imprescindible controlar el tratamiento mediante valoraciones frecuentes de electrolitos proteínas plasmáticas y hematocrito. e·- El tratamiento instaurado debe prolongarse hasta que el contenido de electrolitos halla vuelto a la normalidad. 2·- POTASIO: los síntomas más frecuentes de la disminución de niveles de potasio son: • Alteraciones musculares debilidad o incluso parálisis. • Alteraciones intestinales (atonía total ó parcial (pérdida del tono muscular)) • Alteraciones del electrocardiograma Los déficit de potasio aparecen en las siguientes situaciones: • En el coma diabético • Por pérdida masiva de secreciones gastrointestinales; es menos frecuente que en el sodio porque las secreciones gastrointestinales tienen menor concentración de potasio que de sodio. Las pérdidas de potasio sólo se evidencian cuando se han normalizado los niveles de sodio mediante el tratamiento. • Durante el tratamiento con diuréticos: ya que los riñones siguen excretándolo a pesar de que exista deficiencia y sigue disminuyendo su valor. ~ Tratamiento: a·- Ingestión de zumo de frutas (plátanos) b·- ingestión de sales potásicas por vía oral. La administración de potasio por vía intravenosa es peligrosa y solo se debe realizar cuando se cuenten con instalaciones que permitan determinar rápidamente el potasio sérico y cuando la eliminación urinaria sea abundante. El tratamiento debe prolongarse normalmente durante varios días hasta que el potasio comience a elevarse en el suero. 3·- MAGNESIO: esta deficiencia es poco frecuente ya el riñón en situaciones de déficit regula su excreción. Sin embargo se detectaron casos de déficit de magnesio en personas que tras sufrir pérdidas continuas y prolongadas de secreciones gastrointestinales o padecer problemas graves de absorción intestinal se encuentran sometidos a terapéutica intravenosa. ~ Clínica: Tetánica Síntomas psiquiátricos en pérdidas prolongadas de secreciones gastrointestinales. PREGUNTAS 1·- Compartimiento extracelular. Características y composición. Supone solo el 20% y se encuentra rodeando a las células proporcionándoles un ambiente externo constante. Posee también neutralidad eléctrica y a sus vez está formado por 3 componentes principales: plasma, líquido intersticial y líquido trascelular. 2·- Dos formas mediante las cuales los electrolitos contribuyen al mantenimientos de la homeostasis. Los iones y el agua del organismo están en continuo intercambio con el exterior y aunque no están distribuidos uniformemente se mantiene en un equilibrio fundamental para la vida. Existe una igualdad entre el total de aniones y cationes en los compartimientos líquidos corporales. En condiciones normales existe una estado de neutralidad eléctrica de manera que todo aumento de un determinado anión va acompañado de la disminución de otro. 3·- Definición de osmolaridad y cual es la concentración osmolar normal de los líquidos corporales. Es una propiedad de las soluciones que puede definirse como ¿el número de partículas de soluto, por unidad de volumen de una disolución, expresada en miliosmoles de soluto en un litro de solución. La concentración osmolar normal es de 290 ± 10 miliosmoles/litro 4·- ¿Cómo se realiza la determinación de osmolaridad? Se determina mediante un osmómetro, que es un dispositivo que mide el descenso del punto de congelación de una disolución. 5·- Tres recomendaciones para cubrir las necesidades de electrolitos en la dieta. ~ Debe ingerirse en pequeñas cantidades ~ Cuando el consumo es escaso, pueden acumularse ~ Algunas como el calcio y el potasio se eliminan continuamente por lo que han de consumirse de forma regular par evitar su carencia. 6·- Causas que originan una hiponatremia ~ Disminución en el aporte de sodio ~ Aumento de las pérdidas intestinales y gástricas ~ Aumento de las pérdidas renales ~ Alteración endocrina, enfermedad de Adisson ~ Otras: quemaduras graves, sudoración excesiva acompañada de ingestión masiva de H2O 7·- Clínica de la hipernatremia Aumento del volumen de agua lo que dará lugar a: hipertensión, edema., sed, fiebre y alteración del sistema nervioso central. 8·- Causas de la hiperpotasemia ~ Aumento del aporte ~ Perfusiones de potasio ~ Disminución de la excreción renal ~ Acidosis metabólica 9·- ¿Qué consecuencias tiene que no exista umbral renal para el potasio? Indica que incluso en estados carenciales de potasio, podemos seguir eliminando este catión. Se necesita por tanto una ingesta diaria y regular de este alimento. 10·- ¿Porqué el metabolismo del fósforo y del calcio están estrechamente relacionados? 1·- Todos son parte integrante del hueso, que es su principal reservorio, así el 99% del calcio, el 81% del fosfato y el 65% del magnesio se encuentran en los huesos. 2·- Existen numerosos mecanismos homeostáticos comunes a ellos. 3·- Siempre existe entre ambos iones (calcio y fósforo) una reacción inversa, de forma que cuando las concentraciones de calcio disminuyen las de potasio aumentan y viceversa. 11·- ¿Qué es la osteoporosis? En ella está disminuida la masa ósea. Los niveles de calcio, los de fósforo y la PTH van a ser normales. Sin embargo el calcitriol ó vitamina D3 activa está disminuida 12·- Funciones de la calcitonina. Tiene una función contraria a la PTH, por tanto, inhibe la reabsorción de calcio y facilita el depósito de calcio nuevo, por tanto disminuye la calcemia. 13·- Regulación del calcitriol. La regulación del calcitriol es mediante un mecanismo de Feed-Back, es decir, cuando el mecanismo requiere calcio (hipocalcemia) aumenta la síntesis de vitamina D3 (aumentaría su activación en el riñón). 14·- ¿Qué factores intervienen en la homeostasis del calcio? Intestino, huesos, riñones y sistema endocrino sobretodo la PTH y la calcitonina 15·- Definir hipercalcemia y que ocurre cuando existe hiperalbuminemia. Cuando los niveles de calcio total es mayor a 10’5 y si es mayor a 13’5 mg/dl es grave. Si hay hiperalbuminemia por cada mg/dl de albúmina sérica disminuiría el calcio en 0’8 mg/dl, por lo tanto, existiría una hipocalcemia. 16·- ¿Cuál es el principio de los métodos espectrofotométricos en la determinación el calcio? Es la formación de compuestos coloreados entre el calcio y diversas moléculas orgánicas (cantidad de color). 17·- Principios de los métodos complexométricos en la determinación de calcio. se utiliza un indicador fluorescente y una sustancia acomplejante del calcio. Cuando la muestra entra en contacto con una sustancia fluorescente emite luz fluorescente de una determinada longitud de onda dependiendo de la sustancia elegida. 18·- ¿Cómo sucede la absorción del fósforo? Sucede a nivel intestinal, mediante un mecanismo de transporte regulado por la vit D. 19·- Funciones del fósforo. a·- Forma parte de diferentes estructuras del organismo (matriz, ósea, el sistema nervioso y la célula). b·- Colabora en el mantenimiento del equilibrio ácido-base por el tampón fosfato c·- Participa en los mecanismos de absorción y en el metabolismo de los principios inmediatos. d·- Interviene en la contracción muscular 20·- Métodos del fosfomolibdato. Consiste en la reacción de iones fosfato con el reactivo molibdato y se forma el fosfomolibdato que puede ser medido bien directamente en el espectrofotómetro o bien reduciéndolo con diferentes agentes reductores en azul de molibdeno, leer el color formado con el espectrofotómetro 21·- Absorción del magnesio. Se produce en el intestino delgado, concretamente en el duodeno e ileon terminal y dicha absorción no depende de al vitamina D. 22·- Tratamiento de la deficiencia del sodio. a·- Controlar constantemente el estado clínico de la persona: La pérdida moderada de sodio de líquido extracelular provoca vómitos Una pérdida intensa (más de 1/3 del sodio del líquido extracelular) puede desencadenar la muerte. b·- Instaurar cuanto antes la administración vía oral de una solución salina (9 gr/l de cloruro sódico con sabor a limón y glucosa), evitando los problemas de sobre-tratamiento. c·- Cuando no se puede por vía orla se administra solución salina intravenosa de forma totalmente empírica (a ojo) y se controla haciendo determinación frecuentes de los diversos electrolitos. También se debe vigilar el estado clínico del paciente. d·- En todos los casos es imprescindible controlar el tratamiento mediante valoraciones frecuentes de electrolitos proteínas plasmáticas y hematocrito. e·- El tratamiento instaurado debe prolongarse hasta que el contenido de electrolitos halla vuelto a la normalidad. TEMA 8 ESTUDIO DE LA ORINA APARATO URINARIO Es el encargado de librar a la sangre de las sustancias de deshecho que se acumula en el torrente circulatorio, eliminándolas al exterior a través de la orina. Está constituido por: riñones, uréteres, vejiga urinaria y uretra. • Riñones: son 2 órganos (derecho e izquierda) con forma de judía. Están situados en las fosas lumbares, detrás del peritoneo a ambos lados de la columna vertebral (entre la doceava vértebra dorsal y la tercera lumbar). Tiene una longitud entre 12-14 cm, una anchura de 7 cm y un grosor de 3 cm. En le polo superior de cada riñón se encuentra la cápsula suprarrenal que no tiene relación con la función renal. • Estructura macroscópica: en un corte longitudinal del riñón distinguimos microscópicamente 2 partes: corteza y médula. La corteza es la zona periférica, tiene un color amarillento y aspecto granulosos. La médula tiene olor rojizo y está constituido por una serie de conos: son las pirámides de Malpighi. Estos conos tienen su base dirigida hacia la corteza y el vértice termina en las papilas renales. La orina al salir de las papilas renales es recogida por unas pequeñas bolsas llamadas cálices renales. Esto se reúne entre sí par formar la pelvis renal que se continúa con el uréter. Al pelvis renal tiene forma de embudo con una parte que está dentro del riñón y otra externa al riñón. • Estructura microscópica: LA NEFRONA Microscópicamente el riñón está formado por multitud de nefronas. En el hombre el número de nefronas es aproximadamente un millón en cada riñón. La nefrona es la unidad estructural y funcional del riñón y está constituidas por el corpúsculo renal o de malpighi y el sistema tubular. ~ Corpúsculo renal: está constituido por la cápsula de Bowman y el glomérulo. El glomérulo es un ovillos de capilares formado por las sucesivas ramificaciones de la arteria renal. La cápsula de Bowman es una especie de saco de doble pared que rodea al glomérulo. ~ Sistema tubular: está constituido a continuación de la cápsula de Bowman y consta de las siguientes partes: Túbulo contorneado proximal: que es la primera porción Asa de Henle: tiene 2 porciones o ramas; la ascendente y la descendente Túbulo contorneado distal Túbulo colector: que es la última porción. ~ El túbulo colector se dirige en trayecto rectilíneo hacia el vértice de las pirámides. Varios túbulos colectores de diferentes nefronas confluyen en el extremo de la papila dejando caer la orina en el cáliz correspondiente. La orina baja por el uréter desemboca en la vejiga y sale por la uretra y sale al exterior. MECANISMOS DE LA FUNCIÓN RENAL El glomérulo tiene una extensa red capilar, por la cual circula cada minuto 1’2 litros de sangre. Su función principal es la de filtrar el plasma (alrededor de 25 ml de sangre/minuto) para conseguir depurarla, eliminando todas aquellas sustancias inútiles y nocivas para el organismo. En total a lo largo del día circula por el glomérulo 150 litros de plasma. A nivel del glomérulo además de agua filtrar básicamente: urea, ácido úrico, creatinina, aminoácidos, glucosa, proteínas de bajo peso molecular. La filtrado por el glomérulo es recogido es recogido en la cápsula de Bowman y de ahí se dirige hacia la red tubular donde se lleva a cabo un proceso de reabsorción selectiva, porque solo e van a reabsorber sustancias concretas y que necesitamos. La red tubular tiene básicamente 2 funciones que son: la de recoger y transportar aquello que se ha filtrado al glomérulo y modificar la composición del filtrado: • Retirando agua • Retirando ciertos alimentos aunque hayan sido filtrados son útiles para el organismo como: glucosa, aminoácidos,... • Permitiendo la secreción e otras sustancias que por su toxicidad deben ser posteriormente eliminadas mediante la micción. Como amonio (Derivados), hidrogeniones, (H+), etc. La modificación de la composición del filtrado se debe a diversos mecanismos físicoquímicos (transporte activo, difusión facilitada, etc) entre las células de la red tubular y el filtrado glomerular. El agua y las sustancias disueltas que no son recuperadas forman la orina. Tras la intervención de los túbulos, del total de plasma filtrado por el glomérulo se elimina únicamente alrededor de 1 ml/minuto (1500 ml/diarios). CUADRO / ESQUEMA 1·- Filtración glomerular: el glomérulo filtra el plasma desde los capilares que lo envuelven hasta la cápsula de Bowman. 2·- Reabsorción tubular: el producto obtenido en la filtración glomerular ve modificada su composición en la red tubular. Se reabsorbe agua, glucosa sodio, cloruro, potasio y urea. El líquido obtenido se concentra. 3·- Secreción tubular: se produce un transporte de sustancias desde la red capilar hacia los túbulos renales, destaca la secreción activa de iones H+ que permite la regulación del equilibrio ácido-base en el organismo. RECOGIDA DE MUESTRAS DE ORINA La información obtenida tras un estudio riguroso de una muestra de orina va a estar muy determinada por la forma y condiciones en que se realice su recogida (toma de muestras). La orina supone una muestra de fácil obtención y en genera de carácter no traumático para el paciente. No obstante para poder garantizar la calidad de los resultados es necesario sistematizar los procedimientos de obtención de la misma en función de los objetivos perseguidos de las características del paciente, etc. Una vez determinado por el personal facultativo el tipo de muestra necesaria para el análisis se procederá (si es posible por escrito) a: 1·- Informar a la persona objeto del análisis. 2·- Indicar el tipo de muestra deseada (primera de la mañana, 24 hora, ...) 3·- Orientar acerca de la técnica de obtención de la misma 4·- Cuando la muestra sea tomada fuera del laboratorio indicar las pautas del almacenamiento y transporte más adecuadas. 5·- Insistir en la importancia de la higiene y de la limpieza en general cuando se procede a la recogida de la muestra (evitando la contaminación involuntaria). 6·- Describir el tipo y características más adecuadas del recipiente utilizado. A la hora de elegir el método más adecuado para llegar a cabo la recogida de una muestra de orina, es muy importante tener en cuenta: 1·- Capacidad del paciente para evacuar la vejiga de forma voluntaria. 2·- La necesidad de utilizar muestras técnicas más o menos invasivas para obtener la orina en condiciones adecuadas. CUADRO / ESQUEMA Micción espontánea: el paciente es el responsable de la misma. El objetivo es obtener una muestra sin contaminación. Para prevenir la contaminación eliminamos la primera porción de la micción y debemos asegurarnos de que el paciente realice un lavado minucioso y previo de los genitales. • Indicaciones: ~ Análisis físico-químico de rutina ~ Estudio del sedimento ~ Cuantificación de la excreción de solutos en función de la concentración de creatina ~ Microbiología (en ocasiones) • Los inconvenientes son: la posibilidad de contaminación, bien por la flora presente, en toda la uretra femenina y en la terminal masculina o bien por la flora del área perineal. Cateterismo vesical ó sondaje: requiere para su colocación personal especializado. Existe peligro de contaminación cuando permanece colocado demasiado tiempo. Está indicado en paciente que presentan dificultades en la micción y a veces con mujeres para evitar la contaminación vaginal. • Los inconvenientes son las posibilidades de introducir gérmenes en al vagina y producir una infección delas vías urinarias. Punción supra-púbica: es una técnica invasiva que debe ser realizada por personal especializado. Las indicaciones son: diagnóstico de infección por microorganismos extraños en niños y cuando la muestra de orina recogida por los otros métodos no reúnan las condiciones necesarias. • Los inconvenientes son: la posible contaminación por la flora cutánea y está contraindicada en mujeres embarazadas o con tumores ginecológicos. TIPO DE MUESTRA En cada caso el tipo de muestra dependerá del análisis solicitado y estará directamente condicionado por 2 importantes factores: El tiempo y La interferencia de la contaminación en el análisis a realizar. Para poder comparar los resultados obtenidos algunas sustancias deben determinarse en un periodo de tiempo establecido previamente (en ocasiones hasta 24 horas) tal en el caso de: 1·- Sustancias cuya eliminación obedezca a ciclos metabólicos circadianos (varían a lo largo del día). 2·- Compuestos que se excretan en función de la cantidad de hormonas presentes. 3·- Sustancias cuya excreción varía en función de la dieta. En las muestras que requieren un análisis bacteriológico, o en aquellas que contienen sustancias fácilmente degradables por las bacterias es muy importante extremar las medidas de limpieza e higiénicas para evitar las interferencias debidas a la contaminación. Cuando evitar la contaminación sea imprescindible la toma de muestra deberá estar supervisada o ser directamente tomada por personal especializado. En niños (que todavía no han adquirido el control sobre la micción) se utilizan métodos especiales que proporcionan muestras aceptables evitando en los posible técnicas invasivas. El método más utilizado consiste en usar bolsas de poliestireno estériles que se adhiere a la piel perineal envolviendo completamente los genitales del niño. A·- TIPOS DE MUESTRA PARA UN ANÁLISIS DE ORINA SIN SUPERVISIÓN: 1·- Primera orina de la mañana: es una muestra de 8 horas y se recomienda porque la concentración de soluto es variable a lo largo del día y está en relación con la ingesta de líquido. Sus indicaciones son: • Análisis rutinario de orina. • Determinaciones de la capacidad de concentraciones del riñón. • Es la más adecuada para realizar estudios físico-químicos. 2·- Orina toma al azar: es una muestra al azar que puede dar mal los resultados (por ejemplo por excesiva dilución). Sus indicaciones son: • Examen rutinario siempre que ese haya retenido un tiempo la orina • Determinación de la capacidad del riñón para concentrar la orina 3·- Orina minutada: se elige un intervalo de tiempo y se comienza vaciando la vejiga, anotando la hora y va recogiendo la muestra hasta que finaliza el periodo elegido. Al recogida concluye vaciando completamente la vejiga. Las indicaciones son: • Sustancias cuya eliminación sea variable a lo largo del día. • Sustancias que se excretan en función de la cantidad de hormona presente • Sustancias cuya eliminación esté en función de la dieta. 3.1·- En función del tiempo puede ser: ~ Fraccionada: es de gran utilidad en el seguimiento de pacientes diabéticos. Recogiéndose durante el día 3 muestras y determinándose en ella glucosuria y cetonuria. Las fracciones son: desayuno-comida, comida-cena y cena-desayuno. ~ De 2 horas: es muy poco utilizada. ~ De 24 horas: es necesario asegurarse de recoger todas las micciones realizadas en esas 24 horas. Técnica: Se vacía la vejiga a primera hora de la mañana (normalmente a las 8 horas) y se deshecha la orina emitida. Se recoge toda la orina emitida incluyendo la de la misma hora de la mañana siguiente. Se mezcla y se homogeniza toda la orina recogida. Se reparte en alícuotas (en porciones similares) Se lleva a analizar B·- TIPOS DE MUESTRA PARA UN ANÁLISIS DE ORINA CON SUPERVISIÓN: se denomina orina de media micción o chorro medio. Intenta evitar la contaminación por la flora uretral que es arrastrada por la primera micción. También debe evitarse la micción debida a la flora peritoneal. La técnica de realización es deshechar la primera porción de la micción y la última, aprovechándose sola la porción intermedia de la micción. C·- TIPOS DE MUESTRA PARA ANÁLISIS DE ORINA RECOGIDA POR PERSONAL SANITARIO: • Cateterismo vesical (sondaje): es una técnica invasiva con un apreciable riesgo de infección urinaria y facilita la tomada muestra de orina para análisis bacteriológico y físicoquímico. Las normas de realización son: ~ Realizarla únicamente cuando sea imprescindible. ~ Utilizar guantes y equipos en condiciones de esterilidad. ~ Mantener el campo de operaciones estéril durante todo el proceso. ~ Cuando sea posible utilizar equipos de sondaje de circuito cerrado (la bolsa de recogida va unida a la sonda) ~ Mantener permeable la luz de la sonda. ~ Evitar que se produzcan reflujos d orina. ~ Cambar el sistema cada 10-15 días. ~ Realizar controles periódicos para detectar la aparición de bacteriuria. Para un análisis bacteriológico extraemos la orina directamente de la válvula que une la sonda con la bolsa de recogida, mediante aguja y jeringa estériles. Una vez que se haya desinfectado el punto de punción. Para un análisis físico-químico se recoge la orina directamente del a bolsa recolectora. • Punción suprapúbica: es una técnica invasiva muy utilizada para el diagnóstico de infección urinaria en niños cuando se sospecha de la presencia de microorganismos extraños. Es la única muestra útil para el cultivo de anaerobios. Las normas de realización son: ~ Utilizar siempre material aséptico. ~ Evitar la posible infección por la flora cutánea. ~ Esperar al llenado completo de la vejiga. ~ A continuación, punción entre el ombligo y la sínfisis púbica. ~ Recoger la muestra en un recipiente estéril. RECOGIDA DE LA MUESTRA De una forma general para poder obtener la mayor cantidad de información posible la preparación de recogida, es decir, la toma de muestras debe ajustarse en la medida de lo posible a las siguientes reglas básicas: 1·- Que la muestra utilizada sea homogénea (es fundamental homogenizar la muestra antes de realizar dicho análisis). 2·- Que sea representativa del total. Si la muestra que tomamos no los es, los resultados serán erróneos. 3·- Que sea formada en condiciones adecuadas según sea el objeto del análisis de orina. Hay que procurar alterarlo lo menos posible, especialmente si lo han de transportar. 4·- Utilizar los recipientes más adecuados en cada caso. 5·- Conservarla adecuadamente cuando no pueda ser analizada de forma inmediata. 6·- Etiquetar adecuadamente e identificar correctamente a la muestra haciendo constar datos como: datos personales (nombre, apellidos, lugar de residencia, etc), tipo de análisis solicitado, fecha y hora exacta de la recogida, en caso necesario indicar conservadores utilizados y otros datos complementarios. El recipiente en el cual vamos a recoger la muestra debe ser el más adecuado, teniendo una serie de características fundamentales: ~ Limpios y/o estériles en función del tipo de análisis a realizar (siempre han de estar limpios y secos, aunque no siempre es indispensable que sean estériles). ~ Con una tapa ancha consistente y con un capacidad entre 50-100 ml. ~ Normalmente de material transparente que permite ver el interior (excepto para la determinación de sustancias que son fotosensibles, como la bilirrubina, urobilinógeno, catecolaminas, porfirinas, etc, en cuyo caso deben utilizarse de material opaco). ~ Posibilidad de colocar etiquetas de identificación (que no se desprenda fácilmente). Los tipos son: ~ Estériles ~ Limpios ~ Envases de 24 horas (de unos 2000 ml) ~ Bolsas pediátricas (estériles). Actualmente los más utilizados son los de poliestireno. Una vez recogida la muestra en el recipiente más adecuado para su procesamiento en le laboratorio es conveniente utilizar tubos que seas: ~ Más manejables ~ De volumen más reducido (10-15 ml) ~ De fácil manejo y almacenamiento ~ Normalmente de fondo cónico ~ Transparentes ~ Fácilmente rotulables ~ Preferentemente con dispositivos de cierre. CONSERVACIÓN DE LAS MUESTRAS Las muestras de orina deben ser analizadas frescas siempre que sean posible y mantenidas en las mejores condiciones de conservación. Deben guardarse siempre, parte de la muestra analizada por su fuese necesario efectuar algún otro análisis de comprobación, o por sí durante el análisis se deteriora sin haber obtenido resultados fiables. En general es conveniente analizar la muestra de orina recién emitida. Si esto no es posible, una conservación adecuada es fundamental para evitar en lo posible la alteración de los componentes de la muestra original. No se recomienda utilizan para un análisis muestras de más de 3 ó 4 horas desde el momento de la recogida, ya que pasado este tiempo las sustancias contenidas en la muestra comienza a degradarse con rapidez. Esto es debido a que algunas bacterias producen amoniaco que harán que aumente el pH debido a lo cual pueden destruirse posibles cilindros (el cilindro urinario es un cuerpo cilíndrico uniforme de la orina o de un asa de henle, se distinguen tipos de cilindros en casos patológicos: céreos, granulosos, hemáticos,...) y células de todo tipo que pudiera haber. Vamos a utilizar 2 tipos de métodos de conservación: 1·- Métodos físicos: A·- Refrigeración: utilizada para análisis rutinario de orina u otras determinaciones específicas. Consiste en conservar la muestra a 4ºC hasta el momento del análisis en que se atempera (se lleva a temperatura ambiente). No es conveniente refrigerar las muestras de orina, que vayan a analizarse antes de 3 ó 4 horas (excepto para análisis microbiológico). Ocurre que ha medida que aumenta la temperatura puede aparecer turbidez. Será importante preservar la muestra de la luz para evitar la degradación de sustancias fotosensibles presentes en ella. Por ejemplo: la bilirrubina. B·- Congelación: menos utilizada que la refrigeración y se emplea sobre todo cuando las muestra a analizar deben enviarse a laboratorio de referencia. 2·- Sustancias conservadoras: su utilización estará básicamente en función de: ~ El tipo de parámetro a analizar ~ El tiempo transcurrido desde la toma de la muestra ~ El tiempo que necesita hasta ser analizada. No se recomienda su utilización en análisis rutinario: A·- Aceites de parafina: forman una película que impide el contacto de la muestra con el aire. Evita la pérdida de dióxido de carbono (volátil) en las pruebas de acidificación. B·- Cloroformo: es tóxico e interfiere en el examen microscópico. Se usa para la determinación de aldosterona. C·- Clorhexidina: en proporción de 200 gr/l previene el crecimiento bacteriano. Esto permite almacenar hasta 6 semanas muestras de orina para el análisis de glucosa. D·- Formaldehído: es formalina al 37% que conserva bien los elementos formes, pero interfiere en la determinación de glucosa. Se usa para análisis de sedimento. E·- Tolueno: forma una capa sobre la muestra que la protege del aire e inhibe el crecimiento bacteriano. Es inflamable y difícil de separar de la muestra una vez añadido. Se usa para determinación de acetona, ácido diacético, proteínas,... F·- Timol: poco utilizado porque produce falsos positivos en la determinación de ciertas sustancias como las proteínas, resulta útil para bastantes determinaciones. G·- Tabletas comerciales: conservan bien los elementos forme e interfieren en la determinación de iones hormonas y en la densidad. Es útil para el transporte de muestras de orina H·- Ácidos: ~ Con ácido clorhídrico: que tiene un pH alrededor de 3 se destruyen los elementos forme ~ Con ácido bórico no se produce este efecto. Con excelentes conservantes siempre que no interfieran en la determinación. I·- Álcalis: normalmente se lleva a cabo con carbonato sódico. Su utilidad más importante es la determinación de porfirinas y urobilinógeno. TRANSPORTE Y ALMACENAMIENTO DE MUESTRAS DE ORINA: el transporte y almacenamiento va a depender del tiempo que deba permanecer la muestra almacenada y el tipo de muestra. • Muestras para análisis bacteriológicos: deben ser realizadas en el mismo centro donde vayan a ser analizadas. Siempre que esto no sea posible se debe mantener a 4ºC un máximo de 24 horas. • Muestras para análisis de rutina: utilizar conservadores adecuados y refrigerar siempre que sea posible par preservar los elementos formes. • Muestras para determinación especiales: seguir en cada caso las recomendaciones de conservación más adecuada. ANÁLISIS DE ORINA Es un procedimiento técnico encaminado a examinar los componentes que lo integran, su cantidad, y la proporción en que se encuentra. El estudio de una muestra de orina, cuando es realizada correctamente, va a proporcionar una gran información acerca de múltiples alteraciones orgánicas y de muy diversa etiología tanto del órgano donde se forma la orina como de torso muchos órganos y procesos metabólicos. A menudo el análisis de orina permite detectar una alteración de carácter patológico. En ocasiones sin embargo sirve para poner en evidencia estados fisiológicos particulares no patológicos (pone en evidencia la existencia de embarazo) determinar el buen funcionamiento renal, etc). En general dicho estudio va a estar muy condicionado por la forma en que se lleve a cabo la recogida de la muestra sometida a examen. Los objetivos fundamentales de cualquiera examen de orina son: 1·- Obtener información del estado general del riñón, así como de las lesiones que pudieran afectarlo. 2·- Detectar la existencia de una alteración a nivel de las vías urinarias por donde se excreta la orina ya formada. 3·- Teniendo en cuenta aquellos productos que se eliminan por vía urinaria, detectar alteraciones funcionales de otros órganos de nuestra anatomía. 4·- Poner de manifiesto la existencia de alteraciones metabólicas de muy diversa etiología, que pueden ser detectables por un aumento o disminución anormal de ciertos metabolitos en la orina. Al analizar la orina, por tanto, se intenta encontrar por un lado sustancias que normalmente, no se encuentran en la misma y por otro lado alguna alteración en la concentración (por defecto o por exceso) de componentes que habitualmente se encuentran en ello. Es muy frecuente en la práctica clínica solicitar al laboratorio el estudio de orina de un paciente bajo denominaciones muy variadas, como: ~ Análisis elemental de orina. ~ Análisis completo de orina. ~ Análisis rutinario ~ Anormales y sedimento Realmente lo que se está pidiendo con todas estas denominaciones es la investigación de ciertos parámetros bioquímicos como pueden ser los siguientes: densidad, proteínas, bilirrubina, urobilinógeno, cuerpos cetónicos, glucosa,... El estudio de los distintos parámetros bioquímicos deberá siempre ir acompañado de una investigación microscópica de la muestra obtenida tras concentrar la orina original (estudio del sedimento urinario). Actualmente todo queda muy simplificado por la utilización de la llamada ‘química seca’ (mediante tiras reactivas) que incluyen además de estos parámetros otros como pueden ser: la valoración bioquímica de la presencia de hematíes y leucocitos, que facilitan la valoración previa del sedimento. Aunque hoy en día un análisis de orina, tiene un interés clínico indiscutible se admite de forma generalizada y presenta 2 inconvenientes básicos que pueden restarle fiabilidad. 1·- La muestra sobre la que se realiza el análisis de orina es a menudo poco representativa y suele ser recogida, transportada (en su caso) y conservada no siempre en condiciones idóneas. 2·- El procesamiento que se le da a la muestra en el laboratorio no es a menudo el más adecuado (falta a menudo rapidez, profesionalidad y eficacia). En general para apaliar en la medida de los posible estos inconvenientes resultan muy eficaces medidas como: ~ La utilización de protocolos de trabajo preestablecidos. ~ La incorporación de sistemas de automatización e informatización. ~ Realizar la selección previa de los sedimentos a analizar. Una vez obtenidas la muestra de orina en condiciones adecuadas, si es posible (hay tiempo, disponibilidad de reactivos y recursos humanos) se procede normalmente a realizar un análisis general de la misma que consiste en: A·- Físico / macroscópico: cantidad, aspecto, turbidez, color, olor, densidad y pH. B·- Químico / anormales: proteínas, glucosa, cuerpos cetónicos, sangre ó hemoglobina, bilirrubina, pigmentos biliares, urobilinógeno y nitritos. C·- Microbiológicos: estudio microscópico de estructuras cristalinas y de formas amorfas en suspensión: ~ Estudio citológico (citología: rama de la biología cuya finalidad es el estudio morfológico y funcional de la célula). ~ Estudio bacteriológico D·- Microbiológico: 1·- Urocultivos ó urinocultivos 2·- Identificación del germen (mediante pruebas bioquímicas de identificación o tipación bacteriana) 3·- ATB (antibiograma): son pruebas de laboratorio destinadas a medir la sensibilidad de ciertos gérmenes para los antibióticos. E·- Parasitología: 1·- Técnicas específicas de visualización macroscópica de parásitos 2·- Estudio microscópico en la muestra de orina (podemos encontrar parásitos enteros, partes de ellos, huevos ó quistes –que son formas de resistencia). Para ello la realización correcta de un análisis de orina debemos establecer el siguiente origen cronológico: 1·- Obtener las características físicas (color, olor, cantidad,...) 2·- Examen bacteriológico cuando este haya sido solicitado (Evitando así contaminar la muestra). 3·- Llevar a cabo todas las pruebas necesarias de tipación bioquímica 4·- Determinar la densidad 5·- Obtención y observación microscópica del sedimento urinario. NOTA IMPORTANTE: la muestra de orina sobrante debe guardar adecuadamente hasta que la analítica haya concluido. NUNCA TIRARLA ANTES DE ACABAR. Es necesario revisar los resultados de los estudios realizados para determinar si los datos obtenidos después del sedimento concuerdan con las pruebas químicas. Además es necesario comprobar que todas las anomalías detectadas han sido confirmadas adecuadamente. EXAMEN FÍSICO-MACROSCÓPICO Proporciona una información sobre posibles alteraciones tanto propias (nefropatías) o ajenas (diabetes) al sistema excretor urinario. Los datos obtenidos en cada caso son orientativas y nunca definitivos a la hora de diagnosticar una determinada patología y por tanto deben ser confirmadas con otros análisis complementarios. Es importante tener presente que existen determinadas situaciones fisiológicas (la menstruación, grado de hidratación), que altera algunas de las características de la muestra de orina analizada. Conociendo las principales características de una orina normal es posible detectar determinadas alteraciones, a menudo por causas fisiológicas, pero que en ocasiones pueden orientarnos hacia el diagnóstico de una determinada patología. • CANTIDAD: la diuresis normal es de 800-2000 ml/24 horas siendo muy frecuente un volumen de 1200-1500 ml/24 horas. Posibles alteraciones en la cantidad: ~ Oliguria: se emite menor cantidad de orina de la normal. ~ Poliuria: se emite mayor cantidad de orina de la normal. ~ Anuria: no hay emisión de orina. El volumen se ve influenciado tanto por factores fisiológicos como patológicos. Así la ingestión de líquidos y de sustancias que puedan ayudar en su eliminación (bebidas diuréticas como el té y el café, fármacos diuréticos, alcohol, nerviosismo, frío, etc) son factores fisiológicos que aumentan el volumen. • ASPECTO / TURBIDEZ: la orina recién emitida es clara y transparente, mientras que la orina almacenada pueden aparecer elementos en suspensión, puede aparecer: ~ un sedimento blanquecino que normalmente indica fosfato y carbonatos ~ un sedimento rojizo significa presencia de uratos los cuales desaparecen al calentar la orina a 60 ºC Las posibles alteraciones son: ~ Aspecto gelatinosos: indica presencia de leucocitos (se denomina piuria que es la presencia de pus en orina normalmente asociado a una infección. ~ Aspecto opalescente: puede ser opalescente uniforme (crecimiento bacteriano) y no uniforme (que indica que la muestra tiene contaminación por secreción vaginal y/o moco). ~ Turbidez con sedimento rojo: indica hematíes. ~ Espuma persistente: indica normalmente que hay proteínas normalmente albúmina, en este caso si hay dudas resulta conveniente realizar pruebas de detección de proteínas en orina. Observaciones: ~ La turbidez a menudo se debe a precipitación de sales o de una piuria y para poder distinguir ambas causas es importante medir el pH ya que fosfatos y carbonatos aparecen en orinas básicas. Además si se trata de piuria la turbidez desaparece al calentar la orina a 60ºC. ~ La turbidez debida al crecimiento bacteriano no desaparece al acidificar la orina y demás al microscopio se pueden detectar los microorganismos. ~ También puede aparecer turbidez a la presencia de espermatozoides o de líquido prostático que tampoco desaparecen al calentar ni al acidificar. ~ Hay que asegurarse que la espuma persistente no procede de restos de detergentes para lo cual es necesario utilizar frascos de recogida herméticos y deshechables. • COLOR: lo normal es amarillo ó ámbar (en función de la concentración). Las posibilidades de alteraciones son: ~ Incolora ó amarilla claro: diabetes insípida o en las poliurias. ~ Amarilla ó amarilla verdoso ó amarilla marrón: ictericia ~ Marrón-pardo-oscuro (como el coñac o la coca-cola): hepatitis ó una cirrosis hepática. ~ Naranja: por medicamentos normalmente por antibióticos ~ Blanquecina-lechosa: infección de las vías urinarias. ~ Amarilla oscuro: fiebre aguda ~ Roja-marrón ó rojiza: sangre [hematuria (rojo turbio) y hemoglobinuria (rojo transparente)] ó a medicamentos. • OLOR: aromático y muy característico (ligeramente amoniacal) Alteraciones: ~ Putrefacto: es patológico y se da en infecciones urinarias ~ Claramente amoniacal: envase cerrado durante mucho tiempo. ~ Acetona: presente de esta sustancia en orina (manzana) ~ A ratón: indica fenil-cetonuria • DENSIDAD: normalmente es entre 1010 y 1030 pero si es a primera hora de la mañana es entre 1020 y 1025 pudiendo determinar si por tiras reactivas, urodensímetros o por refractometría. Alteraciones: ~ Disminuye: diabetes insípida, alteraciones renales. ~ Aumenta: debido a las alteraciones renales o a estados febriles. 2 Observaciones: ~ Cuando el volumen de orina es inferior al necesario añadir agua destilada y después realizar una corrección de la tinción. ~ Si la temperatura de la orina difiere de la calibrada del urodensímetro se hará una corrección de la temperatura, sumar o restar 0’001 a la densidad obtenida experimentalmente por cada 3ºC de diferencia. • pH: valores normales entre 4’5-8’2 aunque lo normal es un pH de 6. Alteraciones: ~ Ácido: indica fiebre, acidosis o tuberculosis renal. ~ Alcalino: úlceras gástricas, cistitis ó tratamiento con antiácidos. El pH puede variar en función de la alimentación: un exceso de carne en la dieta acidifica la orina y una dieta muy rica en vegetales basifica la orina. EXAMEN BIOQUÍMICO. DETERMINACIÓN DE ANORMALES Habitualmente en un examen bioquímico de orina se investiga: proteínas, glucosa, cuerpos cetónicos, hemoglobina, pigmentos biliares, urobilinógeno y nitritos. En condiciones normales los métodos de análisis no detectan en la orina estas sustancias (de ahí el concepto de anormales) debido a que su concentración es menor que la sensibilidad dichos métodos. Se denomina sensibilidad de un método analítico para una sustancia determinada a la mínima concentración de esa sustancia que el método es capaz de detectar. Es también la concentración mínima de una determinada sustancias que es necesaria en la muestra analizada para que de positivo. Ejemplo: Si tenemos un método A que tiene una sensibilidad 0’8 mg/dl y un método B que tiene una sensibilidad 0’3 mg/dl. El más sensible es el método B. En la actualidad el estudio de anormales en una muestra de orina se lleva a cabo mediante la utilización de la ‘química seca’(tiras reactivas de diferentes tipos) y los resultados obtenidos con ellas son cualitativos ó semi-cuantitativos. Cuando debido a las característica de la enfermedad que se pretende diagnosticar se precisan valores más exactos y no aproximaciones orientativas y se procederá a la realización de pruebas bioquímicas cuantitativas. 1·- Proteínas: proteinuria es la eliminación de proteína en orina superando los valores normales. En condiciones normales las proteínas se encuentran en orina en cantidades muy pequeñas (130-150 mg/día) y que varía según el volumen de orina eliminada. Sin embargo en los recién nacidos sobre todo en los 3 primeros días de vida es normal encontrar de 2-8 mg/100 ml Las proteínas que se eliminan en orina son básicamente: •Albúmina: es lo que se denomina albuminuria fisiológica y es normal después de un ejercicio físico intenso, fiebre,... • Globulinas • Proteínas de Tamm-Horsfall (T-H): es una mucoproteína de estructura viscosa que no se encuentra en el plasma. Se forma en el túbulo contorneado distal y constituyen la matriz de los cilindros. Supone 1/3 de la proteinuria total. • Otras: transferrina, Ig A, ... Las proteínas con peso molecular inferior a 50-60.000 atraviesa en condicione normales la membrana glomerular y se filtran, reabsorbiéndose después a nivel tubular en su mayor parte. La albúmina con peso molecular 69.000 se filtra solo en una mínima cantidad. Tipos de proteinuria: A·- Según la cantidad de proteína eliminada puede ser proteinuria • Intensa mayor ó 4 gr/día. Ocurre cuando existe un daño renal grave, por ejemplo en el síndrome nefrótico o en la glomérulo-nefritis aguda ó crónica. • Moderada: cuando es de 0’5-4 gr/dl sería en estadios menos graves de las enfermedades anteriores, píelo-nefritis con hipertensión, nefropatía diabética. • Leve: menos de 0’5 gr/dl sería en lesiones renales incipientes (comenzando) B·- En función de la zona renal afectada: • Proteinuria de patrón glomerular: el glomérulo pierde la permeabilidad en la filtración, por lo tanto la filtración es inadecuada pro lo tanto aparece en orina albúmina y otras proteínas de tamaño y cargas similares (antitrombina, transferrina, pre-albúmina). A mayor tamaño de las proteínas aparecidas mayor lesión glomerular. • Proteinuria de patrón tubular: cuando hay lesión tubular aparecen en orina proteínas de pequeños tamaños que en condiciones normales se reabsorberían a este nivel, por ejemplo las mioglobulinas. La función glomerular no está alterada y por tanto no se filtra proteína de gran tamaño. C·- En función de la duración: puede ser: • Intermitente o transitoria: aparecen pacientes sin causa renal aparece; puede ser fisiológica pero habría que comprobarla. • Persistente: se mantiene en el tiempo suele cursar con hematuria y su pronóstico es peor A parte de todas las proteinurias anteriores (de causa renal) existen otras proteinurias de causas extra-renal: • Proteinuria de Bence-Jones ó plasmacitoma: en la cual las células plasmáticas tumorales liberan cadenas ligeras (L) de las inmunoglobulinas que atraviesan el filtro glomerular. • Falsa o fisiológica: producida pro contaminación con proteína de procedencia ajena a la orina, por ejemplo: de semen. 2·- Glucosa: las variaciones de los niveles de glucosa en sangre y por lo tanto su presencia en orina pueden significar: • Alteraciones primarias del metabolismo de los hidratos de carbono • Alteraciones secundarias: que acompañan a otra patología. La orina normal carece casi por completo de g de glucosa, porque aunque es continuamente filtrada pro nivel glomerular vuelve casi toda a sangre pro reabsorción tubular. (La glucemia normal es de 80-120 mg/dl). La máxima concentración de glucosa en sangre que los túbulos son capaces de reabsorber se denomina umbral renal que es de 160 mg/dl. La glucosuria es el aumento de la concentración de glucosa en orina por encima de los valores normales. Las causas fundamentales de glucosuria son: A·- un aumento de la glucemia por encima de lumbral renal. B·- una alteración renal o túbulopatía: sucede cuando aparece a la vez normoglucemia (valor de glucosa en sangre normal) y glucosuria. 3·- Cuerpos cetónicos: se conocen como cuerpos cetónicos a los siguientes compuestos: el ácido acetil-acético, ácido -hidroxi-butírico, acetona. En personas sanas los cuerpos cetónicos se sintetizan en el hígado que se metabolizan por completo de forma que en la orina aparecen la concentración mínima (indetectables). La cetonuria es la aparición de cuerpos cetónicos detectables en orina. La presencia de estos en orina y su aumento en sangre implica que no se realiza correctamente el catabolismo oxidativa de los ácido grasos. Las causas fundamentales de cetonuria son: ~ Sobrecarga de lípidos en la dieta. ~ Diabetes mellitus ~ Vómitos (niños y embarazadas). ~ Bajo consumo de hidratos de carbono o alteraciones en su metabolización. El organismo al no poder usar los hidratos de carbono utiliza las grasas y algunas proteínas como fuentes de energía, a consecuencia se agotan las reservas alcalinas del organismo y se produce acidosis. ~ Ayuno prolongado 4·- Hemoglobina: no aparece en orinas normales si la cantidad es muy elevada se puede observar a simple vista. Causas de hemoglobinuria: • Enfermedad renal de vías altas. • Anemias hemolíticas • Reacciones transfusionales • Infecciones como la malaria 5·- Pigmentos biliares: bilirrubina y biliverdina. Se forma en el bazo, hígado y médula ósea por degradación fisiológicas de la hemoglobina . Pueden distinguirse 2 tipos diferentes de bilirrubina: • Bilirrubina unida a albúmina que también se denomina libre, indirecta o insoluble • Bilirrubina unida a ácidos glucurónico: también llamada conjugada soluble ó directa. Aparece bilirrubina y pigmentos biliares en orina siempre que aumente la bilirrubina unida a glucurónicos en sangre. Estos se da en las siguientes condiciones: 1·- La enfermedad obstructiva o ictericia obstructiva: la bilirrubina unida a glucurónico no puede pasar al intestino delgado y se acumula en la sangre por lo tanto se excreta en orina. 2·- Lesiones hepáticas por ejemplo hepatitis o hepatotoxicidad Frecuentemente estas sustancias aparecen en orina antes de que se manifiestan otros signos de la propia enfermedades. 6·- Urobilinógeno: la bilirrubina unida a glucurónico (conjugada) se sintetiza en el hígado y con la bilis pasa a intestino delgado donde por acción del flora bacteriana se transforma en urobilinógeno. Este compuesto se elimina de 2 formas: con las heces en elevada proporción (color marrón oscuro) y con la orina en menor concentración (que le da el color ámbar). La cantidad de urobilinógeno aumenta en la orina en las hepatitis y en las anemias hemolíticas. La determinación de este compuesto debe realizarse rápidamente en orina ya que se transforma en urobilina más oxígeno dando un falso resultado negativo. 7·- Nitritos: su aparición en orina indica crecimiento bacteriano (bacteriuria) de gérmenes capaces de reducir los nitratos ingeridos en la dieta hasta nitritos. Por ejemplo: enterobacterias. Un resultado negativo de la prueba de los nitritos nos indica ausencia de microorganismos ya que: ~ Estos pueden no ser productores de nitratos por ejemplo estreptococos o los estafilococos. ~ Habiendo crecimiento por enterobacterias el resultado puede ser negativo por ausencia de nitratos ingeridos en la dieta. EXAMEN MICROSCÓPICO DE ORINA. SEDIMENTO URINARIO. El estudio del sedimento urinario comprende la investigación hallazgo e interpretación de una serie de elementos o estructuras del más variado origen y composición que aparecen suspendidos en la orina y que proporcionan una ayuda par el diagnóstico y la evolución de las enfermedades renales. Siempre que sea posible la muestra debe examinarse antes de transcurridas 3-4 horas de sus recogida ya que algunas estructuras presentes se lisan fácilmente (células, cilindros,...) Para la obtención del sedimento vamos a seguir los siguientes pasos: ~ Homogeneizar bien la muestra ~ Colocar 10 ml de orina en un tubo de centrífuga (preferiblemente de fondo cónico) ~ Centrifugar a 2.00 R.P.M. durante 5 minutos. ~ Decantar completamente el sobrenadante. ~ Resuspender el sedimento residual ~ Montar una preparación en ‘fresco’ del sedimento (es decir, colocar una gota entre porta y cubre). Es muy importante evitar la formación de burbujas. ~ Observar sin demora al microscopio a 40 aumentos con intensidad lumínica media y condensador a media altura. Estructuras del sedimento urinario: nos vamos a encontrar en el sedimento urinario con: estructuras organizadas, no organizadas y artefactos. • Estructuras organizadas: ~ Células o Células hemáticas Glóbulos rojos o hematíes Glóbulos blancos ó leucocitos o Endógenas Epitelio columnar ó cuboideo Epitelio transicional ó urotelio Epitelio escamosos o Neoplásicas o Otras células Células prostáticas Células vaginales escamosas Espermatozoides ~ Cilindros o Hialinos o Granulosas Cilindros granulosos finos Cilindros granulosos gruesos o Celulares Epiteliales Hemáticas Leucocitario Bacterianos o Céreos o Grasos ~ Microorganismos o Bacterias o Levaduras o Parásitos microscópicos • Estructuras no organizadas: ~ Cristales ó elementos mineraloides o Cristales endógenos normales o Cristales endógenos patológicos o Cristales exógenos pH ácido Ácido úrico Oxalato cálcico monohidratado Oxalato cálcico dihidratado Uratos amorfos Cistina Leucina Tiroxina Bilirrubina pH básico Fosfato cálcico Fosfato cálcico triple (amónico-magnésico) Carbonato cálcico Uratos amónicos o Cristales de creatina ~ Gránulos orgánicos o De grasa De vaselina o De mucina o De amiláceos • Artefactos ~ Propios de paciente o Pelos o Hilos o Polvo ~ Procedentes del recipiente donde se ha recogido la muestra o Polen o Moho ~ Artefactos debido al observador o Portaobjetos en mal estado o Preparaciones con burbujas de aire • Estructuras organizadas: ~ Células Hemáticas o Hematíes: pueden proceder de cualquier parte del sistema renal. La cifra normal es de 0-1 hematíes / campo. Su presencia en gran número sugiere infección, traumatismo, neoplasias o litiasis renal (cálculo o piedras en el riñón). En general la presencia de 1-2 hematíes / campo no debe considerarse anormal. Tampoco cuando una orina procede de una mujer ya que puede deberse a contaminación menstrual. Puede confundirse con levaduras y ciertas formas de cristalización de oxalato cálcico monohidratado. Si se procede a una tinción de Gram los hematíes aparecen en rojo, las levaduras en violeta, y los cristales aparecen incoloros. Es muy importante distinguir entre macrohematuria y microhematuria. La macrohematuria se observa macroscópicamente la presencia de hematíes en el sedimento por el color rojo del mismo. La microhematuria se detecta únicamente la presencia de cierta cantidad de hematíes al microscopio. También es importante diferenciar si el color rojo observado microscópicamente es debida a los hematíes o a la hemoglobina ya que si se trata de esta última al centrifugar el sedimento el color rojizo permanecer. o Leucocitos: pueden proceder de cualquier parte del sistema renal. Las cifras normales son: En hombres de 1-2 leucos/campo En mujeres de 2-6 leucos/campo En niños también de 2-6 leucos/campo. Más del 50% de los leucocitos se lisan al permanecer más de 2 ó 3 horas a temperatura ambiente. Cualquier cifra superior a los valores normales en el sedimento se denomina piuria. Generalmente la presencia de más de 5 leucos/campo puede indicar infección (cistitis, píelo-nefritis, ...) La mayor parte de los trastornos renales o del tracto urinario cursan con un aumento de la cifra de leucocitos esencialmente neutrófilos. Endógenas: el árbol urinario se halla revestido por 3 tipos embriológicamente diferentes de epitelio. o Epitelio columnar o cuboideo: proviene de cápsulas de Bowman, o de los túbulos: proximal, distal ó colector. o Epitelio transicional ó urotelio: proviene de pelvis renal, uréteres, vejiga y uretra. o Epitelio escamoso: proviene de la uretra. En condiciones normales se produce a todos los niveles una escasa descamación que se ve sin duda alterada (en ritmo y profundidad) ante elementos como microorganismo, productos químicos, cuerpos extraños (sonda), procesos generativos y proceso invasivos destructivos. Todos ellos de forma directa o indirecta participan aumentando dicha descamación A·- Células del epitelio columnar ó cuboideo: tienen un tamaño un tercio mayor que los leucocitos. Su forma es rectangular o cúbica. Tienen un núcleo grande y a menudo excéntrico. No se detectan apenas en un sedimento normal. Su presencia indica normalmente patología renal, así enfermedades de origen infeccioso píelo-nefritis , enfermedades de causa no infecciona que afectan a las nefronas como la glomérulo-nefritis (inflamación que afectan a glomérulos y túbulos), normalmente secundarias a una infección) B·- Células del epitelio transicional o urotelio: es pluriestratificado ya que constan de 3 capas, una basal, una intermedia y una tercera superficial. Las células que lo componen en general son de un tamaño 2-4 veces mayor que los leucocitos. Su forma es redondeado o piriforme (forma de pera) y tienen un núcleo generalmente pequeño. La aparición en el sedimento de elevadas cantidades de estas células en grandes masas celulares exige un estudio citológico más completo ya que cabe la posibilidad de un carcinoma en cualquier punto situado entre la pelvis renal y la vejiga. C·- Células del epitelio escamosos: son planas y tienen abundante citoplasma. Su núcleo es central y pequeñas a menudo sin bordes aparecen dobladas y replegadas. Las cifras normales son: en hombres de 1-3 por campo y en mujeres 2-5 por campo. Ni su ausencia ni su presencia en cantidades significativas tiene importancia clínica alguna. Neoplásicas: la presencia de las mismas en el sedimento puede ser debida a un proceso tumoral asintomático. Otras células: o Células prostáticas: no suelen encontrarse en condiciones normales pueden aparecer como consecuencia de una palpación prostática. o Células vaginales escamosas: no tiene significación clínica. En condiciones normales son indistinguibles de las del tercio distal de la uretra o Espermatozoides: básicamente está formado por cabeza y cola. En el hombre es muy frecuente la aparición de espermatozoides en le sedimento (eyaculación, recuento, poluciones nocturnas, etc). En la mujer aparecen después de haber mantenido relaciones sexuales. Es decir, tanto en hombres como en mujeres indica contaminación por líquido seminal. ~ Cilindros: básicamente los cilindros no son sino el resultado de la consolidación de las proteínas en los túbulos distal, proximal y colector de las nefronas. En individuos normales pueden encontrarse algunos (sobretodo Hialinos) en el sedimento pero en personas con alguna enfermedad renal pueden aparecer en gran número y de estructuras muy diferentes. Comienzan a desintegrarse en la orina a pH alcalino. Así como en presencia de bacterias, probablemente porque muchas de ellas contribuyen a la alcalinización del medio. Se acepta que esta consolidación de lugar a lo que conocemos como cilindros es necesario que concurran aisladamente o en conjunto las siguientes condiciones: 1·- disminución del pH de la orina 2·- aumento de la densidad o concentración de los solutos 3·- Un cierto grado de estancamiento en la orina, normalmente producido por una disminución del filtrado glomerular. En lugar de la nefrona en el que se forma determinan el tamaño y la forma de los cilindros: A·- Cilindros estrechos más o menos contorneados y son los que proceden de los túbulos distales. B·- Cilindros anchos son los que se originan en los túbulos colectores. Los principales tipos de cilindros son: Hialinos: cifras normales en hombres y en mujeres son: 1-2 hialinos/campo, aunque no es frecuente este tipo de cilindros se puede encontrar en grandes cantidades en orina, por ejemplo en casos de deshidratación o de estrés físico. También puede encontrarse en diversos tipos de nefropatías. No obstante su aparición en el sedimento no tiene significación clínica. Para visualizarlos mejor en el micro hay que evitar un exceso de iluminación dada su escasa refringencia. Normalmente sus contornos se aprecian con suficiencia nitidez y uno de sus extremos en romo (forma de un dedo de un guante) A menudo se habla también de cilindros granulosos hialinos muy semejantes a los hialinos pero con alguna incrustación en su estructura. Tampoco tiene significación clínica. Granulosas: en este tipo de cilindros predomina la estructura granular y desaparece casi completamente el aspecto hialino. Se puede distinguir 2 tipos bien diferenciados de cilindros granulosos. o Cilindros granulosos finos: su apariencia recuerda a los hialinos en tamaño y forma pero tienen mayor refringencia debido a la presencia masiva de pequeños gránulos de inclusión. o Cilindros granulosos gruesos: tiene una estructura diferente a los anteriores ya que tienen mayor tamaño. Su aspecto es rígido y tienen mayor refringencia. Sus bordes son muy contrastados y angulados. Aunque pueden aparecer en orinas normales su presencia suele sugerir una nefropatía. Celulares: la presencia de este tipo de cilindros en la orina nunca es normal. En este grupo pueden encontrarse los siguientes tipos: o Epiteliales: la matriz del cilindro engloba una serie de células epiteliales que se ha desprendido de la luz tubular. Si es posible reconocer las células que se encuentran en el seno del cilindro la identificación no presentará problema alguno (pero a veces se forman acúmulos celulares muy densos). A menudo la degeneración que sufren las células durante el recorrido por los túbulos dificulta la tarea. Gran variedad de nefropatías cursa con este tipo de cilindros pero frecuentemente se deben a lesiones del epitelio tubular debidas a: diversos tóxicos industriales, medicamentos y virus (hepatitis). o Hemáticas: también se llaman eritrocitarias. Aparecen en sedimento con hematuria son un signo indudable de lesión a nivel del parénquima renal, normalmente se tratan de lesiones vasculares aunque en ocasiones se trata de píelo-nefritis. El grado de empaquetamiento y la integridad de los hematíes en el seno del cilindro son muy variables. La cantidad de ellos es muy escasa (incluso en pacientes con hematuria clara) lo cual dificulta su localización. o Leucocitario: son relativamente fáciles de reconocer ya que los leucocitos presentes en su matriz se conservan relativamente estables durante el trayecto por los túbulos. Su presencia normalmente acompañada de una piuria más o menos intensa indica a menudo infección localizada en el parénquima renal (píelo-nefritis) aunque también pueden aparecer en lesiones del parénquima renal de tipo inflamatorio (glomérulo-nefritis aguada). o Bacterianos: se parecen a los granulosos toscos. Si se identifican en un sedimento generalmente unidos a piuria probablemente se trate de píelo-nefritis. Céreos: son altamente refringentes, rígidos, de apariencia dura, con una superficie ligeramente rugosa y brillante (recuerda la cera de las velas) y con sus extremos angulados. No suelen contener gránulos y son generalmente de gran tamaño. Su presencia en el sedimento es un síntoma claro de una alteración renal importante, suelen estar inmersos en una cilindruria en los que están representados la mayoría delos diferentes tipos de cilindros. Grasos: son cilindros granulosos o celulares en los que aparecen pequeñas inclusiones de material lipídico (gotitas de grasa). Poseen una alta refringencia y una tonalidad amarillenta en los lugares en los que aparecen dichas inclusiones. La detección de este tipo de cilindros sugiere la existencia de alguna nefropatía todavía no manifiesta. ~ Microorganismos: Bacterias: la orina es un líquido biológico estéril y por lo tanto no contiene bacteria en condiciones normales. No obstante dado su composición es un excelente medio de cultivo para el crecimiento de microorganismos. Es muy constante la aparición de bacterias analizadas en laboratorio. Aunque en la mayoría de las ocasiones las bacterias encontradas son fruto de una contaminación debida en gran parte (sobre todo en mujeres) a la flora saprofita alojadas en zonas próximas al meato urinario (zona anal, perineal, vaginal,...) Por todo lo anterior salvo en orinas tomadas de un forma y en unas condiciones ideales la frecuente presencia de bacterias en sedimento no debe se tenida en cuente, salvo que vaya acompañada de piuria. Levaduras: la gran mayoría de las veces aparecen como consecuencia de una contaminación. Cuando son encontradas acompañadas de piuria puede ya pensarse en una infección de las vías urinarias por esto microorganismos. Las orinas de personas diabéticas debido a la glucosuria parecen facilitar el crecimiento micótico. Su identificación es relativamente sencilla gracias a su forma cuboidea y a la frecuente presencia de células en estado de gemación. Debido a que tiene una refringencia muy parecida a los hematíes y un tamaño ligeramente mayor en ocasiones pueden confundirse con estos. En raras ocasiones la presencia de levaduras en orina corresponde a una auténtica infección urinaria. Cuando esto ocurre suele tratarse de una vaginitis causada la mayoría de las veces por ‘candida albicans’ Parásitos microscópicos: cuando aparecen protozoos normalmente se tratan de ‘tricomonas vaginales’ que es relativamente frecuente en sedimento de mujer y más raro en el de los hombres. Su aspecto es piriforme de mayor tamaño que los leucocitos y con una gran movilidad debido a la presencia de flagelos. Cuando la motilidad está muy mermada precipita, su identificación resulta más complicadas debido a ir acompañada de piuria y al tener una tamaño semejante al de los leucocitos. A menudo conviene solicitar una nueva muestra cuando la movilidad sea más intensa. La importancia clínica de la determinación de este parásito radica en que la piuria que la acompaña puede hacer pensar erróneamente en una infección bacteriana. Se descarta esta posibilidad al obtener urocultivos sistemáticamente negativos. Si aparecen en la orina de las mujeres normalmente proceden de la vaginitis que puede ser asintomática. Otros parásitos cuya aparición indica siempre contaminación de la muestra de orina con material fecal son: huevos de parásitos (schistosoma Spp), quistes ó trofozoitos de: giardia, tricomonas hominis. • Estructuras no organizadas: ~ Cristales ó elementos mineraloides: la presencia de formaciones cristalinas en la orina (algo muy frecuente se conoce como cristaluria). En general estos cristales que aparecen en la orina son productos finales del metabolismo que se excretan a nivel urinario. En determinadas condiciones físico-químicas de la orina (pH, densidad, temperatura, ...) algunos de estos metabolitos adoptan formas cristalinas. De todos los factores el pH de la orina es el más determinante en la formación de los cristales. Entre las formaciones cristalinas más frecuentes en el sedimento urinario pueden distinguirse 3 grandes grupos bien diferenciados Cristales endógenos normales: no corresponden a alteraciones metabólicas ni funcionales. Son de muy frecuentes de aparición en el sedimento. Puede aparecer en orinas recién emitidas. Cristales endógenos patológicos: reflejan trastornos metabólicas o afectación grave de algún órgano o sistema. Raras veces aparece en orina. Cristales exógenos: aparecen en la orina tras la introducción en el organismo (vía enteral –vía intestinal-, o parenteral –intravenosa-) de sustancias diversas. Ejemplo: contrastes radiológicos, vía endovenosa, sulfamidas. Los cristales los podemos clasificar según aparezcan: en orinas de pH ácido que serían cristales de predominio ácido y en orinas de pH básico que serían cristales de predominio básicos. o pH ácido: Ácido úrico: aparecen en orinas ácidas. Son birrefringentes. Tienen formas variadas (huso, rombo, rosetas,...) el color es marrón rojizo, amarrillo e incluso incoloras. Su presencia no indica una situación patológica o concentración anormal del aumento de ácido úrico. Oxalato cálcico monohidratado: aparecen en orinas ácidas. Son menos frecuentes que las anteriores. Se presentan en forma de prismas incoloros (casi nunca aislados) a modo de haces unidos por un punto medio (pesas de gimnasia) y redondeados finamente estriados incoloros y con una depresión central (radios de bicicleta). Oxalato cálcico dihidratado: Uratos amorfos: aparecen en orinas ácidas se presentan como un precipitado amorfo coloreado debido a la presencia de pigmentos coloreados de color amarillo-naranja. Cistina: suelen cristalizar en orinas de pH ácido. Son los únicos cristales que tienen significación clínica por si solos, ya que aparecen en orinas como consecuencia de un exceso de eliminación urinario de dicho compuesto (cistinuria). Su aspecto es incoloro y adopta la morfología de placas hexagonales, regulares, finas y transparentes. Es imprescindible confirmar la presencia de estos cristales con la existencia de una elevada concentración de cistina en la orina. Leucina y Tiroxina: estos cristales raramente se observan en orina, ambos son productos finales del metabolismo proteico, suelen aparecer juntos siempre en orinas ácidas y en condiciones clínicas graves, en las que existe una destrucción o necrosis tisular importante fundamentalmente en el tejido hepático. Por ejemplo cirrosis, hepatitis. Los cristales de tiroxina aparecen formando manojos de tiras finas. Los de leucina aparecen como gránulos esféricos de estrías radiales y concéntricas de aspecto oleoso o graso y muy refringente. Ambos presentan coloración amarilla o marrón. Bilirrubina: aparecen en orinas ácidas. Se presentan en orinas de pacientes que cursan con bilirrubinemia. Se observan como agujas de color marrón-rojizo. o pH básico: Fosfato cálcico: aunque no de forma muy frecuente pueden aparecer en orina, normal, alcalina, neutra. Se presentan en forma de prismas largos, y afilados a modo de agujas que en ocasiones se agrupan formando estrellas o rosetas. A veces también pueden aparecer como placas granulares amorfa se incoloras. No tienen clasificación clínica aunque a veces su aparición parece ligado a alteraciones como la hipertrofia de próstata o algunas infección urinarias crónicas. Muchos cálculos urinarios contiene fosfato cálcico. Fosfato cálcico triple (amónico-magnésico): su presencia en orinas en alcalinas o neutras es relativamente frecuente. Su forma cristalina más frecuente es la de tapa de ataúd aunque pueden verse como octaedros y de forma muy simular a la de sobre de carta (que en realidad es la forma típica de los cristales de oxalato cálcico) solo que en vez de tener un vértice presentan una pequeña arista. Tiene tamaño variable y no tiene significación clínica. Carbonato cálcico: pueden encontrarse en orinas alcalinas o neutras. Son cristales que no se ven muy frecuentemente. Aparecen como un material a orfo o granulado en ocasiones pueden encontrarse como pequeños lazos y más raramente como pequeñas esferas incoloras. Pueden aparecer en orinas tras la ingesta de vegetales pero no tienen significación clínica alguna. Uratos amónicos: suelen aparecer en orinas muy alcalinas. Presentan color amarillo-marrón muy intensos morfológicamente predominan formaciones esféricos de distintos tamaños. No tienen significación clínica, pero puede estar asociados a infección del tracto urinario por bacterias productoras de ureasa (aumentan la concentración de amonio en orina y por tanto aumentan el pH, es decir, se basifican). Cristales de creatina: raramente encontradas en orinas de personas adultas. Son frecuente en cambio en orinas de niñ@s antes de la pubertad. La creatina es un metabolito resultante de la degradación endógena del metabolismo muscular cuando este proceso se acelera aparecen en la orina cristales de creatina. Por ejemplo las distrofias musculares. Presentan forma pseudohexagonal característica. ~ Gránulos orgánicos: pueden ser de varios tipos: De grasa: o De vaselina: (lubricante) de la sonda vesical De mucina: por contaminación vaginal, inflamación De amiláceos: (de algodón) a menudo proceden de contaminación fecal. • Artefactos: pueden tener diferentes orígenes: ~ Propios de paciente: Pelos Hilos Polvo ~ Procedentes del recipiente donde se ha recogido la muestra: Polen: Moho: ~ Artefactos debido al observador: Portaobjetos en mal estado Preparaciones con burbujas de aire INFORME DEL SEDIMENTO URINARIO Una vez identificadas las estructuras presentes en la muestra de orina analizada se procede a la elaboración del informe del sedimento. Para que dicho informe tenga una verdadera utilidad diagnóstica debe presentar una estructura más o menos estandarizada. De forma general un informe del sedimento urinario debe: Cuadro 11.14 EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE ORINA La orina es un flujo orgánico hasta el momento de la micción hasta que se contamina. No obstante es un perfecto medio de cultivo para eventuales microorganismos patógenos que pueden causar infecciones en el aparato excretor urinario Riñones, uréteres y vejiga son estériles y por tanto en condiciones normales carecen totalmente de flora bacteriana. La infección del tracto urinario es extremadamente frecuente y la variedad de microorganismo aislado en él es muy grande. La mayoría de los órganos patógenos del tracto urinario proceden de la flora intestinal. De entre los gérmenes causantes de infecciones a nivel urinario destacan: Bacilo GRAM negativos: Escherichia Coli Proteus Spp Pseudomonas Aeruginosa Klebsiella Pneumoniae Cocos GRAM positivos: Sterptococcus Grupo D Stafilococcus Levaduras: Cándida Spp La toma de muestras para el análisis microbiológico de orina requiere una serie de cuidados especiales ya que entre otras cosas debe ser obtenida bajo condiciones asépticas y por tanto recogida en recipientes estériles evitando en todo momento la contaminación. El paciente debe ser instruido en la forma más adecuada (diferencias entre hombres y mujeres) de llevar a cabo esta recogida. El protocolo a seguir a la hora de realizar el análisis microbiológico de una muestra de orina es: 1·- Diluir la muestra si procede. Preparar un inóculo 2·- Sembrar ya sea en superficie o en profundidad: • En superficie podemos utilizar varios medios: ~ Medio Cled: es un medio que por sus características impide la invasión del mismo por Proteus. ~ Medio MacConkey: es un medio selectivo y diferencial para GRAM negativo. ~ Medio agar-centrimide: es un medio muy eficaz para la búsqueda de pseudomonas. Se pueden usar otros muchos medios que por sus características permiten el crecimiento de aquellos gérmenes presentes en la muestra. Sembrar un profundidad es muy poco frecuente. 3·- Incubar: la incubación de la muestra debe realizarse a la temperatura óptima de crecimiento de los microorganismos buscados. Habitualmente es de 37ºC. 4·- Realizar el recuento debe procederse al recuento de los microorganismos que hallan crecido tras la incubación, presumiblemente las causantes de la infección. Si hay menos de 10.000 microorganismos/ml de orina decimos que no hay infección urinaria. Puede hacer infección y no haber sido detectada por diferentes causas: ~ Por haberse instaurado ya un tratamiento con antibióticos ~ Por existir una obstrucción a nivel de las vías renales ~ Por haber obtenido la muestra por punción suprapúbica (sin pasar por al uretra donde está la flora saprofita) Si hay más de 100.000 microorganismos/ml de orina existe infección urinaria. Si aparece entre 10.000-100.000 microorganismos/ml de orina decimos que el diagnóstico es incierto. Una vez determinada la infección hay que resembrar en medios selectivos para proceder a la identificación (tipación) del germen causal de la misma. Ejemplo de medios selectivos el EMB que aísla el E. Coli. TEMA 9 ESTUDIO DE LOS CÁLCULOS URINARIOS INTRODUCCIÓN Los cálculos renales son concreciones (acúmulos, depósitos) anormales presentes en el riñón o en las vías urinarias denominándose a este fenómeno ‘litiasis renal’. Estas concreciones pueden ser de diferentes tamaños clasificándose según este criterio en: arenillas, arna gruesas y cálculos. Normalmente los cálculos de mayor tamaño se encuentran en la vejiga y los menores en el riñón. Aunque en ocasiones están compuestos por sustancias extrañas (sulfamidas ó silicatos) se forman generalmente a partir de productos del metabolismo presentes en el filtrado glomerular normal que precipitan debido a cualquier alteración en la orina (sobresaturación de un producto, cambios de pH, etc). Su estructura está constituido por una matriz de naturaleza orgánica que representa aproximadamente el 2’5% del peso seco total y es el núcleo central alrededor del cual se disponen varias capas concéntricas de naturaleza cristalina que constituyen el auténtico cálculo. El paso del cálculo por los uréteres o uretra provoca el cólico renal. Este consiste en un episodio de dolor intenso, usualmente irradiado a las ingles con vómitos persistentes y anorexia; el paciente está pálido y sudoroso. Puede haber polaquiuria (frecuencia exagerada de micciones) y hematuria. Los síntomas suelen acabar cuando el cálculo a pasado. Otros pacientes pueden expulsar arenillas, acompañadas de disuria (micción difícil y dolorosa) y hematuria (síntomas que pueden confundirse con una infección urinaria. COMPOSICIÓN QUÍMICA Según el número de componentes que interviene en la formación del cálculos, estos se clasificación en: • Cálculo simple: cuando tiene un único componente. • Cálculo mixto: cuando tiene 2 ó más constituyentes. Muchos cálculos renales son de composición mixta, pero es normal que un componente esté presente en cantidades dominantes. Los constituyentes habituales de los cálculos son: ácido úrico, cistina, y muy raramente xantina, colesterol, y sulfamidas. Según su composición se clasifican en: 1·- Cálculos que contienen calcio: oxalato cálcico ó fosfato cálcico. 2·- Cálculos de fosfato amónico-magnésico ó estruvita . 3·- Cálculos que contienen ácido úrico. 4·- Cálculos que contienen cistina. MECANISMOS DE FORMACIÓN Aunque pueden formarse en cualquier parte de las vías urinarias, más del 80% son de origen renal ó urotélico. Se producen por la precipitación de compuestos urinarios en forma de cristales. Estos cristales se van depositando en la superficie de las papilas renales, formándose agregados cristalinos que van aumentando de tamaño, se fragmentan y emigran al uréter pudiendo quedar en l vejiga o salir al exterior. En el proceso de formación de un cálculo intervienen varios factores diferentes siendo principalmente 4: A veces se puede producir por una excreción anormalmente aumentada del cristaloide en cuestión, ya sea debido a una elevada concentración en plasma o a un fallo en la reabsorción tubular normal. 1·- Aumento de la concentración urinaria de las sustancias formadoras de cálculos: se pueden producir por reducción del volumen urinario, aun con función renal normal debido a la restricción de líquidos ó a la pérdida de los mismos durante largos periodos de tiempo (deshidratación). A veces se puede producir por una excreción anormalmente aumentada del cristaloide en cuestión, ya sea debida a una elevada concentración en plasma o a un fallo en la reabsorción tubular normal. 2·- Cambios en el pH urinario: las alteraciones del pH urinario tienen un gran efecto sobre la solubilidad de ciertas sustancias, favoreciéndose la precipitación de las mismas. Una orina ácida reduce notablemente la solubilidad del ácido úrico y aumenta así la probabilidad de formación de cálculos de uratos, mientras que un pH alcalino disminuye la solubilidad del fosfato, favoreciendo la formación de cálculos mixtos de fosfatos. 3·- Anormalidades de las vías urinarias: la infección o estasis (es la detección o estancamiento, especialmente de la sangre, en alguna parte del cuerpo apareciendo los vasos dilatados y llenos de una masa de eritrocitos) de tracto urinario desempeñan un papel importante en la formación de cálculos. La infección particularmente pro microorganismos metabolizadores de la urea, eleva el pH y la concentración de amoniaco en la orina. Ambos factores favorecen la formación de cálculos mixtos de amonio y fosfatos. Las éxtasis del tracto urinario proporciona mayor tiempo par que ocurra la cristalización si existen las condiciones adecuadas. 4·- Promotores e inhibidores de la cristalización: existen determinados compuestos presentes en la orina que pueden favorecer determinados compuestos presentes en la orina que pueden favorecer o inhibir la formación de cálculos. Así ciertos cristales en solución pueden dar lugar a un aumento de la cristalización de otros solutos, mientras que otros compuestos como los pirofosfatos inhiben la precipitación y la agregación de cristales. No está claro el papel que desempeña la matriz en la formación del cálculo. Inicialmente se pensó que la mucoproteína que formaba la matriz influenciaba en su crecimiento, pero más tarde se vio que la matriz actúa como un coprecipitante inespecífico que no como una sustancia promotora de la formación del cálculo. INVESTIGACIÓN CLÍNICA Ante la sospecha de litiasis renal se realizan estudios con la finalidad de: • Determinar la etiología de la formación del cálculo. • Establecer el grado de lesión renal que pueda haber. Los estudios efectuados son de 2 tipos: 1·- Pruebas radiológicas: ~ Radiografía simple de abdomen ~ Urografía intravenosa ~ Cistografía miccional (con contraste, vaciado de vejiga) ~ Píelografía retrógrada (se introducen medios de contraste radiológicos similares a los utilizados en urografía directamente en la vía urinaria con introducción de sonda urolateral, llegando a visualizarse el riñón). 2·- Pruebas de laboratorio: se le hará: ~ Bioquímica sérica: o Calcio o Fósforo o Pruebas de función renal (urea, creatinina) o Electrolitos o Proteínas o Ácido úrico ~ Análisis de orina: o estudio del sedimento y del cultivo o pH o calcio o fosfato o ácido úrico de 24 horas o oxalato o aclaración de creatinina y cistina ~ Análisis del cálculo pueden ser: o químico o cristalografía óptica o difracción por rayos X o espectroscopia con rayos infrarrojos ANÁLISIS DE ORINA Comprenden: • determinaciones bioquímicas de parámetros urinarios. La proteinuria se presenta sólo si existe lesión tubular. Es importante el estudio del pH urinario para saber cuales son el tipo de cristales urinarios que es probable que cristalicen • pruebas de funcionalismo renal: existirá un aclaramiento de creatinina disminuido cuando se afecta a la filtración glomerular debido al calor. • estudio del sedimento: la hematuria es un hallazgo constante incluso cuando los cálculos son asintomáticos. No aparecen cilindros o son raros. Si existe excreción aparecerá leucocitos. Pueden aparecer acúmulos de células de transición (que recubre uréteres, pelvis renal y vejiga) y ello contribuye al diagnóstico de cálculos insospechados. Pueden encontrarse cristales o no. ANÁLISIS DE CÁLCULO RENAL A·- ANÁLISIS MACROSCÓPICO: las características físicas de los diferentes cálculos rara vez bastan par identificarlos, aunque ayudan en su estudio. Los cálculos pueden tener diferentes tamaño y formas, los grandes y redondeados son característicos de la vejiga y las coraliformes o asta de ciervo son características de la pelvis renal. El examen macroscópico constituyen en: ~ Lavar el cálculo para eliminar los restos de sustancias que pudiera podido arrastrar en su salida al exterior (pus, tejidos, sangre y moco). ~ Medirlo en centímetros ~ Describir sus características macroscópicas: aspecto (poroso, compacto, brillo ó no) color y forma. ~ Cortar y observar su aspecto interno, buscando cualquier cuerpo extraño que haya servido de núcleo. • Características físicas de los cálculos usuales: ~ Ácido úrico, uratos: suelen ser amarillos, rojos ó pardos. Normalmente lisos, redondeados y sin brillo. Consistencia entre moderada y dura. Tamaño pequeño y friables (que se rompen con facilidad). En ocasiones en asta de ciervos, grandes no visibles con rayos X. ~ Fosfatos y carbonatos: pálidos y frágiles. Aspecto parecido al yeso. Forma de bolas o de la cavidad que los contiene. ~ Oxalato cálcico: generalmente de color oscuro y con brillo cristalino. Muy duros. Superficie rugosa característica. Al aplastarlos aparece un polvo grisáceo. ~ Cistina: color amarillo-pardo. Tacto grasiento, aspecto de jabón. B·- EXAMEN QUÍMICO CUALITATIVO: consiste en realizar una serie de determinaciones químicas sobre laicotas de cálculo pulverizado para poner en evidencia las diferentes sustancias que lo componen. Este proceso se denomina ‘Marcha Analítica Del Cálculo’. Existen diversas técnicas, aunque generalmente se emplean kits comerciales que contiene los diferentes reactivos necesarios ya preparados. • Reactivos: NaCO3 (carbonato sódico) al 20% NaOH (hidróxido sódico) al 20% NH4OH (hidróxido amónico) al 10% Reactivo Nessler (comercial) Molibdato amónico al 3% Amino-naftol- sulfónico al 25% Este y el anterior se pueden sustituir por el reactivo comercial de fósforo HCl (ácido clorhídrico) al 10% Ácido acético al 4% Oxalato amónico al 4% Solución alcohólica de: p-nitro-benceno-azorresorcinol al 0’05% (guardar en frasco de polietileno y en lugar oscuro) Reactivo ácido úrico (comercial) Cianato sódico (NaCN) al 5% (preparar en el momento del luso) Ácido nítrico (HNO3) Nitro-prusiato sódico al 5% (preparar en el momento del uso) • Marcha analítica para el estudio del cálculo: se coloca el cálculo con una pinzas dentro de un mortero triturándolo hasta convertirlo en polvo. De este polvo se separan 4 partes (aproximadamente de 10 mg cada una; si hay suficiente) y se dispone en 3 tubos de ensayos (I, II, III) y en una cápsula de porcelana (IV) reservándose una parte que se utilizará para la investigación de sustancias, extrañas. Se realizarán las pruebas según la secuencia habitual, siempre que exista cantidad suficiente de cálculo. 1·- Prueba de los carbonatos: en un tubo de ensayo (I) con aproximadamente 10 mg de cálculo pulverizado, se añaden entre 10 y 15 gotas de solución de ácido clorhídrico al 10%. Se echa lentamente por la pared del tubo y si se observa efervescencia, la prueba de los carbonatos es positiva, debido a la formación de CO2 en el curso de la reacción. En el mismo tubo (I) se añaden 3 ml de agua destilada. Se calienta a ebullición y se deja enfriar, separándose el sobrenadante que se reparte en 5 tubos. ~ Tubo 1: Determinación del calcio: añadir 2 ó 3 gotas de ácido acético al 10% y 2 ml de oxalato amónico al 4%. Lectura de la prueba: si hay calcio aparecerá un precipitado blanco de oxalato cálcico y la prueba es positiva. ~ Tubo 2: Determinación de amonio: añadir al tubo con el sobrenadante 2-3 gotas de hidróxido sódico al 20% y 2-3 gotas de reactivo de Nessler. Si aparece un precipitado pardo anaranjado la prueba es positiva. ~ Tubo 3: Determinación de fosfato: añadir al tubo con el sobrenadante 1 ml de molibdato amónico al 3% y 0’25 ml de amino-naftol-sulfónico al 25%. Esperar 5 minutos y observar la formación de color azulado que indicará la presencia de fosfatos. ~ Tubo 4: Determinación de oxalato: añadir al tubo con sobrenadante 2-3 gotas de hidróxido sódico al 20% y 2-3 gotas de ácido acético al 10%. Mezclar y si se observa la formación de un precipitado blanco, insoluble al agitar, la prueba e positiva. Esta precipitación corresponde al oxalato sódico formado. ~ Tubo 5: determinación de magnesio: añadir al tubo con sobrenadante hidróxido amónico al 10% en exceso para neutralizar y formar hidróxido de magnesio. Una vez aquí añadir 2-3 gotas del reactivo p-nitro-benceno-azorresorcinol en solución alcohólica al 0’05%. La presencia de una coloración azul indica que la prueba es positiva. 2·- Prueba de ácido úrico (II): en el segundo tubo de ensayo con el cálculo pulverizado se añade una gota de carbonato sódico. Si la prueba es positiva se obtiene rápidamente un color azul intenso. Si el color e azul pálido el resultado se considera negativo. 3·- Prueba de cistina (III): en el tercer tubo de ensayo con el cálculo pulverizado se echa una gota de hidróxido amónico al 10% y otra gota de cianuro sódico al 5%. Transcurrido 5 minutos se añaden 2 ó 3 de nitro-prusiato sódico al 5%. La reacción positiva se reconoce por un color rojo oscuro o anaranjado. 4·- Prueba de xantina (IV): se realiza con la alicota de la muestra pulverizada en una cápsula de porcelana (IV). Para ello se añaden 2 gotas de ácido nítrico concentrado y se evapora sobre baño de vapor. Obteniéndose un residuo amarillo. Se enfría ligeramente y se añade 1 gota de hidróxido sódico al 20% formándose un color anaranjado. Se calienta ligeramente y el color anaranjado pasará a color rojo si hay xantina en la muestra. • Informe del análisis químico de un cálculo: se informa del resultado de todas las pruebas practicadas al cálculo y de la composición química deducida. Ejemplo: producto a analizar Detritus Cálculo Renal. Examen químico Carbonatos ----------------- negativo Cistina ---------------------- negativo Fosfatos -------------------- positivo Magnesio ------------------- positivo Calcio ----------------------- negativo Amonio --------------------- positivo Ácido úrico ---------------- negativo Oxalatos -------------------- negativo Resultado: detritus de fosfato amonio magnesio C·- EXAMEN POR ESPECTROSCOPIA DE INFRARROJOS (IR): mediante la espectroscopia de infrarrojos puede determinarse la composición semicuantitativa de un cálculo. Es l técnica más utilizada en la realidad en los laboratorios cuyo volumen de muestras permite l adquisición de este tipo de espectrómetros. Se trata de una espectroscopia de absorción y por tanto consiste en la determinación de la cantidad de infrarrojos absorbida por las sustancias examinadas midiendo a distintas longitudes de ondas para obtener el espectro característico de cada sustancia. El espectro de infrarrojos e un compuesto proporciona una huella única con una características que se distinguen de los modelos de absorción del resto de los compuestos por lo que puede ser fácilmente identificable por comparación con espectros conocidos. Se obtiene el espectro de absorción completo de la muestra de diferentes longitudes de ondas y se registra automáticamente en forma de gráficas sobre el papel. ETIOLOGÍA, INVESTIGACIÓN CLÍNICA Y TRATAMIENTO DE LOS CÁLCULO MÁS COMUNES A·- CÁLCULOS QUE CONTIENEN CALCIO: la precipitación de calcio en las vías urinarias está favorecida por el aumento de su concentración, y el tipo de sal formada dependerá del pH de la orina y de la disponibilidad de oxalato y fosfato. Así en el hiperparatiroidismo aparecen cálculos de calcio ya que la excreción de calcio está muy aumentada. Un aumento de la excreción de oxalato favorece la excreción de oxalato cálcico, sal muy insoluble. El pH adecuado para la formación del pH de oxalato es neutro ó más bien cálcico. El origen del aumento de oxalato en la orina puede encontrarse en la dieta ya que ciertos alimentos como espárragos, coles, manzanas, uvas, lechuga o espinacas contienen oxalato que se elimina sin transformar en la orina del metabolismo de lípidos, hidratos de carbono y proteínas. En enfermedades del intestino delgado y en individuos que ingieren grandes cantidades de vitamina C se produce también hiperoxaliuria y litiasis. Como causa muy rara del aumento del oxalato en orina está la hiperoxaliuria primaria (error congénito del metabolismo oxálico). B·- CÁLCULOS DE FOSFATO AMÓNICO-MAGNÉSICO: un pH alto favorece la formación de este tipo de cálculos junto con las de fosfato cálcico. Este tipo de calcio des muy frecuente en las infecciones urinarias crónicas por alcalinización de la orina debida al metabolismo bacteriano (infección por proteus). Son frecuentes también en personas con espina bífida y lesiones medulares. Aparecerán bacteria y leucocitos en orina. El tratamiento sería antibioterapia según antibiograma y acidificación urinaria. C·- CÁLCULOS DE ÁCIDO ÚRICO: se asocian frecuentemente a hiperuricemia favoreciéndose la precipitación por el pH ácido, aunque en un gran número de casos no se haya ninguna causa predisponente. Las posibles causas son: gota, diuresis escasa, enfermedad intestinal crónica (como una diarrea crónica) tratamiento antitumoral (quimio para una leucemia),... Estos cálculos son transparentes a los rayos X y el tratamiento adecuado sería elevar el pH urinario y evitar alimentos ricos en purina: carnes, pescado y mariscos. D·- CÁLCULOS DE CISTINA: son muy raros. En las cistinurias (error congénito del metabolismo de la cistina) la concentración de este aminoácido en la orina rebasa los límites de solubilidad y aparecen cálculos renales radio-opacos como el ácido úrico, la cistina es menos soluble a pH ácido por lo que el tratamiento consistiría en alcalinizar la orina y ralentizar el aporte de líquidos 3-4 litros/días. E·- CÁLCULOS DE XANTINA: son poco frecuentes y pueden ser debidas a un error congénito del metabolismo de la xantina con déficit de metabolización de lo mismo y presencia de xantiuria. PREGUNTAS 1·- Definición de litiasis renal. La litiasis renal son concreciones anormales presentes en el riñón ó en las vías urinarias. 2·- Clasificación de los cálculos según su composición química Cálculos que contienen calcio: oxalato cálcico ó fosfato cálcico. Cálculos de fosfato amónico-magnésico ó estruvita . Cálculos que contienen ácido úrico. Cálculos que contienen cistina. 3·- Menciona los 4 mecanismos de formación de los cálculos Aumento de la concentración urinaria de las sustancias formadoras de cálculos Cambios en el pH Anormalidades de las vías urinarias Promotores e inhibidores de la cristalización 4·- En que consiste el examen macroscópico del calcio Lavar el cálculo para eliminar los restos de sustancias que pudiera podido arrastrar en su salida al exterior Medirlo en centímetros Describir sus características macroscópicas: aspecto, color y forma. Cortar y observar su aspecto interno, buscando cualquier cuerpo extraño que haya servido de núcleo. 5·- Cálculos de xantina. Son poco frecuentes y pueden ser debidas a un error congénito del metabolismo de la xantina con déficit de metabolización de lo mismo y presencia de xantiuria. TEMA 10 TÉCNICAS DE SEPARACIÓN DE SUSTANCIAS Frecuentemente en la práctica diaria de un laboratorio de bioquímica es necesario recurrir hacia otras técnicas para poder separar unas sustancias de otras el objetivo final de dicha separación suelo ser la posterior identificación de aquello que se ha conseguido separar y también frecuentemente su cuantificación. Las técnicas más usadas actualmente para la separación de sustancias en cualquier laboratorio están basadas en los siguientes principios: • Diferencias de densidad entre las distintas sustancias: ~ Centrifugación ~ Decantación • Diferencias de tamaño: ~ Filtración ~ Diálisis • Diferencias de solubilidad: ~ Extracción • Diferencias en cuanto a carga eléctrica: ~ Electroforesis • Diferencias en cuanto a solubilidad, capacidad de absorción, absorción, etc: ~ Cromatografía CENTRIFUGACIÓN Gran cantidad de determinaciones en el laboratorio comienzan con una centrifugación de la muestra que en general va a permitir separar el material más denso o pesado del resto (sobrenadante). El aparato utilizado para ello denominado centrífuga genera un campo de fuerza tal que las partículas de material centrifugado de mayor densidad migaran más rápidamente que las de menor densidad. Lo más importante con respecto a la potencia de una centrífuga relativa que viene dada en “g” y que puede calcularse numéricamente mediante la expresión siguiente: FcR = k • r • (r.p.m.)2 k constante que depende que depende de la velocidad angular. Tiene un valor de 1’118• 10-5 r radio en centímetros entre el eje de la centrífuga y el centro del tubo que se está centrifugando. r.p.m. número de vueltas que gira la centrífuga por cada minuto. O también mediante el nomograma que relaciona la FcR con el radio en centímetros y las r.p.m. En el caso de las microcentrífugas (para centrifugar tubos capilares) se deben de alcanzar las 10.000 g. En general cuando lo que se pretende separar es suero o plasma se utilizan alrededor de 2.000 g aunque estos valores pueden ser siempre modificados según las necesidades. Para separaciones analíticas o cuando la centrífuga persigue la preparación de la muestra para posteriores analíticas pueden utilizarse las denominadas ultracentrífugas que pueden llegar a superar valores de 100.000 g. En general para una misma centrífuga la duración de la sedimentación de las partículas y su aceleración centrífuga son inversamente proporcionales de manera que si se duplica la aceleración y el tiempo de centrifugación puede reducirse a la mitad y viceversa. En el nomograma la determinación de la potencia de una centrífuga se hace mediante el uso de una regla. Se une el radio (escala de la izquierda) con el número de r.p.m. (escala de la derecha) y el punto de intersección de esta recta con la escala central nos va a indicar la potencia de la centrífuga expresada en g. FILTRACIÓN Es la separación de las partículas de un sólido del líquido con el que se encuentra en contacto mediante la utilización de un cuerpo permeable y poroso denominado filtro a través de cuyos poros pasa fácilmente el líquido (filtrado) y quedando el sólido (residuo) retenido. Los filtros más usados en el laboratorio son: • Papel de filtro • Placas filtrantes El papel de filtro se utiliza muy poco en el laboratorio químico. Presenta poros cuyo diámetro es variable y permite elegir en cada caso el más conveniente en función del tamaño de las partículas. El objetivo final de cualquier filtración es que esta sea rápida y que la retención del sólido sea total para lo cual una elección adecuada del tamaño del poro es fundamental. Cuando este tamaño es excesivamente grande el sólido atravesará el filtro mientras que si es demasiado pequeño la filtración será muy lenta. Los filtros de papel son de un solo uso y para su correcta utilización han de colocarse en un embudo adecuado. Existen filtros de papel endurecidos que por sus características presentan mayor resistencia al agrietamiento por la humedad y la acción química de ácido y bases aunque para apaliar estos problemas es recomendable el uso de las membranas filtrantes: éstas están formadas por polvo de vidrio aglomerado y normalmente están ya montadas sobre un embudo o sobre un crisol. Permiten llevar a cabo repetidas filtraciones aunque es imprescindible proceder a una adecuada limpieza cada vez que se utilizan son muy resistentes a la agresión química. Métodos de filtración: El paso del sólido a través del filtro puede realizarse por acción del a gravedad o por succión. La filtración por gravedad utiliza papel de filtro (liso o de pliegues) colocado en un embudo en posición vertical por el cual desciende el líquido por acción de la gravedad. El filtro liso es el más indicado cuando se pretende recoger el sólido tras la filtración. El filtro de pliegues aunque está comercializado puede prepararse fácilmente en le laboratorio. La filtración se lleva a cabo vertiendo a un ritmo adecuado aquello que se desee filtrar en el interior del embudo. Para evitar salpicaduras es conveniente que la varilla del embudo toque la pared interior, del vaso colector (el que recoge el filtrado). Dicha varilla ha de estar a la suficiente altura como para que se encuentre siempre por encima del nivel de filtrado. Siempre que sea posible se debe dejar reposar la muestra antes de mezclar para que las partículas sólidas se sedimenten y la filtración sea más rápida. El filtro no debe llenarse nunca hasta el borde. Cuando tras la filtración el filtrado no aparece claro hay que pensar que el filtro no tenía la porosidad adecuado. La filtración por succión utiliza como medio filtrante un papel de filtro colocado en un embudo especial provisto de una placa perforada (Büchemer) o bien una placa filtrante montada en un embudo o crisol. El embudo se ajusta perfectamente a la boca del recipiente de recogida mediante una junta de goma, la filtración se produce por succión para ello se conecta el matraz (kitasato) mediante una tubuladura lateral a una bomba de vacío como consecuencia el líquido que se encuentra en el embudo es aspirado y la filtración se produce con cierta rapidez. Es imprescindible que todas las conexiones estén bien ajustadas para evitar que entre aire en el interior del matraz, cuando se usa un papel de filtro este debe recortarse perfectamente ajustado a la medida del embudo. Al comenzar a filtrar es conveniente usar un vacío moderado para evitar que las partículas más finas puedan atravesar el filtro o bien obstruyan los poros. Finalizada la filtración es conveniente desconectar el dispositivo antes de cerrar el grifo de lo contrario es posible que entre agua y se mezcla con el filtrado. DIÁLISIS En la diálisis una bolsa o vaina con estructura de membrana semipermeable se llena con la muestra, las macromoléculas presentes en la misma quedan retenidas mientras que el líquido y las moléculas de menor tamaño atraviesan la membrana. El intercambio de material se produce por difusión y por tanto es un proceso lento. Un método para acelerarlo consiste en ejercer una presión sobre la muestra que se ha de realizar por filtración molecular. Las membranas utilizadas tienen un diámetro de poco comprendido entre 15 y 0’025 micrómetros (10-3). La filtración molecular se puede utilizar para el enriquecimiento proteico de fluidos biológicos que como la orina o el líquido cefalorraquídeo son pobres en proteínas. El agua, las pequeñas moléculas y los electrolitos presentes en ellos atraviesan la membrana mientras que las macromoléculas (especialmente las proteínas) al no poder atravesarla se van concentrando. DECANTACIÓN Es un método de separación consiste en mantener la mezcla a separar en reposo durante un cierto tiempo para que el sólido sedimente totalmente en el fondo del recipiente y posteriormente extraer cuidadosamente el sobrenadante con ayuda de una pipeta pasteur o similar por succión. Un método alternativo utilizado para el estudio del sedimento urinario consiste en inclina cuidadosamente el recipiente que contiene la muestra tras la sedimentación vertiendo líquido sobrenadante y manteniendo el sólido en el fondo. Es un método menos eficaz que la filtración. Esto última técnica cuando se realizada después de un decantación es más rápida. EXTRACCIÓN Es la separación de una o más constituyentes de una mezcla mediante un disolvente. Para conseguir una buena extracción el disolvente utilizado debe: • Tener un buen “poder separador”, es decir, ser capaz de disolver perfectamente la sustancias que se quiere extraer sin disolver las restantes. • Poder ponerse en contacto con la sustancia a extraer. Este procedimiento se utiliza en el laboratorio con cierta frecuencia para: • Eliminar impurezas de una muestra • Conseguir el enriquecimiento de ciertos compuestos químicos. Básicamente se distinguen 2 tipos de extracción: • Sólido-líquido: consiste en la separación de una o más componente de una mezcla sólida mediante un disolvente líquido y tiene lugar en 2 etapas fundamentales: 1·- El contacto del disolvente con el sólido 2·- La separación de la disolución del resto del sólido en la primera de ellas tiene lugar la separación de 1 ó más componente de una mezcla sólida mediante un disolvente líquido el proceso puede llevarse a cabo a temperatura ambiente o en caliente en cuyo caso para evitar pérdida de disolvente puede recurrirse a una ebullición a reflujo. Cuando interesa recuperar el soluto hay que completar el proceso con otra técnicas como la destilación y la evaporación. Una variante de la extracción que se utiliza para evitar el consumo de grandes cantidades de disolventes es la denominada extracción continua que mediante el empleo de una serie de dispositivos especiales permite llevar a cabo buenas extracciones con pequeñas cantidad de disolventes. Este método es muy útil cuando la sustancia que se desea extraer es poco soluble en el solvente o cuando queremos después de la extracción recuperar el soluto ya que evita tener que evaporar grandes cantidades de disolvente. Uno de los sistemas de extracción continua más utilizado es el Soxhlet (extraer grasa de los alimentos) • Líquido-líquido: la sustancia que interesa extraer forma parte de una disolución líquida y se extrae mediante un disolvente líquido para que la extracción sea efectiva el líquido extractor debe ser insoluble o muy poco soluble en la disolución. Este método de extracción está basado en la denominada ley de reparto según la cual la relación existente entre las concentraciones de un mismo soluto en 2 disolventes no miscibles que están en contacto es una constante (coeficiente de reparto). La forma más sencilla para efectuar una extracción en el laboratorio consiste en agitar vigorosamente durante unos minutos la mezcla disolución-líquida extractos en una ampolla de vidrio denominada embudo de decantación este embudo debe manejarse con las 2 manos de forma que con una de ellas se sujeta el tapón de la parte superior y con la otra se manipula la llave situada en la parte inferior. Tras la agitación de la mezcla puede producirse una sobrepresión en el interior del embudo que debe ser eliminada periódicamente durante el proceso de extracción colocándolo invertido y abriendo la llave ligeramente. Finalizada la extracción se procede a separar las 2 capas de líquido (fases) para ello se deja reposar el embudo de decantación en posición vertical el más necesario. La capa situada en la parte inferior se extrae por la llave mientras que la superior se extrae por la parte de arriba debido al pequeño diámetro del embudo de decantación a la zona cercana a la llave la separación resulta mucha más sencilla y exacta. DESTILACIÓN Es un procedimiento que consiste en la separación (por acción del calor) de un líquido volátil de una sustancia no volátil o bien de otro líquido cuyo punto de ebullición sea distinto (cuanto más diferente sea mejor será la separación) recogiendo los vapores en un recipiente apropiado tras su condensación. Se desarrolla en 2 etapas. Durante la primera el líquido alcanza su punto de ebullición y pasa a vapor en la segunda se condensa y es recogido en un recipiente diferente. La destilación se clasifica en 2 tipos fundamentales: • Simples: permite separar un líquido de un sólido o 2 líquidos cuyos puntos de ebullición difieren en más de 80ºC. Un destilador en general consta básicamente de: ~ Un matraz donde hierve el líquido ~ Un refrigerante en el que se condensan los vapores ~ Un recipiente colector en el que se recoge el líquido ya condensado. • Fraccionado: se utiliza para separar mezclas de 2 líquidos cuyo punto de ebullición es muy aproximados. Por ejemplo el agua a 100ºC y el etanol a 64’5ºC. una destilación normal no permite separarlos ya que el vapor formado contiene una mezcla de ambos. El componente más volátil de la muestra (en este caso de alcohol) se va a encontrar en mayor proporción en el vapor formado que en el líquido de manera que si el vapor condensa y hervimos este líquido en el nuevo vapor formado habrá un aumentado la proporción de alcohol. De esta manera por medio de varias destilaciones sucesivas podrían separarse ambos líquidos. Para simplificar y acelerar este proceso se pueden emplear las denominadas columnas de destilación de las cuales las más usadas en el laboratorio son: ~ Las de relleno: en su construcción pueden usarse materiales y formas diferentes. ~ Las de Vigreux: son enteramente de vidrio y presentan una serie de hendiduras que aumenta la superficie de contacto entre este y el vapor formado. TEMA 11 TÉCNICAS Y MÉTODOS INSTRUMENTALES CLASIFICACIÓN DE LAS TÉCNICAS Y MÉTODOS INSTRUMENTALES CRITERIO TÉCNICA y/o MÉTODO A) Señal detectada Radiación Emisión Espectroscopia de emisión: Ultravioleta (UV) Rayos X Visible (V) Electrónica Fluorescencia de rayos X, UV y/o V Fosforescencia de X, UV y/o V Absorción Espectroscopia de absorción X UV V Infrarrojos (IR) Resonancia magnética nuclear (RMN) Resonancia de Spin electrón (RES) Dispersión Espectroscopia Raman Turbidimetría Nefelometría Difracción Difracción de rayos X Refracción Interferometría Rotación óptica Polarimetría Dispersión rotatoria óptica Dicroísmo circular Eléctrica Resistencia Conductimetría Potencial Potenciometría Crono-potenciometría Carga Coulombimetría Corriente Polarografía Amperometría Razón masa a carga Electrometría de masas Radiactividad Análisis de activación isotópica Análisis de dilución isotópica Velocidad de reacción Cinética de reacciones Propiedad térmica Conductividad térmica Métodos de entalpía B) Tipo de medida Única Medida puntual A punto final Dos Dos medida Dos puntos Varias Variación / tiempo Cinético Directamente el analito Directos Compuesto relacionado Indirectos Presencia / ausencia Cualitativos Concentración Aproximada Semi-cuantitativos Exacta Cuantitativos C) Tipo de reactivo Enzima D) Tipo de muestra Muestra problema Muestra referencia E) Otros Enzimáticos Analítico Control de calidad Patrón Patrones Método de adicción de patrón interno Método de las adiciones Método combinado recuperación-adición Método de la recta de calibrado PARÁMETROS ESTADÍSTICOS MÁS EMPLEADOS A·- Media de la muestra: es el promedio de un conjunto finito de datos. X: media Σ: sumatorio de todos los componentes de la muestra. Siendo i = 1 N: total de la muestra B·- Desviación estándar de la muestra: Se aplica al denominador n - 1 al considerar que la muestra de un laboratorio de análisis clínico es una muestra finita, no se refiere a toda la población. C·- Desviación estándar relativa: es el valor de la desviación estándar con respecto a la X de la muestra expresado en %, ‰, etc. Si a = 2 la desviación estándar relativa se conoce también como el coeficiente de variación (C.V.%) D·- Varianza: es el cuadro de la desviación típica. Ejemplo: Explicación: Y=a+b*x b = pendiente = h/k a = blanco = 0 (de la muestra) y = averiguar (sensibilidad) x = concentración del analito (conocida) a = ya lo sabemos porque es el valor (del blanco para la muestra) que nos la da el aparato. Lo que nos falta es y, es decir, en que punto de la pendiente estamos (siempre que siga la linealidad). Siguiendo la fórmula hayamos la de la recta de adición. PARÁMETROS ANALÍTICOS MÁS EMPLEADOS Describen las características de un método, técnica ó equipo instrumental en unas condiciones determinadas son las siguientes: A·- Sensibilidad: de un equipo instrumental, técnica y/o método analítico se define como la capacidad de poder diferenciar 2 señales muy parecidas del mismo analito o lo que es lo mismo entre 2 magnitudes (concentración, actividades y/o cantidades) similares del mismo. Si se representa de forma gráfica la variación de la señal que se registra con respecto a la variación de un analito en diferentes situaciones patrón, el método, técnica o equipo instrumental más sensible es el que da lugar a una recta de calibración de mayor pendiente. Esto significa que con la misma concentración, un aparato, técnica o método de mayor sensibilidad registra una señal de valor superior y también que con soluciones de concentración muy similares es capaz de registrar una mayor diferencia de señales. La sensibilidad depende del analito del equipo instrumental, del método y de la matriz de la muestra (suero, sangre completa, orina, líquido cefalorraquídeo,...) también se define como la mínima cantidad, concentración y/o actividad que es capaz de detectar par unas condiciones determinadas de técnica, equipo y muestra. Existe un término en espectroscopia relacionado con la sensibilidad que es la sensitividad, que se define como la concentración de un analito capaz de producir una absorbancia de 0’04 (siendo la absorbancia la cantidad de radiación absorbida). B·- Límite de detección (LD): de una técnica, método y/o instrumental se define como la mínima cantidad o concentración del analito que es capaz de detectar para un nivel de confianza dado. Esta magnitud depende de la señal analítica y de la señal del blanco. Cuando la concentración del analito de la muestra biológica problema es similar al LD. Las señales obtenidas para esta muestra son del mismo orden de las del blanco. Para su cálculo se realiza una recta de adición con soluciones patrón del analito en una matriz similar a la muestra biológica (se va a analizar sueros, preparar las soluciones en suero fisiológico) y se registran al menos 20 medidas del blanco. La mayor concentración del patrón que se distingue del blanco al menos en 3 veces el valor de su desviación estándar se considera como el límite de detección. Siendo S n - 1 la desviación estándar de la muestra y b es la pendiente de la recta de adición. C·- Límite de cuantificación (LC): su valor es el de la menor concentración del patrón que se distingue del blanco al menos en 10 veces de su desviación estándar. D·- Límite de linealidad (LL): es el valor máximo de concentración para que la señal registrada por el instrumento de medida y la concentración son directamente proporcionales. Para su cálculo se realiza la recta de adición con concentración creciente del analito en las soluciones patrón, hasta que se pierde la linealidad. Al representar gráficamente la señal con respecto a la concentración se observa el valor de este límite. E·- Intervalo de concentración aplicable (ICA): el intervalo de concentración aplicable de un método y/o técnica es el comprendido entre el límite de cuantificación y el límite de linealidad. F·- Selectividad: es la capacidad de discriminación entre el analito y otras especies de la muestra. Cuanto mayor es la selectividad de un método y/o técnica analítica, menos se ve afectada por la interferencias que darían lugar a una lectura errónea del parámetro que se esté analizando. Cuando se optimiza una técnica analítica se van adaptando las condiciones de medida con la finalidad de aumentar su selectividad. Esta magnitud suele expresarse en métodos relativos como coeficientes de selectividad (C.S.) de la especie interferente (I) con respecto al analito (A). Siendo CSI,A coeficiente de selectividad de la especie interferente con respecto al analito (A). si su valor es 0 se dice que no hay interferencias en al muestra para ese parámetro o analito A. Si su valor es negativo se interpreta como que la especie interferente ocasiona una reducción de la señal con respecto a la que se obtendría con respecto a se esta especie no estuviera en la muestra, con lo que la concentración obtenidas sería errónea por defecto. Si es positiva indica lo contrario la señal obtenida es superior y la concentración es errónea por exceso. bI y bA son los valores de los respectivos puntos de la recta de adición obtenidas empleando concentraciones crecientes de la especie interferentes que se pretende evaluar y del analito. G·- La precisión: es el grado de concordancia entre diferentes medidas de analito obtenidas en pruebas analíticas realizadas en las mismas condiciones. Esta magnitud describe la reproductibilidad de los resultados. Para indicar la precisión de un instrumento, método y/o técnica es necesario explicar las condiciones exactas en las que se han realizado el análisis. Se expresa en términos de coeficientes de variación cuyo valor porcentual es el de: coeficiente de variación CV (%) = La precisión es mayor cuanto menor es el coeficiente de variación par que una técnica y/o método se considere fiable se establece unos valores óptimos de este coeficiente. A medida que la técnica y/o método presenta una mayor complicación (elevada cantidad de reactivos, difícil preparación de los mismos, largos tiempos de medida, variación de las condiciones durante el análisis, etc) o cuando la concentración del analito en la muestra es reducida, se permite coeficiente de variación superiores. Un resultado elevado de coeficiente de variación suele indicar la presencia de errores aleatorios como por ejemplo: la contaminación de un reactivo o la desviación de un pH por añadir una sustancia de forma no intencionada, etc. Pueden considerarse varios tipos de coeficientes de variaciones según las condiciones de medidas: • CV instrumental: hace referencia a la precisión-imprecisión del instrumento de medida. Se calcula realizando el análisis del mismo alícuota un número de veces mayor a 20 y detecta posibles irregularidades en el aparataje. • CV del método: se calcula preparando una 20 alícuotas de la muestra y midiendo la señal obtenida en cada una, una sola vez. • CV interdía; se calcula midiendo la señal de una alícuota cada día. Nos puede indicar la tendencia de alguna alteración en el aparataje. H·- Exactitud: es el grado de concordancia del valor de concentración ó cantidad obtenido por el analista y el valor del analito en la muestra biológica considerado como real. El valor real de la concentración del analito es conocido en el material de referencia de la misma naturaleza que la muestra problema y analizado en las mismas condiciones que esta. Hay laboratorios y/o casas comerciales autorizados que preparan estas muestras para la evaluación del control de calidad del laboratorio de análisis clínicos. Un resultado inexacto al analizar el material de referencia suele indicar la presencia de errores sistemáticos en la medida. Estos errores está definidos, tienen una causa determinada y afectan do la misma manera a los resultados. Su se repite el análisis en las mismas condiciones que cuando aparece el error. Los errores sistemáticos se clasifican en: • Errores instrumentales (propios del aparato): circuito electrónico, fugas y/o pérdidas, alteraciones del fluido, alteración del voltaje, pérdida del calibrado. • Errores personales: son fallos en la destreza y forma de trabajo del operador. • Errores del método: pérdidas del analito, alteraciones del analito, reacciones químicas y/o alteradas, inestabilidad de los reactivos, etc. Para evaluar la exactitud se establecen unos criterios en los que se indican los límites permitidos y el grado de exactitud que se considera para cada intervalo. Se emplean en adjetivos como adecuado - inadecuado, correcto - incorrecto, excelente - muy bueno - bueno regular, inexacto - exacto. Un ejemplo sería considerar los valores incluidos en el intervalo de la media y la primera desviación estándar, como correcto, muy bueno o excelente, los comprendidos entre 1 y 2 desviaciones estándar como adecuado ó buenos y los valores superiores o inferiores a la media más o menos 2 desviaciones estándar como malos, inadecuados ó incorrectos. Este intervalo se empleará a medidas que aumentan la dificultad en la técnica analítica. Para validar los resultados obtenidos en la analítica hay que refrendarlos adjuntando los valores de precisión y exactitud obtenidos al analizar material de referencia. La exactitud se expresa en términos de error, este puede ser absoluto [Ea] ó relativo [Er]. El error absoluto se expresa como una diferencia entre el valor obtenido en la analítica [X] y el considerado como el real [Xr] El error relativo se expresa como el porcentaje del absoluto con respecto al resultado real. SELECCIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO Para seleccionar el método analítico correcto de un parámetro en una muestra determinada hay que responder adecuadamente a varias preguntas y ponderar el resultado valorando la relación-efectividad-riesgo-coste de los medios que cada laboratorio dispone. Criterio de selección del método analítico: CRITERIO RELACIONADO CON A TENER EN CUENTA Analito Muestra biológica Técnica aplicada Resultado Coste Operadores Átomo, molécula Función fisiológica / patológica Intervalo de concentración Tejido y/o fluido Cantidad / volumen Interferencias posibles Procedencia y número de especimenes Aparataje/ rapidez/ facilidad-dificultad analítica Interferencias Precisión instrumental y del método Rapidez en su entrega (dificultad/ facilidad de obtención) Precisión/ exactitud exigidos, necesidad de validación Destino (particular, investigación, exposición,... Reactivos, analíticas, funcionamiento, aparataje Destreza Experiencia en la técnica MÉTODOS USUALES EN EL LABORATORIO DE ANÁLISIS CLÍNICO (LAC): Métodos analíticos más usuales en bioquímica: en el laboratorio de análisis clínicos se realizan las determinaciones de los parámetros ó analitos en las muestras biológicas que en él se reciben y procesan. Las diferentes casa comerciales preparan reactivos para que añadidos a las muestras biológicas convenientemente preparadas, en lasa proporciones adecuadas y establecidas pro ellas, permiten la determinación de la presencia/ ausencia/ cantidad/ concentración y/o actividad de los analitos, dependiendo de la sustancias que se vaya a analizar. Al unirse la muestra biológica con los reactivos comerciales, se desencadenan una serie de reacciones que dan lugar a un cambio apreciable y mesurable (medida) por el equipo instrumental gracias al cual se puede obtener información sobre la presencia- ausenciaconcentración-cantidad y/o actividad del analito. A + B + C D + E. A es la muestra (analito) B y C son reactivos con lo que su mezcla da algo diferente que es lo que va a medir. Las técnicas analíticas son los diferentes procedimientos de análisis basados en el comportamiento de la materia ante la energía (eléctrica, radiante). Esta unidad didáctica se centra en la espectroscopia, técnica que estudia el comportamiento de la materia al incidir sobre ella con energía radiante. En el laboratorio de análisis clínico los análisis más usuales suelen realizarse con un equipo de espectroscopia cuya fuente de radiación es ultravioleta y visible, es decir, con un espectrofotómetro ultravioleta y visible. La señal que registra el aparato es la absorbancia (cantidad de radiación absorbida) ó directamente la concentración. Los métodos analíticos se consideran aplicaciones de las técnicas en casos determinados, con parámetros y protocolos concretos y suelen recibir nombres que hacen referencia a alguno de los reactivos empleados (método del verde de bromocresol); a la persona que optimizó el método (método de Biuret); o a alguna característica analítica (método de las adiciones), etc. A veces se emplean indistintamente los términos método y técnica sobretodo en análisis de rutina. Los métodos pueden clasificarse en varios grupos dependiendo del criterio empleado. A·- Según el desarrollo de la reacción: • Método a punto final: la reacción entre la muestra y los reactivos se produce hasta el final, es decir, se agotan A, B y/o C y se forma D y/o E. En las determinaciones con reactivos comerciales suele haber exceso de reactivos para asegurar que el parámetro (analito) reaccione en su totalidad en las condiciones de temperatura, pH, tiempo, etc indicados en su protocolos. La concentración del parámetro es directamente proporcional a la concentración de alguno de los productos formados en la reacción bien de forma directa, variación en la estructura del parámetro al unirse con algún reactivo; o bien de forma indirecta al aparecer o desaparecer algún compuesto mesurable por la presencia del parámetro de la muestra biológica. La ley de Lambert-Beer se cumple generalmente en las condiciones establecidas por el protocolo comercial. En caso de no cumplirse se dan instrucciones que adecuadas de dilución de la muestra y el factor de corrección para que se encuentre dentro del rango lineal. A=•b•c A = absorbancia = cantidad de radiación absorbida igual a la concentración a = = absortividad = absorción de una solución de concentración de 1 mol/l a una determinada longitud de onda y un espesor de cubeta de 1 cm. Es una magnitud característica de cada sustancia y su valor está tabulado para unas condiciones de pH, longitud de onda, temperatura., disolvente previamente establecidos. b = trayecto óptico = su valor está estandarizado en 1 cm. Es la longitud de la muestra que atraviesa la radiación cuando esta se encuentra depositada en una cubeta. Es una medida estandarizada para todos los espectrofotómetros. c = concentración de la sustancias ó analito = suele expresarse en moles/l (con la absortividad molar) o gr/l )absortividad). Por lo tanto = coeficiente de extinción molar si c = moles/l. = coeficiente de extinción si c = gr/l. Para la determinación de la concentración problema (la del parámetro) se suele emplear una solución acuosa patrón del mismo parámetro, de concentración conocida e indicada por la casa comercial. Si aplicamos la ley de Lambert-Beer para la solución patrón y para la muestra problema: Apt = • b • cpt y Apr = • b • cpr. Como el valor de es el mismo y b es igual a 1 cm en las 2 ecuaciones, si se divide y se despeja el valor de la concentración del parámetro en la muestra se obtiene que este valor es: • Métodos cinéticos: se mide la velocidad de la reacción antes de que esta concluya. Es muy importante mantener las condiciones de la reacción descritas en los protocolos comerciales sobre la temperatura, tiempo de medida, etc, para garantizar la fiabilidad de los resultados. En estas determinaciones analíticas la absorbancia no es directamente proporcional a la concentración del parámetro biológico en la muestra problema. Es la variación de la absorbancia durante una unidad de tiempo establecida lo que es proporcional a la concentración y/o actividad del parámetro. Esto es debido a que la presencia del parámetro en la muestra va a dar lugar a la aparición o desaparición de sustancias capaces de absorber la radiación a la longitud de onda de medida. La presencia del parámetro, incluso es a veces el mismo parámetro biológico el que varía por acción de los reactivos. La ley de Lambert-Beer que se aplicará en estos caso queda modificada o adaptada como A = • b • c. Siendo la letra griega delta la que representa la variación de la magnitud que viene a continuación, en este caso la absorbancia (A también se llama extinción (E) ó densidad óptica (DO)) por lo que también se expresa como A = DO. Generalmente se toma el minuto como la unidad de tiempo de medida de la DO por lo que se expresa DO/minuto = • b • c. Al ser b, 2 valores constantes se expresa su producto como un factor numérico su producto como un factor numérico que a menudo lo proporciona las casas comerciales de tal manera que la concentración del parámetro la expresaríamos como DO/min = e • b • c La reacción que da lugar a una variación de la absorbancia se desencadena al añadir los reactivos a la muestra biológica convenientemente preparada y con las condiciones de reacción controlada. A mayor concentración del parámetro biológico mayor será la variación de la absorbancia en la unidad de tiempo. En el caso de que el parámetro sea una enzima y que lo que se esté determinando sea su actividad enzimática la DO en la unidad de tiempo será directamente proporcional a su actividad. B·- Según algunas características de la reacción: • Métodos colorimétricos: se denomina así las determinaciones analíticas que se miden empleando por dentro del visible. También se pueden llamar así haciendo referencia a un tipo de reactivos los ‘cromógenos’ que son sustancias coloreadas o capaces de formar compuesto colorados y que por lo tanto absorben el visible. Estos compuestos pueden: 1·- Unirse al parámetro y formar un compuesto coloreado. 2·- Aparecer en el medio como consecuencia de la existencia del parámetro (se genera en el medio de la reacción a causa de la presencia del parámetro buscado). 3·- Desaparecer a causa del parámetro. En cualquier caso la intensidad de color o su variación es directamente proporcional a la concentración del parámetro a determinar. Para determinar la concentración se pueden emplear patrones acuosos y la siguiente expresión: Ya que suelen ser generalmente reacciones a punto final y aunque a veces también pueden ser reacciones colorimétricas y cinéticas. • Métodos enzimáticos: son aquellos métodos analíticos en los que algunos de los reactivos son enzimas. No tienen porque ser métodos donde lo que se mida sean actividades enzimáticas. El enzima añadido como parte de los reactivos al unirse al parámetro desencadena una reacción que permite su determinación bien con la aparición de un compuesto coloreado (reacción a punto final), o bien por D/ut (método cinético. C·- Otros métodos usuales en el laboratorio de análisis clínico: • Método de la curva o recta de calibración: se produce in vitro una reacción química en la que participa el analito, bien puede ser una reacción fisiológica o bien otro tipo de reacción basado en alguna propiedad física ó química para ello se dispone de diferente soluciones patrón de cantidad, concentración ó actividad conocida del analito y se desencadena esta reacción con cada uno de los puntos. Los valores de los estándares don del orden de los que normalmente se encuentran en las muestra biológicas para los parámetros o analitos estudiados. La matriz de las soluciones estándar a de parecerse lo más posible a la matriz biológica de la muestra, por ejemplo: si el analito se encuentra en el suero se prepara los estándares en suero fisiológico. Se representa la señal detectado (eje de ordenadas ó variable dependiente Y)con respecto a la magnitud conocida de las soluciones patrones (eje de abscisas ó variable dependiente X) y así queda registrado el comportamiento del ante la escala de valores. Entre la señal y la magnitud (concentración) existe una relación directamente proporcional cuya representación se aproxima a una recta aunque también, este método, se conoce como el de la curva de calibración porque no es un relación lineal para todos los rangos de concentraciones sino que cuando la magnitud analizada alcanza valores elevados se pierde la linealidad. Debidos a los errores aleatorios no sigue exactamente una relación lineal como ocurriría en una representación teórica. La ecuación de la recta es y = a + b • x, siendo a el origen de coordenadas, y b la pendiente de la recta. Cuando se analicen la muestras problemas se provoca una reacción idéntica a la realizada con los patrones y se emplean los mismos reactivos. Para calcular la cantidad , concentración ó actividad del analito, se interpola (intercala) la respuesta del parámetro a analizar en la recta gráfica de calibrado ó en la ecuación del recta y así se encuentra la magnitud buscada que es x. Siempre que se disponga de los reactivos con los que se ha elaborado la recta, puede emplearse los datos obtenidos en la gráfica o registrados en el ordenador del equipo instrumental. La preparación de las solución estándares es laboriosa pro lo que sólo tiene sentido el empleo de este método si el volumen del trabajo a realizar es elevado; si hay que analizarse muchas muestras. • Método de la adicción de patrón: se emplea cuando existe un gran número de variables que pueden interferir en el análisis y/o para comprobar que la determinación no existen pérdidas de analito ni contaminaciones con otras sustancias diferentes a él que daría lugar a resultados erróneos por exceso o por defecto respectivamente Para ello se añade tanto a las muestras problemas como a las soluciones estándares una cantidad conocida del analito (solución patrón). La relación entre la señal obtenida por el analito sin adición y la obtenida tras la adición interno se utiliza para el cálculo de la magnitud a analizar. Para comprobar si existe pérdida o contaminación del analito se realiza un ensayo de recuperación de la cantidad añadida. Si se conoce es recomendable añadir una cantidad 3 veces mayor al intervalo de concentraciones que se espera encontrar en la muestra problema. Se analiza la muestra adicionada, la muestra sin adicional y el blanco. Para calcular el porcentaje de patrón añadido se aplica la siguiente expresión: Recuperación (%) = 100 MA = concentración del analito en la muestra adicionada MX = concentración del analito en la muestra SIN adicionar. Mad = concentración añadida del analito • Método de las adiciones: se aplica cuando existe interferencias de matriz (fluido biológico que contiene el analito, suero, orina, sangre completa) ó cuando la concentración del analito es bastante pequeña. Para ellos se añade a varias alícuotas de la muestra problema una cantidad conocida de un patrón del analito preparando la muestra sin adicionar añadiendo la misma cantidad de agua que en el patrón se añadía en el resto de las muestras. Se registra la señal de cada muestra y se calcula la recta de adiciones cuya expresión será y = a + b • x donde b es la pendiente de la recta x es la concentración del analito y es la señal registrada (absorbancia) y a ese el origen de coordenadas. La concentración del analito en la muestra se calcula despejando el valor de x. Las clasificaciones no son excluyentes sino que permite la descripción más detallada del método analítico como se muestra en el siguiente cuadro (fotocopia). TEMA 12 CROMATOGRAFÍA DEFINICIÓN Conjunto de técnicas de separación que se basa en los diferentes afinidades de los componentes de una mezcla por 2 fases diferentes una móvil y otra estacionaria. La fase móvil es un fluido, líquido ó gas en el cual están disueltos los solutos que se van a separar y la fase estacionaria (líquido ó sólida) es el lecho a través del cual va a fluir la fase móvil. Los componentes de la mezcla se desplazarán a diferentes velocidades según su mayor ó menor afinidad por la fase estacionaria: a menor afinidad mayor velocidad y viceversa. A consecuencia de esta diferencias de movilidad las distintas sustancias que componen la muestra se separan en una serie de bandas que pueden ser analizadas tanto cualitativamente como cuantitativamente. Las ventajas de la cromatografía como métodos de separación de sustancias son las siguientes: gran rapidez, simplicidad, coste moderado, tiene gran aplicación como método de separación y la posibilidad de proporcionar resultados cuantitativos. CLASIFICACIÓN 1·- Según el estado físico de la fase móvil Cromatografía líquida LC • Líquido (fase móvil) Líquido (fase estacionaria) (Cromatografía de reparto) • Líquido (fase móvil) Sólido (fase estacionaria) (Cromatografía de adsorción) • Intercambio iónico • Exclusión por tamaño Cromatografía gaseosa GC • Gas (fase móvil) líquido (fase estacionaria) • Gas (f móvil) fase enlazada (son especies orgánicas enlazadas a una superficie sólida • Gas (fase móvil) sólido (fase estacionaria) Cromatografía de fluidos supercríticos • Fase móvil es un fluido supercrítico y la fase estacionaria son especies orgánica enlazadas a una superficie sólida. • Los fluidos supercríticos son compuestos con densidades, viscosidades y otras propiedades intermedias entre las de unas sustancias en estado gaseoso y el líquido. • Propiedades es una técnica híbrida ente la cromatografía de g as y la líquida se realiza en columna se analizan compuestos que no pueden ser analizados ni por cromatografía de gas ni por cromatografía de líquidos, compuestos no volátiles a los que no se le puede aplicar cromatografía de g as y compuestos que no poseen grupos funcionales que hacen posibles aplicar cromatografía de líquido. 2·- Según la disposición de la fase estacionaria: Cromatografía plana: la fase estacionaria se encuentra extendida en una superficie plana. Cromatografía en papel: la fase estacionaria es agua retenida entre las fibras de celulosa de una hoja de papel. Cromatografía en capa fina: el soporte es una capa fina de un material porosos extendido sobre una placa de vidrio, plástico o metal (por lo que fluye la fase móvil por capilaridad). Cromatografía en columna: la fase estacionaria se encuentra empaquetada en el interior de un tubo de longitud y diámetros variables. 3·- Según el tipo de interacción entre fase estacionaria y los componentes que vamos a separar (fase móvil): Cromatografía de adsorción: retención inespecífico de moléculas sobre un sólido. Cromatografía de reparto: los solutos se separan por su diferente solubilidad ente una fase móvil y una fase estacionaria inmiscibles (no solubles) entre sí. Cromatografía de intercambio iónico: la separación se basa en la interacción electrostática entre grupos ionizables de los componentes de la mezcla y de los grupos cargados de la fase estacionaria por tanto se separan en base a la diferencia en cuanto al signo y magnitud de sus cargas. Cromatografía de penetrabilidad ó filtración en gel ó exclusión molecular: los diferentes componentes se separan en función de su forma y tamaño. Cromatografía de afinidad: la separación se basa en interacciones específicas entre 2 moléculas. Ejemplo: antígeno-anticuerpos. CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN Normalmente se realiza en columna que se llene de la sustancia adsorbente adecuada las sustancias a separar en la parte superior de la columna. Los diferentes disolventes que van pasando a lo largo de la columna separan los diferentes componentes de la muestra. Tras la cromatografía cada componente va a salir de la columna en momentos diferentes pudiendo así ser separados (Elusión: es el paso de la fase móvil hasta la salida de los solutos). Los adsorbentes más usados son albúmina, sílice y carbonato cálcico (CO3Ca) y los disolventes más usados son éter de petróleo tetracloruro de carbono (Cl4C), éter etílico, acetona, benceno, metanol, etanol y agua. La utilidad más importante es la separación de diferentes sustancias en orina por ejemplo las catecolaminas. CROMATOGRAFÍA DE REPARTO Permite separar sustancias en base a la diferente distribución (diferente solubilidad) de estas en una fase orgánica y en una fase acuosa. Puede realizarse: en papel, en capa fina o en columna. La cromatografía en papel es fundamentalmente una técnica de reparto líquido-líquido en la que el agua suele actuar como fase estacionario y distintos disolvente orgánicos como fase móvil. Se define como Rf (factor de retención ó coeficiente de reparto) como el coeficiente (entre la distancia recorrida más dicha sustancia y la distancia recorrida por el frente cromatográfico, es característico de cada sustancia y varía con la temperatura, pH del medio y cantidad de muestra aplicada. CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO Están basadas en las interacciones electrostática entre grupos ionizables de las sustancias a separar y grupo cargados unidos a un soporte inerte (Resina). Los cambiadores iónicos (resina) son sustancias insolubles que contienen grupos cargados unidos covalentemente a iones móviles de signo contrario que neutralizan los grupos fijos., Estos móviles pueden intercambiarse de forma irreversible con otros iones de la misma carga. Los cambiadores tanto catiónicos como aniónicos pueden ser fuertes o débiles. El mecanismo de acción de esta cromatografía es la unión reversible entre los compuestos o separar y los cambiadores de manera que una vez introducidos en la columna los diferentes componentes se quedan más o menos retenidos dependiendo de la interacción con los cambiadores presentes en la columna. A continuación se introduce un tampón a pH adecuado que va a permitir que las sustancias separadas y retenidas se liberen de la unión con el cambiador y salgan ya separadas de la columna. La utilidad de este método es la aplicación bioquímica para la separación de aminoácidos, péptidos, proteínas, nucleótidos y en general para compuestos de naturaleza iónica (hemoglobina, isoenzimas,...) CROMATOGRAFÍA DE PENETRABILIDAD Se separar las sustancias en función de sus forma y tamaño. La fase estacionaria es un gel (polímero anhidro deshidratado, muy hidrófilo) que se hincha al sumergirlo en agua o en solución electrolíticas. La fase móvil es agua o cualquier solución electrolíticas La elusión o salida de las sustancias de la columna sólo depende de la forma y tamaño y es independiente del eluyente o fase móvil utilizado, de su pH y de su fuerza iónica. Una vez introducidas en el gel cuanto menor, sean las moléculas de la sustancia que separan más tardarán en salir de la red y por tanto diluirán más tarde. Utilidad: separación de sustancias de peso molecular elevado (por ejemplo péptidos, proteínas polisacáridos o también purificación de ciertas sustancias). ANÁLISIS CUALITATIVO A nivel cualitativo la cantidad de información obtenida a partir de una cromatografía es limitada: obtenemos datos de tiempo de retención y datos de posición de la sustancia en la fase estacionaria tras la evolución; comparadas con otras técnicas como la espectroscopia de masa o la resonancia magnética nuclear. La cromatografía es una técnica muy usada para detectar la ausencia de determinados componentes en mezclas con un número limitado de compuestos de los cuáles se conoce una determinada sustancia no quiere decir que esté ausente si no que puede estar presente a una concentración menor al límite de detección del sistema utilizado. ANÁLISIS CUANTITATIVO Las técnicas cromatográficas pueden también proporcionar: • En cromatografía plana el área cubierta por las sustancias separadas sirve como parámetro para el análisis cuantitativo. • En cromatografía en columna se usa la altura o área de los diferentes pocos obtenidos al compararlos con determinaos patrones. El método más senillo es someter a una cromatografía, una serie de diluciones obtenidas a partir de un punto cuya composición es similar a la de la muestra problema. Seguidamente se obtienen los cromatogramas de los diferentes patrones y se representan gráficamente las alturas o áreas de pico en función de la concentración. La representación de los datos deben dar una línea recta que pase por el origen de coordenadas. Los análisis cuantitativos están basados en la gráfica así obtenida. CROMATOGRAFÍA PLANA Integra un conjunto de técnicas en que la fase estacionaria se encuentra extendida en una superficie plana y la fase móvil líquida se desplaza por capilaridad o adsorción. Destacan la cromatografía en papel (PC) y cromatografía en capa fina (TLC Thin Layer Chromatography). • Cromatografía en papel: es esencialmente una cromatografía de reparto en donde la fase estacionaria es el agua retenida entre las fibras de celulosa de una hoja de papel y la fase móvil suele ser un disolvente orgánico o bien una mezcla de disolventes, es por tanto una cromatografía líquida-líquida. La técnica consiste: ~ Aplicación de la muestra (1 gota de forma que el diámetro de la muestra no sobrepase los 5 ml) sobre el papel sobre un extremo de este con un capilar o una micropipeta. Esperas a que se seque. Las características del soporte del papel influyen decisivamente en la velocidad de desarrollo y por tanto en la eficacia de la separación. ~ Una vez seco introducción del soporte (tira de papel) en una cámara que consiste en una cubeta de vidrio bien cerrada que contiene el eluyente ó líquido de desarrollo y en posición vertical. ~ Se deja que fluya el eluyente por capilaridad a través de la tira de papel, arrastrando a su paso los componentes de la tira de la muestra. Dichas componentes se irán separando en función de reparto entre las 2 fases de forma que en sustancias muy solubles en el líquido de desarrollo se moverán libremente con este mientras que las que sean muy solubles en agua quedarán retenidas. ~ Cuando el solvente a alcanzado el frente del papel se quita la tira de la cámara y se deja secar. Se marca el nivel exacto alcanzado por el solvente o eluyente. ~ Las sustancias separadas se detectan mediante el revelado: bien directamente si son coloreadas ó bien por algún método de detección que las haga visibles (físicas ó químicas). Los diferentes solutos habrán avanzado más ó menos según su coeficiente de reparto la distancia avanzada se mide en relación con la distancia avanzada por el frente del soluto este número que expresa esta distancia es Rf. Este número Rf es característico para cada soluto para unas condiciones de trabajo constante y sirven por tanto para la identificación de sustancia (análisis cualitativo). Este Rf está condicionado por varios factores: ~ La composición del líquido en desarrollo ~ La temperatura de realización de la técnica cromatográfica ~ Características del soporte (papel) usado (grosor, tamaño del poro,...) La elección del líquido de desarrollo es fundamental para obtener una buena separación y esta va a depender de la naturaleza de las sustancias que se desean separar, así: ~ Para separar compuestos polares se usan eluyentes con agua. ~ Para sustancias poco polares eluyentes no acuosos. Para determinaciones cuantitativas usamos fotometría y comparación con patrones. El revelado de las manchas se pueden realizar por métodos físicos y químicos. Los métodos físicos consiste en pulverizar una sustancia fluorescente (fluoresceína) sobre el soporte de papel de manera que al iluminarlo con una fuente de luz ultravioleta se observan las diferentes manchas oscuras sobre un fondo fluorescente. Los procedimientos químicos más usados consiste en pulverizar el soporte de papel con agentes reveladores que dan reacciones coloreadas con los diferentes componentes de la muestra problema. Podemos usar 2 sustancias: ~ Ninhidrina al 0’25% en acetona (ó bien al 3% en etanol): para revelado de aminoácid ~ Nitrato de plata amoniacal ó ftalato de anilina al 2’5% en butanol para el revelado de azúcares. En los tipos de cromatografía en papel el proceso puede desarrollarse de 3 formas: ~ Ascendente: el eluyente sube por el soporte. ~ Descendente: el papel se mantiene colgado de la parte superior del recipiente y el eluyente va descendiendo. ~ Bidimensional: consiste en ejecutar una segunda cromatografía girando el papel 90º y empleando un disolvente diferentes de forma que sustancias que en una primera separación quedaron muy juntos se podrían separar en el segundo proceso. • Cromatografía en capa fina: en este tipo de cromatografía el soporte es plano y consiste en una cromatografía de un material poroso extendido sobre una placa, vidrio, plástico ó metal por el que fluye la fase móvil por capilaridad. Es un técnica de reparto en la que también son muy importantes las interacciones por adsorción. El material poroso puede ser: ~ Gel de sílice ó silica-gel ~ Celulosa ~ Poli amida ~ Gel de óxido de aluminio ~ Gel de silicato magnesio La aplicación de muestras y el desarrollo cromatográfico es similar a la cromatografía en papel con la salvedad de que siempre es ascendente. Frecuentemente se usa la técnica tridimensional combinando 2 sistemas distintos de disolvente. La cromatografía en capa fina Eq-100, es una técnica más rápida y sensible que la cromatografía en papel y se usa para separar sustancias de bajo peso molecular (aminoácidos, lípidos, e carbohidratos). La elusión de los componentes se realiza mediante raspado de las distintas manchas en el soporte y posterior extracción con disolventes adecuados. Una vez extraídos se procede a su identificación y cuantificación. CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA Los métodos en columna se emplean para varios tipos de cromatografía tanto en cromatografía líquida como gaseosa, tanto en fase estacionaria líquida como sólidos. Los mecanismos en virtud de los cuales se produce la separación son de diferentes tipos ~ Adsorción ~ Reparto ~ Intercambio iónico En este método de cromatografía la fase estacionaria se dispone como el relleno de un recipiente cilíndrico abierto por varios extremos y de longitud y ancho variable que se denomina columna, este relleno denominado también lecho cromatográfico puede ser la propia fase estacionaria o ir asociada a un líquido que constituye la fase estacionaria. La fase móvil es un solvente que se hace pasar a través de la columna o bien un gas. El flujo de la fase móvil puede estar propiciado por la acción de la gravedad (sería una cromatografía convencional) ó bien por un sistema de bombeo de alta precisión (Sería una HPLC). La muestra se deposita sobre la parte superior del lecho cromatográfico se abre la columna por el extremo opuesto y se deja que vaya fluyendo hacia el interior del lecho. Antes de que se seque se añade nueva fase móvil y se continúa así hasta el final del proceso. El eluido es fraccionado en tubos de ensayo de forma que se obtiene distintas fracciones de fase móvil que contiene concentraciones elevadas de los distintos solutos. El desplazamiento de los diferentes componentes de la muestra solo puede ocurrir en la fase móvil y por tanto la velocidad de emigración va a depender del tiempo que cada componente permanezca en esta fase. Esta fracción de tiempo de tiempo va a ser pequeña para aquellas sustancias que son retenidas fuertemente por la fase estacionaria y viceversa. En cualquier caso la diferencia de velocidad de los diferentes componentes va a permitir su separación, objetivo final de la cromatografía. Como detector debe ser utilizado aquel que sea capaz de identificar cada una de las fracciones de la muestra. Si la señal recogida por el detector es representada en función del tiempo se obtiene una gráfica (registro ó cromatograma) donde aparecen una serie de picos que pueden ser utilizados tanto par el análisis cualitativo como cuantitativo La composición de la fase móvil puede ser constante o variar (mezcla de uno ó más eluyentes en gradiente continuo o discontinuo). Para que la columna pueda ser reutilizada hay que regenerarse después de cada uso para que no queden restos de la separación anterior. Normalmente se mantienen refrigeradas entre 2-4ºC. CONCEPTOS TEÓRICOS IMPORTANTES Volumen de retención (VR) ó volumen de elusión (Ve): es el volumen de fase móvil que ha de pasar a través de la columna para que eluya un soluto determinado. Este volumen está relacionado con la constante de distribución Kd. Vm = Vo = volumen de exclusión o volumen vacío = es el volumen de fase móvil requerido para eluir un compuesto sin afinidad por la fase estacionaria. Kd = constante de distribución. Tiempo de retención (TR): es el tiempo al que un soluto sale eluido. El tiempo tomado como referencia será aquel al que salga eluida una sustancia no retenida en la fase estacionaria. VR = TR • F F = velocidad de flujo de la elusión (ml/minuto) VR y TR: son específicos para cada sustancia en condiciones de trabajo constantes por tanto sirve para determinar las sustancias. Selectividad (): es el factor que describe la capacidad de separar 2 solutos. Es la relación entre los coeficientes de distribución de los 2 solutos en estudio. En la separación entre 2 sustancias se busca que sea lo mayor posible y normalmente que sea mayor que 1. Resolución: capacidad del sistema para que las sustancias queden separadas lo mejor posible. En el cromatograma obtenido tras la elusión y lectura de las fracciones éstas nos aparecen en picos sucesivos correspondiendo cada pico a una sustancia. En el cromatograma se mide: ~ La distancia a la que aparecen los picos desde un punto de referencia (inyección de la muestra). Las distancias pueden ser medidas como VR y TR. ~ El ancho de la base de cada pico que se mide en las mismas unidades que la anterior. La resolución se calcula como: Para considerar que una separación cromatográfica es buena se requiere un valor de resolución mayor de 1’25. CROMATOGRAFÍA DE PENETRACIÓN Es un tipo de cromatografía líquida. La fase móvil es líquida y la estacionaria es sólida. Se realiza en columnas. El soporte son microesferas formadas por enrejado de un polímero (agarosa, dextrano, poliacrilamida y metacrilato) que pueden tener diferentes tamaños de poros. Los huecos o porros de estos enrejados tendrán un tamaño determinado por la concentración de fibras y el grado de entrecruzamiento de las mismas, seleccionando el más adecuado al tipo de separación y deseamos realizar. El fundamento de separación es el tamaño molecular y puede influir la forma de la molécula: la solución da las sustancias a separar es introducida en la columna de manera que aquellas cuyo tamaño sea superior al poro del soporte pasan sin ser retenidas y aquellas que tienen un tamaño menor que el porto penetran en el gel y son retenidas siendo eluidas más tarde. Aplicaciones: ~ Purificación de macromoléculas biológicas (virus, proteínas,...) ~ Determinación de pesos moleculares. ~ “Desalado” de muestras: la separación de solutos de las sales que las acompañan. CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO Es un tipo de cromatografía líquida. La fase móvil es líquida y la estacionaria es sólida. También se realizan en columnas. En este tipo de cromatografía la fase estacionaria denominada resina de intercambio iónico tiene grupos cargados que interaccionan con iones de signo contrario de la fase móvil por tanto las sustancias se separan en base a las diferencias entre el signo y al magnitud de sus cargas. Si la resina poseen grupos cargados positivos se denominan resinas intercambiadores de aniones. (resinas+ Cl- intercambiadores de aniones). Si son negativos serian resinas intercambiadores de cationes ( resinas- Na+). Las resinas intercambiadoras de aniones tienen sus grupos cargados unidos a contraiones (Cl- / Na+ / Ca+2) de forma que el conjunto sea eléctricamente neutro. Los solutos ionizados se intercambian con los contraiones así: Las variantes más importantes a considerar en vistas a controlar el equilibrio de cambio de ión son: ~ pH del eluyente: ya que altera la carga del soluto modificando la posición del equilibrio anterior desplazándolo hacia la izquierda o derecha según se adquiera más ó menos carga. ~ Fuerza iónica del eluyente que también puede desplazar el equilibrio anterior. Aplicaciones: ~ Primeras etapas de purificación de biopolímeros. ~ Separación de proteínas y nucleoproteínas ~ Análisis de aminoácidos CROMATOGRAFÍA DE GASES En esta técnica de separación la muestra se volatiliza y posteriormente es inyectada en una columna cromatográfica. El proceso de elución es llevado acabo por la acción de un gas inerte (fase móvil) cuya única función es la de transportar la muestra a través de la columna. En función de la naturaleza de la fase estacionaria la cromatografía de gases puede ser: ~ Cromatografía gas-líquido (GLC) ó cromatografía de gases ~ Cromatografía gas-sólido (GSC) La cromatografía gas-sólido (GSC) necesita una fase estacionaria sólida en la cual mediante la adsorción física son retenidos los diferentes componentes de la muestra problema. Su aplicación bastante limitada se reduce a la separación de ciertas sustancias gaseosas de bajo peso molecular. La cromatografía gas-líquido o de gases (GLC) es ampliamente utilizada y está basada en la distribución de la muestra entre una fase móvil gaseosa y una fase líquida retenida sobre la superficie de un sólido inerte. Actualmente dada su gran utilidad existe una gran variedad de quipo de cromatografía de gases y todos cuentan con: ~ Un soporte informático que permite el control automático de la mayor parte de los parámetros que de una forma y otra pueden influir en el desarrollo cromatográfico. “Una tecnología que permite un alto grado de rendimiento a coste moderado. ~ Unas columnas capilares capaces de separar gran cantidad de sustancia en un tiempo relativamente corto. De todos los componentes básicos de un cromatógrafo de gases destacan por su importancia los siguientes: El gas portador El sistema de inyección de la muestra La columna de desarrollo Sistema de detección El gas portador debe de ser químicamente inerte y su elección debe estar determinado por el tipo de detector utilizado en cada caso. Debe ser administrado a la presión indicada y estar libre de agua e impurezas. Los gases más usados son: helio, nitrógeno, hidrógeno y dióxido de carbono. El tamaño de la muestra y la forma que esta es introducida en al columna determina en gran parte la eficacia del proceso. Concretamente la inyección lenta de muestras demasiado grandes da lugar a bandas anchas y por tanto a una deficiente resolución en el proceso de separación. El sistema más usado para la inyección de la muestra consiste en la utilización de una microjeringa aplicada a la cabeza de al columna. El volumen de muestra inyectado depende del tipo de columna usado (ordinaria ó capilar). Cuando la columna es capilar el volumen de muestra requerido es tan pequeño que se utiliza un “divisor” que únicamente deja pasar a la columna una pequeña parte de la muestra y deshecha el resto. Podemos utilizar 2 tipos de columnas de desarrollo: columna de relleno o empaquetadas y columnas capilares o tubulares abiertos. Columna de relleno Diámetro interno 2-4 mm Longitud 1-6 m Tamaño muestra 10-106 ngr Presión relativa Alta Velocidad relativa Lenta Material de fabricación Vidrio, sílice fundido, acero Forma Helicoidal Columna de capilares 0’1-0’75 mm 10-100 m 10-10000 ngr Baja Rápida inoxidable y teflón Helicoidal Aunque las columnas de relleno han sido muy usadas hoy por su gran rapidez y eficacia las columnas capilares las han desplazado. Un detector ideal para la cromatografía de gases debería reunir al menos las siguientes características: ~ Adecuada sensibilidad ~ Buena estabilidad ~ Gran reproductibilidad (repetir resultados) ~ Amplio margen de temperatura de trabajo posible (Desde temperatura ambiente hasta 350ºC) ~ Reducido tiempo de respuesta independientemente de la cantidad de muestra detectables. ~ Alta fiabilidad ~ Fácil manejo ~ No destruye la muestra Los detectores más utilizados son: ~ De ionización de llama: son los más usados y los más útiles ~ De conductividad térmica: de los primeros en usarse pero hoy no tienen gran utilización ~ Termoiónicos: son selectivos de los compuestos que contiene fósforo y nitrógeno ~ De captura electrónica: son de respuesta selectiva muy sensible a los compuestos que contiene grupos funcionales electro-negativos (halógenos, peróxidos, insecticida clorados) e insensibles a grupos funcionales tipo aminas, alcoholes e hidrocarburos. ~ De emisión atómica: son los más recientes y están basado en la espectroscopia de emisión atómica. Aplicaciones: es inmejorable para muestras orgánicas complejas compuestos órganometálicos y sistema bioquímicos. Para el análisis cualitativo puede recurrirse a TR ó VR. Para el análisis cuantitativo se usan los picos ó áreas del cromatógrafo obtenidos. CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDO DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC) Constituye la forma más eficaz de llevar a cabo el proceso cromatográfico. La fase móvil se bombea a través de la columna bajo una presión elevada. Lo que la caracteriza es su elevada resolución que se traduce en picos de elusión estrechos. En este tipo de cromatografía la fase estacionaria está mucho más finamente dividida y a de estar formada por partículas de mayor rigidez mecánica para evitar que se deformen o rompan a someterlos a elevadas presiones. Las columnas utilizadas son de acero inoxidable si las presiones son elevadas. En este tipo de cromatografía pueden realizarse los diferentes tipos de cromatografía vistas. CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD Este tipo de cromatografía la separación se basa en al funcionalidad biológica de las moléculas. La mayor parte de las funciones biológicas son el resultado de interacciones muy específicas entre 2 biomoléculas por ejemplo hormona-receptor, antígeno-anticuerpo. En este tipo de cromatografía el soporte cromatográfico (Agarosa) se ancla covalentemente uno de los componentes de tales sistemas biológicos (por ejemplo anclar el antígeno). Si el segundo componente viaja en la fase móvil (anticuerpos) y ambos están funcionalmente activos se producirá su función específica, es decir, su retención en al columna, de esta forma se pueden purificar biomoléculas a partir de mezclas muy complejas ya que la mayoría de los solutos pasarán de largo y podrán ser lavados de la columna. Para la elusión del componentes retenidos pueden utilizarse eluyentes específicos (alterando la fuerza iónicos del eluyente, el pH ó la temperatura) Agarosa-antígeno mezcla (Ac) agarosa-antígeno-anticuerpo eluyente ↓ TEMA 13 ELECTROFORESIS Se define como electroforesis aquel proceso en el cual las especies cargadas (iones ó partículas coloidales) se separan en función de su diferente velocidad de emigración, cuando se encuentran sometidas a la acción de un campo eléctrico. La velocidad con que las diferentes sustancias se desplazan durante el transcurso de al electroforesis se denomina velocidad de migración. Dicha magnitud depende básicamente de la densidad de la carga y esta a su vez está condicionado por una serie de parámetros (pH, fuerza iónica, diferencia de potencial del campo eléctrico aplicado, naturaleza de la muestra, interacciones de la misma con el soporte elegido) que van a acondicionar el desarrollo experimental de la técnica electroforética. La electroforesis es una herramienta práctica para el análisis de mezclas que compuestos biológicos, ya que permite separar macromoléculas en una mezcla, sirviendo tanto como método analítico como preparativo para la posterior realización de otras técnicas analíticas., para que esta separación tenga lugar es necesario que la sustancia se encuentre cargada de manera que al colocarla en el seno de un campo eléctrico se desplace hacia un polo u otro en función de su carga. De forma general las sustancias cargadas positivamente se dirigirán hacia el polo negativo, es decir, el cátodo y las cargadas negativamente hacia el polo positivo que es el ánodo. Es necesario que todos los componentes de la mezcla a separar se encuentran cargados de igual forma (todos positivos o todos negativos). De manera que después de hacer la siembra, es decir, depósito de al muestra sobre el soporte en uno de los polos, se dirijan todos hacia el polo contrario, separándose unos de toros en función de la diferente velocidad de emigración. El desplazamiento de los distintos componentes de la muestra durante el transcurso de la electroforesis depende básicamente de: ~ La carga de la sustancia ~ Voltaje del capo eléctrico cerrado ~ El coeficiente de fricción (rozamiento entre el soporte y la sustancia depositada en el mismo –se opone al movimiento-) “La velocidad de migración de los diferentes componentes de la muestra que queremos separar durante su desarrollo electroforético por unidad de tiempo recibe el nombre de movilidad electroforética ()”. El proceso electroforético desde su inicio a sufrido múltiples variaciones encaminadas a obtener un mayor rendimiento y mejores resultados. Actualmente existen una gran variedad de cámaras de electroforesis en el mercado (generalmente cada casa comercial elabora el modelo adecuado en función del soporte a utilizar). En general son preferibles aquellas cuyo tamaño es reducido por: ~ Presentan una menor superficie de evaporación. ~ Las diferentes temperaturas se minimizan entre un compartimiento y otro. ~ Permite una reducción del tamaño de las aplicaciones con lo que se pueden procesar un mayor número de muestras al mismo tiempo. FACTORES QUE INTERVIENEN EN EL DESARROLLO ELECTROFORÉTICO Los principales parámetros que influyen o afectan en el desarrollo de una electroforesis y que condicionan su utilidad en el laboratorio son básicamente: A·- Carga neta de la sustancia en migración: el grado de ionización y por tanto la carga neta de las distintas sustancias de la muestra sometida a electroforesis depende del pH del medio en el que se lleva a cabo todo el proceso. A su vez este parámetro queda determinado por el tampón elegido que permite utilizar el pH más adecuado. La influencia del pH sobre la carga neta es especialmente importante, ya que hay sustancia que dado su carácter anfótero (como es el caso de las proteínas que son compuestos que presentan cargas positivas y negativas sobre la misma molécula siendo el número de unas u otras dependientes del pH del medio) pueden encontrarse cargadas positivamente ó negativamente. Se define punto isoeléctrico (PI) como aquel valor de pH al cual el balance de cargas positivas ó negativas superficiales de una sustancia es 0 (carga neta nula). Al pH de su PI una sustancia no presenta carga neta alguna y por tanto al ser sometida a un proceso electroforético no migra (permanece inmóvil en el punto de aplicación). Cuando el pH es superior al PI, la sustancia se encuentra cargada negativamente (el número de cargas negativas supera a la de positivos) y sometido a electroforesis migrarán hacia el polo positivo, el ánodo. Cuando el pH de medio es inferior al de su PI la sustancia cargada positivamente se dirigirá hacia el cátodo que es el polo negativo. B·- Fuerza iónica del medio: al igual que el pH final la fuerza iónica depende del tampón elegido para la electroforesis. En un proceso electroforético la corriente eléctrica es transportada por todos los iones presentes, tanto a los debidos a la muestra en solución como los de tampón, mayor es la proporción de corriente transportado por los iones del tampón y menor la transportada por la muestra que se desea separar, de manera que esta última migrará más despacio. En cualquier proceso electroforético de concentración de tampón elegido sirve en cada caso para: ~ Mantener constante el pH adecuado. ~ Proporcionar una fuerza iónica que permita el movimiento de cargas. Cuando la concentración del tampón es superior a la requerida la migración de las sustancias presentes en la muestra es más lenta y pero la separación conseguido. C·- Estructura y tamaño de la sustancia: aunque estos factores no influyen por igual en todos los procesos electroforéticos en ocasiones son de gran importancia. Tal es el caso de aquellas electroforesis en las que el soporte elegido permite el paso selectivo de las moléculas en función de su tamaño (retiene las partículas más grandes y deja pasar las de menor tamaño). D·- Potencial del campo eléctrico aplicado: como se ha visto anteriormente la movilidad electroforético de una sustancia es mayor cuanto mayor es el potencial eléctrico aplicado. No obstante recurrir a un gran aumento de voltaje para alterar el proceso electroforético presenta el inconveniente de que se produzca un aumento de la temperatura que a su vez es el responsable de: ~ Alteraciones debidas al calor de la muestra sometida a electroforesis (cuando se trata de proteínas plasmáticas se produce su desnaturalización por calor). ~ Evaporación del tampón utilizado. Como consecuencia de la evaporación el tampón queda más concentración aumento se fuerza iónica y se dificulta el desarrollo electroforético. E·- El soporte: en general una electroforesis puede realizarse directamente en una solución tamponada de la sustancia que se desea separar (electroforesis libre) ó puede hacerse sobre un soporte de manera que una vez terminado el proceso las acciones queden permanentemente separadas y sea fácil proceder a su cuantificación, esto se denomina electroforesis zonal. La electroforesis zonal se usa ampliamente en laboratorio clínico. Los soportes más comúnmente utilizados son: ~ Acetato de celulosa ~ Gel de agarosa ~ Gel de almidón ~ Gel de acrilamida La elección del tipo de soporte depende muy directamente del objetivo del análisis. Para la mayor parte de los diagnósticos clínicos es suficiente un soporte de acetato de celulosa o de gel de agarosa. En los últimos años el gel de agarosa a aumentado su popularidad ya que ofrece ciertas ventajas, sobre otros soportes como pueden ser: ~ Mayor resolución ~ Ausencia de efectos cromatográficos (no capta el colorante dando colores de fondo no deseables) ~ Transparencia completa. Al poseer una elevada y uniforme porosidad favorece la migración uniforme de las sustancias cargadas, de manera que al moverse a la misma velocidad producen una banda homogénea y nítida con lo cual se traduce en un incremento de la resolución. Debido a su gran contenido en agua el gel de agarosa es totalmente transparente y por ello evita la distorsión en el trazado electroforético y los posibles trazados erróneo producidos por efectos hipercrómicos que si se producen en toros medios opacos. Concretamente el acetato de celulosa es un material opaco que debe ser transparentado con disolventes orgánicos lo cual puede hacer desaparecer las bandas más débiles. Soportes electroforéticos: todos los soportes son sólidos, de consistencia gelatinosas que incluyen el solvente en su preparación. Esta puede ser: • Homogénea: misma concentración de gel en todo el soporte. Se utiliza normalmente para soportes planos. • En gradientes: la concentración del gel varía a lo largo del soporte de una forma continua (gradiente continuo) o discontinuo (gradiente discontinuo), según los casos, los soportes se clasifican en: Soportes no restrictivos: las sustancias depositadas sobre este tipo de soporte puede moverse libremente de forma que su separación electroforética tiene lugar único en función de su carga eléctrica. En realidad no hay un soporte que sea completamente no restrictivo, pues las sustancias cuyo peso molecular es elevado pueden verse frenadas en su desplazamiento o no desplazarse en absoluto. o Papel: fue el primer soporte utilizado en electroforesis de zona. En la actualidad prácticamente no se utiliza. o Acetato de celulosa: se obtiene a partir de la reacción de anhídrido acético con los grupos hidroxilos de la celulosa. Su estructura deja gran cantidad de huecos llenos de aire. En el momento de ser utilizado las membranas de acetato se sumergen en el tampón, que penetra en los huevos llenándolos. Este tampón es el encargado de llevar la corriente eléctrica a través del soporte, permitiendo así el soporte electroforético. El más utilizado es el Cellogel y sus principales ventajas son: Fácil manipulación Rapidez de ejecución Elevada reproductibilidad Fácil lectura o Gel de agarosa: está formado por agarosa, uno de los componentes del agar (es un compuestos de agarosa y agaropectina). Debido al elevado tamaño del poro (mayor del de otros geles) las sustancias depositadas en él migran únicamente en función de su carga eléctrica. Las sustancias de alto peso molecular se ven totalmente frenadas en su desplazamiento. Presentan las siguientes ventajas: Carece de cargas eléctricas que podrían intervenir en la migración electroforética. No presenta problemas de endósmosis (en muy importante cuando se utiliza agar para electroforesis –no agarosa- y es atribuible a gran número de grupos cargados negativamente sulfato y carboxilos presentes en el agar. Se traduce en que debido sobre todo al movimiento de líquido y a la distancia calidad del agua presentes en diferentes grupos componentes de la muestra sufren un arrastre de tipo osmótico hacia el polo contrario). No captan el colorante (no dan lugar a colores de fondo no deseables) y son muy adecuados para la cuantificación de las distintas fracciones por densitometría. Soportes restrictivos: ejercen algún tipo de resistencia al desplazamiento electroforético de las sustancias depositadas en ellos. Dicha resistencia dependerá fundamentalmente de: El tamaño del poro de la sustancia que forma el soporte El tamaño y características estructurales de las sustancias que vayan a desplazarse en el mismo. En general presentan la ventaja de proporcionar buenas separaciones de la distintas fracciones. o Gel de almidón: su uso es limitado debido a los dificultades derivados de su preparación. Proporciona un mayor número de fracciones de la muestra a separar que otros soportes. Por ejemplo: el gel de agarosa. Presenta entre otro los siguientes inconvenientes: Considerable dificultad para obtener un soporte de espesor y porosidad uniforme. La preparación del gel extemporal o Geles de poliacrimilamida: son el resultado de la polimerización de la acrilamida con diferentes compuestos. Son los que proporcionan un mayor número de fracciones y la mejor resolución de las distintas bandas utilizándose sobretodo en laboratorio de investigación. El tamaño del poro puede variarse variando la composición del gel, de manera que las sustancias depositadas en este tipo de geles se separan en función de su carga y su tamaño. Presentan las siguientes ventajas: Químicamente inertes Porosidad variable Elevada resolución (obtención de bandas, estrechas y nítidas) Transparencia (permite cuantificación por densitometría) Pueden ser utilizados para electroforesis especiales (permiten la introducción en su estructura de diferentes compuestos. Aplicación de la muestra: la aplicación de la muestra en el soporte directamente en la superficie dejando que penetre o bien en el interior de orificios o ranuras practicadas en el seno de los geles (inmuno-electroforesis). También se puede incluir en el propio gel durante el proceso de polimerización o formación. En general para incrementar la resolución debe tener las siguientes características: ~ Ser lo más estrecha posible ~ No poseer una cantidad de muestra excesiva ~ Ser homogénea F·- Características generales de la corriente aplicada: el voltaje aplicado durante la electroforesis influye de forma decisiva en el resultado obtenido. En general cuanto mayor es el voltaje aplicado, mejor es la resolución obtenida. No obstante el calor generado en el desarrollo electroforético provoca la evaporación de parte del agua contenida en el soporte y puede deteriorar la muestra. Los voltajes a los que habrá que trabajar en una electroforesis estarán limitados por el exceso de calentamiento que pueda tener lugar. En el caso de una electroforesis convencional sobre gel de agarosa, esto no es ningún problema, dado la breve duración del proceso (unos 20 minutos) y el moderado voltaje. En cambio los sistemas que utilizan voltajes elevados deben estar provistos de dispositivos de refrigeración capaces de mantener constantes la temperatura durante todo el proceso. G·- Revelado: para el revelado de los trazados obtenidos correspondientes a cada una de las fracciones separadas de al muestra puede recurrirse a diversos procedimientos, en función de la sustancia y de la sensibilidad requerida en cada momento. En el caso más típico el de la electroforesis de proteínas plasmáticas la sensibilidad mejoró considerablemente con la introducción de los primeros colorantes histoquímicas que serían el azul de bromo-fenol y el negro amido, que han sido desplazados por colorantes que como el azul brillante de coomasie proporciona una mayor sensibilidad siendo capaces de detectar desde medio microgramo de proteínas. La utilización de sustancias fluorescentes como la fluoresceína aumenta la sensibilidad hasta 1 nanogramo mientras que la tinción de plata mejora unas 100 veces la sensibilidad obtenida con el colorante de coomasie. ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS SÉRICAS Se utiliza tampón veronal cuya composición es la siguientes: ~ Barbital sódico ~ Ácido dietil-barbitúrico ~ Ácido bórico ~ Hidróxido sódico Al pH proporcionado por el tampón veronal todas las fracciones proteicas se encuentran cargadas negativamente y por tanto, sometidas a una corriente eléctrica y aplicando la muestra en el cátodo migrarán hacia el ánodo, que el polo positivo. El procedimiento general consiste básicamente en: ~ Sumergir durante 10 minutos las tiras de acetato de celulosa en el tampón. ~ Colocar las tiras en el puente de la cubeta de electroforesis una vez eliminado el exceso de humedad. ~ Proceder al depósito individual de la muestra sobre el soporte mediante el aplicado. ~ Introducir el puente en la cubeta en contacto con el tampón depositada en la misma. ~ Una vez tapado convenientemente conectar todo el dispositivo a una fuente de corriente continua (regulando la intensidad de la corriente en función de las necesidades). ~ Una vez transcurrido el tiempo adecuado de migración desconectar el equipo y proceder al revelado de las tiras normalmente mediante el empleo de colorantes adecuados que se fijan específicamente a la muestra elegida. Cuando el soporte elegido para la electroforesis es acetato de celulosa de la muestra de suero se obtiene 5 bandas que son: 1·- Albúmina: es la que más migra respecto del punto de aplicación de la muestra (es decir el cátodo) 2·- Alfa 1 (1) 3·- Alfa 2 (2) 4·- Beta (): cuando el soporte de gel es de agarosa esta banda se divide en 2: 1 y 2. 5·- Gamma (): es la que menos se desplaza y en sueros no patológicos la banda más ancha. Finalizado el revelado, tras la tinción y decoloración de las tiras, proceden a la cuantificación de cada una delas fracciones obtenidas, a partir de la muestra inicial. Para ello normalmente se recurre a la espectrofotometría o a la densitometría. • Espectrofotometría: ~ Recortar cuidadosamente cada una de las bandas obtenidas tras la electroforesis. ~ Introducir cada banda en un tubo conteniendo una sustancia capaz de disolverla completamente. ~ Realizar la lectura del color así obtenido utilizando el espectrofotómetro (la densidad óptica obtenida para cada una de las banda es proporcional a la concentración de las sustancia contenida en la misma). • Densitometría: ~ Proceder al transparentado del fondo de la tira mediante la utilización de una sustancia transparentadora adecuada. Resulta importante conseguir el punto óptimo de transparentado de las tiras. ~ A continuación introducir la tira en un densitómetro. Se obtiene una gráfica en la que aparecen cuantificadas cada una de las fracciones presentes en la sustancia sometida a la separación electroforética. ~ Precauciones generales: 1·- Sumergir completamente las tiras utilizadas como soporte. Evitando la formación de burbujas sobre la superficie que podrían dar lugar a manchas opacas sobre la tira. 2·- Aplicar cuidadosamente la muestra en forma di línea fina mediante un aplicador, evitando el exceso de muestra que podría dar lugar o distorsión en el trazado. 3·- No utilizar tampón para más de 2 ó 3 separaciones. 4·- Asegurarse siempre de que el contacto con los electrodos (preferentemente del grafito) sea adecuado. 5·- Garantizar la correcta limpieza de la cubeta y de todos los recipientes utilizados. 6·- Mantener en todo momento un estado de hidratación de las tiras adecuado (ni demasiada humedad para evitar la difusión de las bandas ni demasiada sequedad que podría propiciar el depósito de proteínas en exceso. Electroforesis de muestras de orina: El objetivo fundamental de electroforesis en una muestra de orina es la detección de la muestra de orina es la detección de la proteína de Bence-Jones. Aparece como 1 ó 2 bandas en al zona b-x y más raramente en la zona de 2 ó 1. el método electroforético es el procedimiento más seguro para su determinación ya que el llamado test del calor proporciona bastantes falsos positivos y negativos y las tiras reactivas que reaccionan en orina no son útiles para el hallazgo de proteínas de Bence-Jones. Inmunoelectroforesis: De forma parecida a la descrita para las proteínas séricas se realiza frecuentemente en el laboratorio la electroforesis de otras sustancias de gran interés clínico como las lipoproteínas, hemoglobina y otras sustancias susceptibles de ionización en función del pH y por tanto de desplazarse en el seno de un campo eléctrico. INTERPRETACIÓN DE LOS DISTINTOS TRAZADOS ELECTROFORÉTICOS La mayoría de las ocasiones el examen visual del trazado electroforético realizado por una persona experta es suficiente para poder llevar a cabo una interpretación. Frecuentemente proporciona mayor información sobre una determinada patología que las concentraciones numéricas de las distintas fracciones de manera que exista una gran relación entre los distintos trazados o patrones electroforéticos y ciertas patologías. Así por ejemplo en una respuesta inflamatoria aguda (un operatorio inmediato, está aumentada la a, anti-tripsina y el fibrinógeno y están disminuidas la albúmina y la transferrina). REALIZACIÓN PRÁCTICA DE LA ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS SÉRICAS: Preparación de la cubeta: ~ Cubeta limpia y seca ~ Rellenar con tampón varios lados sin que entren en contacto ~ Tapas para evitar la evaporización del tampón Preparación del soporte inerte: ~ Coger la tira por un extremo utilizando pinzas ~ Si no tiene ninguna marca que indique cual es la cara absorbente realizar un corte en la parte inferior derecha. ~ Sumergir las tiras de 5-15 minutos en la solución tampón de la cubeta con la cara absorbente hacia arriba y procurando que no queden adheridas. ~ Extraerlas con pinzas y eliminar el exceso de tono colocándolas entre 2 papeles de filtro. ~ Colocar las tiras sobre el puente de la cubeta con la cara absorbente hacia arriba quedando los extremos en contacto con el tampón. Ponen el extremo inferior derecha en al zona del cátodo negativo. ~ Tapa la cubeta y esperar de 2-5 minutos para la estabilización de las tiras en el medio. Aplicación de las muestras: ~ Poner en contacto el aplicador con al muestra, este tomará la cantidad adecuada. ~ Depositar la muestra sorbe la tira a 1 cm del borde catódico por simple contacto del aplicador con la tira. Migración electroforética: ~ Conectar la cubeta a la fuente de alimentación ~ Poner en marcha el alimentador y regular. Pondremos una intensidad de 0’1 Amperios, 35 minutos a 2.000 voltios Revelado: ~ Introducir las tiras en una cubeta con colorante (negro amido) durante 10 minutos. ~ Introducir las tiras en 3 ó 4 cubetas con decolorante agitando suavemente hasta que el fondo de la tira no tenga color y únicamente se aprecie las bandas electroforéticas teñidas. ~ Eliminar el exceso de decolorante situando la lira entre 2 hojas de papel de filtro. Cuantificación por espectrofotometría: ~ Poner en 6 tubos de ensayo el disolvente de la siguiente forma Tubos 1,3,4,5, y 6 con 3 ml de disolvente. Tubo 2 con 9 ml de disolvente ~ Cortar las fracciones de la tira y poner la fracción de albúmina en el tubo número 2 (fracción de más color). El tubo número 1 es el blanco y los restantes tubos se llamará 1, 2, . marcar todos los tubos e introducir las fracciones de la tira correspondiente. ~ Tapar cada tubo con parafilm y agitar hasta que al fracción quede disuelta. ~ Medir en el espectrofotómetro la absorbancia de cada tubo ~ Mirando la relación con los valores de absorbancia y concentración obtener los valores de concentración y porcentaje de las diferentes porciones. TEMA 14 ESTUDIO DE LA FUNCIÓN HEPÁTICA El hígado es un órgano de naturaleza glandular profusamente (abundante) vascularizado rodeado por una cápsula fibrosa denominada cápsula de Glison con un peso aproximado de 2’5% del peso corporal (kilo y medio). Presenta la particularidad de la circulación doble, recibe a la vez sangre de la arteria hepática y la vena porta de manera que cada minuto recibe 1.4001.600 ml de sangre (alrededor del 25% del gasto cardiaco es el volumen de sangre expulsada por el corazón en 1 minuto y los límites normales en reposos son de 4-8 litros). Debido a su especial vascularización (la arteria hepática canaliza la sangre procedente del tronco celiaco [25%] y la vena porta la que procede del intestino y del bazo [75%]) el hígado puede actuar sobre los productos recién absorbidos a nivel intestinal mediante el circuito entero-hepático. Histológicamente en el hígado pueden distinguirse: células hepáticas, ó hepatocitos, elementos vasculares y parénquima. • Las células hepáticas ó hepatocitos se caracterizan por: ~ Su membrana poseen mecanismos que permiten el transporte activo de diferentes sustancias: glucosa, aminoácidos y algunos de los electrolitos más importantes del organismo como sodio y potasio. ~ En su citoplasma se acumulan grandes cantidades de glucosa ~ Sus mitocondrias (donde se lleva a cabo la respiración celular) son muy activas en ellas mediante la oxidación celular de los principios inmediatos, se obtiene energía en forma de ATP. ~ Su aparato de Golgi elimina los productos de deshecho (consecuencia de la gran actividad metabólica del hepatocito) con gran efectividad. ~ Elementos vasculares: se componen tanto de vasos sanguíneos (que conducen tanto la sangre arterial como la venosa) como de vasos linfáticos (portadores de linfa) y vías biliares (que canalizan la secreción biliar). Las vías biliares constan de: 1·- Un conducto denominado conducto hepático el cual continúa con el colédoco y de la vesícula reservoria de unos 40 ml de capacidad que desemboca en el intestino delgado (duodeno) mediante un orificio cuya luz es regulada por el esfínter de ODDI. 2·- La pared de todas las vías biliares están formadas por glucosa y tejidos fibromuscular y su función e la de conducir la bilis desde el hígado hasta el duodeno. La vesícula sirve para almacenar la bilis formada en los periodos ínter-digestivos y verterla al intestino cuando se está produciendo la digestión. 3·- Las vías biliares son un órgano tubular lo que determina que la mayor parte de las alteraciones que impiden su normal funcionamiento están relacionadas con un problema de obstrucción. Las causas más frecuentes es la presencia de la luz de concreciones sólidas denominadas cálculos normalmente formados por bilirrubina ó por colesterol. • Parénquima hepático: está formado por un complejo entramado de hepatocitos dispuestos de manera que el contacto entre las células y la sangre que circulan por el hígado tanto de entrada como de salida es máximo. Tradicionalmente se ha considerado como unidad hepática básica tanto a nivel estructural como funcional un pequeño fragmento de 2 ml de diámetro , sección hexagonal y contorno poco parecido denominado lobulillo hepático. Cada lobulillo contiene: ~ Una estructura fibrilar que le sirve de armazón. ~ C. hepáticas ó hepatocitos, dispuestas en finas láminas de una sola célula de espesor ~ Células de Kupffer forman parte del sistema inmunitario de organismo. ~ Capilares biliares: por donde fluye la bilis segregada por los hepatocitos ~ Sinusoides: ocupan el espacio que separan las distintas láminas de hepatocitos y en su pared (provista de pequeños orificio se encuentran las células de Kupffer). ~ Espacio de Disse: situado entre los sinusoides y la membrana de los hepatocitos son equivalentes a los vasos linfáticos en el hígado y a través de ellos se produce el intercambio entre la sangre y los hepatocitos. En el lugar en el que confluyen varios de estos lobulillos se distinguen los denominados espacios porta. Cada uno de estos espacios contiene pequeñas ramificaciones de la vena porta (rama portal) y de la arteria hepática (rama arterial) y un pequeño conducto biliar. En el centro de cada lobulillo se sitúa la vena centrolobulillar. Más recientemente, Rappaport, propuso para el hígado una nueva unidad funcional llamada acino. FUNCIÓN HEPÁTICA En el hígado se llevan a cabo las principales transformaciones metabólicas del organismo siendo el órgano encargado de las transformaciones bioquímicas de los principios inmediatos ingeridos en la dieta y absorbidos a nivel intestinal así como su distribución en todo su organismo. Para conseguirlo (funciones del hígado): 1·- Interviene activamente en el metabolismo d los principios inmediatos. 2·- Participe junto a la medula ósea y el bazo en los procesos de síntesis y regeneración sanguínea. 3·- Forma la bilis 4·- Es el órgano encargado de la eliminación de los productos generalmente tóxicos para el organismo (detoxificación por biotransformación). 5·- Participa en el metabolismo de hormonas y vitaminas: sintetiza proteínas que transportan hormonas y vitaminas a la sangre (fibrinógeno, protombina, albúmina, globulinas) degrada las hormonas y facilitar su eliminación, sirve de almacén de ciertas vitaminas (vitamina A y vitamina K) y participa en el metabolismo de la vitamina D3 activa. Características generales de la secreción biliar: A·- Composición: • Sales biliares 3-45 mEq/L • Bilirrubina < 1 mEq/L • Urobilinógeno < 1 mEq/L • Colesterol 2-6 mEq/L • Agua • Fosfolípidos • Electrolitos: ~ Sodio 145-165 mEq/L ~ Potasio 2’7-4’9 mEq/L ~ Cloro 88-115 mEq/L B·- Las funciones de esta secreción biliar son: 1·- Sirve de vehículo para la eliminación de colesterol y bilirrubina 2·- Sirve para mantener disuelto el colesterol. 3·- Sirve para favorecer la digestión y absorción de las grasas a nivel del intestino delgado (por las sales biliares) C·- La formación de las sales biliares ó colestasis: es debida a un gradiente de presión osmótica y por tanto a la salida de agua desde el plasma hacia el espacio biliar. Depende de entre otros factores de dieta, sexo, edad, permeabilidad del epitelio vascular y el estado gestacional. Actuación hepática en el metabolismo de los principio inmediatos El hígado es el encargado de proporcionar a los tejidos energía (glucosa y ácidos grasos) en los periodos ínter-digestivos (aquellos en los que no se produce la ingestión de alimentos) interviniendo en el metabolismo de los principios inmediatos de la siguiente forma. A·- Respecto de los hidratos de carbono: ~ Después de las comidas, el hígado almacena la glucosa en forma de glucógeno ó triglicéridos. ~ Entre las comidas descomponen el glucógeno proporcionando glucosa a la sangre (glucogenolisis) y por otro lado sintetiza glucosa a partir de glicerol, lactato y aminoácidos mediante el proceso de gluconeogénesis. B·- Respecto a los lípidos: ~ Moviliza ácidos grasos procedentes del tejido adiposo. ~ Sintetiza ácidos grasos a partir del exceso de glucosa y aminoácidos con ellos se sintetizan los triglicéridos que entran a formar parte de algunas lipoproteínas importantes como la VLDL y la HDL. ~ Utiliza ácidos grasos para sintetizar los cuerpos cetónicos que son fuente de energía para el hígado y el resto del organismo. ~ Sintetiza colesterol (Entre 1’5-2 gr/diarios). C·- Respecto a las proteínas: ~ Metaboliza selectivamente los aminoácidos aromáticos ~ Utiliza el amoniaco procedente de la degradación de estos aminoácidos, del riñón y del intestino para la síntesis de urea y glutamina. ~ Sintetiza proteínas plasmáticas entre ellas la albúmina Actuación hepática; la secreción biliar: el hígado es el encargado de formar el bilis, excreción formada básicamente por sales biliares, bilirrubina, colesterol, fosfolípidos, electrolitos y agua, que desempeñan las siguientes funciones: ~ Servir de vehículo para la eliminación de bilirrubina, colesterol y otras sustancias. ~ Mantener disuelto el colesterol. ~ Facilitar la digestión y absorción de grasas a nivel intestinal. Acción hepática; en la detoxificación por biotransformación: Los distintos productos de carácter tóxico tanto endógenos (bilirrubina) como exógeno (tóxicos ó fármaco) sufren en el hígado diversas transformaciones encaminadas a: ~ Modificar su actividad reduciendo o eliminando su toxicidad orgánica. ~ Hacerlos hidrosolubles y por tanto fácilmente eliminables, ya sea vía biliar ó vía urinaria. Actuación hepática; a nivel del sistema monocito macrófago del organismo: el sistema denominado retículo-endotelial (SER) lo componen un conjunto de elementos celulares difundido por todo el organismo fundamentalmente en hígado, bazo, ganglios linfáticos y médula ósea al que se atribuyen las siguientes funciones: ~ Hematopoyéticas ~ Respuesta inmunitaria tanto específica como inespecífica ~ Funciones de tipo metabólico ~ Formación de pigmentos El hígado participa a través de las células de Kupffer y que entre otras funciones llevan a cabo la fagocitosis de agentes extraños y también la síntesis de bilirrubina. Actuación hepática en el metabolismo de hormonas y vitaminas: el hígado sintetiza proteínas transportadoras de hormonas en el torrente sanguíneo, además se encarga de degradan loas hormonas y de facilitar su eliminación. A nivel hepático se almacenan vitaminas y algunas como al vitamina D3 activa se encuentran sometidas a la entero-hepática. El hígado sintetiza también proteínas transportadoras de vitamina en la sangre. TRASTORNOS HEPÁTICOS Las diversas alteraciones del hígado se engloban bajo el nombre de hepatopatías. Son difíciles de clasificar porque a menudo se ignora su causa y evolución no obstante según la zona hepática que se encuentra alterada pueden distinguirse los siguientes grupos de alteraciones hepáticas: • Alteraciones del parénquima hepático: están localizadas en la propia masa glandular, es decir, localización intra-hepática. • Alteraciones de las vías biliares ó enfermedades hepato-biliares. • Alteraciones vasculares por problemas en al circulación sanguínea a nivel hepático. Enfermedad del parénquima ó intra-hepáticas: 1·- Hepatitis: pueden ser de origen viral ó tóxico. Tipos: aguda y crónica. 2·- Cirrosis: puede ser de origen alcohólico de tipo: ~ Biliar, por hemocromatosis (trastorno metabólico más frecuente en hombres, caracterizado por la acumulación de hierro, cirrosis y disminución de tolerancia de los hidratos de carbono). ~ Fibrosis quística pancreática 3·- Infiltrados: pueden ser: ~ De grasa (triglicéridos y colesterol) ~ De glucógeno ~ De tipo amiloide ~ Otros (leucemia, linfoma y granuloma) 4·- Lesiones que ocupan un especio (en el hígado): tumores, quistes ó abscesos (acúmulo de pus). 5·- Trastornos funcionales que cursan con ictericia: por ejemplo la supresión ó detección del flujo de bilis (colestasis) en el embarazo, ó síndromes diversos. Enfermedad hepato-biliares: Son el resultado de alteraciones en las vías biliares destacan la obstrucción biliar extrahepática y la colangitis (que es una inflamación de los conductos biliares). Enfermedades vasculares: Son de origen circulatorio y podemos englobar: ~ Malformaciones arterio-venosos ~ Trombosis de la vena hepática ó vena porta ~ Congestión pasiva crónica Como consecuencia de los distintos trastornos y en función de la gravedad de los mismos el hígado va a ser incapaz de desarrollar adecuadamente las diferentes funciones fisiológicas que tiene encomendados dango lugar a una insuficiencia hepática cuya consecuencia para la salud pueden llegar a ser muy graves. Vamos a analizar los trastornos más frecuentes de la funcionalidad hepática que son principalmente: 1·- Trastornos del metabolismo de los principios inmediatos: A·- Hidratos de carbono: en una insuficiencia hepática se observa hiper e hipoglucemia. La hiperglucemia (siempre que los niveles de insulina no sean inferiores a lo normal) puede ser debida a una reducción de l capacidad del hígado para metabolizar la glucosa. Esta reducción a su vez puede ser debida a una disminución del número de hepatocitos y alteraciones de la propia estructura hepática. La hipoglucemia que sólo aparece en insuficiencia hepática grave es consecuencia de la incapacidad del hígado: ~ Para sintetizar glucosa (gluconeogénesis) ~ Almacenar la glucosa (glucogenogénesis) ~ Liberar glucosa (glucogenolisis) al torrente sanguíneo. B·- Lípidos: una insuficiencia hepática puede ser la causa de un déficit de ciertas enzimas que intervienen decisivamente en el metabolismo lipídico, como consecuencia la vía metabólica que regulan estos enzimas se alteran dando consecuencias de diferente gravedad. Así por ejemplo un déficit de lecitil-colesterol-acil-transferasa (LLAT) (Enzima que regula la esterificación de colesterol en sangre) tiene como resultado un aumento del colesterol libre que al depositarse sorbe la membrana de los hematíes hace aumentar su superficie como consecuencia, estos glóbulos rojos adaptan formas anómalas, normalmente se vuelven más frágiles y pueden causar anemia hemolítica. C·- Proteínas: la urea (NH2-CO-NH2) se sintetiza en el hígado a consecuencia de la neutralización del anión bicarbonato (CO3H-) con el ión amonio (NH4+). Una insuficiencia hepática puede afectar a este proceso provocando: ~ Alteraciones cerebrales graves (encefalopatía hepática) como consecuencia del acúmulo de amoniaco en sangre. ~ Alcalosis metabólica por disminución del consumo de bicarbonato. ~ Una disminución del nivel de urea en plasma por disminución en su síntesis. Por otra parte cualquier alteración en la síntesis de proteína cuyo origen es hepático, es decir, causada por una alteración de la función de este órgano va a afectar a todos aquellos proceso en los que dichos proteínas intervengan por ejemplo alteraciones de tipo hemorrágico debidas a un fallo a nivel hepático de la síntesis de factores de coagulación (De carácter proteico). 2·- Trastornos de la función biliar: las consecuencias más importantes de la alteración de esta función hepática son la ictericia y al detección del flujo de bilis (síndrome de colestasis). A·- Ictericia: es un signo ó síntoma consistente en la coloración amarillenta de piel y mucosas consecuencia de la acumulación de un pigmento denominado bilirrubina en los tejidos. Cuando este pigmento se encuentra en la sangre en concentraciones superiores a 2 mg/dl. La concentración normal de bilirrubina es de 0’5-1 mg/dl. La ictericia indica trastornos en al formación captación, conjugación y eliminación de bilirrubina por el hígado. De todos ellos la eliminación es el proceso más difícil por lo tanto el que más fácilmente puede fracasar. Una pequeñas parte de la bilirrubina tiene su origen en el catabolismo de ciertas enzimas hepáticas (citocromos y catalasas) y en la destrucción de l médula ósea de eritrocitos inmaduros. En su mayor parte la bilirrubina procede del catabolismo de la hemoglobina presente en el interior de los eritrocitos, que tiene lugar en las células del sistema retículo endotelial (bazo, hígado y ganglios linfáticos, principalmente). Los glóbulos rojos que ya han completado su ciclo vital (120 días) son desintegrados liberando al torrente circulatorio la hemoglobina que contenían en su interior, una vez en el sistema retículo endotelial la hemoglobina se desdobla en 2 partes: • El grupo ‘HEM’ conteniendo es su interior un átomo de hierro ferroso (Fe+2) • Las cadenas de una proteína llamada globina. El grupo HEM que tiene estructura de anillo se desdobla abriéndose y libera el átomo de hierro el cual pasa a la sangre para llegar finalmente a la médula ósea, para participar en la síntesis de nuevos glóbulos rojos. Al abrirse en grupo HEM se transforma en una cadena lineal formada por 4 anillos denominados “anillos pirrólicos” que son la estructura básica de los denominados genéricamente pigmentos biliares. El primer pigmento formado es la biliverdina que tras una reducción se transforma en bilirrubina, esta recién incorporada al torrente sanguíneo es insoluble y se denomina bilirrubina indirecta, libre, no conjugada ó liposoluble no esterificada y circula en la sangre unida a la albúmina. Esta bilirrubina indirecta no puede ser excretada vía biliar ni urinaria y en caso de excesiva acumulación (hemólisis masiva) se acumula en zonas del organismo ricas en lípidos (cerebro, tejido celular subcutáneo) originando importantes trastornos. (Esquema) Una vez en el hígado la bilirrubina libre se separa de la albúmina y en el hepatocito sufre una conjugación en el ácido glucurónico transformándose en bilirrubina hidrosoluble o lo que es lo mismo conjugada directa ó esterificada. Una pequeña parte la bilirrubina directa regresa al torrente circulatorio pero. La mayor parte accede al intestino delgado a través de un orificio cuya apertura está regulada por el esfínter de Oddi. La bilirrubina conjugada que a atravesado el hígado y llegó al intestino va a sufrir la acción de la flora allí presente la cual la transforma en una serie de derivados que en conjunto se denomina urobilinógeno. Este es en parte reabsorbido para ser eliminado de nuevo por la bilis y en pequeña proporción por el riñón con la orina el resto es eliminado por las heces proporcionándoles su color característico. La bilirrubina conjugada que antes de atravesar el esfínter de Oddi refluyó ó una vez reabsorbida en el intestino delgado se encuentra en el torrente circulatorio necesaria debe ser eliminada pro el organismo y para ello usará 2 vías: ~ Una pequeña parte lo hará por la orina ~ La mayor parte a través de la vena porta volverá al hígado y desde esta al intestino delgado cerrando el ciclo: Circulación Entero-hepática. La cantidad de bilirrubina en sangre se conoce como bilirrubinemia y sus variaciones pueden ser de 2 tipos: • Hiperbilirrubinemia: aumento de la concentración de bilirrubina en sangre, puede ser fisiológica o patológica. • Hipobilirrubinemia: disminución de la concentración de bilirrubina en sangre, aparecen anemias intensas. Las hiperbilirrubinemia de tipo fisiológica, por ejemplo: en recién nacidos y por permanecer a altas temperaturas y de tipo patológico da lugar a: ictericia prehepática, hepática y/o post-hepática. La hipobilirrubinemia puede aparecer en anemias intensas tanto ferropénicas como aplásicas. • Tipos fisiológicos de la ictericia: Tipo 1: aumento en la producción de bilirrubina: ~ Aparece anemias hemolíticas ~ El hígado no es capaz de asumir el aumento de bilirrubina debida a la ruptura masiva de eritrocitos, como consecuencia se acumula en sangre bilirrubina no conjugada. Tipo 2: captación anormal de la bilirrubina por los hepatocitos: aparecen determinados síndromes como el de Gilbert, falla en el hígado la proteína transportadora y por tanto la captación hepática de bilirrubina es anormal pro consiguiente se acumula en sangre. Tipo 3: alteración en el proceso de conjugación de la bilirrubina: ~ Es el único trastorno en la ictericia del recién nacido. ~ Es debida a una inmadurez de la glucuronil-transferasas, enzima responsable de la conjugación hepática de la bilirrubina se produce y por tanto una retención en sangre de bilirrubina indirecta. Tipo 4: trastornos en la eliminación de la bilirrubina conjugada por los hepatocitos: ocurre en la hepatopatías difusas y algunas enfermedades congénitas. Existe una incapacidad de los hepatocitos para eliminar la bilirrubina conjugada por medio de la bilis, se produce por tanto una acumulación en sangre de bilirrubina conjugada. Tipo 5: trastornos del flujo biliar de la bilirrubina: aparecen diversos trastornos en los que las vías biliares están obstruidas. La bilirrubina conjugada al no poder seguir por las vías normales refluye o regurgita a la sangre se produce una acumulación en sangre de bilirrubina directa. (Esta bilirrubina directa pasa a la sangre (refluye) de 2 maneras: a través de los hepatocitos o bien por los espaciaos intercelulares de la pared de los conductos biliares de pequeño calibre). Las hiperbilirrubinemias pueden dar lugar a: • Ictericia prehepática ó hemolítica: su causa más frecuente es la hemólisis masiva por causa patológicas. Las características de esta ictericia la hacen identificable con el tipo fisiológico 1( aumento en la producción de bilirrubina). Características: ~ Orinas no colúricas (no tiene color oscuro) ~ Heces pleiocrómicas (con un aumento del color) ~ Está aumentada la bilirrubina indirecta en suero ~ El urobilinógeno en orina está aumentado • Ictericia hepática ó hepatocelular: en ella existe una incapacidad de los hepatocitos para captar, conjugar y eliminar la bilirrubina. Características: ~ Orina colúrica ~ Heces normales ó hipocólicas ~ Aumento en el suero la bilirrubina directa y la indirecta ~ El urobilinógeno en orina es variable • Ictericia post-hepática u obstructiva: se produce por alteraciones del flujo biliar. Características: ~ Orina colúrica ~ Heces hipocólicas ó acólicas ~ Aumento en el suero la bilirrubina directa ~ El urobilinógeno en orina está disminuido ó ausente. • Colestasis: es la alteración de la formación de la bilis o de su excreción hacia el duodeno que puede producirse tanto por un mal funcionamiento de las células hepáticas como por obstrucción de las vías de evacuación de la bilis. Las manifestaciones clínicas de esta alteración depende básicamente del tiempo transcurrido desde que esta se manifieste y de la duración de la misma. Inicialmente se observa: ictericia, coluria, hipocolia o acolia y prurito (picos). Si la colestasis se prolonga posteriormente aparece: xantomas (costra de color amarillo) esteatorea (heces con exceso de grasas) y síndrome de maladsorción. La colestasis puede ser de origen intra ó extra-hepático. Para efectuar el diagnóstico de una colestasis puede recurrirse a al ecografía o a la tomografía axial computarizada (TAC) resulta de gran utilidad poder contar con algunos datos de laboratorio que ayuden al diagnóstico. 3·- Trastornos de la capacidad de detoxificación por biotransformación: como consecuencia de la insuficiencia hepática para eliminar ciertos componentes puede aparecer una cierta intolerancia a aquellas sustancias (fármacos) que deben ser metabolizadas vías hepática, debida a esto, estas sustancias se acumula y llega a provocar múltiples trastornos. 4·- Trastornos en el metabolismo de hormonas y vitaminas: dada la gran importancia del hígado en el metabolismo de hormonas y vitaminas una insuficiencias hepática puede ser la causa de alteraciones cualitativas y cuantitativas en estos metabolitos y por tanto de importantes alteraciones fisiológicas. Ejemplo: trastorno en el desarrollo observados en personas cuyo sistema hepático no es capaz de sintetizar la somatomedina hormona imprescindible para el normal funcionamiento para la hormona del crecimiento (GH) ó somatotropina. DETERMINACIÓN DE LA FUNCIONALIDAD HEPÁTICA A la hora de determinar la causa (diagnóstico) de una determinada hepatopatía resulta imprescindible recurrir a una completa exploración del hígado que proporciona la mayor cantidad de información posible, dicho exploración puede ser: ~ De tipo físico ~ De tipo instrumental ~ De tipo funcional TIPO FÍSICO La exploración física por simple palpación y percusión del abdomen proporciona información de aspecto tales como la sensibilidad, consistencia y textura de la superficie hepática y del aumento del tamaño del hígado (hepatomegalia) la cual puede orientar hacia alteraciones hepáticas tales como: • Tumores, quistes y otras lesiones que ocupen espacio • Insuficiencia cardiaca (el acúmulo de sangre que tiene lugar puede explicar el aumento de tamaño del hígado) • Obstrucción de las vías biliares (acumulación de bilis) • Hepatitis (por la inflamación hepática) TIPO INSTRUMENTAL Para esta exploración se recurre a técnicas de tecnología y diagnostico avanzadas y precisas. • Radiología: se existe aumento del tamaño del hígado el diafragma derecho es desplazado hacia arriba, y esto lo podemos detectar con radiología de tórax. • Gammagrafía: se administra un isótopo radiactivo con afinidad sobre los hepatocitos y las células de Kupffer. La radiación emitida por el isótopo es registrada y nos ofrece una imagen del órgano. La existencia de lesiones como abscesos, quistes y tumores que no tiene capacidad para fijar el compuesto radiactivo no se registran. • TAC: es una técnica diagnóstica que usa radiación X. El haz de rayos X atraviesa la zona abdominal a diferentes niveles /Cortes transversales) realizando un “barrido”. La información obtenida, registrada adecuadamente y procesada informáticamente, proporcionan un imagen del hígado en función de la diferente densidad radiológica. La información obtenida es: ~ Forma y tamaño del hígado ~ Existencia de lesiones y a veces su naturaleza ~ Calibre d las vías biliares • Ecografía: técnica que usa ondas sonoras. Información que nos da: ~ Tipo de lesión, es decir, si es sólida o contiene líquido (abscesos ó quiste) ~ Calibre de los conductos biliares infrahepáticos • Laparoscopia: está basado en al introducción de un dispositivo óptico en al cavidad abdominal. Permite observar directamente el hígado. • Punción biopsia: permite la obtención de una muestra biológica de tejido hepático para su posterior estudio mediante anatomía patológica. PRUEBAS FUNCIONALES HEPÁTICAS Las pruebas funcionales hepáticas son aquellas que permiten determinar la capacidad global del hígado para llevar a cabo las funciones que le son propias, fundamentalmente las detoxificación, la síntesis y las de tipo metabólico. Estas pruebas son en su mayoría inespecíficas, ya que otros órganos distintos al hígado y otros mecanismos de regulación influyen en los resultados obtenidos. Además algunas de las pruebas de exploración funcional no lo son en realidad pues informan acerca de aspectos parciales como una obstrucción en las vías biliares, lisis de los hepatocitos, etc. Todas aquellas pruebas seleccionadas para determinar la gravedad y la evolución de una enfermedad hepática, debe valorar distintos parámetros bioquímicos, en función de la propia evolución de la enfermedad; y deben ser interpretados según el contexto clínico global. No todas aquellas determinaciones clínicas que reflejan la gravedad y evolución de una enfermedad hepática son realmente pruebas funcionales. Las distintas pruebas que determina ciertos componentes sanguíneos, que al variar su concentración plasmática ponen en evidencia una lesión en el hepatocito o una falta de la permeabilidad de las vías biliares (son los que se conocen como marcadores séricos de enfermedad hepática), no valoran en realidad la funcionalidad de este órgano y no son por tanto estrictamente pruebas funcionales hepáticas. Tampoco lo son, algunas pruebas bioquímicas de gran especificidad muy utilizadas actualmente, que permiten diagnosticar una determinada enfermedad hepática /(hepatitis vírica, tumores hepático, etc) pero que no evalúan realmente el funcionamiento del hígado. No obstante por razones de tipo práctico unas y otras suelen incluirse en cualquier clasificación de las pruebas funcionales hepáticas. MARCADORES SÉRICOS DE LAS HEPATOPATÍAS Son constituyentes sanguíneos, útiles en el reconocimiento de la enfermedad hepática, aunque no sirve para medir la funcionalidad hepática global, su alteración refleja fundamentalmente el daño del hepatocito o del árbol viral. El nivel sérico de todas las enzimas está en función de la lesión celular y de la alteración de su síntesis, de manera que: • En aquellas enfermedades en que exista daño celular habrá rotura de células y las enzimas, que se encuentran en el interior, saldrán al exterior aumentando en el suero. • Aquellas enfermedades que se manifiesten y una inhibición de la síntesis de las enzimas, reflejarán una disminución de sus niveles séricos respecto de los valores normales. • Las enzimas hepáticas idóneas como marcadores de una lesión a nivel hepático, serán aquellas que proporcionan un mayor grado de sensibilidad y especificidad. Algunas de las utilizadas en la actualidad son: ~ Transaminasas: 1·- GOT ó Aspartato-aminotransferasa ó ASAT 2·- GPT ó alaninamino-transferasa ó ALAT ~ Fosfatasa alcalina ó ALP ~ Leucín-amino-peptidasa ó LAP ~ 5-Nucleotidasa ó 5-NT ~ Gammaglutamil-transferasa ó -GT ~ Lactato deshidrogenasa ó LDH En concreto la citolisis hepática (necrosis hepatocelular) es una situación clínica de origen muy diverso que se manifiesta fundamentalmente por un aumento plasmático de las transaminasas. En algunos casos aumentan también la ALP, aunque su aumento en relación a los valores normales es más moderado. A·- Transaminasas: se conoce con este nombre a 2 enzimas, la transaminasa glutámico-oxalacética (GOT) y la transferasa glutámico-pirúvica (GPT), presente en el interior de diversas células (especialmente en las hepáticas aunque también se encuentran en las musculares). • GOT: se localiza tanto en el citoplasma como en las mitocondrias y los valores plasmáticos normales son 5-34 U/L. Se ve aumentado en: ~ Lesiones hepáticas: en las hepatitis agudas los niveles aumentan muchísimo incluso más de 3.000 U/L y en las hepatitis crónicas hay aumento pero más moderado: ~ Necrosis del miocardio ~ Proceso que afectan a las células musculares como esta triquinosis. ~ Necrosis tisulares (por ejemplo: embolia pulmonar ó infarto pulmonar). Esta enzima es muy difícil que se vea disminuida y si esto ocurre indica desaparición del parénquima hepático. • GPT: es una enzima intracelular presente solo en el citoplasma. Los valores normales son menores a 55 U/L. Se ve aumentada sólo en enfermedades que afecten al hígado: hepatocarcinoma, hepatitis aguda y crónicas, metástasis hepáticas, etc. En general se considera que pueden detectarse niveles elevados de GPT en lesiones hepáticas de poca entidad, mientras que es necesario que la lesión sea más grave para que se encuentran elevados los niveles de GOT. La determinación de estas enzimas, aunque tiene un escaso valor pronóstico, es de gran utilidad a la hora de determinar la actividad de las enfermedades hepáticas que cursan con lisis celular. Triquinosis: enfermedad producida por las larvas de Trichinella Spirallis. El hombre la contrae por la ingestión de carne de cerdo infestada por Trichinella, cruda ó mal cocida y de embutidos en idénticas condiciones., provocan diarrea, vómitos y náuseas. Seguido de un periodo con estado febril y adinámico, con dolores musculares. Por último un periodo de enquistamiento en el cual sobreviene la caquexia (adelgazamiento extremo sobretodo a nivel de los músculos, glúteos, diafragma y pectorales). B·- Fosfatasas alcalina: son un conjunto de enzimas (isoenzimas) cuya actividad total en sangre ese encuentra aumentada fundamentalmente en 2 tipos de procesos: las alteraciones óseas y hepáticas. NOTA: todos los isoenzimas (cada una de las formas en que puede presentarse una enzima en el organismo) tiene las mismas propiedades catalíticas, pero difieren en sus propiedades físicas, químicas e inmunológicas. [catalizador acelera o frena una reacción]. Su concentración normal en el suero es de 25-85 U/L. En concreto la isoenzima hepática aumenta cuando existe obstrucción biliar, total o parcial, ó una lesión que ocupa un espacio en el hígado. La elevación de la actividad de la fosfatasa alcalina hepática es indicadora de: ~ Colestasis: se define como patrón de colestasis la elevación de al fosfatasa alcalina hepática más la elevación de la -GT, manteniéndose normales los niveles de las transaminasas. ~ Cirrosis hepática ~ Metástasis hepáticas, carcinoma de vesícula biliar, etc. Niveles séricos inferiores a los normales de fosfatasa alcalina pueden hallarse en personas con hipotiroidismo y niños que presentan retraso en el crecimiento. C·- LAP (Leucín-amino-peptidasa) y 5-NT (5-Nucleotidasa): ambas enzimas son de gran utilidad a la hora de aumentar la especificidad de la fosfatasa alcalina, ya que se encuentran elevadas en las enfermedades hepáticas y en cambio no lo hacen en los trastornos de tipo óseo. Un aumento de la fosfatasa alcalina acompañado de un aumento de estas 2 enzimas indica una alteración hepática, sin embargo un aumento de fosfatasa alcalina con niveles normales de la LAP y 5-NT, indica que la elevación tiene otro origen. D·- -GT (Gammaglutamil-transferasa): esta enzima es un marcador de gran sensibilidad a la hora de determinar una alteración hepática (indica tanto y que hay rotura de células como colestasis). Cuando el valor hepático de esta enzima es normal, la probabilidad de que no haya ninguna alteración a nivel hepático es muy elevada. Se utiliza en combinación de la fosfatasa alcalina para diferenciar el origen hepático u óseo de una alteración. E·- LDH (Lactato deshidrogenasa): es una enzima presente en la mayor parte de las células del organismo. Está formada por varios isoenzimas, de los cuales la LDH-5 es de localización hepática. Su aumento plasmático es indicativo de necrosis hepatocelular o de carcinoma metastático de hígado. PRUEBAS BIOQUÍMICAS QUE VALORAN LA FUNCIÓN HEPÁTICA Una vez conocida la utilidad que para el diagnóstico de las hepatopatías supone la determinación de las diferentes marcadores séricos, conviene destacar la importancia de las pruebas bioquímicas capaces de valorar los aspectos más importante de la funciones hepáticas y que son fundamentalmente los siguientes: A·- Pruebas que valoran la capacidad de síntesis: una lesión hepática puede provocar una disminución de los niveles séricos de aquellas proteínas cuya síntesis se realice únicamente en el hígado (albúmina, protombina y fibrinógeno). En general la determinación de la proteínas en el suero va a proporcionar una valiosa información acerca de la capacidad de síntesis del hígado. Así unos niveles anormalmente bajos de estas proteínas va a indicar una disminución de dicha capacidad. Algunas determinaciones utilizadas más habitualmente para valorar la síntesis hepática son las siguientes: • Determinación de albúminas y globulinas • Determinación de los factores de coagulación • Medida del amoniaco en sangre Estas pruebas realmente resultan de escasa utilidad para evaluar la función hepática total, puestos que: ~ No son indicadoras absolutas de lesión hepática ~ No permiten distinguir entre las distintas hepatopatías ~ Su descenso sérico no es específico de la enfermedad hepática B·- Pruebas indicadoras de la capacidad excretora hepática: determinar la capacidad del hígado de eliminar de la sangre las sustancias, tanto endógenas como exógenas, que pueden resultan nocivas para el organismo. También valoran su posterior excreción (directamente a la bilis ó tras sufrir alguna transformación en toros órganos)., algunas de las más utilizadas son: • Las que determinan los niveles de ciertos metabolitos en sangre, orina ó heces: bilirrubina ó urobilinógeno. • Las que miden la velocidad de captación y/o excreción a nivel hepático de diversas sustancias tanto endógenas como exógenas: colorantes, ácidos biliares y/o fármacos. C·- Pruebas que valoran la actividad metabólica hepática: las distintas pruebas bioquímicas que valoran la actividad metabólica hepática están basados en la gran influencia que el hígado posee en el metabolismo de las distintas principios inmediatos. Estas pruebas deben determinar el buen funcionamientos hepático del metabolismo de lípidos, hidratos de carbono y proteínas. • Pruebas funcionales metabólicas: 1·- Pruebas que valoran el metabolismo de hidratos de carbono ~ Curva de la glucosa ~ Hiperglucemia adrenalínica ~ Prueba de sobrecarga de galactosa ~ Lacticidemia de esfuerzo (Es la presencia de ácido láctico en sangre) 2·- Pruebas que valoran el metabolismo lipídico ~ Determinación del colesterol esterificado 3·- Pruebas que valoran el metabolismo proteico: ~ Determinación de albúmina plasmática ~ Determinación de muco-proteínas ~ Determinación de proteína de la coagulación sanguínea ~ Síntesis de protombina ~ Amoniemia (Determinación de la presencia de carbonato amónico en al sangre). En general en función del aspecto que dentro de la función hepática global pretende valorar las distintas pruebas de exploración funcional, se pueden clasifican en: ~ Pruebas que valoran la función hepatocelular ~ Pruebas de colestasis ~ Pruebas que determinan el funcionamiento de las células de Kupffer. ~ Pruebas que valoran la destrucción ó lisis de los hepatocitos. Las pruebas que valoran la función hepatocelular estrictamente (también denominadas pruebas del parénquima o pruebas metabólicas) aportan información acerca de aspecto tan importante como: ~ La función metabólica hepática ~ La capacidad de biotransformación hepática ~ La reutilización de los ácidos biliares por los hepatocitos. Las pruebas de colestasis ponen en evidencia, principalmente, retenciones del flujo biliar normal. Las pruebas que determinan la funcionalidad del as células de Kupffer son aquellas encargadas de poner en evidencia un aumento de -globulinas, que caracteriza este tipo de trastornos. Cuando ciertos antígenos procedentes del intestino acceden al hígado son normalmente neutralizados por la acción de las células del sistema monocito-macrófago a nivel hepático (células de Kupffer). Cuando esta función no puede ser realizada correctamente, se estimula la síntesis de anticuerpos específicos frente dichos antígenos, pudiendo detectarse entonces un aumento de las -globulinas (anticuerpos). Por último las pruebas que valoran la destrucción de los hepatocitos son aquellas que permiten determinar el aumento plasmático de las enzimas presentes en el interior de las células hepáticas y que tras la lisis de las células hepáticas salen al exterior. PRUEBAS DE EXPLORACIÓN FUNCIONAL HEPÁTICA A·- Pruebas que valoran la insuficiencia hepatocelular: 1·- Determinación de albúmina: R.S1.: hipoalbuminemia S.C2.: ~ Es muy buen indicador de la gravedad de una hepatopatía ~ Aparece en hepatitis grave y otras enfermedades graves. ~ No informa de una insuficiencia hepática de reciente instauración OBS3.: ~ Las células hepáticas tienen un importante papel en la síntesis proteica y cuantitativamente la albúmina es la más importante, siendo los valores plasmáticos normales entre 3’5-5 gr/dl ~ Tiene una vida media (más ó menos) de 20 días, por lo que la disminución de los niveles en plasma tardan en detectarse. ~ Para su determinación puede recurrir a técnicas de electroforesis o inmuno-electroforesis (De mayor sensibilidad y especificidad). 1 R.S.: resultado significativo S.C.: significado clínico 3 OBS.: observaciones 2 2·- Determinación de globulinas: R.S.: hiperglobulinemia S.C.: ~ Hepatopatías crónicas como hepatitis crónica activa, cirrosis, hepatitis ~ Cirrosis ~ Hepatitis vírica subaguda ~ Alteraciones extra-hepáticas OBS: ~ globulinas (inmunoglobulinas) sintetizadas a nivel hepático y siendo sus valores normales de 2-3’5 gr/dl ~ Son menos específicos de enfermedades hepáticas ya que también pueden encontrarse alteradas en procesos extra-hepáticos. 3·- Determinación de bilirrubina: R.S.: Hiperbilirrubinemia mixta S.C.: ~ Indica insuficiencia hepatocelular. Falla la captación, conjugación y eliminación de la bilirrubina, apareciendo ictericia. OBS: ~ Aparece tanto bilirrubina directa como indirecta por eso se denomina hiperbilirrubinemia mixta. 4·- Determinación de factores de coagulación: R.S.: ~ Tiempo de protombina elevada S.C.: ~ Indica insuficiencia hepatocelular R.S.: ~ Tiempo de tromboplascina parcial elevada S.C.: ~ Indica hepatopatías graves OBS: ~ El hígado sintetiza en exceso algunos de los más importantes factores de coagulación: como el fibrinógeno (factor I), protombina (factor II), y los factores V, VII, IX y X. Una lesión hepática grave puede dar lugar a déficit de algunos factores, con lo cual se podrían haber alterado el mecanismo de la hemostasia (Detección espontánea de un flujo sanguíneo o hemorrágico). ~ La vida media de los factores de coagulación es corta, así que estas pruebas detectan una insuficiencia hepatocelular reciente. 5·- Determinación de amoniaco en sangre (amoniemia): R.S.: Amoniaco plasmático elevado (hiperamoniemia) S.C.: ~ Incapacidad hepática par transformar el amoniaco en urea (este amoniaco puede ser eliminado en forma de urea con la bilis y pasa a l circulación sistémica ocasionando hiperamoniemia). OBS: ~ El hígado es el encargado de transformar el amoniaco (compuesto nitrogenada de marcado carácter neuro-tóxico) en urea y eliminarlo por la bilis. Su acumulación puede causar trastornos neuro-tóxicos como una encefalopatía hepática. ~ Para su detección se utilizan técnicas enzimáticas normalmente adaptadas al empleo de autoanalizadores. 6·- Determinación de glucosa: R.S.: Hipoglucemia S.C.: ~ Necrosis hepática aguda (muy rara) OBS: ~ En general no es un índice muy claro de enfermedad hepática ~ En caso de enfermedad del hígado pueden encontrarse muy alterados la gluconeogénesis y la glucogenogénesis, con lo cual la tolerancia a l glucosa se ve afectada. ~ Con cirrosis hepática la prueba de sobrecarga oral ó intravenosa de glucosa aparece claramente alterada. 7·- Determinación de colesterol plasmático total: R.S.: Colesterol elevado S.C.: ~ Ictericia obstructiva R.S.: Colesterol con valores normales S.C.: ~ Ictericia hepatocelular R.S.: Colesterol con niveles bajos S.C.: ~ hepatitis grave y cirrosis OBS: ~ Todas las células dl organismo sintetizan colesterol, pero el hígado y el intestino son su mayores productores. ~ El colesterol hepático es útil para la estructura de las membranas celulares del hígado y para el catabolismo de las sales biliares ~ Es excretado por la bilis ó estereficado para su almacenamiento. 8·- Determinación de triglicéridos: R.S.: triglicéridos aumentados S.C.: ~ Ictericia obstructiva ~ Alcoholismo, etc OBS: ~ Junto a la determinación de colesterol de triglicéridos es fundamental par distinguir las distintas hiperlipoproteínemias 9·- Determinación de bilirrubina: R.S.: Aclaración hepático disminuido de la sustancia elegida para la prueba S.C.: ~ Valoran la capacidad del hígado para extraer colorantes de la sangre OBS: ~ Los más utilizados par esta pruebas son: a·- Bromosulftaleína: es una prueba de gran sensibilidad pero su realización es muy compleja (tiene peligrosos efectos secundarios para el paciente) y por ello muy poco utilizada en la actualidad. Consiste en la introducción intravenosa del colorante y normalmente se determina la velocidad de excreción mediante sucesivas determinaciones en plasma. Se consideraría normal un retención de colorante por encima del 6% de la dosis administrada. Su utilidad es el diagnóstico diferencial de ciertas hepatopatías, valoran la gravedad de una enfermedad hepática o determina el grado de recuperación de la misma. b·- Rosa de Bengala: este se utiliza habitualmente par el diagnóstico diferencial de ictericia infantil. Su administración se realiza por vía parenteral y la excreción se mide por orina y heces. Por su baja sensibilidad a l hora de determinar la capacidad excretora hepática se usa cada vez menos. 10·- Medida de l excreción de ácidos biliares: R.S.: ~ Ácido cólico plasmático aumentado ~ Ácido quenodesoxicólico plasmático aumentado S.C.: ~ Insuficiencia hepatocelular OBS: ~ Ambos ácidos biliares conjugados con glicina y taurina son secretadas con la bilis y almacenados en al vesícula biliar si hay ayuno o vertidos al intestino durante la digestión. ~ Su eliminación de la sangre es muy similar a la de la bilirrubina y de los colorantes ~ Debido a la complejidad de los métodos utilizados (cromatografía de gases, radio-inmuno-análisis y enzimo-inmuno-ensayo). Su determinación se limita a la investigación clínica. 11·- Medida de la excreción de fármacos: se determina tanto la rapidez con que los fármacos son aclarados del plasma por el hígado como al aparición de productos metabólicos en plasma y orina. Son pruebas difíciles de aplicar a la práctica clínica cotidiana. B·- Pruebas de colestasis: 1·- Determinación de bilirrubina: R.S.: bilirrubina directa en sangre aumentada S.C.: ~ Colestasis OBS: ~ La bilirrubina conjugada (Directa) no puede ser transportada al intestino con lo cual vuelve a la sangre. Los niveles están aumentados en el plasma. 2·- Determinación de enzimas en plasma: R.S.: Fosfatasas alcalinas aumentadas S.C.: ~ Colestasis OBS: ~ La síntesis de estas enzimas en actividad a nivel hepático y son liberadas a la sangre donde se incrementa su presencia. ~ Debe descartarse una procedencia de la fosfatasa alcalina distinta de la hepática (de origen óseo) para ello hay que comprobar que la que está alterada es la isoenzima hepática. ~ Simultáneamente a las fosfatasas alcalinas pueden detectarse otras enzimas como al 5-NT que aumenta también en la colestasis. C·- Insuficiencia de las células de Kupffer: 1·- Determinación de gammaglobulinas séricas: R.S.: las gammaglobulinas en el suero aumentan S.C.: ~ Hepatopatías crónicas OBS: ~ En las hepatopatías crónicas diversos agentes procedentes del intestino no son eliminados por las células de Kupffer y por tanto estimulan la síntesis de los correspondientes anticuerpos. D·- Pruebas que determinan la hepatolisis: 1·- Determinación de enzimas en el suero: R.S.: Aumento plasmático de ciertas enzimas S.C.: ~ Necrosis de los hepatocitos OBS: ~ Las enzimas que pueden encontrarse aumentadas en suero son sobretodo las Transaminasas y los láctico deshidrogenasas, aunque también puede haber otras. ~ La destrucción de las células hepáticas liberan al suero las enzimas que contiene, aumentado los niveles séricos que contienen NOTA: el diagnóstico de estas enfermedades hepáticas en el laboratorio todavía no es totalmente satisfactorio. Ocasionalmente sirven apareciendo hepatopatías crónicas en las que todas las pruebas bioquímicas arrojan resultados normales. Además sólo en casos excepcionales pueden demostrase una relación causa-efecto entre determinadas pruebas por un lado y la etiología y/o la alteración detectada a nivel hepático por el otro. Normalmente lo que sucede es que la prueba funcional, la causa de la alteración hepática y la patología no se encuentren en estricta relación. HEPATITIS Bajo el nombre se engloba a todo aquel proceso que causa con inflamación más ó menos aparentes del hígado. Aunque esta alteración hepática puede estar originada por causas muy diversas (tóxicos, fármacos, etc) requieren una especial atención las hepatitis de origen infeccioso y muy en particular aquellas cuyo agente etiológico es de origen vírico (hepatitis infecciosas víricas). En general sea cual sea la etiología, una hepatitis puede manifestarse de forma puntual e intensa (hepatitis aguda) ó de una forma menos intensa aunque recurrente en el tiempo, y con un pronóstico incierto que puede ir desde la curación lenta, graves alteraciones hepáticas como cirrosis ó procesos de tipo neoplásicos (hepatitis crónicas). Los más frecuentes agentes productores de hepatitis en nuestro medio son los virus. En concreto son los virus de las hepatitis A, B, C (hasta el momento han sido identificados 5 de esto virus A, B, C, D y E) los causantes de la gran mayoría de los casos. 1·- Hepatitis víricas: la infección por los virus antes mencionadas induce en el huésped una respuesta inmune que se materializa en al formación de anticuerpos específicos., loa detección en el plasma de dichos anticuerpos (normalmente mediante técnicas inmunológicas de notable sensibilidad y especificidad) así como en su caso la de distintas estructuras de carácter antigénico propias del virus causante de la hepatitis, va a permitir una adecuada orientación diagnóstica en cada caso. A·- Hepatitis víricas agudas: clínicamente las hepatitis víricas agudas se manifiestan mediante síntomas tan diversos como: abstemias, fiebre, anorexia, náuseas, cefaleas, dolor abdominal, erupciones (especialmente urticaria). Las formas que cursan con ictericia representan menos de un 10% de los casos, pudiendo aparecer también manifestaciones de origen extra-hepático (alteraciones glomerulares, anemia, aplasia medular,...) Tras una anamnesia orientativa, para proceder al diagnóstico de la hepatitis aguda se recurre inicialmente al estudio de los siguientes parámetro biológicos: • Transaminasas: en las hepatitis sus niveles plasmáticos aumentan entre 01-100 veces los normales. • Pruebas de coagulación: la más utilizada es el tiempo de quick (ó protombina) (cuando se reduce más de la mitad es necesario proceder a la hospitalización). • Serología: ~ Investigación de la presencia de ciertos antígenos procedentes del virus causantes de la hepatitis. ~ Determinación de los distintos anticuerpos específicos (especialmente de tipo IgM e IgG) que aparecen en el plasma de las personas afectadas. B·- Hepatitis víricas crónicas: en general son procesos inflamatorios del hígado originados por el virus de la hepatitis B y C (los virus de la hepatitis A no desarrollan cronicidad que puedan acabar favorablemente o desembocar en lesiones hepáticas graves y que se caracterizan por que cursan con lesiones hepáticas que van desde necrosis de los hepatocitos hasta infiltrados de tipo inflamatorio, permitiendo su clasificación en: persistentes, lobulares y activas. Actualmente en función del agente causal las hepatitis víricas pueden clasificarse en 5 tipos diferentes A, B, C, D y E. A·- Hepatitis A: este tipo de hepatitis cursa normalmente con ictericia, hepatomegalia y esplenomegalia. La necrosis de las células hepáticas ocasionan la liberación a la sangre de enzimas y bilirrubina. Tienen un periodo de incubación de entre 2-6 semanas. Es fulminante en menos del 0’2% de los casos y no provoca tumor hepático. La transmisión de este tipo de hepatitis se produce vía entérica, una mejor higienecalidad de las aguas de consumo se va a traducir en un descenso de los nuevos caso aparecidos. En el serodiagnóstico de la hepatitis A es prioritario determinar los anticuerpos antivirus A , es decir, los anti-VHA. Dichos anticuerpos pueden ser de tipo IgM (Dan positivos cuando es una infección reciente ó IgG. Se dispone de una vacuna efectiva que está especialmente recomendada en los siguientes casos: • Personal hospitalario • Personas, sobretodo niños, que viven en colectividad. Por ejemplo: guarderías, centros escolares,... • Entorno de los afectados por la infección • Personas que viajan a países donde la hepatitis A es endémica. • Personas implicadas en la cadena alimentaria y tratamiento de aguas. B·- Hepatitis B: el virus de la hepatitis B recibe el nombre de partícula “DANE”. Estructuralmente pueden distinguirse en él las siguientes partes: • Genoma viral: contiene la información para la replicación viral. • Cápsula: es la parte externa de la estructura y se denomina antígeno de superficie ó HBsAg. • Núcleo-cápside ó core: formado por DNA y proteínas, y se denomina HBcAg Actualmente este virus es el causante de dos millones de fallecidos/años de entre los aproximadamente trescientos millones de portadores crónicos identificados en todo el mundo. La enfermedad se trasmite principalmente por 3 mecanismos: ~ Vía parenteral: contacto con sangre o derivados sanguíneos, hemodiálisis, compartir agujas o jeringas en drogadicción intravenosa. ~ Vía sexual ~ Vía perinatal Cursa con ictericia, tiene un periodo de incubación de entre 1-6 meses, es fulminante en el 1% de los casos, y tiende a cronificarse en un 15-20% de los casos. En las personas afectadas existe un mayor riesgo que en la hepatitis A de sufrir procesos neoplásicos malignos. Un estudio serológico adecuado va a permitir: • Establecer la etiología (Aguda ó crónica de la infección) y determinar en cada caso su estado evolutivo. • Detectar las mujeres gestantes portadoras del virus de la hepatitis B. • Detectar la enfermedad crónica asintomática en niños de madres portadoras del virus. • Determinar el estado inmune previo a la vacunación de individuos con riesgo de infectarse. • Realizar estudio epidemiológico. Para la realización de dicho estudio serológico de la infección por el virus de la hepatitis B es necesario valorar la ausencia o presencia así como el estudio de los siguientes marcadores: ~ HBsAg: es el denominado antígeno Australia ó antígeno de superficie y forma parte de al estructura externa del virus. Su presencia en el suero indica infección actual del virus de la hepatitis B, pero no informa de si la infección es aguda ó crónica. Un HBsAg negativo no excluye necesariamente una infección por el virus. ~ HBcAc: son anticuerpos originados en respuesta al estímulo antigénico del core. Aparece en fases muy temprana de la infección (concentraciones altas) y suelen mantenerse durante muchos años en bajas concentraciones en personas que ya están curadas. En concreto la presencia de anticuerpos del tipo IgM (HBcAc IgM) es indicación de infección activa reciente. Es l prueba más útil para diagnosticar una hepatitis aguada, ay que si sale positiva la confirma y si da negativa permite descontarla. ~ HBsAc: son anticuerpos contra el HBsAg. Se detectan como únicos marcadores en las personas vacunadas, en los recién nacidos de madres portadoras. ~ HBeAg: es el antígeno e del virus de la hepatitis B. Su presencia indica replicación activa del virus y por tanto la posibilidad de contagio de la enfermedad. ~ HBeAc: son anticuerpos contra el antígeno e de la hepatitis B. Suele aparecer 2 semanas después del inicio de los síntomas y persiste durante muchos meses. La aparición de esto anticuerpos y la desaparición simultánea del HBeAg indica un buen pronóstico. ~ DNA y RNA del virus de la hepatitis B: su positividad implica generalmente replicación activa del virus. La vacuna en el caso de la hepatitis B debe proponerse a aquellas personas que presenten un mayor riesgo de padecer la enfermedad: • personal sanitario • toxicómanos por vía parenteral • cualquier persona que consulte por u a enfermedad de transmisión sexual • entorno de afectados y portadores del antígeno de superficie del virus (HBsAg) • personas portadoras del VIH y sus parejas sexuales • politransfundidos • hemodializados Un recién nacido de una madre portadora del HBsAg presenta aun mayor riesgo de padecer la infección y que esta evolucione hacia la cronicidad. Es por ello aconsejable (en algunos países es obligatorio) detectar a las madres que sean HBsAg positivas en el último trimestre del embarazo, en cuyo caso será imprescindible: ~ realizar un diagnóstico completo de la enfermedad ~ aplicar medidas de profilaxis al entorno para prevenir el contagio ~ proceder a la serovacunación del recién nacido en las hors siguientes al nacimiento ~ par proceder al diagnóstico clínico de la hepatitis B se recurre en la actualidad a técnicas inmunológicas que permiten identificar anticuerpos específicos frente a diversas proteínas antigénicas del virus, o que hacen posible la detección en el suero de l persona afectada del propio antígeno viral. Las principales técnicas utilizadas para ellos son: • Enzimoinmunoanálisis (EIA): son técnicas que detectan antígenos y anticuerpos en una muestra en base a reacción colorimétricas que utilizan enzimas como marcadores para detectar la presencia de antígenos ó anticuerpos específicos. • Radioinmunoanálisis (RIA): este tipo de técnicas utilizan isótopos radiactivos como marcadores para detectar la presencia de antígenos ó anticuerpos específicos. • Inmunoelectroforesis: son técnicas inmunológicas de precipitación en las que para aumentar la sensibilidad y especificidad a la hora de determinar la presencia de antígenos y anticuerpos se aplica una electroforesis. Una de las más utilizadas es la contrainmunoelectroforesis (Reacción doble y bidimensional). C·- Hepatitis C: se transmite por vía parenteral (no transmisión sexual). En la actualidad el virus C es el responsable de la mayor parte de las hepatitis post-transfusionales. La enfermedad cursa con ictericia, tiene un periodo de incubación entre 2-16 semanas y su aparición fulminante es muy poco frecuente. Aunque la transmisión vertical (madre-hijo) parece ser débil tiene lugar frecuentemente cuando la madrea es además VIH positiva. Alrededor e la mitad de las personas afectadas desarrollan una infección crónica (presenta una mayor tendencia a la cronicidad que la hepatitis B) y un 20% cursa con cirrosis. Aparece ser que las personas afectadas de hepatitis C tienen una mayor riesgo de padecer tumores malignos. Todavía no se dispone de una vacuna adecuada. Para su diagnóstico actualmente sólo tiene interés la determinación de los anticuerpos frente al virus de la hepatitis C, HCAc, aunque esta no es útil en la fase aguda de al enfermedad, puesto que estos anticuerpos pueden tardar meses en aparecer. D·- Hepatitis D: solo aparece en personas portadoras de infección por el virus de la hepatitis. Se transmite por vía parenteral a personas que padecen o han padecido hepatitis B. Cursa normalmente con ictericia mayor frecuentemente provocan un agravamiento de la cronicidad de la hepatitis B. Existe un probable incremento del riesgo de padecer un proceso neoplásico maligno. Para su diagnóstico es útil la determinación de los siguientes marcadores: HDAg: antígeno del virus de la hepatitis D. Sólo se detecta en la fase aguda. HDAc: anticuerpos antivirus de la hepatitis D. El lóbulo es alto en infección agudas ó crónicas activas y bajo en infecciones ya pasadas. RNA del virus de la hepatitis D: es positivo en las hepatitis criónicas activas. E·- Hepatitis E: cursa normalmente con ictericia. Se transmite vía oral-fecal, en epidemias causadas por fuentes de agua contaminadas. Tiene un periodo de incubación de 3-9 semanas no provoca infección hepática crónica, se desconoce el riesgo de provocar tumores malignos. Para este tipo de hepatitis no se conoce vacuna. Tiene especial gravedad cuando aparecen en mujeres embarazadas (Es mortal entre 1040% de los caos) especialmente cuando se infecta en el primer trimestre del embarazo. Es desaconsejable los viajes de estas pacientes a zonas donde la hepatitis E sea endémica. TEMA 15 PRINCIPIOS BÁSICOS DE ESPECTROSCOPIA La espectroscopia se encarga del estudio de la interacción de la energía radiante con la materia (átomos, molécula, iones,..) La espectrofotometría se encarga del estudio de la interacción de la radiación electromagnética (REM) con la materia (átomos, moléculas, iones). INTERACCIÓN DE AL ENERGÍA RADIANTE CON LA MATERIA La energía radiante puede manifestarse como movimientos ondulatorios (REM es energía radiante que lleva asociados un movimiento ondulatorio) o como si estuviese integrada por un flujo de partículas indiscretas ó paquetes ondulatorios energéticos denominados fotones, es decir, presentante propiedad electromagnéticas y energéticas. Estos 2 modelos de la energía radiante no son excluyentes sin o complementarios. PARÁMETROS ONDULATORIOS La radiación electromagnética es una forma de energía radiante (asociada a un movimientos ondulatorio) por lo tanto tiene propiedades ondulatorias propagándose en forma de ondas. En este fenómeno ondulatorio se define: • Amplitud (A): es la longitud del vector eléctrico en el máximo de la onda. • Longitud de onda (): es la distancia entre 2 puntos que se encuentran en el mismo estado de vibración. Se identifica con la letra griega Lambda () y se suele expresar en nanómetros (nm). 1 nm = 10-9 m. también se puede expresar en Angstrons (Aº) = 10-10 m; en micrómetros (mm) = 10-6 m (IR). Cada sustancia absorberá a una longitud de onda característica que dependerá de su estructura, el medio en el que este, etc. • Periodo (T): es el tiempo en segundos y tarda una partícula en realizar una oscilación completa. • Frecuencia (): es el número de ciclos por segundo, es el número de oscilaciones completas que una partícula realiza en una unidad de tiempo generalmente un segundo. La unidad de la frecuencia es el Hertz = seg.-1. Es la inversa a la longitud de onda. C = velocidad de la luz y = longitud de onda. • Velocidad de propagación (v): es el resultado del producto de la frecuencia por la longitud de onda. Depende del medio de propagación de la radiación. • Número de onda (1/): es el parámetro descriptivo cuyos valores es l inversa de la longitud de onda. Se mide en cm-1. • Potencia (P): es la energía del haz de radiación que llega hasta un área determinado en la unidad de tiempo. Existe una relación entre la energía radiante y la longitud de onda de la radiación que se expresa en la ecuación siguiente. En la cual ambos parámetros son inversamente proporcionales de manera que cuanto mayor sea la longitud de la radiación electromagnética menor va a ser su energía y viceversa. COMPORTAMIENTO DE LA MATERIA ANTE LA RADIACIÓN ELECTROMAGNÉTICA La materia está constituida por átomos, iones o moléculas. En los átomos los electrones se disponen en orbitales más ó menos alejados del núcleo, adoptando una configuración característica. En las moléculas los enlaces covalentes entre átomos se forman porque los electrones que los constituyen se localizan alrededor de los 2 centros atómicos de tal manera que se minimizan las fuerzas de repulsión. Las zonas interatómicas ocupadas entre los electrones enlazantes se conocen como orbitales moleculares, y se pueden considerar como la superposición de orbitales atómicos. Cuando se incide sobre la materia con una energía radiantes tiene lugar determinadas transiciones electrónicas (desplazamiento de electrones) desde unos orbitales a otros. Las moléculas cualquiera que sea su posición y el estado físico están en constante movimiento de vibración, rotación y traslación. Los movimientos que experimentan los átomos y moléculas va asociados a una energía que se denomina vibracional, rotacional y traslacional, y por ello presentan diferentes estados energéticos. Tanto las moléculas como los átomos solo pueden presentar determinados estados de energía discontinuos y cuantificados definidos por su configuración electrónica y su disposición espacial. La energía emitida ó absorbida será aquella que permite la transición entre 2 estados energéticos diferentes. La diferencia de energías entre los estados vibracionales, rotacionales y/o electrónicos es única y común para los átomos o moléculas de la misma especie química y por ello solo absorben energía radiante de características definidas , etc). En base a este comportamiento se aplican las técnicas analíticas espectroscópicas para identificar y/o cuantificar en muestras biológicas los parámetros, indicadores de estados fisiológicos y/o patológicos. ABSORCIÓN ATÓMICA DE ENERGÍA En los átomos los electrones ocupan alrededor del núcleo determinados niveles energéticos que definen orbitales características para cada tipo de átomo. Un átomo en estas condiciones se encuentran en su estado fundamental ó de menor energía (Eo). Su configuración electrónica es estable y tiende a mantenerla y a recuperarla si esta a sido alterada. Cuando estos átomos iones o su agrupaciones se someten a la acción de energía de excitación se van a producir una serie de transformaciones y/o desplazamiento dependientes de las características de la energía. En el caso de radiación electromagnética la respuesta del átomo está relacionada con los parámetros ondulatorios de la radiación incidente (,...). De acuerdo con la regla de Kirschhoff una sustancia que es sometida a excitación al recuperar su estado fundamental no puede emitir más energía de la que es capaz de absorber en las mismas condiciones de la irradiación. La emisión de energía puede realizarse de una sola vez o en varios estadio intermedios denominados máximos de emisión. Cuanto más elevado sea el nivel de excitación alcanzado mayor será el número de desplazamientos electrónicos posibles y por tanto mayor el número de líneas espectrales (cada desplazamiento electrónico da lugar a una línea espectral) Si esta excitación se produce a gran escala, la emisión produce espectros continuos como consecuencia del gran número de líneas que no dejan margen para la aparición de discontinuidades finitas. Los átomos tiene espectros de líneas y las moléculas de bandas. En el caso de radiación correspondiente a la banda espectral del ultravioleta y/o del visible la radiación tiene la energía suficiente como para producir el desplazamiento de los electrones de enlace (moléculas) a posiciones más en energética y por tanto menos estables denominados estados excitados (En). Los átomos tienden a estar en el estado de mayor estabilidad que coincide con el estado fundamental (Eo) ó menos energético por lo que los electrones al volver parcial o total a este estado en el proceso denominado relajación la energía que fue previamente ligada a la cantidad de energía incidente. Cada desplazamiento electrónico al que corresponde una determinada cantidad de energía (E = h • ) produce un determinado máximo de absorción ó emisión denominado línea espectral. Para cada elemento existe un número de desplazamientos posibles dependiendo de su configuración electrónica, por lo tanto unas líneas espectrales concretas. Cada elemento determinado nº de electrones nº de líneas espectrales determinadas La energía emitida y reabsorbida está en función del tipo de energía incidente y de la estructura electrónica de la materia. Sólo se absorben aquellos fotones cuya energía es compatible con el paso de los electrones del estado fundamental al excitado y a la inversa [un fotón es un cuanto de energía de luz], la energía de los fotones es inversamente proporcional a la longitud de onda de la luz. Este fenómeno es la base de técnicas espectroscópicas de análisis tales como: ~ Absorción atómica ~ Emisión ~ Fotometría de llama (emisión atómica) ~ Fotoluminiscencia (fluorescencia y fosforescencia) ~ Dispersión Raman ~ Nefelometría ~ Turbidimetría Cuando la radiación incidente es más energética como la radiación X se produce excitación en electrones más internos que acceden a orbitales más energéticos y los huecos ocasionados pueden ocuparse por otros electrones que emiten esa energía para alcanzar posiciones cercanas al núcleo. Este fenómeno es la base de las técnicas analíticas espectroscópicas de: absorción, emisión, difracción, dispersión y fluorescencia de radiación X Los niveles de energía no se afectan por el tipo de combinación química del átomo ni por estado químico del elemento por lo que la absorción y emisión de radiación X se aplica para la identificación de elementos en las muestras. En el caso de la radiación mucha más energética y penetrante su acción se localiza a nivel nuclear donde ocasiona transmutación y desintegración en el núcleo dando lugar a otro elemento que puede ser radiactivo. Este fenómeno es la base del análisis de activación aplicado para la identificación de elementos en las muestras. ABSORCIÓN MOLECULAR DE ENERGÍA Las moléculas (agrupaciones atómicas) presentan estados magnéticos bien definidos que se denominan estados permitidos o Eigestates. Los niveles de energía asociados a dichos estados reciben el nombre de niveles energéticos permitidos también denominados Eigenvaues. El nivel de energía más elevado es el momento magnético que se describe con la letra mu (). También existen estados energéticos intermedios entre el fundamental y los excitados. Las moléculas se encuentran en constante movimiento de rotación, traslación y vibración a los que se encuentran asociados energéticos vibracionales, rotacionales y electrónicos. Una moléculas presenta muchos más niveles cuantizados de energía vibracional que niveles electrónicos y a su vez mayor número de niveles energéticos rotacionales que vibracionales. Los espectros de absorción de las moléculas poliatómicas son más complejos que los espectros atómicos, al presentar un número y de transiciones entre sus numerosos estados energéticos. Para cada estado energético electrónico existen varios vibracionales y para cada vibracional varios rotacionales, lo que supone una gran cantidad de líneas espectrales, tantas que se superponen entre ellas dando lugar a los espectros de bandas que abarcan un intervalo considerables de longitud de onda. La energía asociada a las bandas de una molécula presenta por tanto 3 componentes, el rotacional, el vibracional, y el electrónico. Las moléculas se encuentran en constante movimiento y se distinguen: A·- Un movimiento de vibración de los átomos que constituyen la molécula de tal manera que se alejan y se aproximan entre sí o se mueven en varios planos. La energía asociada a estos movimientos se presentan también en estados bien definidos (es decir, tiene eso valores y no otros), se denomina energía vibracional. Solo son posibles determinados estados energéticos vibracionales, entre los que se producen transiciones moleculares en dirección a estados excitados más inestables y energéticos (Estados vibracionales) a incidir con energía radiante sobre la muestra. El tipo de energía que provoca estas transiciones es la radiación infrarroja insuficiente para ocasionar transiciones electrónicas. A causa de las transiciones rotacionales pueden surgir una serie de picos para cada estado vibracional pero en muestras líquidas y sólidas la rotación está impedida y las pequeñas diferencias de energía no se detectan en el espectro. B·- Un movimiento de rotación por el que las moléculas giran en el espacio llevando asociadas una energía rotatoria que existe solo en estados energéticos bien definidos. Al incidir sobre la muestra con energía radiante de unos determinadas características s producen unas transiciones moleculares a estados energéticos rotacionales superiores o excitados en los que gira con mayor rapidez. Así se origina el espectro rotacional. Las radiaciones que producen este tipo de transiciones son de baja energía y elevada longitud de onda como por ejemplo la radiación microondas. Los gases muestran espectros rotacionales puros en esta banda espectral. C·- Un movimiento electrónico ocasionado tras la irradiación, es decir, transiciones electrónicas hacia estados energéticos más inestables, excitados en los que permanecen un periodo corto. Como en los casos anteriores sólo son posibles determinados estados energéticos dependiendo de la configuración electrónica de los átomos que forman las moléculas y a su vez sólo se permiten transiciones en los electrones de las capas más externas es la radiación correspondiente a las bandas visible y ultravioleta del espectro. En general podemos decir que la irradiación sobre las moléculas de las muestras ocasionan un aumento de la rotación y vibración. La vibración y la rotación molecular depende de la estructura y disposición de los átomos así como de la masa de sus componentes y sus grupos funcionales. Si la irradiación incidente es de radio-frecuencia es capaz de producir excitación electrónica. Sin embargo su acción se localiza a nivel nuclear donde ocasiona un cambio den la distribución de cargas de las capas más internas. Este fenómeno se aplica en analítica clínica y en diagnóstico más imagen (ecografía). EMISIÓN DE ENERGÍA Cuando la materia excitada se relaja a niveles menos energéticos cede su exceso de energía en forma de fotones La excitación puede originarse por diversos mecanismos: A·- Bombardeando la materia con electrones u otras partículas elementales (neutr y prot B·- Exposición de la materia a una chispa de corriente alterna de elevado potencial. C·- Tratamiento térmico con arco ó llama D·- Irradiación con radiación electromagnética Los átomos o iones atómicos muy separados entre sí como ocurre en la materia gaseosa son capaces de emitir energía radiante de escaso número de longitud de onda al haber sido excitada previamente con lo que el espectro será discontinuo ó de líneas. Los espectros continuos de bandas son aquellos constituidos por un elevado número de longitud de onda tantas que la discriminación de las mismas es difícil y resultan de la excitación de sólidos ó líquidos en el que los átomos no tiene mucho espacio entre ellos o bien de la excitación de moléculas. Cuando la energía incidente es una radiación electromagnética tan penetrante como para arrancar electrones de capas cercanas al núcleo y desplazarlos hasta niveles superiores, al volver al estado fundamental se emite radiación (a través de transiciones electrónicas cuantizadas) presentado espectro discretos e emisión de radiación X formados por líneas características de la materia que han sido irradiada. La fluorescencia es un fenómeno de emisión atómica y/o molecular que se produce tras al relajación de la materia previamente irradiada y cuya duración es del orfen de 10-5 segundos desde el inicio d la excitación. Se distinguen varios tipos de fluorescencia: • Fluorescencia de resonancia: se manifiesta cuando la radiación reemitida es de la misma frecuencia y energía que al empleada en al a excitación. • Fluorescencia no resonante: ocurre cuando la materia irradia son moléculas en solución líquida o en estado gaseosos donde la radiación de relajación está desplazado al ser menos energético. Posee una frecuencia menor y una longitud de onda mayor que la excitación este desplazamiento de parámetros ondulatorios se denomina desplazamiento de Stokes. La fluorescencia de las moléculas puede ocasionar radiación de resonancia ó no resonante. Otro caso de emisión es la fosforesceína donde se produce tras la irradiación de la materia un cambio en el Spin de los electrones con lo que la emisión energética posterior se mantiene durante un tiempo que oscila desde unos pocos segundos o minutos ó incluso horas. Este fenómeno fluminiscente tiene lugar cuando una molécula excitada vuelve a niveles menos energéticos denominados estados tripletes emitiendo una radiación de mayor longitud de onda que la de excitación (por lo tanto se produce desplazamiento de Stokes) Los 2 fenómenos (fluorescencia y fosforescencia) se conocen en conjunto con el nombre de fotoluminiscencia. Existe otro fenómeno fotoluminiscencia denominado quimioluminiscencia que se produce en el transcurso de una reacción química. En algunas ocasiones no es el analito el que experimenta el proceso de excitación-relajación si no una especie formada por la reacción del analito y los reactivos químicos utilizados en la prueba. LEYES DE ABSORCIÓN La radiación electromagnética es una propagación de la energía y se considera como un conjunto de fotones que lleva asociadas una onda. El espectro electromagnético es el conjunto de radiación electromagnética cubre un amplio intervalo de energía de radiación y está divido en varias regiones ó bandas espectrales caracterizadas por varios parámetros como: longitud de onda, frecuencia, etc. La relación de la longitud de onda con la frecuencia y la energía de radiación es inversa por lo que las radiaciones más energéticas (las más penetrantes) son a su vez las de mayor frecuencia y menor longitud de onda. La región visible del espectro es la zona de longitud cuya energía radiante es capaz de detectar el ojo humano y va desde el violeta al rojo. Al incidir sobre el material biológico con una (radiación) intensidad inicial (Io) las moléculas y/o átomos del mismo absorben parte de esa radiación denominada Ia, otra parte la dispersa denominada Id y otra atraviesa la muestra It. La cantidad de radiación absorbida (Ia) se ajusta a las leyes físicas concretas dependientes delas características tanto de la radiación como de la materia sorbe la que se irradia. La radiación incidente será igual a la radiación absorbida, la dispersada y la q atraviesa la muestra sin entrar en contacto con los átomos y moléculas de la misma (Io = It + Id + Ia) La relación entre la radiación incidente (Io) y la trasmitida (It) se llama transmitancia se representa por t y se expresa por la ecuación Indica la radiación no absorbida ni dispersada y sus valores se expresan en porcentajes. El porcentaje de transmitancia es % t = La cantidad de radiación absorbida se conoce como absorbancia se representa por A y también denominada densidad óptica (DO) o de extinción (E) y se expresa por la siguiente ecuación LEY DE LAMBERT Ó BOURGER Esta ley expresa que la cantidad de radiación absorbida (A) es proporcional a la absortividad (a) de la muestra y al trayecto óptico (b) suponiendo que el parámetro ondulatorio y la muestra no varíen: LEY DE BEER Esta ley muestra que existe una relación entre la absorbancia de radiación por parte de la muestra (A) y la concentración del analito de la misma, siendo constantes la longitud de onda y el trayecto óptico (=1 cm). Expresado en la ecuación: LEY DE LAMBERT-BEER Es el resultado de combinar ambas leyes de absorbancia e indica la relación directamente proporcional que existe entre la absorbancia de una muestra y su concentración, el ser constantes los valores del trayecto óptico (b = 1 cm), la longitud de onda de la radiación incidente y la absortividad, expresada como absortividad molar (). A = a • b • c = • b • c (moles/L) Nos indica que mayor mayor va a ser la absorbancia, significa que el método va a tener mayor sensibilidad. Entonces la ley de Lambert-Beer la escribimos de la siguientes forma: Siendo: Io: intensidad de la radiación incidente It: intensidad de la radiación final, después de haber atravesado la cubeta de la muestra A: absorbancia: es la medida de la absorción de la radiación por parte de la muestra, también se denomina densidad óptica ó extinción, es una magnitud adimensional, generalmente los espectrofotómetros expresan la absorbancia hasta las milésimas (0’---). Suelen ser magnitudes que oscilan entre 0 y 1. aunque en determinados análisis en los que se mide la variación de la absorbancia con el tiempo se pueden obtener valores superiores. b = trayecto óptico: su valor está estandarizado en 1 cm, la longitud de la muestra que atraviesa la radiación cuando esta se encuentra depositadas en una cubeta. c = concentración de las sustancias (analito) en la muestra: suele expresare sen moles/L) (con la absortividad molar –-) ó gr/l si se utiliza absortividad. : la constante se define como la absorción de una solución de 1 mol/L a una determinada longitud de onda y un espesor de cubeta de 1 cm. Es una característica de cada sustancia y su valor está tabulado para unas condiciones de pH, longitud e onda, temperatura, disolvente, etc previamente establecidos. LIMITACIONES DE LA LEY DE LAMBERT-BEER La relación directamente proporcional entre la absorción de la radiación por parte del analito y su concentración en al muestra, no es lineal len cualquier situación. Si representamos gráficamente entre la absorbancia y la concentración obtenemos una línea recta. Existe unas condiciones limitantes ó desviación de esta ley que depende de determinadas características del analito o que tiene un origen instrumental ó químicos en los que la relación no presenta linealidad. Estas desviaciones son: 1·- Dependientes de las características del analito: A·- Cuando la concentración del analito (átomo, molécula y/o iones) es relativamente pequeña y además existe en la muestra concentración elevadas de electrolitos que son capaces de alterar mediante interacciones electrostáticas, la del analito. Este hecho ocasiona una alteración en al absorción que la desvía de la linealidad. B·- Cuando la concentración del analito es elevada. Se considera que si supera el valor de 0’01M la distancia media entre las especies responsables de la absorción disminuye tanto como para alterar la distribución la carga eléctrica y por tanto su capacidad de absorción de la radiación. A veces aunque la concentración del analito sea inferior a 0’01M el tamaño de las moléculas absorbentes es tal que las interacciones electrostáticas originadas alteran la capacidad de absorción. C·- Cuando existen impurezas (Sustancias ó situaciones distintas al analito) en la muestra que presentan emisión ó absorción de radiación a la longitud de onda del análisis) 2·- Limitaciones químicas: cuando por las características de la técnica o del analito si produce una interacción química (asociación, disociación ó reacción) de este con otras sustancias de la muestra ó de los reactivos. Resultando un compuesto que presenta un espectro de absorción distinto al analito. 3·- Limitaciones instrumentales: cuando por las características del aparato óptico de medida se detecta una cantidad de radiación denominada radiación parásita diferentes a la absorbida por el analito. El cumplimiento de la ley de Lambert-Beer únicamente es estricto cuando la radiación incidente es monocromática, echo que es muy difícil de conseguir dado que los dispositivos que discriminará la longitud e onda no son tan selectivos. Esta desviación de la ley no es perceptible cuando el rango de longitud de onda discriminados es relativamente estrecho. La radiación parásita puede llegar a medirse cuando la radiación incidente es poco energética y la concentración de analito es elevada. Los reactivos comerciales están preparados para que las diferentes técnicas de análisis se realicen dentro del campo lineal de la ley de Lambert-Beer. LA ESPECTROSCOPIA EN ANALÍTICA CLÍNICA Muchos de los métodos analíticos espectroscópicos resultan de la aplicación de la ley de Lambert-Beer. La selectividad en la absorción o emisión de energía por parte de la materia ha hecho posible el desarrollo de métodos analíticos cuya finalidad es la detección en fluido y tejidos biológicos de: ausencia o presencia de parámetros analíticos la cuantificación de la concentración de estos parámetros actividad de numerosas enzimas Estos parámetros analíticos son indicadores de determinados estados tantos fisiológicos como patológicos y junto a otras pruebas permiten la prevención, el diagnóstico y el tratamiento ola evaluación del seguimiento de este estados de salud. Conociendo la longitud de onda óptima (óptima) a los que absorben los parámetros biológicos o analitos (o especies directamente relacionadas con ellos) y aplicando las leyes de espectrofotometría se pueden realizar las analíticas en los laboratorios clínicos. Al incidir la radiación electromagnética sorbe la muestra biológica líquida (por su naturaleza o por que se ha sido preparada en el laboratorio en ese estado para su análisis) las moléculas, iones y/o átomos de la misma, se van a comportar de diferentes formas dependiendo de : ~ El tipo de muestra ~ El tipo de parámetro para identificar o cuantificar ~ La concentración del analito en la muestra ~ Las características de la radiación que incide sobre la muestra () Si se selecciona una longitud de onda a la que sólo o preferentemente absorbe ese analito ó especie directamente relacionada con él y se mide la cantidad de radiación absorbida se podrá cuantificar la concentración de analito en la muestra Esta longitud de onda de medida es característica de cada analito, y técnica de determinación y se denomina longitud de onda óptima de medida (óptima) no tiene porque ser la longitud de onda de máxima absorbancia a no ser que sea una sustancia pura en al muestra (ejemplo: en la determinación de glucosa plasmática por el método de la glucosa oxidasa la longitud de onda es de 620 nm). SISTEMAS ÓPTICOS ESPECTROSCÓPICOS Los métodos ópticos utilizados en espectroscopia tienen su base en 4 fenómenos: ~ Absorción ~ Emisión ~ Dispersión ~ Luminiscencia: fluorescencia, fosforescencia y quimioluminiscencia El aparataje utilizado tiene muchos componentes comunes diferenciándose en su composición dependiendo del tipo de medida que se realice. Como esquema general de un espectroscopio se puede decir que sus componentes son: A·- Fuentes de radiación B·- Sistema de depósito de la muestra C·- Selectores de longitud de onda D·- Detector de radiación E·- Sistema de registro y lectura El conjunto de los elementos ordenados constituyen la óptica del aparato y dependiendo de la colocación se diferencian los aparato de haz sencillos y los de doble haz. En la mayoría de los equipos los componentes C, D, y E son comunes y se disponen en ese orden; son en los componentes A y B en los que se encuentran las variaciones dependiendo del tipo de medida. COMPONENTES DE UN EQUIPO ESPECTROSCÓPICO Veremos un esquema general de un equipo espectroscópico de haz simple y de doble haz. La diferencia entre ambos radica en la división del haz incidente en 2 haces de similares intensidades: el de referencia y el de la muestra. Es sistema de desdoble puede ser un espejo plano que refleja aproximadamente la mitad de la radiación incidente hacia la muestra con orificios que permiten atravesar la radiación no reflejada (radiación referencial) hacia el sistema de detección. Con esta disposición se evitan errores analíticos debidos a fluctuaciones ocurridos en la fuente de radiación. A·- Fuente de radiación: es el origen de la emisión energética en forma de radiación electromagnética lo suficientemente porten y estable para que sea su detección y su medida una vez a atravesado la muestra a analizar. Su diseño depende del tipo de radiación que se pretende aplicar a la muestra (rangos de longitud de onda). Para que se considere una fuente de radiación adecuada a de cumplir 2 condiciones fundamentales: ~ Debe cubrir toda la banda de longitud de onda del espectro que se van a utilizar en la determinación ~ La intensidad de la radiación ha de ser elevada, constante y sin fluctuaciones Existen varios tipos de fuentes: • Fuentes continuas • Fuentes de líneas • Láser • Las fuentes continuas se utilizan sobre todo en adsorción y fluorescencia. Se conocen también como lámparas y pueden ser: monocromáticas (emiten radiación de longitud de onda ó de un rango pequeño de longitud de onda) y policromáticas.(emiten radiación en determinadas bandas de longitud de onda). Ejemplos de fuentes continuas: ~ Lámparas de filamentos de Tungsteno y de halógenos para el visible y el ultravioleta próximo (está entre 250-350 nm) ~ Lámparas de hidrógeno y/o deuterio con radiación del ultravioleta (220-370 nm) ~ Lámparas de arco con xenón ó mercurio a elevada presión para el visible ~ Lámparas de infrarrojos constituidos por sólidos inertes calentados por la temperatura de 2.000ºC. • Las fuentes de líneas emiten radiación en forma de líneas discretas y se aplica con espectroscopia de adsorción atómica, de fluorescencia atómica, de fluorescencia molecular y en espectroscopia Raman. Ejemplo de estas fuentes: ~ Lámpara de vapor de mercurio ~ Lámparas de vapor de sodio ~ Lámparas de cátodos huecos que se usa en espectroscopia de adsorción atómica y fluorescencia ~ Lámparas de descargas sin electrodos, en espectroscopia de adsorción atómica y fluorescencia • Láser (light amplification by stimulated emission of radiation) resulta de gran utilidad debida a su aumento de radiación y a su pequeña anchura de bandas. Se emplea en espectroscopia Raman, en espectroscopio de adsorción molecular, espectroscopia de emisión y en algunos tipos de espectroscopia infrarroja. El dispositivo láser se activa con una radiación o una descarga eléctrica externa que consigue que unos pocos fotones energéticos den lugar a una haz extenso y definido. El interior del medio láser puede estar constituido y un cristal sólido, un material semiconductor, una solución de un colorante ó un gas (el más conocido es el de rubí). Ejemplo: ~ Láser en estado sólido: Láser de rubí Láser de neodimio en un cristal de granate de aluminio e itrio ~ Láser de gas: Láser de átomos de helio-neón Láser de iones de argón ó kriptón Láser de moléculas en medio CO2 ó N2 Láser excimeros de helio, flúor y argón, kriptón ó xenón B·- Dispositivo que contiene la muestra biológica: el dispositivo en espectroscopia de adsorción molecular ultravioleta-visible es una cubeta o celda que debe de estar fabricada de un material que no absorba el material incidente sobre la muestra para evitar errores. Si se mide con luz visible suelen ser de plástico (más baratas y operativas al ser desechables) ó vidrio. En caso de radiación ultravioleta se emplean cubetas de cuarzo ó sílice fundida. El ancho está estandarizado en 1 cm. Las capacidades que pueden presentar son: 0’5 ml (microcubetas), 0’5-2 ml (semi-microcubetas), mayor de 2 ml (macrocubetas). En energía atómica donde los analitos son átomos los dispositivos que contiene las muestras constan de un sistema de atomización y del recipiente propiamente dicho, situado en el trayecto óptico de la radiación. En el caso de un sistema de atomización electrotérmica el espectrofotómetro se conoce con el nombre de cámara o horno de grafito y el recipiente es un tubo de grafito de unos 2 cm de longitud y 0’5 de diámetro con un orificio poro el que se deposita la muestra líquida con una micropipeta. Para esta misma cámara pueden emplearse una variante del tubo de grafito que dispone de una plataforma adicional denominada plataforma de L`vov cuya finalidad es la de conseguir una temperatura homogénea en toda la superficie e interior de al gota de muestra. En el caso de un sistema de atomización térmico el espectrofotómetro se conoce con el nombre de llama y esta es la que contiene a la muestra que accede aspirada y nebulizada a través de un capilar hasta el interior de la llama. A veces es necesario producir en la llama una reacción química para conseguir optimizar la atomización. El recipiente es un dispositivo de material termo-resistente, situado en el trayecto óptico del haz incidente. C·- Sistemas de selección de longitud de onda: su función es la de discriminar ó seleccionar una banda estrecha de longitud de onda de las procedentes de las fuentes de radiación con la finalidad de aumentar la sensibilidad de la medida de absorbancia. Esta radiación seleccionada será o tendrá incluida la longitud de onda óptima del analito Se emplean diferentes tipos de selectores variando su capacidad para discriminar radiación, desde los más grosero (seleccionan rangos más amplios del espectro) a los más selectivos (seleccionan rangos más estrechos de longitud de onda). Algunos ejemplos de estos sistemas son: • Filtros: que absorben la mayor parte de la radiación, exceptuando una banda estrecha de la misma, en al que se incluye la longitud de onda de medida, ya que es muy difícil discriminar con una sola longitud de onda. Los filtros más empleados son los de absorción para medidas en el visible y los de interferencias que operan en las regiones espectrales del ultravioleta ó infrarrojo. • Monocromadores: diseñados para poder realizar mediadas en un intervalo de longitud de onda. Los que se emplean con fuentes de radiación visible, ultravioleta, infrarrojos están constituido con componentes similares: Rendijas de entrada Lente ó espejo que produce un haz de radiación paralelo Redes ó prismas que dispersan la radiación en sus longitudes de onda individuales Un elemento focalizador que enfoque la imagen Una rendija de salida que aísla la banda espectral de medida D·- Detectores: son sistemas que amplifican y transforman la energía radiante no absorbida (It) por la muestra de energía eléctrica y al convierten en una señal eléctrica y cuantificable. Las propiedades de un bien detector son: • Cubrir un amplio intervalo de longitud de onda • Elevada sensibilidad • Elevada relación señal-ruido • Respuestas rápida y constante • Mínima señal en ausencia de radiación incidente • Señal directamente proporcional a la potencia de energía radiante que detecta. Ejemplo: 1·- Detectores de fotones: ~ Fotocélulas ~ Células fotovoltaicas ~ Células de capa-barrera ~ Fototubos multiplicadores ~ Detectores de fotoconductividad ~ Fotodiodos de sílice 2·- Detectores multicanal de fotones ~ Tubos vidicon multicanal ~ Detectores de transferencia de carga 3·- Detectores de calor E·- Registro y presentación de datos: la señal eléctricas producida es amplificada por el procesador de señal que lo transforma en dígitos numéricos que nos puede indicar la transmitancia o la absorbancia de analito de al muestra ó su concentración; dependiendo de cómo se programe el espectrofotómetro en cada caso, ya que debe contar con la capacidad de poder realizar operaciones matemáticas. Se puede registrar el papel para almacenar los resultados y poder realizar posteriores estudios. Los más utilizados son los procesadores de conteo de fotones. PREGUNTAS 1·- En un movimiento ondulatorio definimos longitud de onda como: 2·- Definición de frecuencia 3·- ¿En los enlaces covalentes de las moléculas los electrones que las forman ocupan las zonas interatómicas denominadas? 4·- Las diferencias de energía entre los estados vibracionales, rotacionales y/o electrónicos de los átomos y/o moléculas es única y común para los átomos y moléculas de la misma especie química ¿V ó F? 5·- En los átomos los electrones ocupan alrededor del núcleo determinados niveles energéticos, que definen orbitales característicos para cada tipo de átomo. Un átomo en estas condiciones se encuentra en ............ 6·- Regla de Kirschoff 7·- En el caso de al radiación ultravioleta y/o visible tiene suficiente energía como para producir el desplazamiento de los electrones de enlaces de estados excitados. Estos al volver a su estado fundamental mediante el proceso denominado ............... la energía previamente absorbida a ser .............. en forma de .............. de longitud de onda ligada a al cantidad de energía incidente. 8·- Para cada elemento cada desplazamiento electrónico de un máximo de absorción o emisión denominado ........... 9·- La radiación tiene acción a nivel .............. donde ocasiona ............ ........ en el núcleo dando lugar a otro elemento 10·-. Las moléculas se encuentran en constante movimiento de .......... .......... y ............. a los que se encuentran asociados ......... ............. vibracionales, rotacionales y electrónicos 11·- Una molécula presenta mayor número de niveles energéticos .......... que ......... que a su vez son mayores que los ................ 12·- La radiación del espectro que produce transiciones moleculares a estados energéticos vibracionales excitados es: 13·- La radiación del espectro que produce transiciones moleculares a estados energéticos rotacionales excitados es de ....... energía y ........... longitud de onda como la de ............... 14·- La .......... ................ provoca transiciones electrónicas hacia estados energéticos excitados 15·- Los átomos o iones de la materia gaseosa son capaces de emitir energía radiante de escasos números de longitud de onda al haber sido excitados previamente dando un espectro .......... ......... .............. mientras que los espectros ........ ............. ............. resultan de al excitación de átomos sólidos o líquidos. 16·- Tipos de fluorescencia y definirlas 17·- En la fosforescencia se produce un ........... .............. ............... ................ de los electrones tras la irradiación de las materia. 18·- ¿Cuál es más energética la radiación X o al infrarroja? 19·- Definición de espectro electromagnético 20·- Definición de transmitancia y ¿qué indica? 21·- Fórmula de la absorbancia y definición 22·- Definición de la ley de Lambert-Beer y fórmula 23·- ¿La absorbancia es una magnitud adimensional? 24·- Definición de energía 25·- ¿Es una limitación de la ley de Lambert-Beer que la concentración del analito sea elevada (mayor de 0’01 M) ó aunque sea menor a 0’01 M el tamaño de las moléculas crea interacciones electrostáticas? 26·- Las limitaciones de al ley de Lambert-Beer son de 3 tipos, nómbralas. 27·- ¿Qué es la longitud de onda óptima de medida de un analito? 28·- Esquema general de un espectroscopio y dibuja el de doble haz. 29·- ¿Qué condiciones debe reunir la fuente de radiación? 30·- Tipos de fuentes continuas 31·- El láser se caracteriza por su .......... ............ ............. y su ........... ............. ............... 32·- ¿Qué tipo de cubetas se usaría con radiación ultravioleta? 33·- En espectroscopia atómica usamos los sistemas de atomización que pueden ser de 2 tipos. Nómbralos y di como se denomina entonces el espectroscopio o espectrofotómetro. 34·- Los sistemas de selección de longitud de onda permite: .................................... ¿Cómo se denominan los varios tipos? ........................ TEMA 16 ESTUDIO: LÍQUIDO PLEURAL, PERICÁRDICO Y PERITONEAL FORMACIÓN Y LOCALIZACIÓN Las membranas serosas del organismo forman sacos cerrados tapizando las cavidad esplácnicas (rodeando las vísceras). Están formados por 2 hojas: la parietal y la visceral, entre las cuales se encuentra una pequeña cantidad de líquido derivado del suero (líquido serosos) que es secretado por la membrana y cuya función es proteger a los órganos de la fricción. Las membranas serosas más importantes son: la pleura, el pericardio y el peritoneo. La pleura: es una membrana serosa transparente que rodea a cada pulmón. Consta de 2 capa, la pleura visceral que s adhiere a la superficie del pulmón, y la pleura parietal que reviste la superficie interna de la pared torácica. En el espacio situado entre ambas ó cavidad pleural se encuentran el líquido pleural. El pericardio: es una membrana fibro-serosa que envuelve al corazón junto con las raíces de los grandes vasos sanguíneos. Consta de una capa externa ó pericardio fibroso formado por la capa parietal que reviste la superficie interna del pericardio fibroso y la capa visceral adherida al exterior del corazón. Entre las 2 horas se encuentra el líquido pericárdico. El peritoneo: es la membrana serosas más extensa del organismo. El peritoneo parietal reviste las paredes de la cavidad parietal y el peritoneo visceral recubre las vísceras abdominales. El espacio situado entre estas 2 capas ó cavidad peritoneal contiene el líquido peritoneal. La cavidad peritoneal es un espacio potencial completamente cerrado en el varón; en la mujer comunica con el exterior a través de las trompas de Falopio, el útero y la vagina. Con una secreción normal de líquido peritoneal permite los movimientos de las vísceras abdominales con la respiración, el peristaltismo o los cambios de posición. Los fluidos serosos se producen por la hoja parietal de la membrana y se absorbe por los capilares y los vasos linfáticos de la capa visceral en un proceso continuo. El aumento anormal de la cantidad de líquido da lugar a un derrame ó efusión serosa que se forma al dañarse los mecanismos fisiológicos responsables de la formación y/o absorción del líquido ó fluido. Las efusiones serosas pueden ser de diferentes tipos: • Trasudados: fluidos no inflamatorios ó mecánicos que se producen por procesos que alteran la presión osmótica del plasma sanguíneo o la presión hidrostática capilar, sin alterar de forma directa a la membrana serosa. Se da en los siguientes procesos: ~ insuficiencia cardiaca congestiva (fallo de la zona derecha del corazón) ~ Cirrosis hepática ~ Hipoproteinemia ~ Obstrucción de la cava inferior y la subhepáticas (por ejemplo: ateroesclerosis) • Exudado: son fluidos inflamatorios producidos como consecuencia de un procesos patológico como inflamación ó irritación de la membrana serosa y el consiguiente aumentos de la permeabilidad capilar. Se trata de enfermedad que lesionan directamente la capa serosa como: ~ Infección bacteriana ó micótica ~ Neoplasia ~ Traumatismo ~ Enfermedad reumatoide ~ Lupus eritomatoso sistemático ~ Otros: pancreatitis, infarto pulmonar y de miocardio, enfermedades metabólicas,... • Derrame quiloso: es un fluido debido al escape de quilo (es una sustancias alcalina, lechosa, constituida por grasas neutras y opacas debido a la presencia de quilomicrones, que son lipoproteínas que transportan los triglicéridos exógenos a los tejidos. El quilo es formado en el sistema linfático de ahí va por el conducto torácico hasta la vena subclavia izquierda donde se mezcla con la sangre) desde el conducto como consecuencia de: ~ Lesión u obstrucción linfática debida a un trauma, tumor ó tuberculosis. ~ Síndrome nefrótico INTERÉS CLÍNICO El análisis de los líquidos serosos contribuye en muchos casos a la formulación del diagnóstico etiológico de la enfermedad que lo produce. Lo más importante en el estudio de laboratorio es la distinción entre trasudado y exudado, pues ello ya orienta hacia 3 grandes grupos de procesos: mecánicos, inflamatorios ó purulentos (empiema: es una concentración purulenta en una cavidad preexistente como puede ser la pleura, pericardio,...) esta diferenciación se hace en base a una serie de datos proporcionados por el análisis del líquido seroso en cuestión siendo el dato fundamental la cuantificación de proteínas. EXUDADO Más proteínas Más células Glucosa más baja que en suero pH < 7’3 TRASUDADO Proteínas normales Células normales Glucosa igual que en suero pH > 7’3 En el caso del derrame quiloso las características diferenciales son: • Aspecto lechoso • pH alcalino • Aumento considerable de triglicéridos respecto a los niveles séricos • Aumento de los quilomicrones en la electroforesis El análisis habitual del derrame pleural, pericardio y peritoneal de causa desconocida incluye examen bioquímico, citológico y bacteriológico. Es de gran interés el estudio citológico diferencial (citología: estudio morfológico y funcional de la célula) mediante el cual se detectan y diagnostican carcinomas malignos con una sensibilidad y especificidad elevadas. Análisis de los derrames serosos • Físico: ~ Observación del aspecto • Citológico: ~ Recuento de hematíes ~ Recuento de leucocitos ~ Recuento diferencial • Bioquímico: ~ Proteínas totales ~ Presencia de ADA (adenosín-desaminasa) • Microbiología: ~ Tinciones ~ Cultivo ~ Demostración de bacilo tuberculoso ~ Entero-bacterias y anaerobios del tubo digestivo La toma de muestras ó paracentesis consiste en la aspiración de líquido de la cavidad abdominal, torácica ó pericardio. En la paracentesis peritoneal el lugar de función es la línea media del abdomen, entre la sínfisis del pubis y el ombligo. En la toracocentesis se aspira líquido de la cavidad pleural a través del espacio intercostal (justo por encima de la costilla), en la cual previamente se ha constatado matidez franca (la matidez es un sonido obtenido por la percusión de una parte del cuerpo caracterizado por la elevación del tono, la disminución de la intensidad y la ausencia de timbre especial). La interposición de líquido entre la pared torácica y el pulmón transforma el sonido claro pulmonar en mate. Los líquidos serosos se artefactan con rapidez, se lisan fácilmente y con frecuencia coagulan. Para la recogida de las muestras se usan tubos heparinizados ya preparados comercialmente, o bien se preparan poniendo 2 ó 3 gotas de heparina sódica al 1% en un tubo de 10 ml antes de llenarlo con el líquido. Se mezcla rápidamente y se envía con urgencia al laboratorio. EXAMEN FÍSICO Inmediatamente después de haber extraído el líquido se lleva a cabo el examen del aspecto. El simple color ya puede ser de ayuda en el planteamiento del diagnóstico. Cuadro. EXAMEN CITOLÓGICO • Recuento de hematíes y leucocitos: no es muy conveniente el recuento en contadores electrónicos porque los restos celulares pueden dar valores falsamente elevados. La técnica de recuento manual es la que se utiliza. • Recuento diferencial. Estudio morfológico: las células pueden concentrarse por centrifugación, citocentrifugación, filtración con membranas Millipore o similares. En el primer caso se realiza una centrifugación inicial suaves, 10 minutos a 250 G para separar el compuesto celular y el líquido sobrenadante. En este proceso se produce una discreta pérdida celular que no afectará al resultado del estudio citológico. El líquido sobrenadante se distribuye en alícuotas y puede refrigerarse ó congelarse para posteriores análisis químicos. El sedimento celular se resuspende en 1-5 ml de tampón de fosfato isotónico de pH 7’4 para el estudio citológico y puede conservarse en la nevera. Las tinciones empleadas son: Wright, May-Grumwald, giemsa, ó giemsa rápida, … El recuento diferencial convencional se realiza distinguiendo el porcentaje de linfocitos, neutrófilos, macrófagos y eosinófilos. Para la observación detallada de la morfología se tiñe la muestra con la tinción de papaonicolao. Tinción de papaonicolao: A·- Extensión de la muestra: los frotis se realizan sobre portaobjetos cubiertos con una delgada capa de albúmina. La extensión se realiza con otro portaobjetos lo más rápidamente posible, y no debe de ser muy gruesa ya que después será difícil eliminar el exceso de colorante de las partes gruesa. B·- Fijación: cuando la preparación empieza a secarse por los bordes, pero conservando húmedo el centro se fija con alcohol-éter como mínimo 1 hora. C·- Tinción de papaonicolao es la tinción de rutina para citología. Los colorantes utilizados son: hematoxilina, orange G, eosina y verde luz. La metódica de trabajo consiste en: ~ Inmersión del frotis 10 veces en cada alcohol del 50%, 70%, 80%. ~ Lavar con agua destilada ~ Agregar 2 partes de hematoxilina de Harrys, una parte de solución de alumbre amoniacal y filtrar. Teñir durante 2-3 minutos. ~ Lavar con agua destilada. ~ Inmersión en una mezcla de 97 ml de alcohol al 70% y 3 ml de amoniaco durante 3’ ~ Inmersión 10 veces en cada alcohol de 50%, 70%, 80% y 95% ~ Teñir durante 1-3 minutos con el orange G ~ Lavar con alcohol del 95% y pasar después por alcohol absoluto ~ Inmersión en alcohol absoluto y xilol aparte iguales durante 5-15 minutos ~ Aclarar con xilol ~ Montar embalsamo de Canadá (con cubreobjetos) D·- Observación: se realiza preferentemente en las partes finas de la extensión. Los núcleos celulares se tiñen de color azul con los nucleolos azules oscuros o rojo. El citoplasma rosa ó azul según el tipo de célula. La queratina se tiñe de rojo-anaranjado y los hematíes de rojo. EXAMEN QUÍMICO A·- Líquido pleural: debe realizarse siempre la determinación de proteínas en el líquido pleural para la diferenciación de trasudado y exudado. La determinación de ADA es de ayuda para el diagnóstico de pleuritis tuberculosa. Cuando la concentración de la enzima es superior a 45 U/L es bastante sugestiva de tuberculosis pleural, aunque se observan cifras similares en la pleuritis reumatoide y en el empiema. Valores por debajo de 45 U/L descartan prácticamente el origen tuberculoso del problema. La concentración de glucosa en el líquido pleural tiene relación con la sérica. Disminuye en los exudados y es normal en los trasudados se consideran cifras anormales por debajo de 60 mg/dl o bien si es 40 mg/dl menor que la glucosa sérica. Cuando el líquido pleural tiene aspecto lechoso es importante la determinación de triglicéridos. Si están elevados y hay presencia de quilomicrones podría tratarse de un quilotorax (por traumatismo u obstrucción linfomatosa del conducto torácico). En las pancreatitis agudas puede estar aumentadas las amilasas en le líquido pleural. Se consideran valores elevadas cuando rebasan los valores séricos. Los valores de pH inferiores a 7’2 indican una posible evolución del derrame hacia el empiema. B·- Líquido ascítico: los parámetros que se han de examinar siempre son su concentración de proteínas y de otras sustancias más específicas según el diagnóstico que se sospecha. Los niveles de glucosas similares a los séricos disminuyen en la peritonitis tuberculosa y en la carcinomatosis (Carcinoma diseminado por el cuerpo) peritoneales. Además en la carcinomatosis peritoneal el exudado suele ser de tipo hemorrágico. Cuando se produce perforación del intestino delgado o grueso aumenta la actividad de diversas enzimas en el líquido peritoneal, siendo la más específica de este proceso la fosfatasa alcalina cuyos valores aumentan el doble. El amoniaco aumenta considerablemente en la úlcera péptica perforada, apéndice perforado y en el estrangulación del intestino delgado o grueso. C·- Líquido pericárdico: va a disminuir la glucosa en la pericarditis bacteriana y en la inflamación no séptica debida a enfermedades reumatoides ó tumor. TEMA 17 LA ESPECTROSCOPIA DE ABSORCIÓN MOLECULAR ULTRAVIOLETA-VISIBLE-INFRARROJO PROCESO DE ABSORCIÓN ULTRAVIOLETA-VISIBLE Enlace iónico: un átomo ‘roba un electrón a otro átomo porque tiene la suficiente fuerza Enlace covalente: se comparte un electrón debido a que ninguno de los 2 átomos tiene fuerza suficiente como para ‘robar’ ese electrón y por lo tanto lo comparten. Longitud de onda: se define como la distancia entre 2 máximos de un ciclo completo de un movimiento ondulatorio. Se expresa en nanómetros (1 nm = 10-9 m) Frecuencia: es el número de ciclos/ segundo y es inversa a la longitud de onda. Cuanto mayor sea la longitud de onda menor es al energía de un haz de luz. Espectro electromagnético: es un amplio intervalo de energía radiante que incluye desde los rayos gamma (que son los de longitud de onda corta) y hasta los de ondas de radio (que son los de longitud de onda larga). Se divide en regiones: rayos gamma- rayos X- UV- V IR- Microondas. Proceso de absorción: cuando una partícula se encuentra en estado de ‘reposo’ o estado fundamental, interacciona con un haz de luz absorbe energía y pasa a lo que se denomina estados excitados. En la partícula se produce cambios que dependen de las características a la propia partículas (tipos de enlaces,...) y de la energía (longitud de onda) de la luz que interacciona. • Espectro de absorción: cada especie absorbente )Cromógeno) tiene lo que se llama un espectro de absorción característico. Este espectro representa la relación entre la longitud de onda incidente y la absorbancia que presenta una solución de la especie en condiciones definidas de trabajo. La medida de al cantidad de luz absorbida por una solución de una especie absorbente, es el fundamento en que se basa las técnicas de espectroscopia de absorción. Se rige por la ley de Lambert-Beer. La absorción molecular de radiación ultravioleta-visible por una especie atómica ó molecular se produce a consecuencia de la excitación de los electrones de enlace. Debido a esto la longitud de onda de los picos de absorción se puede correlacionar con los tipos de enlaces existentes en al especie que se estudie. Por lo tanto la espectroscopia de absorción molecular resulta valiosa para la identificación de los grupos funcionales de una moléculas. Nos proporciona un método bastante selectivo para el análisis cuantitativo de compuesto cuyos enlaces producen absorción. En las moléculas los electrones responsables de los enlaces covalentes (Se producen una compartición de un electrón entre 2 átomos) se localizan alrededor de los 2 centros atómicos en los denominados orbítales atómicos (orbitales por el cual discurre un electrón). Cuando se combina o se superpone 2 orbitales atómicos, se constituyen un orbital molecular, localizado en el espacio existente entre los 2 átomos. Este orbital puede ser de tipo enlazante de baja energía y mayor estabilidad ó un orbital molecular anti-enlazante, altamente energético e instable (Se marca con un asterisco para diferenciarlo). Los electrones en el estado fundamental ocupan los orbitales de mayor estabilidad o enlazantes. Entonces al incidir sobre la muestra con una radiación de longitud de onda correspondiente al rango del espectro del ultravioleta-visible (la longitud de onda en nanómetros del ultravioleta-visible abarca de 180750 nm). Se producen una serie de transiciones electrónicas entre niveles. Según la cantidad de energía que empleemos se producirá un tipo u otro de transición. Los electrones que absorben las radiaciones ultravioleta-visible en una molécula orgánica son los electrones enlazantes (de baja energía y bastante estabilidad), que están asociados a más de un átomos y los electrones externos o no enlazantes localizados alrededor de átomos como el oxígeno, nitrógeno, azufre y los halógenos. Las longitudes de onda y los picos de absorción ultravioleta-visible dependerá del tipo de enlace presente en cada especie absorbente. Este echo da lugar a la posibilidad de identificación del tipo de enlace y de la especie absorbente por las características de la radiación de la absorción. Algunas aplicaciones de al espectroscopia de absorción molecular ultravioleta-visible son: a) Identificación de grupos funcionales en las moléculas. b) Cuantificación de compuestos que poseen grupos funcionales absorbentes Estas técnicas deben tener selectividades aceptables, buena precisión en general, fácil preparación de las muestras y fácil obtención de resultados. Aproximadamente un 95% de las determinaciones analíticas clínicas de rutina se realizan por estas técnicas. INSTRUMENTACIÓN EN ESPECTROSCOPIA DE ABSORCIÓN MOLECULAR UV-V Componentes: consta de 5 componentes principales: A·- Fuentes de radiación B·- Sistema de depósito de la muestra C·- Selectores de longitud de onda D·- Detector de radiación E·- Sistema de registro y lectura Las características a destacar en al espectroscopia de absorción molecular ultravioletavisible son: a) Fuente de radiación: es necesario una fuente de radiación continua, que abarque un amplio sector de longitud de onda y cuya potencia sea estables. Las más usadas son: a. Lámparas de descarga de deuterio e hidrógeno: la excitación eléctrica a presión reducida de estos elementos general una radiación continua en la banda espectral correspondiente al ultravioleta. Ambas lámparas originan un espectro continuo en al zona del espectro de 160-375 nm. Si al longitud de onda es superior, provoca la formación de líneas de emisión que ese superpone sobre este espectro e interfieren en la medida. Las ventanas de estas lámparas son de cuarzo debido a que el vidrio absorbe radiación de longitud inferior a 350 nm. b. Lámparas de filamento de tungsteno: origina radiación de al región visible e infrarroja cercana del espectro, entre 350-2500 nm. La emisión de radiación depende de al temperatura, que en al mayoría de las lámparas es de 2870ºK. Para controlar la requerida estabilidad del voltaje se emplean transformadores y/o reguladores electrónicos. c. Lámparas de arco de xenón: la excitación eléctrica de una atmósfera de xenón genera una radiación continua en la banda espectral de 250-600 nm. b) Sistema de depósito de la muestra: el equipo de instrumentación para la absorción molecular ultravioleta-visible emplea cubetas o celdas para contener la muestra conveniente preparada con los reactivos del análisis. El material del que están fabricadas no absorbe la radiación procedente de al fuente. Así para longitudes de ondas inferiores a 350 nm se emplea cuarzo ó sílice fundido y cuando la longitud de onda es superior se emplea vidrio de silicato o plástico. Su anchura está estandarizado en 1 cm para que esta sea la longitud de onda de al trayectoria óptica de la radiación. Si se requiere atemperar el contenido de la cubeta (a 37ºC generalmente) la mayoría de los equipos e instrumentos de medida ya poseen dispositivos propios que calientan las muestras. Equipos de espectroscopia de absorción molecular ultravioleta-visible: TIPOS RADIACIÓN DE 1 SOLO HAZ VISIBLE (V) DE DOBLE HAZ ULTRAVIOLETA (UV) SONDA VISIBLE-ULTRAVIOLETA (UV-V) DE UN SOLO HAZ ULTRAVIOLETA-VISIBLE (UV-V) DE DOBLE HAZ UV-V CONTROLADO POR ORDENADOR UV-V DE DOBLE DISPERSIÓN UV-V MULTICANAL UV-V ESPECTROSCOPIA INFRARROJA La región espectral electromagnética correspondiente al infrarrojo se localiza en el intervalo de longitud de onda entre 780-106 nm. Esta zona se subdivide en 3: • Infrarrojo cercano: 780-2500 nm • Infrarrojo medio: 2500-5•104 nm • Infrarrojo lejano: 5•104-106 nm Las aplicaciones en analítica cualitativa y cuantitativa de compuestos orgánicos son múltiples. En clínica se emplean en análisis a cálculos renales. Los datos de absorbancia, transmitancia, composición y/o concentración del analito se obtiene por comparación de la magnitud de la muestra con los estándares. a) Fuentes de radiación (IR): están constituidas por sólidos inertes a los que se les aplica una energía térmica entre 1500-2200ºK y se consigue la emisión de una radiación continua y estable. Las más usadas son: a. Emisor de Nernst: es de forma cilíndrica y se le aplica una corriente eléctrica que se consigue elevar su temperatura hasta los 2200ºK. b. La fuente globar: es un cilindro de carburo de silicio al que se le aplica una corriente eléctrica y alcanza temperaturas de hasta 1500ºK. c. La fuente de LÁSER de dióxido de carbono; la lámpara de filamento incandescente; la lámpara de filamento de tungsteno (sirve para el IR cercano). En casi todos es necesario un sistema de refrigeración de la fuente para evitar su destrucción térmica. b) Sistema de depósito de la muestra: son celdas o cubetas desmontables que suelen presentar trayectoria ópticas menor que otras técnicas espectroscópicas. Estas cubetas van a ser de 0’1-1 mm con posibilidad de variar las dimensiones. c) Detectores: a. Detectores térmicos: cubren toda la región infrarrojo excepto parte del cercano y mide la variación de temperatura que experimenta la fuente a su paso por la muestra. Las más utilizados son los termopares, constituidos por la unión y calentamiento eléctrico de 2 metales (bismuto y antimonio) y los volómetros ó termómetros de resistencia. b. Detectores piroeléctricos (piroelectricidad: conjunto de cargas eléctricas que se presentan en la superficie de diversos cristales por los cambios de temperatura): están formados por láminas de material piroeléctrico. c. Detectores fotoconductores: están constituidos por una lámina semiconductora que varía su resistencia eléctrica en función de la temperatura. d) Sistemas de registro y lectura: en muchos equipos instrumentales se dispone de una base de datos donde se registran los espectros infrarrojos de moléculas de frecuente análisis, de tal manera que el espectrofotómetro infrarrojo es capaz de identificar el espectro de la muestra problema con alguno que tenga en la memoria. TIPOS 1·- Espectroscopia infrarroja de reflexión interna: se aplica a muestras que por sus características presentan dificultades analíticas que se fundamentan en el fenómeno de reflexión que experimenta la radiación infrarroja al atravesar la muestra. 2·- Espectroscopia infrarroja fotoacústica: se basa en el fenómeno de dispersión de la radiación que experimentan ciertas muestras sólidas y/o líquidas. 3·- Espectroscopia infrarroja de reflectancia en el infrarrojo cercano: se aplica para el análisis de muestras sólidas debidamente preparadas (disminución del tamaño de la partícula,...) dependiendo de la preparación de la muestra esta va a dispersar de unas manera característica del haz de radiación infrarrojo cercano con el que incide. 4·- Espectro infrarroja en el infrarrojo lejano: se emplea en el estudio de analitos inorgánicos. Se emplea para el análisis de identificación de algunos compuestos tóxicos que pueden encontrarse en muestras biológicas. 5·- Espectro de emisión infrarroja: estudia la emisión infrarroja de la muestra tras haber sido incidida con radiación de esa mima región espectral. Se usa en la identificación de sustancias tóxicas y/o contaminantes en muestras clínicas y medio ambientales. FUNCIONAMIENTO GENERAL DEL EQUIPO DE INSTRUMENTACIÓN EN ESPECTROSCOPIA DE ABSORCIÓN MOLECULAR UV-V E IR El procedimiento general por el cual se realiza las determinaciones analíticas se puede resumir en la siguiente secuencia: a) Conexión a la red b) Encendido del equipo c) Selección del tipo de medida a. Absorbancia (A, DO, E) b. Transmitancia (t) c. Concentración (c) d. Cinética (A, DO) d) Ajuste de longitud de onda de medida e) Ajuste del blanco (elimina la radiación absorbida que no es debida al analito) puede ser: blanco reactivo, blanco muestra, blanco agua, blanco aire. f) Colocación de la muestra problema: si es un sistema de autoanálisis (mide varias muestras a la vez), se colocan las cubetas debidamente identificadas en el sistema autoanalizador. Las cubetas o celdas han de estar libres de huellas de suciedad para evitar errores, y colocadas de forma que el haz las atraviese en dirección perpendicular de las paredes de la cubeta. g) Medida de la magnitud seleccionada y obtención del dato correspondiente a la muestra. En algunos casos de análisis cualitativo, el dato resultante consiste en la identificación del analito a comparación con espectros almacenados en la memoria o en la bibliografía. NEFELOMETRÍA Y TURBIDIMETRÍA: PRINCIPIOS BÁSICOS Son 2 técnicas relacionadas con la espectroscopia de absorción molecular en al zona del visible, tanto en los aspectos teóricos como en la práctica. Se basan en el comportamiento de la materia al incidir sobre ellas una radiación electromagnética: ocurre fenómenos de dispersión, reflexión, bloqueo y transmitancia des resto de la radiación hasta alcanzar el detector. La muestra presenta una serie de características: son partículas no transparentes en el seno de un líquido, es decir, precipitados, suspensión coloidales,... La nefelometría estudia la radiación dispersada de la muestra en ángulos diferentes al de incidencia de radiación; y la turbidimetría estudia la radiación no dispersada. • Nefelometría: la dispersión de al radiación es un fenómeno físico resultante de la interacción entre esta y las partículas en suspensión en un medio adecuado. Los ángulos de medidas de radiación dispersada oscila entre los 15-90º. Esta dispersión está influida por: ~ La concentración del analito ~ Volumen, tamaño, peso y número de partículas. ~ Longitud de onda de al radiación incidente ~ Distancia del detector a la cubeta. El grado de influencia de estos factores está reflejado en la teoría de Ray-Leigh. Entre otras cosas expone que: a) La intensidad de luz dispersa es: a. Directamente proporcional a la concentración de las partículas de la muestra b. Directamente proporcional al peso molecular de las partículas de la muestra. c. Inversamente proporcional al cuadrado de la distancia entre el detector y la cubeta. d. Inversamente proporcional a la cuarta potencia de la longitud de onda b) La distancia entre el detector y la cubeta se relaciona de forma directa con la sensibilidad de los métodos aplicados. c) El modelo de dispersión depende de la relación del tamaño de la partícula y la longitud de onda de la radiación incidente. El equipo de medida es específico para estas determinaciones y está diseñado de tal manera que el detector pueda variar de posición con respecto a la dirección de la radiación incidente en unos ángulos preestablecidos. Si en un principio la muestra es transparente y tras la aplicación de los reactivos aparecen las partículas en suspensión, para ajustar el espectrofotómetro se emplean generalmente un blanco muestra, que elimina el bloqueo de la radiación incidente por causas ajenas al analito y debidas a la muestra. • Turbidimetría: mide la radiación bloqueada por parte de la muestra relacionando la intensidad del haz incidente y del resultante de traspasar la cubeta. La detección de la radiación trasmitida se realiza en la misma dirección que el haz incidente y al señal puede expresarse como absorbancia o transmitancia. Este fenómeno se rige por la ley de Lambert-Beer: la intensidad de la radiación bloqueadas por la muestra es directamente proporcional a la concentración del analito. El equipo de medida suele ser el mismo que en espectroscopia de absorción molecular en el rango del visible. PREGUNTAS DEL TEMA 17 1) Define longitud de onda 2) Define frecuencia 3) Define espectro electromagnético 4) ¿Qué representa el espectro de absorción característico de cada especie absorbente? 5) La absorción molecular de radiación ultravioleta-visible por una especie atómica o molecular se produce a consecuencia de ............... 6) Define orbital molecular 7) Di 2 aplicaciones analíticas de la espectroscopia de absorción molecular UV-V 8) Menciona los 5 componentes de una espectroscopia de absorción molecular UV-V 9) ¿De qué material esta fabricada la cubeta o celda para el depósito de la muestra para longitudes de ondas inferiores a 350 nm? 10) ¿En que 3 intervalos se divide el infrarrojo? 11) Menciona 2 fuentes de radiación de infrarrojos 12) ¿Qué dimensiones tiene las cubetas o celdas utilizadas en espectroscopia IR? 13) Menciona 2 tipos de espectroscopia infrarroja 14) ¿En qué consiste la nefelometría? 15) ¿En qué consiste la turbidimetría? TEMA 18 ESPECTROSCOPIA DE ABSORCIÓN ATÓMICA CON ATOMIZACIÓN DE LLAMA (F-AAS) Y ELECTROTÉRMICA (GF-AAS) PROCESO DE ABSORCIÓN ATÓMICA Es el fenómeno que se produce tras someter a irradiación a la materia con una longitud de onda capaz de ser absorbida por sus átomos. Por ello es necesario la transformación de la muestra a vapor atómico mediante el proceso de atomización. Existen varios sistemas de atomización que son los que dan nombre a las técnicas analíticas: • Espectroscopia de absorción atómica con atomización de llama (F-AAS) • Espectroscopia de absorción atómica con atomización electrotérmica (GF-AAS) Los electrones ocupan alrededor del núcleo determinados niveles energéticos que definen orbitales característicos para cada tipo de átomo. Un átomo en estas concisiones se encuentran en estado fundamental ó de menor energía (Eo) y su configuración electrónica es estable. Cuando los átomos, iones o sus agrupaciones se someten a la acción de radiación electromagnética. La energía absorbida producen el desplazamiento de los electrones más energéticos y por lo tanto menos estables. Los átomos tienden a recuperar el estado menos energético, por lo que toda o parte de la energía que fue previamente absorbida es reemitida en forma de radiación electromagnética cuya longitud de onda es similar o superior a la absorbida. La relajación provoca radiación ultravioleta-visible o X. Cada desplazamiento electrónico es una línea espectral. Los átomos tienen espectros de líneas relativamente simples. PROCESO DE ATOMIZACIÓN Son aquellos procesos que aportan la suficiente energía al analito como para alcanzar su forma atómica. Tiene lugar en los denominados sistemas de atomización que en el caso de la llama lo constituyen el nebulizador, la cámara de premezcla y el mechero y en el caso del horno o cámara de grafito lo constituye el tubo de grafito. Los sistemas de atomización pueden ser: • Continuos: en los que la muestra accede al sistema de forma continua, dando una señal, también continua en el tiempo. • Discretos: en los que una alícuota (parte proporcional) se deposita en el sistema de atomización obteniéndose un máximo de señal que disminuye hasta 0 cuando la muestra desaparece. La energía aplicada a la muestra para atomizarla puede ser: ~ Energía térmica: espectrosc. de absorción atómica de llama es un sistema continuo ~ Energía eléctrica: sería la cámara de grafito y sería un sistema discreto. Se emplean muestras líquidas o preparadas en disolución ESPECTROSCOPIA DE ABSORCIÓN ATÓMICA CON ATOMIZACIÓN DE LLAMA (F-AAS) Es una técnica con buena precisión (tiene un coeficiente de variación cercano al 1%) pero es menos sensible que otras espectroscopias de absorción atómica (cámaras de grafito). Las etapas de la atomización son: 1) Aspiración: la muestra es aspirada por un capilar hasta el nebulizador con unas concisiones de flujo o caudal (litros / minutos) previamente optimizadas. 2) Nebulización: transformación de la muestra liquidada en un aerosol por disminución del tamaño de las partículas. 3) Mezcla de la muestra nebulizada con los gases: la finalidad es la de facilitar después su calentamiento a la llama. Este fenómeno se realiza en la cámara de premezcla. Después el aerosol se enfrenta a un dispositivo denominado Spoiler (De plástico) ó bien a la bola de impacto (vidrio) que reducen aún más el tamaño de partícula que accede ala llama. 4) Desolvatación: también conocida como secado o evaporación rápida del líquido que contiene el analito (suero, plasma, reactivo,...) una vez a accedido a la llama del quemador o mechero 5) Volatilización, mineralización ó disociación de las moléculas del analito del estado sólido al estado gaseosos. 6) Atomización: ruptura de los enlaces del analito con otros átomos transformándolos en átomos elementales que es la especie absorbente. Es la etapa más crítica de estas técnicas, limitante de su precisión y exactitud. Hay que intentar que al energía aplicada en la muestra sea tal que produzca la atomización del analito y evitan que arranque algún electrón apareciendo su forma catiónica que no absorbe de la misma manera que al elemental. A las temperaturas optimizadas establecidas par el análisis sólo el porcentaje reducido del 1% está ionizado por lo que su absorción es prácticamente despreciable. TIPOS DE LLAMAS En general las llamas están compuestos por varias zonas: 1) Zona de combustión primera: donde es difícil alcanzar un equilibrio térmico por lo que no se emplea en la atomización de la muestra. 2) Zona interconal: donde la temperatura es máxima y homogénea. Es la más utilizada para la atomización. 3) Cono exterior: donde se producen una serie de reacciones secundarias y que tampoco se utiliza. Las características de cada llama (Forma, temperatura, velocidad de combustión) depende de la mezcla de gases que la componen. COMBURENTE (medio en que arde) AIRE OXÍGENO AIRE OXÍGENO AIRE OXÍGENO ÓXIDO-NITROSO COMBUSTIBLE (lo que arde) GAS NATURAL GAS NATURAL HIDRÓGENO HIDRÓGENO ACETILENO ACETILENO ACETILENO TEMPERATURA 1700 – 1900ºC 2700 – 2800ºC 2000 – 2100ºC 2550 – 2700ºC 2100 – 2400ºC 2050 – 3150ºC 2600 – 2800ºC La temperatura de la llama es fundamental en el proceso de atomización, dependiendo de esta se distinguen: ~ Llamas frías: aire-propano que alcanza 1800ºC. Útiles para medir elementos de fácil atomización como metales alcalinos y alcalino-térreos ~ Llamas calientes: aire-acetileno que alcanza 2400ºC. Es la más empleada en analítica clínica, capaz de atomizar más de 30 elementos. ~ Llamas más calientes: óxido-nitroso-acetileno cercano a 3000ºC. Útiles para la determinación de elementos de difícil atomización. Como el aluminio silicio y titánico. No es muy empleado en bioquímica clínica. La proporción de la mezcla de gases se establece para cada determinación (combustible-comburente) aunque por lo general la proporción es 1:1 y esa llama se conoce como llama estequiométrica. Una llama reductora presenta mayor proporción de comburente. La mezcla combustible-comburente influye de forma directa en el número de átomos logrados y por tanto en la sensibilidad y el límite de detección del método. Así mismo hay una serie de factores que va a influir en la reacción combustible-comburente, como son la naturaleza de al muestra y el flujo de gases hacia la llama. ATOMIZACIÓN ELECTROTÉRMICA El proceso de atomización es similar al del caso de la llama desde la etapa de desolvatación ya que la muestra se deposita directamente en el interior del tubo de grafito y se establece una diferencia de potencia entre los extremos que provoca una subida de temperatura en el tubo suficiente como obtener los átomos del elemento analizado. Con este tipo de atomización se consigue una elevada sensibilidad de los métodos. Pero con respecto a la llama la precisión es menor (C.V. 0’5%). Otras ventajas frente a la atomización con llama son el elevado tiempo de análisis y la mayor destreza requerida por parte del operador. Los volúmenes de muestra que se emplean oscilan entre 0’5-100 l por lo que es necesario utilizar esta técnica cuando se dispone de volúmenes pequeños, los limites de detección que se alcanzan son cercanos a los 10-10-10-3 gr de analito. La temperatura se va elevando de forma controlada por un programa de atomización de temperatura y tiempo que consta de varias etapas: • Secado • Mineralización • Atomización • Limpieza del tubo (para que quede libre de restos de la muestra analizada y preparado para recibir otra nueva). Cada una de estas etapas, excepto la atomización puede a su vez tener subetapas con el fin evitar una subida tan brusca de temperatura que volatilice al analito antes de su atomización En cada etapa se distinguen 2 tiempos: ~ Tiempo de rampa o tiempo necesario para alcanzar la temperatura fijada ~ Tiempo de permanencia en esa temperatura. Dado que se alcanzan temperaturas cercanas a los 3.000ºC para refrigerar el sistema se establece un circuito de gas argón que rodea el tubo por dentro y por fuera. También se emplea para eliminar del interior los vapores procedente de la matriz de la muestras producidas en las primeras etapas del programa de atomización. Si se representa de forma gráfica el perfil de atomización de un elemento obtenemos por ejemplo el selenio. (Dibujo de la gráfica) EQUIPO DE INSTRUMENTACIÓN EN LA ESPECTROSCOPIA DE ABSORCIÓN ATÓMICA Los componentes no difieren del esquema general pero con características propias. • Fuente de radiación: emiten una radiación monocromática (De una sola o de un estrecho rango de longitud de onda) específica por lo que se denomina fuentes de líneas ó lámparas, y las usadas son: ~ Lámparas de cátodo hueco ó HCL: es una lámpara de vidrio que contiene en su interior un gas inerte como argón o neón y electrodo de trabajo (el ánodo positivo y el cátodo hueco negativo). El cátodo está constituido del material del mismo elemento que se pretende analizar en la muestra (analito). Cuando se aplica potencia en la lámpara los átomos del gas se ionizan (argón) e impactan con el cátodo, esta colisión de los cátodos de argón produce una excitación de los átomos del cátodo al absorber su energía (M*) y esto lleva consigo a su paso un estado menos estable. Al volver a su estado emite una radiación característico del elemento a analizar. Son lámparas de emisión de líneas, por ejemplo si se animaliza la porción sérica de cobre se utiliza una lámpara de cobre de tal forma que si en la muestra hay cobre obtenemos un valor de absorbancia directamente proporcional a la concentración de analito en al muestra (cumple la ley de Lambert-Beer con sus limitaciones). El inconveniente de estas lámparas es su envejecimiento progresivo debida al desgaste del cátodo y su elevado coste ya que en general es necesario disponer de un lámpara para cada elemento. ~ Lámparas de descarga sin electrodo ó EDL: está n constituidas por una pequeña cantidad o una sal del analito situado en un tubo sellado de cuarzo que contiene un gas inerte a baja presión. El tubo está rodeado por un a bobina de RF (radio frecuencia) que produce un campo del orden de 30 megaHz y protegido por una armadura (carcasa cerámica) y con una ventana transparente. Cuando se aplica un potencial a la lámpara el gas se excita y vaporiza el metal o su sal. Los átomos del analito se excitan al chocar con los átomos del gas emitiendo la radiación característica del elemento a analizar. Esta radiación es absorbida por el analito. Las lámparas EDL tienen mayor intensidad y duración por lo que permiten analizar elementos volátiles y/o cuya concentración en la muestra es inferior. • Modulador: es un dispositivo situado entre la fuente de radiación y el sistema selector de longitud de onda que regula la salida de al fuente (de radiación), para que su intensidad oscile a una frecuencia constante, así la energía radiante incide sobre la muestra a pulsos, es decir, de una manera intermitente. Al detector llegan 2 tipos de señales, una alternante desde la fuente y otra continua que procede de la llama. Su finalidad es la de discriminar la absorbancia del analito de la absorbancia de fondo independientemente de este. El modulador interrumpe el haz y en es e momento el detecto sólo registra la radiación que absorbe la muestra. Se puede utilizar filtros ó discos metálicos cortantes. • Sistema selector de longitud de ondas: entre la lámpara y la muestra se encuentra el monocromador cuya función es la de aislar de la fuente de radiación la longitud de onda a la que absorbe el analito (línea de resonancia –R) en el rango menor de nanómetros que le sea posible. Es necesario ajustar la rendija espectrales al máximo para permitir un aislamiento satisfactorio de la línea de resonancia. Las lámparas solo trasmite una estrecha banda de radiación centrada en la longitud de onda de resonancia. Se suele utilizar la red de difracción: consiste en una lámina de vidrio con estrías capaz de dispersar o separar los componentes de la radiación incidente procedente de al fuente. El haz accede al monocromador por la rendija de entrada se refleja por una lente o espejo y se dirige a la red. En la red se dispersa en varios ángulos dependiendo de al longitud de onda. Si la red se coloca en un ángulo determinado la línea de resonancia, R, puede dirigirse hacia un segundo espejo a través de la rendija de salida. • Sistema de depósito de la muestra: la muestra está atomizada cuando se irradio con el haz incidente. Los sistemas de depósito utilizados son: ~ Para la llama: la llama misma procedente de un quemador, es decir, un mechero es la que contiene la muestra nebulizada en el seno del gas. Las dimensiones del mechero han de ser tales que el área de la rendija logre que la velocidad de flujo de la salida de los gases supera la velocidad de entrada, para evitar retroceso y explosión de gases en la cámara de premezcla y que el trayecto óptico consiga una buena sensibilidad. El material del mechero ha de ser resistente par evitar una modificación de sus dimensiones. Se utilizan mecheros de 2 tamaño: 100 • 1’5 ó 50 • 1’5 (longitud • anchura en mm). ~ Para la cámara de grafito: es el tubo de grafito con 3 posibilidades: pirolítico, no pirolítico y con plataforma de L’Vov en su interior para conseguir una temperatura en toda la extensión de la muestra. • Sistema de atomización de la llama: nebulizador, cámara de premezcla y mechero. El nebulizador está compuesto por un dispositivo de conducción cilíndrico que varía el diámetro para que ese produzca el efecto ventury. El gas fluye a través del sistema y provoca una presión reducido en el efecto ventury por lo que la muestra líquida o en disolución va a ser aspirada por un capilar. Cuando la solución sale del capilar el gas la dispersa en forma de fina niebla. La muestra accede nebulizada a la lámpara de premezcla donde va a chocar con dispositivos tales como Spoiler plástico y al bola de impacto de vidrio que reducen más el tamaño de partículas. Las gotas de gran tamaño que se quedan en la cámara se condensa y son eliminadas a través de un sistema de drenaje que va a parar a unas garrafas. • Microprocesador electrónico: va integrado en el equipo y se maneja con u teclado. Se usa para: ~ Selección de longitud de medida: absorbancia, transmitancia,... ~ Selección de las condiciones de medida: longitud de onda, rendija,... ~ Registrar los valores de señal obtenidos por los patrones en la recta de calibrado, ajustar dicha recta e interpolar los valores a la señal de las muestras problemas. ~ Controlar en el caso de disponer de ello el sistema de autoanálisis se adopta al espectrofotómetro un inyecto automático de las muestras con lo que se consigue mayor precisión y se invierte menos tiempo en el análisis. FUNCIONAMIENTO GENERAL DE LAS ESPECTROFOTÓMETROS DE AL ABSORCIÓN ATÓMICA Pueden ser de un solo haz o de doble haz. Para su puesta en marcha requieren una cuidadosa manipulación debido al empleo de gases como el acetileno, en la llama altamente inflamable y a la multitud de factores que hay que tener en cuenta. INTERFERENCIAS EN ABSORCIÓN ATÓMICA Son las causas de errores más frecuente en esta técnica. Podemos distinguir: • Interferencias espectrales: ocasionadas por líneas espectrales que el monocromador no es capaz de discriminar (por ejemplo la existencia de elementos con líneas de resonancia próximas a al de absorción del analito) • Interferencias químicas: ocasionadas por la combinación del elemento a analizar con otras sustancias presentes en la muestra dando lugar a la formación de compuestos volátiles ó equilibrios de disociación en el sistema de atomización. También se producen si al atomización del elemento en las disoluciones patrón difiere de la muestra debido a la existencia de sustancias que interfieran. • Interferencias de ionización: la causa puede ser entre otras la elevada temperatura de atomización que hace aparecer otra especie en la muestra que se comporta de manera diferente ante la irradiación. Entonces se disminuye la señal del elemento al reducirse la cantidad de átomos elementales absorbentes. • Interferencias físicas: van a influir en la cantidad de átomos del analito en el sistema de atomización. Se refiere a las características físicas de al muestra, así en el caso de la llama a menor viscosidad mayor velocidad de flujo hacia el sistema da atomización y cuanto mayor sea la tensión superficial menor será el tamaño de las gotitas del aerosol. Ambos efectos producen elevadas absorbancias y viceversa. • Interferencias de absorción no específicas (NSA): también se denomina absorción de fondo, se debe a la resistencia de absorción moleculares o a la dispersión de partículas en el atomizador que se producen como consecuencia de la matriz de la muestra. Esta interferencia puede minimizarse empleando un corrector de fondo que sea una fuente continua de radiación ultravioleta como por ejemplo la lámpara de deuterio. MÉTODO PARA LA CORRECCIÓN DE LA ABSORBANCIA DE INTERFERENCIA • Método de la corrección de las 2 líneas • Método de corrección de fuente continua: puede ser una lámpara de deuterio que emite en el ultravioleta de forma continua y que está alojada en el interior del espectrofotómetro de absorbancia atómica. Esta lámpara mide la absorción molecular de las interferencias de absorción no específicas para corregir esta absorción debida a la matriz de esta muestra se hace pasa el detector (en fases alternativas) la radiación de la fuente HCL Ó EDL (que mide la absorbancia específica y al no específica) y al de al lámpara de deuterio (que solo permite la absorbancia de la no específica). • Método de corrección basada en el efecto Ziman • Método de corrección basado en el efecto Smith-Hieftje • Método del tampón de radiación • Método de formación de un compuesto para la sustancia interferente • Método de formación de un complejo • Otros métodos OTRAS ESPECTROSCOPIAS DE LA ABSORCIÓN ATÓMICA DE ATOMIZACIÓN DE LLAMA 1·- Técnica de análisis por inyección en flujo (FIAS): consiste en la introducción de la muestra en el seno de una corriente de un líquido portador. Se pueden realizar sobre la corriente procesos físicos y químicos a la muestra. Las posibilidades de la manipulación de al muestra permite : • Determinación de la masa absoluta además de al concentración del analito • Análisis especializados, etc • Elevada capacidad de muestreo El análisis final puede realizarse por: • Es absorbancias atómica de llama. • Sistema de atomización de plasma inducido 2·- Técnicas de generación de vapor: se divide 2: • Técnica de vapor frío: consiste en añadir a la muestra un agente reductor normalmente estaño que mantiene al analito en su forma elemental. Normalmente se extrae de la muestra con una corriente de nitrógeno. Esta corrientes atraviesa a una célula de cuarzo sorbe la que se incide radiación electromagnética y se aplica la ley de Lambert-Beer. Como el analito ya está atomización es necesario utilizar calor. Tiene como ventaja que da una señal estable. • Técnica de generación de hidruros: consiste en al formación de hidruros del elemento que se pretende analiza al añadir a la muestra, borohidruro de sodio al 1%. Se prepara la muestra en solución acuosa y medio ácido y se mezcla con el borohidruro en una cubeta de vidrio. Como productos de esta reacción se obtiene hidrógeno libre que es capaz de reducir al analito (metales) y constituir el hidruro volátil correspondiente. Los hidruros del analito son arrastrados por una corriente de gas, se conducen a la zona del haz incidente sobre la llama y se registra su absorbancia (por tanto la concentración). Con esta técnica se puede analizar: arsénico, bismuto, estaño, selenio y plomo en tejidos y fluidos biológicos. La sensibilidad es mayor que la de llama y similar a la atomización electrotérmica. PREGUNTAS TEMA 18 1·- Definición de atomización 2·- Tipos de sistemas de atomización. Un ejemplo de cada 3·- Nombra las etapas del proceso de atomización en general 4·- ¿Dónde ocurre la mezcla nebulizada con los gases? 5·- Zonas de la llama 6·- Tipos de llamas según la temperatura 7·- Según la proporción de mezcla de gases ¿Qué tiempo de llama tenemos? 8·- En la atomización electrotérmica los volúmenes de muestras ¿Son mayores o menores que en la llama? 9·- En cada etapa del proceso de atomización electrotérmico existen 2 tiempos denominados: 10·- Nombra los 2 tipos de lámparas más importantes en espectroscopia de absorción atómica 11·- Definición de modulador 12·- El sistema selector de longitud de onda en EAA más usado se denomina: 13·- El sistema de depósito de la muestra es: en la atomización de llama: ......... y en al atomización electrotérmica: ........... 14·- En el nebulizador obtenemos la muestra en forma de un ..... por el efecto ........ 15·- En la cámara de premezcla la muestra nebulizada va a chocar con ......... o bien con .......,.. para disminuir ........... 16·- Las interferencias espectrales están ocasionadas por la ......... de líneas espectrales que el monocromador es incapaz de discriminar. 17·- las interferencias de ionización son debidas a la ........ ........... ........... que hace aparecer otra especie en la muestra 18·- Las interferencias de absorción no específica también se denominan .............. y se eliminan con ............... 19·- ¿Qué nos permite determinar la técnica de análisis por inyección de flujo? 20·- Di los 2 tipos de técnicas de generación de vapor. TEMA 19 ESPECTROSCOPIA DE EMISIÓN ATÓMICA (EEA) Las técnicas de espectroscopia de emisión atómica estudian la emisión de radiación que produce una muestra que previamente ha sido atomizada por diversos sistemas: • EEA de llama • EE fluorescente atómica con atomización de llama ó electrotérmica. • EEA con atomización de plasma • EEA con atomización de chispa • Proceso de emisión: algunos compuestos tienen la propiedad tras haber sido excitados de retornar a su estado fundamental produciendo una emisión de energía radiante. La luz emitida se puede medir y ello constituye el principio de algunas técnicas como la fotometría de llama o la fluorescencia. La fotometría de llama es ampliamente utilizada en el laboratorio de análisis clínico para la determinación de sodio, potasio y en líquidos biológicos. FOTOMETRÍA DE LLAMA Esta técnica está basada en el fenómeno de emisión de luz. Cuando un átomo en estado fundamenta es sometido a la energía calorífica de una llama sus electrones se excitan pasando a niveles superiores de energía. Los electrones son inestables en ese estado excitado y el volver a su estado inicial desprende la energía en forma de luz. La luz desprendida puede poseer distintas longitudes (distintos niveles de energía ó líneas del espectro) que son características de cada elemento de modo que se selecciona en cada elemento aquella longitud de onda que emite con mayor intensidad y tiene menos probabilidad de que se presenten otras longitudes de onda, y cercanas que puedan interferir. Los metales alcalinos (litio, sodio, potasio) son los más frágiles de excitar en la llama de un mechero ordinario de laboratorio. En la práctica este fenómeno se traduce en que cuando se pone una solución de estos metales en contacto con una llama cada uno da un color característica y distinto a esa llama (litio = rojo; sodio = amarillo; potasio = violeta) las longitudes de onda corresponden a esos colores son las empleadas para la determinación de los iones correspondientes. En condiciones constantes y controladas, al intensidad luminosa de la longitud de onda típicamente producidas por cada uno de los átomos resultada directamente proporcional al número de átomos y emiten energía, lo cual es a su vez directamente proporcional a la concentración del ión en la muestra. Conviene saber que una solución de unión, tan sólo se encuentra excitado en llama del 15%, siendo esta proporción la que emitirá energía. A pesar de que este porcentaje de átomos excitados sea tan pequeños, la técnica tiene suficiente sensibilidad para la determinación de los metales alcalinos en la mayor de las concentración bioanalíticas. Otros metales como calcio, magnesio, son excitados tan fácilmente en la llama convencional, por lo que no resulta tan sencillo utilizar esta técnica par su medida de ello deriva su escasa utilización. A·- Instrumental: en esta técnica se utiliza el fenómeno de emisión; y si la comparamos con la fotometría de absorción nos encontramos ante un espectrofotómetro en el cual la fuente de luz sea sustituido por la llama, donde los elementos excitados generan su radiación característica. El fotómetro consta de: • Gases: suelen emplearse gas natural, acetileno ó propano con aire u oxígeno. Todos ellos funcionan bien y difieren en la temperatura de la llama de cada uno de ellos, que incide en la sensibilidad que cada combinación proporciona. La elección de la llama (gases) depende de la temperatura que se desee. Para determinaciones de sodio y potasio es suficiente el propano-aire. Es esencial que la temperatura de la llama se mantenga constante para lo cual se precisan reguladoras que mantengan flujo constantes de gas. • Atomizador y llama: tiene como función disgregar la solución problema en pequeñas gotas, para que los átomos absorban la energía térmica de la llama y se exciten. La solución suele entrar a gran velocidad y choca contra las paredes de una cámara, disgregándose en finas gotas. La variable más importante de la llama es su temperatura. En los fotómetros de llama se requiere una constante de estandarización, ya que los cambios térmicos afectan a la respuesta del instrumento. Además se introducen comprobaciones con estándares de valor conocida entre las determinaciones. B·- Fotometría de llama directa con estándar interno: los fotómetros de llama pueden ser de 2 tipos: • Directos: se emplean la intensidad de luz emitida como la medida de la concentración. • Con estándar interno: la intensidad de la emisión del elemento a determinar se compara con la de un elemento agregado como estándar interno. Todos los fotómetros de llama utilizados en clínica son de tipo estándar interno. Se puede emplear como estándar interno litio ó cesio. El litio se emplea para determinaciones de sodio, potasio y el cesio para determinación de litio, sodio, potasio. El estándar interno funciona produciendo una señal de referencia frente a la cual se puede medir la emisión de otros elementos, de modo que el fotómetros hace una comparación de emisión de los elementos deseados y del elemento de referencia. De esta manera, las pequeñas variaciones que pueden darse en la velocidad de aspiración, atomización, viscosidad de la solución, temperatura y estabilidad de la llama, afectan por igual al estándar interno y al elemento a medir. Aunque la intensidad de la emisión del elemento medido y del patrón interno pueden variar, no sucede lo mismo con la relación entre ambos. De esta forma el uso de estándar interno permite determinaciones más precisas y exactas. Características del estándar interno han de ser: • Que esté ausente de los líquidos biológicos a medir. • Que emita a longitud de onda lo suficientemente alejados de los elementos a medir de modo que no interfiera con la detección de estos. C·- Aspectos prácticos: a parte de las consideraciones ya echas y basándonos en ellas conviene hacer hincapié en que la fotometría de llama está enormemente sujeta a todos aquellos factores que dependen de la correcta entrada de la muestra en la llama (aspiración y atomización), y del mantenimiento de una llama de características constantes. Por ello se impone una vigilancia estrecha de todos los componentes del instrumento que participan en esta primera fase: ~ Mantener limpio y libre de obstrucción el mecanismo de aspiración (por donde entra la muestra). ~ Mantener limpio la cámara de atomización. ~ Vigilar los gases y su presión constante de salida. ~ Mantener el quemador limpio para conseguir una llama homogénea. Los fallos iniciales en la precisión y exactitud en las medidas están causadas muy probablemente por un deficiente mantenimiento de estos componentes. ESPECTROSCOPIA DE EMISIÓN FLUORESCENTE ATÓMICA Se estudia la emisión de fluorescencia realizado por la muestra previamente atomizada, con llama o mediante atomización electrotérmica. No se emplea mucho debido a que no presenta ventajas sobre otras técnicas de espectroscopia de emisión atómica y sin embargo, presenta algunos inconvenientes como el elevado coste de adquisición y mantenimiento de los equipos y el estrecho intervalo de concentración del analito en la muestra en los que se puede trabajar. Se emplean como fuentes de radiación lámparas de cátodos huecos, lámparas de descargas sin electrodos y/o láser. ESPECTROSCOPIA DE EMISIÓN ATÓMICA CON ATOMIZACIÓN DE PLASMA Las técnicas más usuales son: • Las técnicas espectroscópicas de emisión atómica que emplean como sistema de atomización el plasma. El plasma es una mezcla conductora de la electricidad, que en estado gaseoso está constituido por cationes y electrones. El plasma más utilizado es el de argón, que una vez ionizado es capaz de absorber suficiente potencia externa como para alcanzar temperaturas alrededor de 10.000ºK. A·- Fuentes de alimentación: las fuentes de alimentación externas pueden ser: • De radiofrecuencia (se denomina ICP ó antorcha ó plasma acoplado inductivamente). El inicio de la producción de energía es una chispa de una bobina de tesla, que provoca la ionización del gas en el interior de los cilindros (son 3 cilindros donde se lleva a cabo el proceso). Con lo que se transforma en cationes y electrones, los cuales interaccionando en un campo magnético (Es un campo magnético oscilante originado por la bobina de inducción) van a dar lugar a la producción de energía térmica suficiente como arpa atomizar la muestra. ~ Sistema de muestreo: la muestra se coloca nebulizada en el seno del plasma a través del extremo superior de los cilindros mediante un flujo de argón. Como nebulizador se emplean el flujo de argón o nebulizadores ultrasónicos que colocan la muestra en el plasma de forma continua. También se emplea como sistema de depósito de la muestra la vaporización electrotérmica. Este sistema permite el análisis de un volumen inferior de muestra al contar con al posibilidad de micromuestreo (volumen en microlitros). • De corriente continua ó DCP: en este caso el sistema de muestreo y al temperatura alcanzada por el plasma es similar al sistema anterior (al de inducción). La muestra se deposita nebulizada y alcanza una temperatura de atomización de hasta 10.000ºK. precisión es parecida al de inducción aunque la sensibilidad es menor. • De microondas (este plasma no se emplea en bioquímica clínica) B·- Instrumentación en espectroscopia de plasma: son básicamente 2 tipos: • Equipos de secuencias: miden las intensidades de radiación absorbida línea a línea y suelen estar programados para registrar la radiación absorbida por uno o varios elementos de la muestra. • Equipo multicanal: están preparado par medir al mismo tiempo las intensidades de radiación absorbida por varios elementos. Las ventajas de los equipos e emisión de plasma son: ~ Proporciona datos de gran calidad ~ Son equipos estables, con bajo ruido y poca radiación de fondo ~ No presentan apenas interferencias químicas, de ionización y/o de matriz. ~ Los límites de detección son bajos ~ Pueden aplicarse a la determinación de gran cantidad de elementos. Los inconvenientes derivan de su elevado coste de funcionamiento, siendo más económica el de corriente con respecto a la de inducción. ESPECTROSCOPIA DE EMISIÓN ATÓMICA CON ATOMIZACIÓN DE ARCO Y CHISPA • Equipo de instrumentación: como sistema de atomización se emplea la fuente de arco y chispa. La atomización se emplea en un pequeño espacio entre electrodos de grafito y metal donde al pasar la corriente eléctrica se genera la energía suficiente como para atomizar la muestra y excitan los átomos que posteriormente emitirán radiación al volver a su estado fundaméntela. Estas 2 fuentes son muy inestables y proporcionan datos poco reproducibles. Para intentar corregir esta echo se realiza la medida al menos durante 20 segundos en instrumentos multicanal como el llamado espectrógrafo, en el que la medida de al radiación dispersada se realiza mediante una placa fotográfica. También puede utilizarse como fuente de atomización un láser pulsado que poseen la energía suficiente para producir la atomización y al excitación de la muestra., este sistema presenta algunos inconvenientes. Como la autoabsorción de radiación, la absorción de fondo y la baja intensidad de las líneas de emisión. Estos inconvenientes se solucionan cuando se emplean como fuentes la microsonda láser. TEMA 20 OTRAS ESPECTROSCOPIAS ANALÍTICAS FLUORESCENCIA, FOSFORESCENCIA Y QUIMIOLUMINISCENCIA MOLECULAR • Proceso de absorción-relajación: ~ Fluorescencia: la fluorescencia es un fenómeno de absorción atómica y/o molecular que ese produce tras la relajación de la materia previamente irradiada (es la capacidad de ciertas sustancias de emitir fulgor transitorio cuando son expuestas a los rayos violetas y ultravioleta de una luz que los contengan; una sustancia que lo produce es el espato-flúor). Se da en sistemas químicos, líquidos, gaseosos y sólidos, simples o complejos. Su duración es de 10-5 a 10-8 segundos desde el inicio de la excitación. La fluorescencia de las moléculas puede ocasionar radiación de resonancia o radiación no resonante. ~ Fosforescencia: la fosforescencia es la emisión continua de luz apreciable en la oscuridad, sin calor sensible. También se define como luminosidad indicada que persiste tras cesar la radiación causal. Este fenómeno se produce tras la irradiación de la materia y se mantiene durante una tiempo que oscila desde unos pocos segundos hasta minutos o incluso horas. Este fenómeno luminiscente tiene lugar cuando una molécula excitada vuelve a niveles menos energéticos meta-estables que se denominan tripletes, emitiendo una radiación de mayor longitud de onda que la de excitación. ~ Quimioluminiscencia: la quimioluminiscencia es un fenómeno luminiscente cuya característica es el origen de la energía de excitación de la materia. Esta energía se produce en el transcurso de una reacción química. En algunas ocasiones no es el analito el que experimenta el proceso de excitación-relajación, sino una especie formada por la reacción del analito y los reactivos químicos empleados en la prueba; generalmente una especie oxidada. • Factores que influyen en la fluorescencia y fosforescencia: ~ Rendimiento cuántico ó eficacia cuántica: es la relación que existe entre el número de moléculas que emiten fluorescencia y fosforescencia y número total de moléculas excitadas. ~ Tipo de transición entre niveles ~ Combinación de los 2 factores anteriores: la eficacia cuántica varia según la transición entre niveles. ~ Estructura molecular: los compuestos cromáticos que contiene grupos funcionales con transiciones de relajación de baja energía son los que presentan mejor fluorescencia. La rigidez estructural favorece también la fluorescencia. ~ Condiciones de medida: la temperatura de medida y la presencia de compuestos pesados en el disolvente se relacionan de forma inversa con la fluorescencia, al contrario que la viscosidad del disolvente cuya relación con la fluorescencia es directa. Con respecto al pH la fluorescencia de un compuesto es diferente, dependiendo de la ionización que presenten sus radicales ácidos o básicos. La presencia de lo disuelto suele reducir la intensidad de la fluorescencia, la potencia de fluorescentes, perdiéndose esta linealidad al aumentar la concentración. INSTRUMENTACIÓN EN FLUORESCENCIA Y FOSFORESCENCIA Se denomina fluorímetros o espectros fluorímetros. Casi todos tienen óptica de doble haz para compensar la variaciones de la fuente. Las señales llegan al sistema de registro donde se mide la relación existente entre la intensidad de radiación emitida por la muestra y la de referencia convirtiéndose en un dato numérico. • Equipos de instrumentación en fluorescencia y fosforescencia: debido a las fluctuaciones de intensidad de radiación, es necesario calibrar a diario de los fluorímetros o de los espectros fluorímetros en al región de longitud de ondas del análisis y el ajuste de las mismas a un nivel de sensibilidad reproducible. Para ellos se utiliza una solución patrón estándar de fluorescencia conocida como fosfata de quinina, que absorbe a 350 nm y emite radiación a 450 nm. Los componentes del equipo son: ~ Fuente de radiación: puede ser una lámpara de arco de mercurio a bajo presión con ventana de sílice, también puede ser una lámpara de xenón a elevada presión ó bien láser de N2 ~ Sistema selectores: van a ser: monocromadores de radiación: dispositivo capaz de aislar una banda muy estrecha de longitud de onda. ~ Detectores: va a ser fotomultiaplicadores: dispositivo electrónico consistente en un tubo vacío capaz de detectar radiación que contiene uno ó pocos fotones y convertirlos en un potencial eléctrico proporcional al número y energía de eso fotones. ~ Sistema de depósito de la muestra: cubetas tanto de vidrio como de sílice. Para atenuar la radiación dispersada se emplean deflectores. • Determinaciones fluorimétricas y fosforimétricas: los métodos analíticos fluorimétricos pueden ser: ~ Directas: cuando se mide la fluorescencia de un compuesto formado pro el reactivo y el analito. ~ Indirectos: que miden la disminución ó aumento de la fluorescencia que produce el analito al reaccionar con los reactivos empleados. En bioquímica se emplea este método para el análisis de alimentos y fármacos. En bioquímica clínica se aplican para determinaciones de muestras biológicas de iones, enzimas, coenzimas, vitaminas, algunos medicamentos, etc. Los métodos analíticos fosforimétricos se emplean en al determinación de ácidos nucleicos, aminoácidos, enzimas, ... no se emplea tanto como la fluorimetría, por que a pesar de su alta selectividad, presenta mayor imprecisión y más inconvenientes en la medida, como el mantenimiento de la temperatura,... Ambas técnicas se emplean como complemento a las técnicas de cromatografía líquida de elevada solución al detectar los elementos luminiscentes que son eluidos a través de la columna cromatográfica. QUIMIOLUMINISCENCIA Esta técnica se aplica más en análisis medio ambiental que en clínico, denominándose bioluminiscencia. El equipo de instrumentación es más sencillo ya que no es necesario emplear selector de longitud de onda; la única radiación producida es la que procede de la reacción química entre el reactivo y el analito. Para calcular la concentración del analito se compara la luminiscencia producida por este con la de un estándar de concentración conocida. Es un método de elevada sensibilidad. ESPECTROSCOPIA RAMAN Los espectros Raman se obtienen haciendo incidir una radiación monocromática visible o infrarroja sobre una muestra con una fuente de elevada potencia. Para obtener el espectro se registra la radiación dispersada por la muestra en un ángulo de 90º con respecto a la dirección del haz incidente par una condiciones previamente establecidas. Las variantes son: ~ Espectroscopia Raman de resonancia ~ Espectroscopia Raman activada por superficie aumentada (SERS) ~ Espectroscopia Raman no lineal. Las fuentes de radiación que suelen utilizarse son: láser, bien de argón, kriptón, de helioneón,... ó microsondas láser. La óptica del equipo suele ser de doble haz. ESPECTROSCOPIA DE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR (RMN) La espectroscopia de resonancia magnética nuclear estudia el comportamiento de los núcleos atómicos en el seno de un campo magnético, al exponerse a una radiación de la región de radiofrecuencia. Al incidir con esta radiación se van a producir transiciones en los niveles energéticos. Tras recuperar estados más estables una forma de relajación puede ser la emisión de radiación que se denomina relajación radiante. Los espectroscopios de resonancia magnética pueden ser: ~ de líneas anchas ~ de alta resolución Esta técnica se emplea para la identificación de estructuras orgánicas e inorgánicas, así como para la identificación de especies absorbentes en al muestra. • Equipos de instrumentación en espectroscopia de resonancia magnética: tiene un agente característico: un imán de gran estabilidad donde se coloca la muestra. La sensibilidad y resolución del equipo está influidos por las características del imán y se relacionan directamente con su potencia. Se clasifican en espectrómetros de líneas anchas o de elevada resolución dependiendo del tipo de imán que se emplee. • Aplicación de la espectroscopia de resonancia magnética nuclear de protón: su principal aplicación es la de identificación de moléculas orgánicas, órgano-metálicas y bioquímicas e incluso puede utilizar se para su cuantificación en análisis de mezclas multicomponentes, por ejemplo fármacos. Otras aplicaciones son: análisis de grupos funcionales orgánicos y análisis fundamental. • Otros tipos de espectroscopia de resonancia magnética nuclear: ~ RMN de carbono 13: informa sobre la estructura espacial de las moléculas ~ RMN de fósforo 31 ~ RMN de flúor 19 ESPECTROSCOPIA DE RAYOS X La radiación X es una radiación electromagnética, energética y de longitud de onda corta. La energía de rayos X estudia el comportamiento de la materia frente a esta radiación: emisión, absorción, dispersión, fluorescencia y/o difracción con estas técnicas se pueda obtener información sobre la estructura y la composición de la materia objeto de estudio. La emisión de radiación X proviene de tubos de radiación X, formados y sustancias radiactivas depositadas en cápsulas recubiertas para que la radiación solo salga por la zona controlada. La emisión puede ser constante o intermitente por lo que los espectros de emisión de rayos X puede ser continuo o de líneas. Los sistemas selectores: se usan monocromadores que no son dispositivos compuestos por 2 colimadores ó estructuras de metal poco espaciados, montados sobre placas metálicas que actúan absorbiendo todos los haces de radiación X, excepto los que se irradian en posición paralelo. Por último existen detectores (que pueden ser de gas semiconductor ó contadores de centelleo) y sistemas procesador de la señal, donde se registra la señal la radiación para poder después ser interpretada. TEMA 21 EQUILIBRIO ÁCIDO-BASE CONCEPTO GENERAL DE ÁCIDO-BASE El concepto de ácido-base de Arrhenius en el siglo XIX, revolucionario en su tiempo presenta la gran limitación de que sólo se podía fijar en disoluciones acuosas. Así: ácido es toda sustancias capaz de ceder protones (H+) al agua y base toda sustancias capaz de ceder hidroxilos (OH-) al agua. Otro fallo de esta teoría es que Arrhenius habla de portón H+ pero en el agua no existen protones como tales, sino que existe como ión hidratado o ión hidronio (H3O+) (realmente sería H9O4+) o lo que es lo mismo H+ • (H2O)4. La hidrólisis del agua es Posteriormente Bronsted y Lowry propusieron un concepto más amplio diciendo que ácido es cualquier sustancia capaz de ceder protones y base cualquier sustancia capaz de captar protones. Así para que una sustancia actúe como base debe tener un par electrónico solitario para aceptar los protones: Según Bronsted y Lowry un ácido y una base que pueda transformarse entre sí por la pérdida o ganancia de un protón se denomina par conjugado ó par ácido-base. Cuando un ácido cede protones se convierte en un compuesto capaz de aceptarlos, es decir, en una base conjugada: Cuando una base acepta protones se convierte en una sustancia capaz de cederlos, es decir, en un ácido conjugado. En 1.923 Lewis propuso otra definición: ácido es toda sustancia capaz de aceptar un par electrónico y base toda sustancia capaz de dar o ceder un par electrónico Una reacción ácido-base es para Lewis aquella en que la base compartirá un par de electrones con el ácido (la transferencia de un protón sería un caso particular) con esta teoría se amplia el grupo de los ácidos ya que entrarían en esta categoría los iones positivos. FUERZA IÓNICA DE ÁCIDO Y BASE En la fisiología humana el agua desempeña un papel fundamental de las reacciones ácidas-básicas. En estas reacciones se produce un proceso de cesión y aceptación de protones (ley de Bronsted y Lowry) por lo cual si pretendemos definir la fuerza de un ácido ó una base podemos decir que dicha fuerza sería la tendencia a cede o a captar protones y que va a depender de la especie que se combine, va a ser un ácido o una base par aceptarlos o cederlos. Si tenemos un ácido en disolución acuosa tendríamos este equilibrio Cuanto más desplazado esté éste equilibrio hacia la derecha más fuere será considerado el ácido (esto significa que está totalmente disociado). Esta medición de la fuerza de un ácido ó base se puede realizar por la constante de equilibrio de la reacción que puede ser constante de acidez o constante de basicidad. Por otro lado podemos definir; pka = - log Ka; pkb = - log Kb; por lo que: ~ Cuanto mayor es el valor de Ka y menor el de pka más fuerte es el ácido ~ Cuanto mayor es el valor de Kb y menor el de pkb más fuerte es el ácido. En general un ácido débil es aquel que en disolución acuosa está principalmente disociado. CONCEPTO DE pH Para definir el pH estudiaremos el pH de disociación del agua ó bien más sencillamente: Definimos la constante de equilibrio para esta ecuación En solución acuosa la concentración de agua es muy grande, pudiendo considerarla constante para soluciones diluidas y por tanto englobarla junto a la constante de equilibrio. Kw es el producto único del agua que tiene un valor a 25ºC de 10-14 M. Cuando se trata de agua pura calcular la concentración de protones e hidroxilos es fácil ya que forman en cantidades iguales (es una solución neutra) Si en la solución acuosa agregamos un ácido, aumenta la concentración de protones y tanto para mantener constante el producto iónico va a disminuir la concentración de hidroxilos. Si a la solución acuosa añadimos una base, aumenta la concentración de hidroxilos por tanto para que la concentración se mantenga constante, si disminuir la concentración de hidroxilos: Por tanto podremos saber la acidez ó basicidad de una disolución midiendo la concentración de hidrogeniones y hidroxilos respectivamente. Sovensen en 1909 introdujo el concepto de pH (pH = - log [H+] ó pH = log 1/[H+]) que sería pH igual a menos el logaritmo decimal de la concentración de hidrogeniones. De igual manera definimos el pOH que es menos logaritmo decimal de la concentración de hidroxilos En realidad la concentración de protones no puede medirse ya que los números de pH de 1 hasta 14 que aparecen en la escala de los peachímetros, se definen a partir de una escala empírica basada los disoluciones tampón estandarizados. Estas disoluciones sufren variaciones según las condiciones de trabajo, temperatura,... A la temperatura corporal de 37ºC el producto iónico Kw es superior (a 10-14) y el pH al cual se cumple la neutralidad eléctrico ya no es 7, sino aproximadamente 6’8. así el pH sanguíneo normal de 7’4 se encuentra en el lado alcalino de la neutralidad y un pH sanguíneo por ejemplo de 6’6 representaría un procedo de acidificación muy grave. SISTEMAS AMORTIGUADORES Un sistema amortiguador ó tampón es la mezcla de un ácido y su base conjugada cuya función fundamental es la de resistir los cambios de pH de otra forma se producirían por adición de incluso pequeñas cantidades de ácido y bases fuertes. Debido a su presencia en una disolución hacen un aumentar la cantidad de ácido o base que es necesario añadir para provocar un cambio significativo del pH. Los tampones presentes en los diferentes líquidos biológicos son normalmente de ácidos débiles (ácido carbónico, ácido fosfórico, algunos ácidos de peso molecular bajo, como el ácido láctico y el cítrico, grupo de proteínas que ceden protones, etc y sus bases conjugadas)., además hay muchos más electrolitos (aniones y cationes) tales como el calcio, magnesio, cloro y sodio que aunque no sean tampones desempeñan una importante función relativa a los cambios del equilibrio ácido-base. En el organismo los sistemas tampón que tiene una verdadera importancia clínica son: ~ Los presentes den el plasma: sistema amortiguador de la hemoglobina, el sistema formado por las proteínas plasmáticas ~ Los presentes en los hematíes ~ Los presentes en el líquido intracelular Estos ácidos y sus bases conjugadas actúan como tampones porque el exceso de hidrogeniones generados en el organismo pueden reaccionar con las bases tampón para dar ácidos no disociados INDICADORES ÁCIDO-BÁSICO Los indicadores ácido-bases son sustancias orgánicas (colorantes) cuyo color es lo suficiente intenso como para ser visible en soluciones muy diluidas. Tienen un carácter ácido y presentan además una conjugación distinta a la de sus bases conjugadas (HIn/In-). La relación entre sus 2 formas HIn/In- está determinada por el pH del medio donde actuar de manera que a un pH bajo predomina la forma HIn y se ve el color de la forma ácida. Mientras que a un pH elevado predomina la forma In- y se ve el color de la forma básica. El cambio del color del indicador es visible en un pequeño margen de pH y por tanto si se elige una serie de indicadores diferente cuyos intervalos de pH se superpongan ligeramente se podrá determinar el pH de una solución acuosa. EQUILIBRIO ÁCIDO-BASE Debido a los constantes procesos fisiológicos del organismos (metabólicos o no) se generan diariamente una gran cantidad de sustancias (tanto de carácter básico como ácido) susceptibles de alterar el equilibrio ácido-base. Dicha alteración se produce en cambios de pH en el organismo, de una gravedad proporcional al desequilibrio que haya tenido lugar. Evitar las variaciones en el pH, es tarea fundamental llevada a cabo por los tampones o sistemas amortiguadores presentes en el organismo capaces de captar o liberar protones como respuesta de los cambios de acidez de los diferentes líquidos orgánicos. Así, las características de los sistemas tampón más importantes del organismos son: • En el líquido intracelular tenemos como sistemas tampón: ~ La proteína hística (HPr/Pr-) ~ Fosfatos orgánicos (Hporg/Porg-) • En el plasma tenemos como sistema tampón: ~ Tampón bicarbonato/ácido carbónico (HCO-3/H2CO3): es el tampón más importante del plasma. El EQ establecido es H2O + CO2 ↔ H2CO2 ↔ HCO-3 + H+. Con ácidos: Con bases: Es el tampón más importante del plasma ya que se encuentra en una elevada concentración. Puede ser eliminado o retenido fácilmente ya sea por un mecanismo amortiguador respiratoria (elimina ó retiene el bicarbonato en forma de dióxido de carbono). El porcentaje de efecto amortiguador de sangre entera en del 35%. ~ Tampón fosfato : se divide en: - Tampón fosfato inorgánico - Tampón fosfato orgánico Representa un efecto amortiguador de sangre entera al 5%. Tiene escasa importancia como efecto amortiguador. Actúa básicamente manteniendo la base durante el proceso de excreción urinaria de sustancia ácida. Los equilibrios establecidos son: Con ácidos: Con bases: ~ Tampón plasmáticas ( ): tienen mucha menor importancia como tampón que la de la hemoglobina y el bicarbonato. El porcentaje de efecto amortiguador en sangre entera es del 7%. Su actividad amortiguadora deriva de la presencia de grupos aminos y carboxilos libres para unirse a los protones. La cantidad de aminos y carboxilos libres e a su función del pH del medio. El equilibrio establecido es: • En los eritrocitos hay 2 sistemas tampón: ~ Tampón hemoglobina ( ):; representa el 35% del efecto amortiguador en sangre entera es el segundo tampón sanguíneo en importancia debido a que se encuentra a una elevada concentración ya que cada molécula de hemoglobina puede captar una gran cantidad de protones. Este tampón actúa fundamentalmente sobre el ácido carbónico producido durante procesos metabólicos. El equilibrio establecido es: ~ Tampón bicarbonato/ácido carbónico ( ): representa el 18% del efecto tampón en sangre entera. La labor llevada a cabo por estos tampones se ve complementada de manera inestable por el efecto regulador que sobre el pH desarrollan los riñones y los pulmones. En condiciones normales el ácido-respiratorio (dióxido de carbono) suele excretarse a través de los pulmones. Por su parte los riñones eliminan mediante la excreción tubular los hidrogeniones originados como consecuencia de los principales fuentes metabólicas no respiratorias del organismos y que son fundamentalmente: La oxidación incompleta de grasas y carbohidratos La oxidación del azufre y de los metabolitos que contienen fósforo. ALTERACIONES DEL EQUILIBRIO ÁCIDO-BASE El equilibrio ácido-base se define como aquella situación de equilibrio establecido en el balance entre sustancias de carácter ácido y carácter básico de la sangre como consecuencia de la interrelación entre los sistemas respiratorio y metabólicos. Valores normales de pH en sangre arterial: 7’35-7’45 y en sangre venosa: 7’31-7’41. Las alteraciones encontradas en el equilibrio ácido-base pueden ser de 2 tipos: ~ Metabólicas: son aquellas en la que la alteración fundamental tiene lugar en la concentración de bicarbonato ( ~ Respiratorias: aquellas en las que la concentración de dióxido carbónico (CO2 ó ácido carbónico) constituye el cambio primario. La mayor parte de los métodos que se utilizan actualmente par detectar un desequilibrio ácido-base en el organismo están basados en la aplicación de la ecuación de HendersonHasselbach. Para un ácido débil consideramos este ácido como HA. Pasando a logaritmos y recíprocos tendríamos: Esta expresión es considerada la ecuación estándar de Henderson-Hasselbach y puede ser aplicada en cada caso para determinar las variaciones sufridas por el equilibrio ácido-base del organismo. Concretamente en el caso del ácido carbónico de la sangre la reacción que tienen lugar en le plasma relaciona en la siguiente reacción 3 magnitudes: ~ pH ~ La concentración molar de ácido carbónico ~ Concentración molar de bicarbonato Aplicando la ecuación de Henderson-Hasselbach obtenemos: Los hidrogeniones que como consecuencia de un proceso orgánico puedan se liberados son temporalmente tamponados por los diferentes sistemas amortiguadores existentes en el organismo. Cuando la cantidad de protones a analizar es excesiva pueden generarse alteraciones del equilibrio ácido-base de distinta gravedad que en ocasiones llegan a ser incompatibles e incluso con la vida. Estos desequilibrios pueden ser por exceso o por defecto y generan en el organismo 2 estados denominados: • Acidosis: es un exceso de hidrogeniones en la sangre (acidemia) por encima de 44 nmoles/L. (pH = 7’36). Está referida a todo el organismo. • Alcalosis: se refiere al déficit de protones en la sangre, debajo de 35 nmoles/L ó un pH de 7’45. es un proceso referido a todo el organismo. Según el tipo de desequilibrio ácido-base general las situaciones de acidosis o alcalosis pueden ser de tipo respiratorio o metabólico. Autoclínicamente aparecen frecuentemente alteraciones mixtas. Acidosis metabólicas: es la carencia primaria de bicarbonato. Se origina en el organismo como consecuencia de una retención o producción excesiva de un ácido más fuerte que el ácido carbónico. Los cambios secundarios que se originan son: ~ El bicarbonato en el plasma está disminuido ~ El ácido carbónico disminuido ~ La excreción renal de protones aumenta ~ En la orina disminuye el pH. Las causas. ~ Aporte elevado de ácidos (por ejemplo acidosis láctica) ~ Pérdida de bases (diarrea intensa) ~ Insuficiencia renal (disminuye la excreción de H+ entonces en el organismo) ~ Disfunción de los túbulos renales. El tratamiento: ~ Mediante la actuación del sistema amortiguador bicarbonato/ácido carbónico ~ Hiperventilación pulmonar ~ Un aumento en la eliminación de ácidos y retención de bases. Acidosis respiratoria: consiste en una retención primaria de dióxido de carbono a nivel pulmonar (los pulmones eliminar menos dióxido de carbono). Los cambios secundarios son: ~ La presión parcial de dióxido de carbono aumenta ~ La cantidad de ácido carbónico aumenta a nivel plasmático ~ El pH sanguíneo disminuye ~ En la orina aparecen niveles aumentados de pH y concentración de amoniaco. Las causas son: ~ Obstrucción de las vías respiratorias ~ Estimulación negativa del centro respiratorio (Depresión por ejemplo por barbitúricos ~ Déficit de la circulación de dióxido de carbono ~ Distribución irregular del aire respirado por enfermedad pulmonar. El tratamiento es: ~ Un correcto funcionamiento de los sistemas amortiguadores fisiológicos sobretodo de las proteínas plasmáticas y la hemoglobina. ~ Por hiperventilación ~ Una adecuada compensación a nivel renal, por ejemplo aumenta la formación de amoniaco, la reabsorción de bicarbonato y la excreción de protones. Este mecanismo renal aparece a las 24-48 horas y es máximo a los 3-4 días. Alcalosis metabólica: es consecuencia de un exceso primario de bicarbonato. Los cambios secundarios son: ~ Los niveles de bicarbonato en plasma, ácido carbónico, pH sanguíneo y dióxido de carbono está aumentados ~ La eliminación renal de bicarbonato esté disminuida y el pH de la orina está aumentado. Las causas son: ~ Hiperaldosteronismo primario ~ Síndrome de Cushing ~ Pérdida por vómitos intensos ~ Drenaje gástrico ~ Ingestión excesiva de bases (por ejemplo toma mucho bicarbonato) El tratamiento es: ~ adecuada compensación a nivel renal (disminuye el amoniaco y disminuye la reabsorción de bicarbonato. Alcalosis respiratoria: es una deficiencia primaria de dióxido de carbono. Los cambios secundarios son: ~ Pérdida de bicarbonato en el plasma por que pasa a los hematíes. ~ Pérdida de bicarbonato en orina ~ Disminución de la presión parcial de dióxido de carbono ~ El valor de pH en sangre aumenta (básico) ~ en casos graves y prolongados aumenta los cuerpos cetónicos y disminuyen los fosfatos. Las causas son: ~ hipoxia (disminución del nivel de oxígeno- asma) ~ estimulación del centro respiratorio (fiebre, ansiedad,...) ~ embarazo ~ ejercicio intenso ~ ventilación mecánica asistida ~ infección por microorganismo gram positivos El tratamiento: adecuada compensación a nivel renal, es decir, disminuye la reabsorción del bicarbonato y disminuye el amonio. VALORACIÓN CLÍNICA DE LAS ALTERACIONES DEL EQUILIBRIO ÁCIDO-BASE Para poner en evidencia la existencia en el organismo de una situación de acidosis o alcalosis no es suficiente con determinar el bicarbonato presente en el plasma ya que: ~ Un valor disminuido de bicarbonato plasmático puede se debido a una acidosis primaria como a una alcalosis respiratoria primaria. ~ Un aumento de bicarbonato en el plasma puede tener su origen en una alcalosis metabólica primaria como en una acidosis respiratoria primaria. Únicamente cuando se base en que el trastorno primario es de origen respiratorio puede conocerse la existencia de un acidosis o una alcalosis determinando únicamente el bicarbonato plasmático. Normalmente la simple exploración clínica permite determinar casi siempre si al alteración del equilibrio es del tipo metabólico o respiratorio. En tal caso será suficiente con: determinar la presión parcial de dióxido de carbono en caso de trastornos respiratorios ó bien determinar la concentración de bicarbonato en el caso de trastornos metabólicos. No obstante par una investigación precisa del equilibrio ácido-base será necesario determinar al menos los parámetros siguientes: ~ La concentración de hidrogeniones ~ La concentración de bicarbonato ~ La presión parcial de dióxido de carbono Determinación de la concentración de hidrogeniones: los medidores de pH más actuales requieren cantidades muy pequeñas de sangre (menos de 100 ml) por lo que la sangre capilar es adecuada para personas normales. Cuando la circulación periférica es escasa debe recurrirse a la sangre arterial teniendo en cuenta que la sangre capilar es más ácida siempre que la arterial. Determinación de la concentración de bicarbonato: en general los cambios en la concentración de bicarbonato en el plasma están relacionados con los diferentes trastornos del equilibrio ácido-base. Así: • La concentración de bicarbonato está disminuida en: ~ Acidosis metabólica ~ Alcalosis respiratoria ~ Trastornos mixtos • La concentración de bicarbonato es normal cuando: ~ El equilibrio es normal ~ Cuando existe un trastorno ácido-base agudo temprano ~ Trastorno mixto compensado: acidosis metabólica y respiratoria o bien alcalosis respiratoria o metabólica). • La concentración de bicarbonato está aumentada en: ~ alcalosis metabólica ~ acidosis respiratoria compensada ~ trastornos mixtos Los valores de referencia son: Acidosis pH < 7’36 Alcalosis pH > 7’44 Acidosis respiratoria: presión arterial de dióxido de carbono > 44 mmHg Acidosis metabólica: concentración de bicarbonato < 21 mmoles/L. Alcalosis respiratoria: presión arterial de dióxido de carbono < 34 mmHg Alcalosis metabólica: concentración de bicarbonato > 29 mmoles/L. TEMA 22 ESTUDIO DEL EQUILIBRIO GASEOSO INTRODUCCIÓN Durante el proceso de la respiración los pulmones y la caja torácica actúan conjuntamente, con el objetivo de proporcionar aire fresco a los alvéolos, para que pueda producirse un intercambio gaseoso adecuado. Debido a la gran elasticidad del tejido pulmonar cuando los músculos de la respiración se contraen, los pulmones y el tórax se expande; y cuando se relajan pulmones y caja torácica vuelven a su posición normal. Durante la etapa de expansión la presión existente en los alvéolos disminuye por debajo de la presión atmosférica. Eso permite que el aire atmosférico fluya desde el exterior hasta llega finalmente a ellos. La salida del aire a los pulmones (espiración) es un proceso pasivo. Como la presión alveolar a aumentado por enzima de la presión atmosférica, el aire sale al exterior desde los alvéolos. Durante el desarrollo de todo este proceso fisiológico la sangre fluye por los pulmones con el principal propósito de llevar a cabo un intercambio gaseoso que elimine de la sangre venosa el dióxido de carbono presente, sustituyéndolo por el oxígeno. Este intercambio es imprescindible para la vida: • El organismo no presenta reservas de oxígeno, por lo que una privación de este gas durante unos minutos puede causar la muerte. • Un desajuste de los niveles de dióxido de carbono (gas de carácter ácido) puede generar una alteración del equilibrio ácido-base incompatible con la vida. Características fundamentales de los gases sanguíneos: ~ Presión parcial de un gas (PO2 Y PCO2): es la presión que ejerce o si solo, como parte del conjunto por parte de todo los gases con los que se encuentran mezclados. ~ Presión total: es la suma de todas las presiones parciales correspondientes a cada uno de los gases presentes en la mezcla. A·- Oxígeno: es un gas necesario para la vida que se encuentra formando parte del aire atmosférico. Cuando llega a los alvéolos, gracias al mecanismo fisiológico de la respiración penetra en la sangre por difusión pasiva ya en la sangre puede encontrase: • Disuelto en el plasma (muy poca cantidad) • Unido a la hemoglobina (la mayor parte) El oxigeno disuelto en plasma puede medirse determinando la PO2 • Oxígeno unido a la hemoglobina: la mayor parte del oxígeno es transportado en la sangre unido al grupo ‘hem’ de la hemoglobina: hemoglobina saturada de oxígeno. La capacidad de unión de la hemoglobina por el oxígeno se conoce con el nombre de afinidad. Es un proceso que básicamente depende de: ~ La PO2 presente ~ La PCO2 ~ La temperatura ~ El pH Así, el aumento de la PCO2 va a hacer que disminuya la afinidad de la hemoglobina por el oxígeno, con lo cual la hemoglobina cederá el oxígeno más fácilmente a los tejidos. Sin embargo la disminución de la PCO2 hace que aumente la afinidad de la hemoglobina por el oxígeno y esta no cederá el oxígeno fácilmente a los tejidos. Los valores normales de PO2 en sangre son más o menos de 97 mmHg. Se considera tolerable clínicamente una PO2 mayor de 80 mmHg. Si es menor estamos ante una situación de hipoxemia. • Excepciones: ~ Los neonatos (valores entre 40-70 mmHg) ~ Personas > de 60 años (disminuye con la edad alrededor de 1 mmHg al año) • Alteraciones: ~ PO2 aumentado (hiperoxia): se produce por respirar aire con una concentración de oxígeno superior al 21%. Es algo muy frecuente en tratamiento con oxigenoterapia. ~ PO2 disminuido (hipoxemia): las causas pueden ser la disminución del oxígeno respirado (altura, agotamiento, consumo de oxígeno presente,...); una hipoventilación grave (asma, depresión neurológica,...); enfermedad pulmonar (neumonía, enfermedades pleurales con derrames,...); alteración cardiovascular (edema agudo del pulmón, trombo-embolismo pulmonar,...). B·- Dióxido de carbono: es un producto del metabolismo celular también conocido como anhídrido carbónico. La mayor parte difunde de los tejidos a la sangre penetrando en los hematíes quedando una pequeña cantidad disuelta en el plasma. Alrededor de un 65% se transporta en la sangre en forma de bicarbonato. El dióxido de carbono puede unirse a proteínas, en concreto a la hemoglobina (HbCO2). La cantidad de dióxido de carbono total en el organismo es un indicador de la capacidad de ventilación pulmonar. Los valores normales de PCO2 son entre 38-42 mmHg (no varían con al edad). • Alteraciones: ~ La PCO2 aumentada: sus posibles causas son: insuficiencia respiratoria crónica (enfisema, bronquitis,..); embolia pulmonar (en este caso existe un espacio pulmonar afuncional); hipoventilación (neumonía, depresión respiratoria neurológica,...) ~ La PCO2 disminuida: su posibles causas son: hiperventilación (espontánea ó por lesión neurológica); tratamiento con ciertos fármacos como las tetraciclinas. FUNCIONALIDAD RESPIRATORIA. PRUEBAS DE VALORACIÓN. La función pulmonar global, para ser efectiva, debe asegurar, una correcta respiración externa. Para conseguirlo 3 son los aspectos que debe desarrollar de forma óptima: • Ventilación: intercambio de aire entre la atmósfera y los alvéolos. • Difusión: intercambio de gases a través d al membrana de los alvéolos pulmonares. • Perfusión: paso de la sangre a través de los vaso pulmonares. Cuando alguna o varios de estas funciones se encuentran alteradas puede presentarse una deficiencia de oxígeno (hipoxia) a nivel arterial. En este caso puede hablarse de al existencia de una insuficiencia respiratoria: se define como el fracaso de al función respiratoria, es decir, la oxigenación y liberación del dióxido de carbono a la sangre. Se manifiesta con una disminución de la PO2 y un aumento de la PCO2 (hipercapnia). La insuficiencia respiratoria puede ser de 2 tipos: ~ Total: cursa con hipoxemia e hipercapnia. ~ Parcial: solo se presenta hipoxemia. Este fracaso de al función respiratorio puede ser debido a: 1·- Alteraciones en la perfusión: son alteraciones a nivel de la circulación sanguínea. 2·- Alteraciones en la difusión: son alteraciones en la membrana alveolo-capilar. 3·- Alteraciones en la ventilación. Estas pueden ser: A·- Obstructivas: son debidas a un defecto en la ventilación lo que hace que la persona afectada deba hacer un gran esfuerzo par producir un flujo de aire, tanto al inspirar como al espirar. Puede ser debida a alteraciones de las vías periféricas (bronquitis,, asma,...); alteraciones del parénquima pulmonar (enfisema); de las vías superiores (cuerpos extraños, edema, tumores,...) B·- Restrictivas: debidas a una limitación en la capacidad de expansión torácica y reducción del campo respiratorio. Estos pacientes presentan una reducción real del volumen de aire inspirado por sus pulmones. Pueden ser debidas : problemas del pulmón (edema); de la pleura (neuro ó hemotórax); neoplasias. Extratorácicos (obesidad, ascitis, embarazo). C·- Mixtas: la persona sufre obstrucción más restricción combinados. A·- Pruebas de valoración: las pruebas que evalúan la funcionalidad respiratoria tiene como objetivos fundamentales: • Valorar la presencia de cualquier alteración en el aparato respiratorio que impide un adecuado intercambio gaseoso. • Determinar la causa que ha provocado dicha alteración • Concretar el grado de la misma. Cuando otro tipo de pruebas (físicas, radiográficas,...) todavía dan resultados normales, las pruebas de valoración pulmonar pueden poner en evidencias alteraciones diversas: • A nivel de las vías aéreas • En los alvéolos pulmonares • En la circulación pulmonar Una primera clasificación de estas pruebas sería aquellas que las agrupa en 3 grandes bloques: • En función de que valores la ventilación de las vías aéreas. • La difusión de los alvéolos • La perfusión a nivel de la circulación pulmonar. Pruebas funcionales respiratorias: son pruebas específicas que permiten estudiar con precisión la funcionalidad respiratoria. Permiten explorar los aspecto más importantes de la respiración: ventilación, perfusión y difusión. • Pruebas que valoren la ventilación: en general estas pruebas estudian volúmenes y capacidades respiratorias, valoración de las resistencias y de las determinación bronco-dinámicas • Pruebas que valoran la perfusión: cateterización de la arteria pulmonar o angioneumografía. • Pruebas que valoran la difusión: son muy complejas y se usan poco. • GASOMETRÍA ARTERIAL: se usa mucho en la actualidad. Permite valorar en sangre arterial: ~ La consecuencias orgánicas de un a insuficiencia respiratoria (hipoxia) ~ Tipo de trastorno que acompaña a la hipoxia (hiper o hipocapnia) ~ El grado de dicho trastorno ~ La repercusión del trastorno en el equilibrio ácido-básico. Nos permite averiguar la PO2 (80-110 mmHg) y el porcentaje de saturación de la hemoglobina por el oxígeno (lo normal es de un 94-98%). También podemos saber la PCO2 (3842 mmHg) y la cantidad (total de CO2 en plasma. Así los datos obtenidos en una gasometría arterial permiten establecer el diagnóstico diferencial entre: ~ Insuficiencia respiratoria por hipoventilación (hipoxia + hipercapnia) ~ Insuficiencia respiratoria no ventilatoria (hipoxia + hipocapnia) En concreto todas estas pruebas pueden ser utilizadas para: ~ Detección precoz de ciertas enfermedades ~ Diagnóstico diferencial de pacientes con disnea. ~ Valoración de la capacidad de tolerancia a los anestésicos (antes de una intervención quirúrgica) ~ Evolución de una enfermedad en pacientes que ya padecen aguan alteración broncopulmonar. ~ Control periódico de personas que trabajan en ambientes laborales con riesgos laborales. ~ Estudio epidemiológico: para determinar la aparición de algunas enfermedades pulmonares. Para una correcta interpretación del resultado obtenido es importante conocer algunos datos de la personas investigada ya que dichas pruebas varían en función de aspectos como: la edad, sexo, peso corporal y altura. B·- Espirómetro: es un dispositivo de medida diseñado par poder valorar la eficacia de los diversos factores que participan en el movimiento de los pulmones y de las paredes torácicas. Dispone de un sistema de lectura que mide las cantidades de gas respiradas ofreciendo el resultado mediante un registro gráfico: espirograma. Un programa informático permite contrastar los datos obtenidos en cada paciente en cuanto a capacidad pulmonar, volumen pulmonar y velocidad de flujo pulmonar con sus propias características de edad, sexo, peso y altura. El resultado proporciona información cuantitativa acerca de: • El grado de obstrucción del paso de flujo del aire. • La restricción en la cantidad de aire que puede ser inspirado. Los espirómetros utilizados pueden ser mecánicos o electrónicos. DIFUSIÓN DE LOS GASES RESPIRATORIOS Los gases presentes en el aire (fundamentalmente oxígeno y dióxido de carbono) que, con la inspiración llegan al espacio alveolar, difunden a través de al membrana alveolo-capilar (son 2 sencillas capas celulares separadas por una fina capa de líquidos intersticiales) hacia la sangre de los capilares pulmonares. Dicha difusión es un proceso pasivo que se realiza a favor de un gradiente de concentración o de presión parcial de cada uno de los gases que difunden de forma que: • El oxígeno difunde del alveolo-capilar donde la PO2 es muy alta hacia el interior del capilar donde el oxígeno es muy baja. • El dióxido de carbono difunde desde el capilar donde el PCO2 es muy elevada en dirección al alveolo donde la PCO2 es baja. El proceso de difusión pasiva finaliza cuando la PCO2 y la PO2 a ambos lados de al membrana alveolo-capilar se iguala. El intercambio gaseoso entre la sangre y alvéolos es tan rápido que en condiciones es de reposo la sangre solo está en los pulmones alrededor de 0’75 segundos y unos 0’3 segundos si se está realizando algún ejercicio físico. La cantidad que difunde de cada uno de los gases respiratorios depende de: ~ La superficie disponible para el intercambio ~ El espesor de la membrana alveolo-capilar ~ La diferencia de presión parcial a ambos lados de la membrana para cada uno de los gases. Aunque debido a la estructura pulmonar, la superficie disponible para el intercambio es muy grande (entre 50-100 m2) algunas enfermedades pueden reducir dicha superficie considerablemente. Por su parte la diferencia de presión parcial varía en función de: • La propia ventilación alveolar • La cantidad de oxígeno presente en el aire inspirado Si el gradiente de presión a ambos lados de al membrana alveolo-capilar disminuye, la velocidad de difusión d los gases será menor. TRANSPORTE GASEOSO EN EL ORGANISMO 4 son los aspectos básicos que determinar el transporte gaseoso o en el organismo: ~ El flujo sanguíneo a nivel pulmonar y tisular ~ La concentración de hemoglobina en la sangre y la afinidad de estas por el CO2 ~ La ventilación pulmonar ~ La demanda tisular de oxígeno en una persona en reposo, cada minuto 250 ml de oxígeno. Son transportado desde los pulmones a los tejidos y aproximadamente la misma cantidad de dióxido de carbono se dirige desde los tejidos a los pulmones par ser eliminados. De todo el oxígeno presente en la sangre la mayor parte (más o menos 96%) se transporta unido a la hemoglobina. El resto circula disuelto en el plasma. La mayor parte del dióxido de carbono presente es transportada en forma de bicarbonato, una segunda parte lo hace convirtiéndose con las proteínas y una pequeña parte va disuelto en el plasma. Una sola molécula de hemoglobina puede unirse de forma reversible a un máximo de 4 moléculas de oxígeno, en función de la reacción. La unión de la hemoglobina con el oxígeno es de tipo cooperativo, es decir, la unión de la primera molécula de este gas provoca un cambio estructural de la molécula de hemoglobina (aumenta la afinidad), que favorece la posterior unión de una segunda y así hasta la saturación total (100% de afinidad). La afinidad de la hemoglobina para unirse al oxígeno es un proceso que depende entre otros factores de al PO2 de la sangre. Para la PO2 bajas (por ejemplo 20 mmHg) la afinidad de la hemoglobina es pequeña (25%) y por tanto, únicamente está unida a una molécula de oxígeno. Cuando la presión parcial de oxígeno sube hasta 40 mmHg, 3 moléculas de oxígeno están unidas a la de hemoglobina (Afinidad de un 75%). En le alveolo pulmonar la PO2 ya alcanza los 100 mmHg y la afinidad de la hemoglobina por el oxígeno es del 100%. A·- Transporte de oxígeno: cuando el oxígeno presente en el alveolo difunde hacia la sangre del capilar-alveolar: • La PO2 en ella es de 100 mmHg • La afinidad de al hemoglobina es máxima • La hemoglobina se encuentra unida a 4 moléculas de oxígeno. Esta sangre procedente de los pulmones llega a los capilares tisulares. En las células de los tejidos, debido sobretodo al continuo consumos de este gas para llevar a cabo los distintos procesos metabólicos, la presión de oxígeno es muy baja (40 mmHg). Este gradiente de presiones permite la difusión pasiva del oxígeno que desde los capilares tisulares, atraviesa primero el espacio intersticial llegando finalmente a las células. Como consecuencia de esta difusión la PO2 de los capilares tisulares va disminuyendo paulatinamente, hasta alcanzar los 40 mmHg. A esta PO2 la hemoglobina (cuya afinidad por el oxígeno disminuye hasta el 75%) cede el oxígeno que sale del eritrocito al plasma. Del plasma pasa a los tejidos donde se consume en las distintas reacciones metabólicas. Cuando la sangre llega a los pulmones una vez cedido el oxígeno a los tejidos, la presión parcial es de 40 mmHg. En los capilares pulmonares tiene lugar un proceso inverso al descrito para los tejidos. En ello la PO2 es de 100 mmHg y por tanto, el oxígeno difunde desde los alvéolos hacia los capilares, hasta que al presión de oxígeno en el capilar alcance los 100 mmHg. B·- Transporte de dióxido de carbono: a nivel tisular el dióxido de carbono se origina de forma continua como consecuencia del metabolismo celular. Allí su PCO2 es de alrededor de 45 mmHg, por tanto, se favorece la difusión de CO2 desde los tejidos hacia los capilares distribuidos por la economía, llegando hasta el interior de los glóbulos rojos. En ellos, por acción de la anhidrasa carbónica, el dióxido de carbono se transforma en ácido carbónico el cual se ioniza rápidamente originando bicarbonato más hidrógeno según la reacción siguientes: Como consecuencia del aumento de hidrogeniones el pH sanguíneo disminuye. Esta disminución no es excesiva ya que la hemoglobina (en su función de tampón fisiológico) se une a los hidrógenos, neutralizándolos. La hemoglobina posee una menor afinidad por el oxígeno tras unirse a los protones y este es cedido más fácilmente a los tejidos, según la reacción reversible: Cuando la sangre llega a los pulmones, el dióxido de carbono abandona por difusión los capilares pulmonares, llega a los alvéolos y allí las reacciones anteriores se llevan a cabo en sentido contrario. La eliminación de dióxido de carbono de al sangre y su oxigenación convierten la sangre venosa en arterial, fin último del proceso respiratorio. DETERMINACIÓN DE GASES SANGUÍNEOS La medida de los gases presentes en la sangre se lleva a cabo mediante una técnica llamada gasometría. Normalmente se mira la determinación de oxígeno y dióxido de carbono en sangre arterial. Se puede hacer: • Basal (en reposo) • De esfuerzo (tras realizar un esfuerzo) • Respirando mezclas de ases ricas en oxígeno. Observaciones: ~ La extracción se hará en la arteria radial, cubital ó humeral y previamente a la extracción el paciente no debe fumar, utilizar broncodilatadores ni recibir oxigenoterapia. ~ No se puede formar burbujas durante la extracción (no agitar ni poner la jeringa vertical) ~ Mantener la muestra hermética y procesarla inmediatamente (Sino se puede hay que conservarla sumergida en hielo). ~ Las medidas de presión de los distintos gases se pueden expresar: mmHg (unidades Torr) Kilopascales (Kpa sistema internacional de unidades) La elección de la muestra a la hora de realizar una gasometría es muy importante, ya que, el contenido en gases, varía significativamente en función del tipo de muestra elegida (venosa, arterial ó capilar). Sobretodo la PO2 va a ser muy distinta en una muestra venosa y en una arterial: En la venosa = 40 mmHg En la arterial = 80-100 mmHg También la PCO2 es bastante menor en la sangre arterial: En la venosa = 46 mmHg En la arterial = 35-45 mmHg Generalmente la elección es sangre arterial debido a que su composición es más uniforme y no está sujeta a variaciones en función de al actividad metabólica del lugar que es extraído. A la hora de valorar una gasometría sanguínea, normalmente arterial hay que tener en cuenta aspectos como estos: • La determinación de PO2 proporciona información sobre el estado de oxigenación • La PCO2 sobre el estado de ventilación • El valor de pH indica el grado de compensación para contrarrestar un aumento de la PCO2. • La cantidad de bicarbonato informa sorbe el grado de compensación renal, para contrarrestar un aumento de la retención de carbónico. La medida de la PCO2 es una determinación de gran utilidad a la hora de valorar el funcionamiento y la efectividad del sistema de control respiratorio (Es el que la mantiene entre 32-45 mmHg). La presencia de una disminución o aumento de la PCO2 indica que este sistema está fallando. El aumento de la PCO2 (hipercapnia) es consecuencia de cualquier alteración respiratoria que impida que halla una ventilación suficiente para eliminar el dióxido de carbono producido en los tejidos. Entre sus causas más frecuentes están: ~ Defecto en el sistema de control respiratorio. ~ Deficiencia de el aparato neuromuscular de la respiración ~ Aumenta en el esfuerzo de la respiración debido a una distancia de las vías aéreas. La disminución de la PCO2 (hipercapnia) suele ser consecuencia de procesos asociados a un aumento de la ventilación en reposo, por encima de los valores normales. TEMA 23 ESTUDIO DEL LÍQUIDO SINOVIAL FORMACIÓN Y LOCALIZACIÓN Prácticamente todas las articulaciones de las extremidades son de tipo sinovial ó diartrodial. Este tipo de articulaciones posee una cavidad articular y por tanto es libremente móvil. En las hidartrosis el cartílago articular que recubre el extremo de los huesos y la propia articulación están rodeados por una cápsula articular y se mantienen en contacto gracias a los ligamentos. La capa externa de la cápsula articular o extracto fibrosos está formada por tejidos fibrosos densos. La capa interna, ó sinovial, es una condensación de tejido conectivo y forma un saco que encierra el espacio sinovial. También encierra los tendones que pasan a través de la articulaciones y los bordes libres de las estructuras intra-articulares como ligamentos y meniscos. En condiciones normales el espacio sinovial tiene una pequeña cantidad de fluido sumamente viscoso llamado líquido sinovial porque desempeñan las siguientes funciones. ~ Lubricar las superficies de rozamiento ~ Aportar nutrientes al cartílago articular. El líquido sinovial deriva del plasma sanguíneo que se filtra a través de los capilares sinoviales difundiendo hasta la cavidad articular a la que se añade algunas sustancias sintetizadas en la membrana sinovial como proteínas y ácido hialurónicos, macromoléculas complejas que le da viscosidad. INTERÉS CLÍNICO La inflamación y otros procesos patológicos que afectan a la membrana sinovial altera la composición, contenido celular y características físicas de líquido sinovial. El estudio de este líquido tiene un lugar importante en el diagnóstico de las enfermedades articulares (artritis y artrosis), junto con los síntomas y signos articulares, las exploraciones radiológicos y otras pruebas de laboratorio (químicos, histológicas y serológicas) Las enfermedades articulares cursan generalmente con dolor articular, tumefacción (inflamación, rojo, caliente), aumento del tamaño de al articulación, hipertermia (enrojecimiento y limitación de los movimientos articulares). El aumento de tamaño de la articulación es debido al aumento de líquido sinovial el engrosamiento de la membrana sinovial. Las artritis (inflamación de las articulaciones) tienen diversos órganos y se clasifican en infecciosas, metabólicas (gota y pseudogota), mecánicas (traumatismos, tumores) y relacionadas con otras enfermedades (alergias), idiopatías (reumatoide) y del lupus eritematoso sistémico (LES). El LES es una enfermedad general del colágeno, aguda o subaguda, más frecuente entre mujeres entre 15-40 años. Se caracteriza por: • Placas eritematosas violáceas y escamosas (nariz y manos) • Ataque profundo del estado general • Fiebre regular y prolongado • Esplenoadenomegalia (aumento del bazo y ganglios) • Abstemia • Lesiones de las sinoviales • Signos de glomérulo-nefritis aguda • Anemias, ... La artrosis es una enfermedad degenerativa articular. El análisis de líquido sinovial permite realizar un diagnóstico preciso en la mayoría de las artritis infecciosas agudas y en las artropatías inducidas por cristales. La toma de muestras se realiza por punción articular ó artrocentesis con jeringa heparinizada y estando el paciente en ayunas, si se va a determinar la glucosa. Se extraen entre 2-5 ml de líquido sinovial de la articulación. La articulación de la rodilla es la más comúnmente utilizada para la punción sinovial. El análisis de líquidos sinoviales comprende: • Características físicas • Bioquímica • Citología • Cristales • Bacteriología • Inmunología EXAMEN FÍSICO A·- Aspecto: el líquido sinovial normalmente es transparente, de color amarillo pálidos, casi incoloro. La existencia de turbidez indica por lo general existencia de leucocitos, aunque también puede deberse a un proceso de tipo inflamatorio u otros componentes como cristales ó fibrina que deben confirmarse con el examen microscópico posterior. La turbidez puede clasificarse de acuerdo a una escala que va de 1-4 cruces. También el color puede verse altero por una serie de circunstancia patológicas. CUADRO Diátesis: tendencia de tipo innato de una persona de sangrar con facilidad. B·- Viscosidad y filancia: el líquido sinovial normal se define como muy viscoso, pegajoso al tacto. En los estados inflamatorios debido a la destrucción del ácido hialurónico por la enzima hialuronidasa de los leucocitos, se origina un descenso de al viscosidad. La apreciación de la viscosidad se hace, generalmente, dejando gotear el líquido desde la jeringa utiliza en la extracción, desprovista de al aguja a un tubo de ensayo y observando si cae gota a gota, en cuyo caso se trata de una muestra de viscosidad normal. Si el líquido sinovial gotea como el agua la viscosidad está disminuida. La filancia es un estudio complementario a la viscosidad para su observación se introduce un asa de platino en al muestra y se extrae estirando suavemente con lo que debe de formarse un filamento de 4-6 cm. Se considera que el grado de filancia está disminuida cuando el filamento formado apenas llega a 3 cm CUADRO C·- Prueba del coágulo de mucina: al echar una gota de líquido sinovial en un tubo con ácido acético diluido que se observa un coágulo ó precipitado de mucina, firme en condiciones normales debido a l precipitación del ácido hialurónico. Este fenómeno está disminuido en las artrosis, gota, e infecciones articulares (si forma una solución turbia y filamentosa). EXAMEN CITOLÓGICO El examen de la celularidad de líquido sinovial se ha mostrado significativamente útil en el diagnóstico diferencial. Consiste en la observación microscópica de la muestra con microscopio óptico ordinario ó con microscopía de contraste de fases. Se realizan 2 tipo de exámenes: recuento celular total y estudio de la morfología celular o recuento diferencial. A·- Recuento celular total: consiste en el cálculo del número de leucocitos por microlitro de líquido sinovial. Un líquido normal contiene de 10-200 celular/ l que son leucocitos casi en su totalidad, siendo patológica una cifra muy superior a 200 leucocitos/ l. • Técnica: el recuento manual se realiza en una cámara cuenta glóbulos, contando el número de leucocitos en al zona de recuento normal de los mismos. Comprende los siguientes pasos: ~ Homogeneización de la muestra ~ Dilución de la muestra, si es necesario. El líquido sinovial se diluirá dependiendo de su aspecto. Si es muy viscoso o purulento se realizará necesariamente una dilución 1/20, 1/50 ó 1/100 antes del recuento. Como líquido diluyente puede utilizarse suero fisiológico con 0’1% de azul de metileno que dará una tinción azulada a los leucocitos, permitiendo su diferenciación de los hematíes. La homogeneización de la muestra diluida debe realizarse concienzudamente y en el caso de líquido muy viscoso se deja reposar durante al menos 20 minutos antes del llenado de las cámaras. ~ Llenado de la cámara de recuento ~ Observación microscópico: con el objetivo de 10X se comprueba que la distribución celular sea homogénea, después con el mismo objetivo o con el 40X se cuenta las células en los 4 cuadrados grandes de las esquinas de 1 mm X 1 mm. ~ Cálculo del número de leucocitos por mm3. El resultado del recuento microscópico habrá que hacerle correcciones: Número de células (leucocitos) contados = N.C. Volumen de cada cuadrado contado = 1 mm X 1 mm X 0’1 mm = 0’1 mm3 Volumen total contado = 0’1 mm3 X 4 = 0’4 mm3 Número de leucocitos / mm3 = N.C. X 2’5 X inverso de al dilución realizada (X 20, X 50, X 100) en el caso de que se halla realizado. Si el líquido es hemorrágico será necesario ligar los hematíes antes del recuento leucocitario, utilizando una solución salina hipotónica (al 0’3%) como diluyente. Hay que tener en cuenta por los hematíes hay que valorarse siempre salvo que se trata de una punción traumática. La cuantificación de hematíes se hace de forma aproximadamente, indicando ‘ausencia’ ó presencia como: escasos, abundantes ó muy abundantes. CUADRO. B·- Recuento diferencial: la fórmula de líquido sinovial es diferente de la sanguínea: • Polinucleares: de un 7-10% aceptándose un valor hasta un 25% con ausencia de eosinófilos y basófilos • Mononucleares: un 70% del cual de un 15-35% son linfocitos y de un 35-55% monocitos • Células sinoviales: de un 3-5% • Células plasmáticas: 10% • Otras células: hasta un 7% Técnica: ~ Preparación de la muestra: puede realizarse una tinción directamente del líquido sinovial o bien del sedimento obtenido por centrifugación suave de la muestra durante 10 minutos. ~ Elaboración del frotis: se prepara varias extensiones finas obtenidas recientemente y se deja secar el tiempo necesario protegidas por papel de filtro. Si va a reservarse alguna preparación puede hacerse envolviéndola en papel de aluminio y congelarla a menos 20ºC. ~ Tinción: puede emplearse la de Wright, may-grunwald-giemsa y la panóptica rápida. La panóptica rápida es un método de tinción por inmersión que emplea fijador y 2 colorantes: solución nº 1 (es una solución alcohólica de triarilmetano y este es el fijador), solución nº 2 (es una solución de santeño), solución nº 3 (solución de tiacina). Dibujo. ~ Estudio de la morfología celular: se realiza la observación microscópica detallada del frotis empleando grandes aumentos (objetivo de inmersión), contando las células hemáticas y tisulares observadas y obteniendo los porcentajes correspondientes: Interpretación clínica: ~ Normalmente se encuentran menos de un 25% de polinucleares en el líquido sinovial, aumenta su número en la infección o inflamaciones articulares. Pueden aparecer algunos tipos especiales de células: * Células AR: es frecuente observar inclusiones citoplasmáticas abundantes y oscuras que contienen Ig G e Ig M (factor reumatoide) en los leucocitos polinucleares de pacientes con artritis reumatoides, aunque no son específicos de esta patología. Aparecen también en la gota y artritis sépticas. * Células LE: en la artritis del lupus eritematoso sistémico pueden encontrarse células LE (son neutrófilos cuyas vacuolas contienen material nuclear) en el líquido sinovial, aun cuando la prueba sanguínea da resultados negativos. * Células de Reiter: en el síndrome de reiter (comienza con una uretritis abactérica aguda o subaguda, seguida de una conjuntivitis purulenta bilateral, seguida de poliartritis que puede persistir durante varios meses, ataca a varones jóvenes y parece ser de origen venéreo, atribuyéndose a una espiroqueta (concretamente la spirochaeta forans)), entre otras patologías particulares, pueden encontrarse monocitos con polinucleares fagocitados. INVESTIGACIÓN DE CRISTALES Se han descrito diversos procesos producidos por la presencia de microcristales en la cavidad articular, como la gota, relacionada con la presencia de los cristales de urato y la pseudogota ó condrocalcinosis, caracterizado por el hallazgo de microcristales de pirofosfato cálcico dihidratado. En menor proporción se encuentran cristales de hidroxiapatita en algunas artritis y excepcionalmente cristales de colesterol en casos de artritis reumatoide. La observación de estos cristales tienen un gran valor diagnóstico. Para la observación de cristales, el líquido sinovial debe de haberse recogido sin anticoagulantes ó con heparina ya que el EDTA y el oxalato cálcico cristalizan y pueden confundirse con los cristales a investigar. • Técnica: el examen se realiza con microscopía óptica convencional y de luz polarizada. En este segundo caso las formas cristalinas adquieren facetas diferentes y aspecto más brillante, observándose además, la presencia de bidifrigencia. CUADRO. Se prepara la muestra depositando la gota en un portaobjeto perfectamente limpio. Se tapa con el cubreobjeto, haciendo ligera presión. Se absorbe el líquido sobrante con papel de filtro. Se sella con barniz el borde del cubreobjeto. Este sellado debe hacerse para evitar la desecación ya que se va a realizar una observación minuciosas de la muestra en búsqueda de microcristales. EXAMEN QUÍMICO La cantidad total de proteína en el líquido sinovial oscila entre los 15-30 gr/l, siendo la albúmina la más abundante (de un 55-70%). Las proteínas aumenta en los procesos articulares en los que se encuentran alterado la membrana sinovial, como la artritis reumatoide, la gota, la artritis séptica y la artritis tuberculosa. La glucosa tiene un nivel igual al del plasma sanguíneo y ligeramente inferior. El descenso de la concentración de glucosa en el líquido sinovial se debe en el cambio del metabolismo de sus células de aerobios a anaerobios. Las artritis inflamatorias la diferencia entre la glucosa séricas y al del líquido sinovial puede exceder los 25-50 mg/dl. Una concentración de glucosa en líquido sinovial inferior a la mitad de las simultáneamente en suero, es muy sugestiva de infección bacteriana. Esto es cierto siempre que no se demore el análisis. La determinación de lactato se realiza como indicador de la inflamación. Un nivel superior a 30 mg/dl constituye un dato indicativo de inflamación. En la artritis reumatoide y el lupus eritematoso sistémico, los niveles de complemento (sustancias o complejo de sustancias inespecíficos que se encuentra en el suero de casi todos los animales; es capaz de lisiar bacterias o células que previamente han sido hechas sensibles a sus acción por ciertos anticuerpos; tienen la función de potenciar la acción defensiva y desplegada por los anticuerpos en el sistema inmunológico; está constituido por fracciones de naturaleza proteica) en el líquido sinovial están reducidos en comparación con los de muestra de suero simultáneas (normalmente por debajo del 30%). INFORME DE UN ANÁLISIS DE UN LÍQUIDO SINOVIAL Ver fotocopia DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL DEL LÍQUIDO SINOVIAL Los líquido sinoviales pueden clasificarse en 4 categorías de fisiopatologías diferenciados, en ocasiones bastan con el examen macroscópico global inmediato par realizar diagnóstico diferencial. CUADRO. Los líquidos sinoviales no inflamatorios o mecánicos suelen estar producidos por artrosis o artropatías post-traumáticas. En estas situaciones el engrosamiento sinovial suele ser mínimo a la exploración físico, pero pueden producirse derrames de entre pocos mililitros y más de 100 ml. El líquido es transparente. Los líquidos inflamatorios son macroscópicamente opacos a causa de los detritus celulares que contiene; aunque se puede recibir luz a través de una muestra, casi nunca se puede leer con claridad la letra impresa. El recuento leucocitario varía entre 5.000 y 75.000 en mm3 y la mayoría de las células son leucocitos polimorfonucleares. La viscosidad está reducida a causa de la degradación de mucopolisacáridos por enzimas liposómicas de los leucocitos polimorfonucleares. Los líquidos inflamatorios no inducidos por cristales suelen aparecer en 1 de 2 grandes categoría de enfermedades: • Artritis reumatoides • Espondilitis anquilopoyética: (es una inflamación de los discos, ligamentos ó articulaciones vertebrales en general; la anquilopoyética es una afección de la columna vertebral que conduce fatalmente a la anquilosis más o menos extensa de las vértebras, convirtiendo la columna en un tallo rígido. El examen de líquido sinovial por si solo raras veces sirve par distinguir estos 2 tipos de alteraciones. Los derrames sinoviales sépticos se producen frecuentemente por el estafilococo y el gonococo que llegan a las articulaciones por vías hematógena. Tienen un aspecto macroscópicos purulento y espeso. El recuento leucocitario está considerablemente elevado con claro predominio de leucocitos polimorfonucleares, a excepción de la artritis tuberculosa en la que el recuento total puede ser más baja y la proporción de células mononucleares mayor el nivel de glucosa está muy reducido (10 mg/ dl ó menos) ya que es utilizado por las bacterias y los leucocitos polimorfonucleares. En un porcentaje demasiado alto de los líquidos sinoviales infecciosos no es posible identificar en un cultivo al agente causal porque los escasos microorganismo de la muestra son muy exigentes en cuanto a sus requerimientos de cultivo; en especial el gonococo. Las acumulaciones de líquido sinovial de líquido hemorrágico pueden deberse a trastornos sistémicos o a problemas articulares localizados. La hemofilia, otras diátesis hemorrágicas o un exceso de anticoagulación, son causas de hemoartrosis, mientras que los traumatismos, la sinovitis y la artropatía neuropatía (es una osteoartritis asociada con hinchazón, destrucción ósea y trastornos tróficos) son situaciones más localizadas responsables de líquidos sinoviales sanguinolentos. Es importante destacar que en la clasificación de los líquidos sinoviales hay superposiciones; por tanto es necesario que las decisiones diagnósticas se apoya en todos los datos disponibles, entre ellos el contexto, la historia, la exploración y los restantes datos pertinentes radiográficos o de laboratorio. Aún así, ciertos hallazgos del examen del líquido sinovial, como la identificación positiva de microorganismos o los cristales son esenciales para llegar a un diagnóstico, exacto y para desarrollar un plan terapéutico adecuado. TEMA 24 ENZIMOLOGÍA DIAGNÓSTICA FISIOLOGÍA Y CINÉTICA ENZIMÁTICA Las enzimas y biocatalizadores son proteínas biológicas especializadas en la catálisis de reacciones orgánicas (catálisis: acción físico química por la cual ciertos cuerpos, llamados catalizadores determinan modificaciones en el medio en el que se encuentran, sin ser ellos mismos químicamente modificados; catalizador: sustancias que producen catálisis, es decir, que acelera o retraso un proceso químico sin ser consumidos durante la reacción). En la determinación de su actividad es sumamente importante el procesado adecuado de las muestras que garantice la conservación de la estructura proteica, fácilmente alterable, por variaciones de temperatura, pH muy ácidos o muy alcalinos, detergentes, microorganismos de los recipientes,... que degradan la proteína. La conservación de los sueros durante varios días a temperatura ambiente provoca la Inactivación de la mayoría de las enzimas. En algunos casos, la reducción de esta actividad es reversible (Inactivación reversible) pero la mayor parte de los casos de las veces el tratamiento adecuado de al muestra supone la pérdida irreversible de su actividad. 1·- Composición: las enzimas pueden contener otras fracciones que no tengan carácter proteico. Estos componentes tienen un paso molecular menor ( menos 1.000) que las enzimas (peso molecular oscila entre 10.000-2.000.000) y se denomina cofactores. Se diferencias los siguientes grupos: A·- Iones metálicos: han de encontrarse en un determinado estado de oxidación y no se modifican durante la catálisis. Su función puede ser la de ayudar a captar el sustrato en su centro activo, mantener la estructura espacial de la enzima ó tener un papel activo al realizar la función catalítica. Se les conocen como ‘activadores enzimáticos’ B·- Moléculas orgánicas: si después de la reacción permanecen enérgicamente unidas a la enzima se denominan grupo protéticos (ejemplo: piridoxal fosfato, que participa en al reacción de transaminación de la GOT y GPT, estando sobre todo unida a la GPT). Si se unen al enzima sólo durante la reacción catalítica se denominan coenzimas (ejemplo: ADP y ATP que participan en las reacciones de quinasas). A las enzimas que precisa del cofactor se denominan holoenzimas y están formadas por el apoenzima (es la estructura proteica) y el cofactor (que es la estructura no proteica). 2·- Mecanismo de acción enzimática: una reacción tiene lugar porque los reactivos llegados un momento pueden llegar a acumular la energía suficiente como para poder llegar a un estado denominado estado de transición, estado activado y altamente energético e inestable. En este estado de elevado energía es muy probable que se rompan algunos enlaces entre ambos y otros se formen, para dar lugar a los productos de la reacción. La energía que alcanzan se denomina energía de activación. Las enzimas se unen con los reactivos de manera de activación. Las enzimas se unen con los reactivos de manera transitoria y alcanzar un estado de transición de menor energía y por tanto de menor estabilidad que le corresponde a al reacción no catalizada. La función de los biocatalizadores orgánicos, las enzimas, es la de acelerar la velocidad de las reacciones, al disminuir la energía de activación y la obtención por rápida de los productos. 3·- Formas en las que pueden aparecer las enzimas: A·- Isoenzimas ó isozimas: son formas múltiples de una determinación enzimas y catalizan la misma reacción. Estas proteínas solo tienen pequeñas diferencias en cuanto a sus propiedades físico-químicas, tamaño, estructura, peso molecular, solubilidad,... Ejemplo: LDH: (lactato deshidrogenasa) aparece en 5 formas isoenzimáticas que catalizan la reacción reversible, lactato piruvato. Está formado por cadenas de 2 tipos: cadenas H (Herat) y cadenas M (muscle). Las formas isoenzimáticas son: LD-5: M4 LD-4: M3H LD-3: M2H2 LD-2: MH3 LD-1: H4 Otra isoenzimas bastantes común en analítica es la CK (crestín quinasa) está formada por: B (brain) y M (muscle). Las 3 formas isoenzimáticas son: ~ CK-BB: localizada fundamentalmente en el cerebro ~ CK-MB: miocardio ~ CK-MM: músculo esquelético y cardiaco. B·- Complejos multienzimáticos: son asociaciones de enzimas que catalizan reacciones consecutivas y el producto de una reacción es el sustrato de la siguiente. Si las enzimas no formarán el complejo se perdería más sustrato, pero, al sustituirlo, se establece un microentorno de las enzimas con los reactivos y se optimiza la reacción, ya que el producto se libera en las inmediaciones del centro activo del enzima siguiente. Por ejemplo: piruvato desoxigenada que catalizan el paso de piruvato a acetil coenzima A. C·- Pro-enzima: son formas precursoras inactivas de las enzimas. A este grupo pertenece las enzimas proteolíticas, que catalizan la hidrólisis de los enlaces peptídicos. Solo alcanzan su capacidad de enzimas funcional en un momento determinado, y en el lugar que realizan su acción catalítica. El peso de pro-enzima a enzimas supone lo ruptura de un enlace peptídico. 4·- Fenómeno catalítico: A·- Interacción enzima-sustrato (E-S): las enzimas en su estructura tienen un lugar concreto a través del cual realizan su función. Esta localización recibe el nombre de centro activo. El resto de la estructura tiene la función de proporcionar un entorno y condiciones propicias para que la enzima actúe. El enzima se une al sustrato el centro activo y el enlace puede ser de diferentes formas: puentes de hidrógeno, interacciones electrostáticas. A veces el enlace enzima-sustrato es covalente pero no es lo más frecuente; ocurre por ejemplo en los hidrolasas. B·- Conformación del centro activo (CA): • Hipótesis de llave-cerradura: se considera cierta rigidez en la estructura del centro activo del enzima. El sustrato se une al centro activo porque su estructura es complementaria. • Hipótesis del acoplamiento inducido: la estructura espacial del centro activo no es rígido y al unirse al sustrato, este induce un cambio en la estructura de la enzima para que puedan acoplarse. 5·- Especificidad enzimática: es la capacidad que tienen las enzimas para actuar con un determinación tipo de sustrato. La especificidad puede ser: • Absoluta: sólo actúa con un sustrato • De reacción: catalizan el mismo tipo de reacción con diferentes sustratos que presentan alguna característica común (por ejemplo que son grasas) • Estéreo-específica: sólo actúan sobre sustratos con determinada configuración espacial. Por ejemplo: con la M-amido-hidrolasa. 6·- Factores que influyen en la actividad enzimática: A·- Concentración del sustrato: la velocidad de la reacción que da lugar a la desaparición de los reactivos y a la aparición de los productos, es mayor cuanto mayor sea la concentración del sustrato, pero sólo hasta cierto punto en el que se alcanza la velocidad máxima (Vmax). Aquí, aunque la concentración de sustrato sea mayor no se supera esta velocidad. Si la cinética de la velocidad enzimática sigue este desarrollo se dice que es una cinética de Michaelis-Menten. Si se representa gráficamente la velocidad de reacción durante el transcurso de la misma frente ala concentración de sustrato, se observa como al principio, la velocidad es directamente proporcional a la concentración de sustrato, siguiendo una cinética de primer orden (punto 1). Cuando se alcanza la velocidad máxima ya no depende de la concentración del sustrato del sustrato puesto que no aumenta, siguiendo una cinética de orden cero que equivale al punto número 2. En las determinaciones analíticas de actividad enzimáticas se trabajo en la zona en la que la actividad es independiente de la concentración de sustrato, es decir, en la zona cinética de orden cero (punto 2) y velocidad máximo, por lo que los reactivos comerciales se preparan con excesos de sustrato. B·- pH: se trabaja en unas condiciones óptimas de pH para que la enzima presente su máxima actividad; dado que las variaciones de pH pueden alterar la estructura proteico al modificar la ionización de sus aminoácidos. Por ello los reactivos suelen preparar para emplear menos, con una solución tampón que mantengan estas condiciones de pH en el momento de la determinación. C·- Temperatura: al aumentar la temperatura suele aumentar la actividad enzimática debido a que se favorece el contacto del enzima y sustrato, siempre y cuando no se supere una temperatura en lo cual la estructura proteica se desnaturalice y disminuye ó desaparezcan esta actividad. Las temperaturas seleccionadas suelen ser: temperatura ambiente (25-30ºC) y temperatura corporal. Si se realiza a temperatura ambiente, se proporciona factores de transformación de la actividad a 37ºC que son las condiciones térmicas del organismo. D·- Presencia de inhibidores-activadores: la inhibición de las enzimas más determinadas metabolitos o por la variación de las condiciones óptimas de actuación constituyen una importante medida de la regulación metabólica para el organismo. Si un enzima está inhibido, la reacción transcurre como sino estuviese. Los reactivos tienen que alcanzan los estados de transición de elevado energía de la reacción espontánea no catalizada. Los activadores son sustancias que aumentan la velocidad de la reacción al disminuir aún más la energía de activación. Suelen ser iones metabólicos ó moléculas de pequeño tamaño 7·- Nomenclatura: la international union biochemistral recomendó en 1.964 una nomenclatura para las enzimas basadas en la reacción que catalizan. En 1.973 apareció una nueva edición ampliando esta nomenclatura done el nombre científico describe el tipo de reacción (deshidrogenasas, oxidasa, transferasa,...), el sustrato, el coenzima y el producto (LLactato: piruvato NAD-deshidrogenasa). Además de cada enzima se le da un número que deriva de la nomenclatura, encabezado por las siglas EC (enzyme cominision), así la LDH se designaría como la EC 1.1.1.3. Para una descripción más exacta es necesario indicar la procedencia del enzima, especie, tejido, localización en el interior ó exterior de la célula (debido a que existen isoenzimas con el mismo nombre y número EC pero se diferencian por su localización y propiedades físicas y químicas). Cuadro. ENZIMAS ANALIZADAS EN DIAGNÓSTICO CLÍNICO (Ver cuadro) DETERMINACIÓN ANALÍTICA DE AL ACTIVIDAD ENZIMÁTICA En general no se determina la concentración de las enzimas, en tejidos o en fluidos orgánicos, sino su actividad. El motivo es que la concentración de las enzimas del suero, muestra biológica más frecuente, es rara; sin embargo dada su elevada capacidad catalíptica es posible determinar su actividad con fiabilidad y, se presupone que, por lo general la actividad es proporcional a la concentración. Para determinar la actividad de las enzimas es necesario importante conocer: • La estequiometría de la reacción que cataliza (la estequiometría es la parte de la química que estudia las proporciones en que se combinan los cuerpos y la determinación de sus fórmulas y exacta presión de sus reacciones química). • Si necesita o no cofactor y cual es. • La concentración mínima de sustrato, cofactor par alcanza la máxima velocidad de reacción • Las condiciones óptimas de medida: pH, tiempo de incubación, procesado de la muestra biológica, temperatura, posibles activadores e inhibidores endógenos o exógenos de la muestras. • Las característica de la técnica analítica par esa muestra biológica. Se puede determinar la actividad enzimática analizando: • La aparición de algún producto • La desaparición de sustrato • La variación del cofactor o de algún componente de al reacción en el transcurso de al misma. Todos estos hechos son debido a la presencia de la enzima en la muestra y a sus actividad específica En la fase de retardo, inmediatamente después de mezclar los reactivos con al muestra biológica, no se debe medir la absorbancia ya que es una fase de encuentro y acoplamiento de sustrato y enzimas. Puede durar de unos segundos o varios minutos. En los protocolos comerciales nos indica el tiempo que tarda este periodo de retardo. Al finalizar esta fase comienza la fase lineal, donde la velocidad de formación del producto permanece constante y es en esta fase donde se debe determinar la actividad enzimática. A medida que va transcurriendo la reacción llega un momento en que la velocidad comienza a disminuir, debido a factores como el agotamiento de sustrato, el equilibrio entre el sustrato y provoca, variaciones del pH que no han podido ser amortiguados por el tampón, etc. La actividad enzimática se mide en unidades internacionales por unidad de volumen por ejemplo UI/L. Se define la unidad internacional como la cantidad de enzimas que transporta un microlitro de sustrato en 1 minuto, en condiciones estándar previamente establecidas. En cada técnica analítica se define la unidad de actividad y su unidades. 1·- Métodos analíticos de determinación enzimática: en estos métodos no es importante un dato puntual de absorbancia, sino la variación de absorbancia por unidad de tiempo ocasionada por la actividad de al enzima del que se pretende analizar su actualidad: A·- Métodos a punto final: se pone en contacto los reactivos (que aportan el sustrato) y la muestra biológica (que aporta el enzima) y tras un periodo de incubación que supere el periodo de retardo se mide la absorbancia. Al cabo de un tiempo establecido se detiene la reacción y se vuelve a medir la absorbancia. No es frecuente este tipo de técnica al presentar los inconvenientes de suponer que la reacción es lineal y la cinética de orden cero, para que la velocidad no depende de la velocidad de sustrato, lo que no ocurre siempre. B·- Métodos cinéticos: consiste en medir la absorbancia varias veces con intervalo de minutos. Permite comprobar que realmente estás en la zona lineal de la curva, zona ideal APRA la determinación. Se detectan desvío de la linealidad se puede despreciar alguna de las medidas finales de al absorbancia. En los protocolos comerciales se indican los pasos a seguir para que el resultado sea fiable en cada determinación. CÁLCULO DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Una vez obtenida la variación de la absorción por minutos, par calcular la actividad enzimática se pueden emplear distintos métodos: ~ Mediante la aplicación de una variante de la ley de Lambert-Beer: AE (UI/L) = DO / Minutos X F ~ Mediante la construcción de una recta de calibrado ~ Medidas indirectas de la concentración de sustrato TEMA 25 REFRACTOMETRÍA Y OSMOMETRÍA PRINCIPIOS BÁSICOS DE REFRACTOMETRÍA La refracción de la luz es un fenómeno de desvío que experimenta el haz incidente al atravesar una solución, ocasionado por la diferente naturaleza del aire y de la solución en la que incide. El ángulo de desvío se denomina ángulo de refracción. Se conoce como índice de refracción (n) de una solución a la relación entre la velocidad de la luz en el aire y la velocidad de la luz a su paso por esta solución. Su valor es directamente proporcional a la cantidad de sustancia disuelta en la misma. Esta relación varía dependiendo de características como la concentración de sustancias disueltas, el tipo de disolvente,.... Se puede controlar la cantidad de soluto en una solución midiendo su índice de refracción depende fundamentalmente de la proteína mayoritaria, la albúmina. REFRACTÓMETRO CLÍNICO Son instrumentos basados en el fenómeno de difracción de la luz para medir la concentración de sustancias disueltas en una solución acuosa. Las determinaciones se realizan gracias a la refracción entre el prisma de índice de refracción elevado y la muestra. En el laboratorio de análisis clínicos se emplea el refractómetro para la medición de la concentración de solutos como la albúmina en muestras séricas y/o plasmáticas y la medida del peso específico de la orina 1·- Componentes de un refractómetro clínico: están dotados de un elevado contraste de la línea de separación de al señal, lo que permite una lectura más fácil, rápida y fiable. Generalmente se emplean líneas de separación de colores por ejemplo: blanco y azul. La anteojera de goma evita posibles interferencias originadas por la luz exterior, a la hora de realizar la lectura entre el ojo y el ocular. Facilita además una mejor observación al resultar la escala y la línea separación. El cuerpo está recubierto de goma para evitar que la temperatura de la mano se trasmita a la muestra, ya que las variaciones de al temperatura influyen en la validez de los resultados. La escala de lectura está graduada y calibrada en térmicos de peso específico para sólidos totales en orina humana y para niveles proteicos en suero. Si se comparan las lecturas de peso específico obtenidos en varias soluciones estándar (soluciones acuosas de peso específico conocido) al medirlas por distintos sistemas se observan que varían milésimas (Fotocopia). UTILIZACIÓN DEL REFRACTÓMETRO • Sacarlo del embalaje y abrir la placa que cubre el prisma • Limpiar la placa y el prisma con un paño suave y procurar no rayar la superficie del prisma • Dirigir la parte del prima hacia la luz. • Ajustar el anillo de dioptrías hasta que se pueda ver claramente la escala. 1·- Calibrado: puede realizarse con agua desionizada o empleando solución estándar de la misma sustancias que luego se va a analizar, de baja y elevada concentración respectivamente. Moviendo el tornillo de ajuste se hace coincidir la línea de separación con el valor exacto. Después se limpia con un paño húmedo y luego con un paño seco. 2·- Medida: • Colocar sorbe el prisma una o varias gotas de la solución a analizar y se cierra la placa • Dejar un tiempo par que la solución problema fluya sobre la superficie del prisma. • Colocar el refractómetro hacia la luz para tener un buen contraste luz-sombra • Rotar el ocular hasta ajustar la escala. • Mirar por el ocular leyendo directamente en la escala de concentración • Corregir la medida si la temperatura es diferente a la de calibración del refractómetro. 3·- Utilización: es un instrumento que se utiliza poco ya que sus medidas están incluidas en otros sistemas analíticos más sencillos, rápidos (como la tira reactiva) y automatizados (autoanalizadores que incluyen tanto el peso específico como al concentración de albúmina). OSMOMETRÍA 1·- Concepto de osmolalidad y osmolaridad: la osmometría se define como la medida del efecto osmótico de una solución, es decir, del número de partículas de soluto disueltas en la solución y es independiente del tamaño o la carga del ión o molécula. Un osmol de una sustancia equivale al peso molecular gramo dividido por el número de partículas (moléculas ó iones) en los que la sustancias se disocia en una solución. Existen 2 formas de expresar la concentración de soluto en una solución: • Osmolalidad: es el número de partículas de soluto por unidad de masa de solvente (mOsm/KG). Una solución que contiene un osmol de soluto por kilogramo de disolvente tiene una concentración de 1 osmolal. • Osmolaridad: es el número de partículas de soluto por unidad de volumen de al solución (mOsm/L). Una solución que contiene un osmol de soluto por una disolución tiene una concentración de 1 osmolar. La osmolaridad es una unidad de medida más adecuado por si es una relación constante peso/ peso. Por el contrario una osmolaridad varía debido a la variación del volumen del líquido con la temperatura y por el propio efecto de expansión debido al soluto disuelto. Para las soluciones acuosas de bajas concentraciones, como son los líquidos biológicos, la diferencia entre la osmolalidad y la osmolaridad es muy pequeña. La utilidad de estas medidas es que proporciona un cálculo del número efectivo de partículas en solución; incluso sin conocer la naturaleza ni la concentración de las partículas disueltas. 2·- Medida de la osmolaridad: es una propiedad de la solución que depende del número de partículas presentes en ellas, cuanto mayor sea su número mayor será su osmolalidad. Los productos disueltos modifican 4 propiedades físicas de las soluciones llamadas propiedades coligativas, que son: • Presión osmótica • Presión de vapor • Punto de ebullición • Punto de congelación La amplitud de estas variaciones a temperatura constante, únicamente está determinada por el número de partículas en solución y no pro su naturaleza. Así, cuanto aumenta la osmolalidad, se produce una disminución del punto de congelación y un aumento de al presión de vapor. Basándose en estos efectos, puede determinarse la osmolalidad de una solución con un aparato llamado osmómetro. Hay 2 tipos: • Osmómetro de punto de congelación o crioscopia • Osmómetro de presión de vapor o de punto de condensación 3·- Interés clínico: la medida de al osmolalidad se utiliza como una indicación del equilibrio de líquido y electrolitos. Sirve de ayuda en la valoración del estado de hidratación, hepatopatías, estados de coma y trabajos toxicológicos. A·- Osmolalidad plasmática: la determinación de esta se utiliza habitualmente par destacar estados hiperosmolares. Se considera como tales los que cursan con osmolalidades superiores a los 325 mOsm/Kg. Cuando esta cifra alcanza los 350 mOsm/Kg la situación reviste extrema gravedad y el paciente entre normalmente en coma hiperosmolar. Los valores normales son de 280-300 mOsm/L de plasma, de los cuales el soluto, no electrolitos, representan solo 10 mOsm. Normalmente aunque lo correcto sería, expresarse en mOsm/Kg se usa mOsm/L de solución. Careciendo de importancias clínica el pequeño error introducido. La mayor contribución a al presión osmótica del plasma se debe al sodio, siendo el efecto de las proteínas despreciables. Debido a estos los cambios rápidos en la concentración de sodio afectan a la hidratación celular. Los niveles normales de glucosa y urea contribuyen poco a la osmolaridad plasmática, sin embargo, concentraciones muy elevadas de ambas contribuyen significativamente a aumentar la osmolalidad. La concentración de otros solutos, como el calcio, el magnesio, el potasio, ... raramente varían de forma significativa la osmolaridad, incluso en estados patológicos. B·- Osmolaridad urinaria: se mide para controlar la capacidad de concentración del riñón. Esta es una medida más exacta que la determinación de la densidad para conocer la concentración de la orina. Depende del número de partículas de soluto en una unidad de solución, mientras que la densidad depende tanto de al cantidad como de la naturaleza precisa del la partícula. La proteínas, la glucosa y los medios de contrastes intravenosos elevan de forma desproporcionada la densidad de al orina, más que la osmolaridad. Los valores normales de osmolalidad urinaria son de 100-900 mOsm/Kg. Después de una retención de líquido de más de 12 horas la osmolalidad urinaria deberán ascender como mínimo a 800 mOsm/L. Sin embargo, en el caso de la insuficiencia renal no se superan los 400 mOsm/Kg. De la misma manera que se pierde la capacidad de concentración en la diabetes insípida. 4·- Interpretación clínica: la osmolalidad en el plasma aumenta con la deshidratación y disminuye con la sobre hidratación. En general, las mismas condiciones que reducen o aumentan el sodio sérico afectan a la osmolalidad. (Ver cuadro 175) TEMA 26 ESTUDIO DE LAS HECES INTRODUCCIÓN La digestión comprende el conjunto de fenómenos mecánicos y bioquímicos que transforman los constituyentes orgánicos más o menos complejos de los alimentos en sustancias simples directamente asimilables que son absorbidos y asimiladas a la circulación sanguínea. Los residuos no asimilables a la digestión se eliminan en las heces. Las heces normales están constituidas fundamentalmente por: agua, restos alimenticios no digeridos, productos de al digestión en gran cantidad y bacterias. Esta composición se modifica en diferentes situaciones patológicas: • Los restos alimenticios están aumentados en alteraciones de la digestión y en las proceso diarreicos, ya que si produce la eliminación antes que la digestión y la absorción se complete. • En las patologías con invasión del tracto digestivo por gérmenes o parásitos, esto salen al exterior en las muestras de heces junto a otros productos, debido a la degradación de la mucosa intestinal como la sangre y el moco. En las infecciones pueden presentarse leucocitos. El análisis de la muestras de heces de un paciente puede conducirnos a valiosas orientaciones diagnósticas que van desde el diagnóstico precoz de un carcinoma (aparición de sangre oculta en heces), hasta el diagnóstico de una esteatorrea (trastorno digestivo que cursa con una mala absorción o digestión de las grasas), sin olvidar los exámenes bacteriológicos y parasitológicos realizados con muestras fecales. Cuadro. En una muestra d heces, por tanto, pueden realizarse diversos tipos de análisis, entre ellos el estudio físico químico que es el comienzo de cualquier examen de heces e irá orientado en función del que el examen posterior sea microbiológico, parasitológico o sea el estudio de la digestión. Así, par realizar un análisis parasitológico no será necesario la determinación de pH, mientras, que será interesante par el estudio de la digestión. Cuadro. TEMA 27 ESTUDIO DEL LÍQUIDO SEMINAL EYACULACIÓN Durante la eyaculación la próstata, el conducto deferente y las vesículas seminales inyectan uno tras otro su contenido en la uretra. Desde aquí la lanza al exterior por las contracciones rítmicas del músculo del periné, especialmente el bulboesponjoso ESPERMA (semen) El líquido espeso expulsado durante la eyaculación. Tiene un color blanco lechoso, se licua de 5 a 30 minutos. El esperma está formado por espermatozoides, secreciones de las glándulas sexuales accesorias, entre los componentes bioquímicos hay que destacar la fructosa, fuente de energía de los espermatozoides (fructosa 1-4gr/l). El pH es de 7’2-7’8. • Componentes accidentales: células descamadas, elementos formas, detritos cel • Volumen: ~ Margen normal: 2-4 ml, el volumen depende sobre todo de las secreciones de las glándulas sexuales accesorias. ~ Parvisema: volumen inferior a 1’5 ml ~ Multisemia: más de 8 ml de eyaculaciones (se produce en irritaciones de las glándulas) • Número de espermatozoides: determinado previa dilución en una cámara de contaje de los elementos formes de la sangre. ~ Margen normal: 6-120 millones/ ml ~ Hipospermia: 20-40 millones/ ml ~ Oligospermia: 1-20 millones/ ml ~ Crisptostermia: menos de 1 millón/ ml ~ Polispermia: más de 300 millones/ ml • Espermatozoides anómalos: en el producto normal de la eyaculación se encuentra de un 10-30% de un espermatozoide anómalo. El aumento de más del 40% se denomina teratospermia. De 2-3% de las células son precursoras de los espermatozoides maduros. • Espermatozoides muertos: su presencia se determina por la tinción de la eosina. Las células muertas se tiñen y las vivas no. Técnica mezclar un gota de esperma con una gota de solución de eosina al 1% sobre el porta, extender, secar al aire y observar al microscopio con aceite de inmersión. De un 8-10% de células muertas es normal. • Movilidad: un espermatozoide puede recorrer de 1-4 mm/minuto. El recorrido se mide en capilares de vidrio calibrados. El porcentaje de los espermatozoides va disminuyendo constantemente después de 1 hora. Se dice que después de 24 horas sigue siendo móvil aún un 10% de los espermatozoides. EYACULACIÓN RETRÓGRADA Después de intervenciones d próstata o en casos de trastornos de inervación el semen toma, a veces, el camino equivocado. En la uretra se moviliza hacia arriba en vez de hacia abajo. En la siguiente micción el semen se expulsa por la orina. El paciente suele ser estéril porque los espermatozoides ya no llegan a la vagina de la mujer. TEMA 28 ESTUDIO DEL LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO 1·- Formación del líquido cefalorraquídeo (LCR) 2·- Interés clínico 3·- Toma de muestras 4·- Examen físico 5·- Examen citológico 5.1·- Recuento células total 5.2·- Recuento diferencial 6·- Examen químico 6.1·- Proteínas 6.2·- Glucosa 6.3·- Otros parámetros 7·- Informe de un análisis de LCR 8·- Análisis del LCR en diversas patologías del S.N.C. TEMA 29 MONITORIZACIÓN DE FÁRMACOS (MF) 1·- Introducción 1.1·- Criterios que justifican la monitorización de fármacos 1.2·- Estudios de monitorización de fármacos 2·- Farmacología: generalidades 2.1·- Conceptos básicos en Farmacología 2.2·- Mecanismos generales de acción de los fármacos 2.3·- Bases farmacocinéticas para la utilización de fármacos 3·- Programa de monitorización de fármacos 4·- Etapas de la monitorización de fármacos 5·- Técnicas analíticas en la monitorización de fármacos 5.1·- Inmunoensayos 5.2·- Técnicas cromatográficos 5.3·- Técnicas inmunonefelométricas 5.4·- Otras técnicas analíticas de monitorización de fármacos 6·- Fármacos a monitorizar 6.1·- Grupos terapéuticos 6.2·- Indicación para la monitorización de los fármacos 6.3·- Fármacos a monitorizar: razones y casos recomendables 6.4·- Ejemplo de monitorización de fármacos 7·- Influencia del estado fisiológico en la monitorización de fármacos. TEMA 30 DROGAS DE ABUSO 1·- Introducción 2·- Farmacología 3·- Analítica de drogas de abuso 3.1·- Niveles de análisis 3.1.1·- Screening 3.1.2·- Confirmación 4·- Métodos de detección de las principales drogas de abuso 4.1·- Cannabinoides 4.2·- Drogas depresoras 4.3·- Drogas alucinógenas 4.4·- Opiáceos 4.5·- Estimulantes 4.6·- Otras drogas de abuso TEMA 31 MARCADORES TUMORALES 1·- Introducción 2·- Marcadores tumorales 2.1·- Clasificación 3·- Indicaciones para la analítica de marcadores tumorales 4·- Pruebas analíticas. Generalidades 4.1·- Valor predictivo 4.1.1·- Valor predictivo positivo 4.1.2·- Valor predictivo negativo 4.2·- Especificidad 4.3·- Sensibilidad 5·- Pruebas analíticas. Ejemplos 5.1·- Modo operatorio de los ensayos MEIA 5.2·- Parámetros analíticos de algunos inmunoensayos. TEMA 32 TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR: HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS 1·- Introducción 2·- Hibridación de los ácidos nucleicos 2.1·- Técnicas de hibridación 2.1.1·- Extracción del ácido nucleico 2.1.2·- Técnica de Southern blot 2.1.3·- Lectura de resultados 2.1.4·- Aplicaciones de la técnica de Southern blot 2.2·- Técnica de Northern blot 3·- Ampliación de ácidos nucleicos mediante PCR TEMA 33 TÉCNICAS ELECTROQUÍMICAS BASES DE ELECTROQUÍMICA La química electroanalítica abarca un grupo de métodos analíticos cuantitativos basados en las propiedades eléctricas de la disolución de un analito cuando forma parte de células eléctricas. La célula electroquímica está constituida por 2 conductores llamados electrodos cada uno sumergido en una solución adecuada de electrolito, un puente salino inerte entre ambos para que circule la corriente eléctrica y un potenciómetro para medir la diferencia de potencial generada. FUNDAMENTO Cuando un metal se sumerge en una disolución de sus propios iones se crea una diferencia de potencial entre el metal y la solución producida por la tendencia de los átomos del metal a pasar a la disolución como iones liberando neutrones en el proceso. La lámina del metal introducida en la disolución se llama electrodo, el sistema completo se denomina semicélula y la reacción que se produce es: Es una reacción de oxidación ya que el átomo pasa del estado neutro al positivo y el electrodo por definición se llama ánodo. Con algunos metales ocurre el proceso contrario los iones metálicos de la disolución toman electrones y pasan a átomos neutros que se depositan en el electrodo. Esta es una reacción de reducción del ión metálico, y el electrodo recibe el nombre de cátodo. En ambos casos la magnitud del potencial generado se encuentra en relación con la concentración o más bien la actividad de los iones metálicos de la solución. Algunos ejemplos de estos sistemas capaces de generar un potencial son: • Plata / iones plata • Cobre / iones cobre Sin embargo existen otros sistemas generadores de este tipo de potencial como son elementos no metálicos (halógenos y oxígeno), sistema de óxido-reducción y ciertos sistemas de membrana. ECUACIÓN DE NERST En los sistemas vistos anteriormente la relación entre el potencial generado en la semicélula y la concentración de la disolución implicada viene dada por la ecuación de Nerst: E = potencial de la semicélula Eo = potencial de la semicélula en condiciones estándar (T) R = constante = 8.314 julios / gramos t = temperatura absoluta n = número de electrones puestos en juego en la reacción (coincide con el cambio de valencia del metal) F = constante de Faraday ln = logaritmo neperiano (igual a logaritmo en base e) Según esta ecuación el potencial de una semicélula es función de ciertas variantes: ~ Temperatura ~ Concentración de la disolución ~ Número de electrones intercambiados Si se sustituye la temperatura por su valor a 25ºC (298ºK), las constantes R y F las sustituimos por su valor y se multiplica por 2’203 para pasar de logaritmo neperiano a decimales, la ecuación anterior se transforma en: Y si el proceso se considera como una reacción REDOX, la expresión de la ecuación será: Siendo (ox) la concentración de la forma oxidada del ión metálico y (red) la concentración de la forma reducida del ión metálico. En la ecuación de Nerst Eo es el potencial de la semicélula en condiciones estándar y se define como el potencial del electrodo cuando todos los reactivos y productos tienen una actividad igual a la unidad. Los potenciales estándar de las distintas semicélulas están calculados experimentalmente. LA CÉLULA ELECTROQUÍMICA No es posible medir directamente la diferencia de potencial generado entre el metal y la disolución de la semicélula. Para ellos es necesario unir 2 semicélulas de forma que los potenciales generados en cada una de ellas se convienen formando una célula electroquímica con una diferencia de potencial que se manifiesta por un flujo de corriente eléctrica mesurable con un voltímetro. El ejemplo más típico es el de la célula de Zinc-cobre. El ánodo de zinc está sumergido en una disolución de sulfato de zinc (SO4Zn) tiene un exceso de electrones por el proceso de disolución. Simultáneamente el cátodo de cobre se empobrecen electrones que son captados por los iones de la disolución. El exceso de electrones va desde el ánodo hasta el cátodo (por el conductor) y este flujo constituye la corriente eléctrica; el exceso de electrones de una parte y el defecto de al otra son responsables de la diferencia de potencial que persiste hasta que al reacción cesa. El circuito se completa con un potenciómetro y un puente salino que establece la conexión eléctrica y es habitual un gel en el que se disuelve un electrolito inerte (KCl) Para medir el potencial (E) de una solución y relacionarlo con su actividad y concentración se necesita por tanto componer una célula electroquímica con 2 semicélulas distintas llamadas electrodos indicador y electrodo de referencia. El potencial del electrodo indicador y electrodo de referencia. El potencial del electrodo indicador responde proporcionalmente a la concentración de la sustancia de interés, mientras que el electrodo de referencia mantiene un voltaje constante y conocido. Lo que se mide realmente es la variación de potencial con respecto a esa semicélula invariable que se considera de referencia: E célula = E cátodo – E ánodo. Donde el montaje del cátodo y del ánodo, el montaje del electrodo para las selecciones catódicas y anódicas. TÉCNICAS ELECTROQUÍMICAS Los métodos electroanalíticos se dividen en 2 grupos: • Métodos que tienen lugar en la interfase del electrodo con la fina capa de disolución adyacente. • Métodos basados en fenómenos que tienen lugar en la disolución y en las que se intentan evitar los fenómenos de la interfase. Aunque el fundamento de cada método varíe, todo se basa en el empleo de la célula electroquímica, ya sea esta ó: ~ Galvánica, es decir, con producción de energía eléctrica ~ Electrolítica, es decir, consume energía eléctrica. Tienen en común las siguientes características: • Las medidas son generalmente específicas para el estado de oxidación para un elemento. • La instrumentación es relativamente barata • Proporciona información sobre las actividades en lugar de las concentraciones, lo que es interesante en estudios fisiológicos. Las técnicas electroquímicas más utilizadas en el laboratorio son: ~ Los métodos potenciométricos: se basan en la medida del potencial de las células electroquímicas en ausencia de corriente. ~ Los métodos amperométricos: se basa en la medida de la cantidad de corriente que fluye cuando se aplica un voltaje cte al electrodo de medida La utilidad en el laboratorio de estas técnicas es: • La medida del pH (más importante) • Determinación de la concentración de iones • Medida de la presión parcial de gases (dióxido de carbono, oxígeno) • Medida del punto final de métodos volumétricos • Medida del poder de oxidación o reducción de una disolución El equipo requerido para estos métodos es símil: ~ Electrodo de referencia ~ Electrodo indicador ~ Dispositivo para medir el potencial generado por la célula. A·- Electrodos de referencia: son semicélulas de potencial conocido y constante que se utilizan para componer una célula con otra semicélula y obtener una diferencia de potencial proporcional a la actividad de la sustancia a medir. Los más usados son: • Electrodo de hidrógeno / ión hidrógeno: consiste en un electrodo de platino en una solución de ácido clorhídrico con hidrógeno a presión atmosférico que borbotea sobre la superficie de platino. La reacción de la semicélula es: H H+ + e-. Este electrodo se considera el electrodo estándar. Tiene un Eo (potencial de semicélula en condiciones estándar) asignado a 25ºC a cero voltios por lo que conectando cualquier semicélula a ésta y midiendo el potencial desarrollado se obtiene el potencial, directamente, relativo de la segunda semicélula. Así se obtiene el potencial estándar de la mayoría de las semicélulas. Aunque el electrodo de hidrógeno es el electrodo estándar no se usa habitualmente por la dificultad de su mantenimiento y por ello se han desarrollado otras células más estables. • Electrodo de calomelanos: los electrodos de referencia de calomelanos constan de mercurio metálico en contacto con una disolución saturada de cloruro mercuriosos (HgCl2) y una concentración conocida de cloruro potásico, se representa del siguiente modo: Hg / HgCl2 (sat), KCl (XM)//. El potencial de electrodo para esta semicélula está determinado por la reacción: Hg2Cl2 (sat) + 2e- ↔ 2HgCl2 (sat) + 2Cl- y depende de la concentración de cloruro (X) por lo que este valor debe especificarse en al descripción del electrodo. Los electrodos de calomelanos más comunes son: ~ Los calomelanos 0’1, 3’5 M. ~ Los calomelanos saturados En todos ellos la disolución está saturada de HgCl2 y difieren sólo en la disolución de KCl. • Electrodo de plata/ cloruro de plata (AgCl): consiste en un electrodo de plata sumergido en una disolución de KCl que ha sido saturada de AgCl y se representa: Ag / AgCl (sat), KCl (XM)//. El potencial del electrodo se determina por la reacción: AgCl + e- ↔ Ag (sat) + Cl-. Los más usados son los que llevan disolución de KCl 3M y saturados. La ventaja sobre el anterior es que los últimos pueden usarse a temperaturas superiores a 60ºC. B·- Electrodos indicadores: un electrodo indicador debe responder rápida y reproduciblemente a los cambios de actividad del analito cuando se pone en contacto con el mismo. Existen 2 tipos de electrodos indicadores: • Electrodos indicadores metálicos: existen 4 tipos: ~ Los de primer especie: se usan para determinar la actividad del catión derivado del ADSAF del electrodo. En este caso interviene una única reacción. ~ Los de segunda especie: determina la actividad de un anión con el que su ión (derivado del electrodo) puede formar un precipitado o ión complejo estable. ~ Los de tercera especie: pueden determinar la actividad de un catión distinto al del electrodo. ~ Electrodos REDOX: los electrodos constituidos con platino, paladio, oro u otros metales inertes sirven como electrodos indicadores para sistemas de óxidoreducción. • Electrodos indicadores de membrana: existe una amplia variedad de estos electrodos que permiten mediante medidas potenciométricas directas determinaciones rápidas y selectivas de: ~ pH ~ Numerosos cationes y aniones: estos electrodos se denominan electrodos selectivos de iones (ISE), debido a la larga actividad de estos electrodos. En general constan de una membrana que separa el interior del electrodo e la solución que hay que medir y tiene la función de permitir la difusión selectiva de los iones cuya actividad debe determinarse, en consecuencia será necesario un electrodo distinto par cada sustancia. Los tipos de electrodo de membrana son: ~ Electrodos de vidrio ~ Electrodos de membrana cristalina ~ Electrodos de membrana líquida ~ Electrodos selectivos a las moléculas ~ Electrodos de vidrio: consiste en una DSAFSD membrana delgada de vidrio sensible al pH dispuesta al final de un tubo de vidrio o plástico de paredes gruesas. (Dibujo 1) El tubo contiene un pequeño volumen de ácido clorhídrico diluido saturado de cloruro de plata. En un hilo de plata inmerso en una disolución de AgCl se conecta a una de las terminales de un voltímetro y un electrodo de referencia se conecta a la otra terminal. El pH se determina midiendo la diferencia de potencial a través de la membrana de vidrio que separa la disolución del analito de la disolución de referencia de concentración de hidrogeniones conocida (solución de HCl generalmente 0’1 M). (Dibujo 2) Como se ve en la figura existe un transporte de carga eléctrica desde la superficie del vidrio expuesta a la solución de la muestra hacia la superficie del electrodo por lo que se produce una diferencia de potencial entre ambos lados de la membrana proporcional de los iones H+. El electrodo de vidrio tiene estas limitaciones: * Error alcalino: estos electrodo son algo sensibles a los iones de metales alcalinos a pH superiores a 12. * Error ácido: a pH menor a 0’5 suelen obtenerse valores algo superiores a los reales. Potenciales de asimetría: debido al envejecimiento del vidrio. ~ Electrodos ión selectivos: se clasifican según las características selectivas: Electrodos de vidrio para cationes: son electrodos selectivos para cationes ya que la corriente eléctrica es transportada por los cationes de menor carga del vidrio. Cambiando la composición del vidrio obtenemos electrodos para determinar iones monovalentes, como sodio, potasio, ión amonio, litio, plata, etc. Electrodos de membrana cristalinas: están formados por materiales que contiene huecos catiónicos para acomodar aniones tamaño y cargas adecuadas. Ejemplo: electrodo con membrana de fluoruro de lantano que se usa para determinar el ión fluoruro. Electrodos de membrana líquida: las membranas líquidas se forman a partir de líquidos inmiscibles que se enlazan de forma selectiva con algunos iones (aniones y cationes). La membrana consta de un soporte sólido inerte y sobre el soporte se sitúa un intercambiador iónicos, líquido de naturaleza orgánica que penetra en los poros de este. Los líquidos activos en las membranas son de 3 tipos: - Intercambiadores aniónicos - Intercambiadores catiónicos - Compuestos neutros que complejan selectivamente determinados cationes Existe uno muy usado en bioquímica para determinar calcio iónico. ~ Electrodos sensibles a gases: aunque se trata también de electrodo selectivos de iones se clasifican a parte por sus características especiales. Se usan para determinar gases disueltos o bien iones que pueden convertirse en gases disueltos por un cambio de pH. Son en realidad células electroquímicas construidas con electrodos específicos de iones y uno de referencia introducidos en una disolución interna que está retenida por una membrana permeable a los gases. En el laboratorio los electrodos gaseoso más importantes son: - Electrodo de dióxido de carbono: consiste en una modificación del electrodo de vidrio y mide el pH de una disolución de bicarbonato. Cuando una disolución con dióxido de carbono se pone en contacto con la membrana se produce la difusión del gas por tanto el medio acuoso se disocia y hace variar el pH de la solución ClNa DASFASD cambio que detecta el electrodo de vidrio. - Electrodo de oxígeno: también se llama electrodo de Clark. Consiste en un cátodo de platino que está conectado a un ánodo de Ag / AgCl (electrodo de referencia), ambos sumergidos en solución electrolítica de NaCl. La superficie del electrodo está recubierta por una membrana que deja pasar las moléculas gaseosas como las del oxígeno. Este electrodo actúa en presencia de corriente eléctrica (métodos amperométrico). Cuando se aplica el potencial se lleva a cabo una reducción del oxígeno en el electrodo: O2 + + 2H + 4e H2O2 + e 2OH . Este movimiento electrónico del cátodo al ánodo constituye la corriente eléctrica cuya intensidad es proporcional al oxígeno difundido y se mide con un amperímetro. DETERMINACIÓN DEL pH El pH se define como el logaritmo negativo de la actividad de los iones de hidrógeno. La actividad de los iones H+ se puede determinar potenciométricamente para ello se construye una célula electroquímica con un electrodo indicador y otro de referencia sumergidos en la solución cuyo pH se quiere determinar. El electrodo indicador es el electrodo de vidrio cuyo potencial varia con al concentración de H+ debido a la permeabilidad del vidrio a los iones H2. como electrodo de referencia usamos el de calomelanos saturado o el de Ag / AgCl de potencial conocido e independiente del pH. • Peachímetros: los equipos potenciométricos que se emplean para la determinar del pH se denominan peachímetros y miden el potencial presentándolo en unidad de pH. Constan básicamente de 2 elementos: ~ Electrodo indicador ~ Electrodo de referencia ~ Panel o escala en unidades de pH o milivoltios ~ Mandos para la calibración del pH y al temperatura Debido a que los cambios de temperatura modifican el potencial algunos peachímetros van equipados con una sonda de temperatura que realiza directamente la compensación de la temperatura en las medidas del pH. Los electrodos indicador y de referencia pueden presentarse separados o bien combinados en una misma unidad llamándose entonces electrodo de pH combinado. RESUMEN DE BIOQUÍMICA NATREMIA • Normal: 135 – 148 mEq / L • Patológico: ~ Hipernatremia: > 150 mEq / L ~ Hiponatermia: < 130 mEq / L • Orina: 4-6 gr / 24 horas • Determinación: absorción atómica o fotometría de llama POTASEMIA • Normal: 3’5 – 5 mEq /L. • Patológico: ~ Hiperpotasemia: > 5’5 mEq / L ~ Hipopotasemia: < 3’5 mEq / L • Orina: 25 –100 mEq / L/ 24 horas ó 2’5 – 3’5 gr / 24 horas • Determinación: fotometría de llama, absorción atómica y métodos turbidimétricos CALCEMIA • Normal: 2’5 – 10 mEq / L • Patológico: ~ Hipercalcemia: > 10’5 mg /dl ~ Hipocalcemia: < 8’5 mg /dl • Orina: calciuria de 50 - 200 mg /dl. Hiper e hipocalciuria • Determinación: fotometría de llama, espectroscopia de masas. FOSFATEMIA • Normal: ~ en niños: de 4-6 mg /dl ~ en adultos: de 3-5 mg dl • Patológico: ~ Hiperfosfatemia: tiene especial gravedad si sube por encima de 9 mg/dl ~ Hipofosfatemia: tiene especial gravedad si baja por debajo de 1 mg/dl • Orina: de 0’6-1’2 gr / 24 horas • Determinación: espectrofotometría, mét. del fosfomolibdeno y mét. enzimático MAGNESIO • Normal: 1’8 - 2’9 mg/dl • Patológico: ~ Hipermagnesemia: > 2’9 mg/dl ~ Hipomagnesemia: < 1’8 mg/dl • Determinación: absorción atómica, métodos enzimáticos, activación neutrónica con disolución isotópica. GLUCEMIA • Normal: ~ En ayunas: 70 – 105 mg/dl ~ En ancianos: 80 – 115 mg/dl • Determinación: pruebas de tolerancia oral a la glucosa. * Aparece glucosuria por encima de 160 mg/dl GASOMETRÍA ARTERIAL • PO2 normal: 80 - 100 mmHg • PCO2 normal: 35 – 45 mmHg • pH: 7’35 – 7’45 LÍPIDOS • Análisis de colesterol y triglicéridos totales mediante métodos enzimáticos. • Análisis de colesterol enzimáticos • Análisis de colesterol LDL fórmula Friedwald • Análisis de los micromicrones se detectan gracias a su aspecto lechoso y opalescente del suero (se puede dejar por la noche a 4ºC formándose una capa cremosa flotante) • Colesterol total: 150 – 220 mg/ dl • Colesterol HDL: > 55 mg/dl • Colesterol LDL: < 150 mg/dl PROTEÍNAS • Prealbúmina: 10 – 40 mg/dl • Albúmina: 3’5 – 5 gr/dl • -globulina: 0’3 0’7 gr/dl • -globulina: 0’4 – 0’8 gr/dl • -globulina: 0’6 – 1’1 gr /dl • Fibrinógeno: 0’3 gr/dl ó 200 – 400 mg/dl • Sangre: ~ Proteínas totales: Biuret (formación de compuestos colorimétricos); refractómetros; absorción en el ultravioleta y métodos de fijación de colorantes (verde de bromocresol). • Orina: ~ Proteínas totales: turbidimétricos y métodos que fijan colorantes (azul brillante de Coomasie). UREA • Normal: 18 – 40 mg/dl • Orina: 15 –24 gr/dl • Determinación: métodos enzimáticos colorimétricos. ÁCIDO ÚRICO • Normal:3’5 mg/dl • Orina: 0’5 – 1 gr/ 24 horas • Determinación: método enzimático colorimétrico CREATINA creatinina: aclaración de creatinina • Normal (suero): 0’5 – 1’3 mg/dl • Orina: 1 – 1’6 gr/ 24 horas • Determinación: método cinético colorimétrico por aclaración de creatinina. DETERMINACIONES HEPÁTICAS • Enzimas • Triglicérido • Proteínas • Glucosa • Colesterol • Transaminasa • Albúmina DETERMINACIÓN DE HORMONAS • Técnicas espectrofotométricas, cromatográficas, pero las más utilizadas son las inmunoquímicas (RIA, EIA, FIA). DETERMINACIÓN DE ENZIMAS • Se mide su actividad (cuadro) HECES • Se determina: ~ pH ~ sangre oculta en heces ~ examen macroscópico ~ examen microscópico (X 40) primero sin teñir y luego con sudán III (grasas) lugol (hidratos de carbono) HIERRO • Anemia: ~ Varón: < de 130 gr/l ~ Mujer no embarazada: < de 120 gr/l ~ Mujer embarazada: < de 110 gr/l • Se mide la concentración de hemoglobina CORAZÓN • Aumento precoz y poco duradera de la CK total (CK-MB) • Aumento más tardía y más duradera de la GOT • Aumento aún más tardía y duradera de la LDH total. MONITORIZACIÓN DE FÁRMACOS • Se determina por RIA, EIA, FIA, EMIT, ELISA, cromatografía y espectroscopia de masas. DROGAS DE ABUSO • Se determina por: FIA, EMIT, RIA, cromatografía y espectroscopia de masas cuando es una prueba de confirmación. Estudio de la hormona del crecimiento y factores de crecimientos: Hormona del crecimiento El crecimiento es un fenómeno biológico fundamental en el desarrollo de todos los niños. El crecimiento se produce por una doble acción: • Un aumento del tamaño de las células del cuerpo. • Un aumento en su número Tanto el crecimiento como estos dos procesos anteriores dependen de la capacidad de las células para asimilar nutrientes, de este modo los alimentos son utilizados para construir nuevas estructuras celulares. El crecimiento de un individuo sufre varios cambios a lo largo de la vida. Un modelo de crecimiento podría ser el siguiente: • fetal: 9 meses en la matriz. • infante: desde el nacimiento al primer año. • niñez temprana: desde el primero al tercer año. • niñez tardía: desde el tercero al décimo año. • pubertad: entre los 10 y 14 años (depende del sexo). • adolescencia: entre los 14 y los 18 años. De estas seis etapas una de las más importantes en cuanto al crecimiento es la puberal, ya que produce un crecimiento brusco llamado estirón puberal. Este es mayor en los varones que en las mujeres y en éstas últimas aparece en una edad más temprana, estos dos factores influyen en la diferencia de talla final existente entre ambos sexos. Para poder establecer si un niño crece normalmente se usan unos gráficos, los cuales utilizan cifras estándar de talla obtenidos a partir de un alto número de individuos de una determinada edad, por lo que partimos de datos experimentales, el resultado de esta investigación es que la gran mayoría de los individuos tienen una altura media o cercana a ella y que solo unos pocos están muy por debajo de ésta o muy por encima. En el crecimiento influyen diversos factores, algunos externos a la persona y otros de carácter interno. • Los factores externos son aquellos determinados por el ambiente que rodea al niño, por ejemplo: la alimentación que recibe o factores emocionales, ya que el crecimiento puede ser suprimido por el estrés que sufre el niño. La situación socioeconómica de la familia influye de forma importante en su desarrollo. • Los factores internos dependen de las características genéticas del individuo, dentro de éstas se incluyen la talla de los padres, la raza y el sexo del niño. También dependen de las hormonas hipofisarias, sobretodo de la somatotropina que estimula tanto el crecimiento como la maduración ósea. El retraso del crecimiento debido a la deficiencia o insuficiencia de la hormona del crecimiento puede ser de origen congénita, adquirida o transitoria. La adquirida puede ser causada por tumores, tratamientos para leucemias, infecciones, etc. La transitoria es normalmente de origen idiopático pero puede tener una base pricosocial debido a malos tratos o origen en un hipotiroidismo primario. Cuando los niños van a consulta para la evaluación de su retraso de crecimiento presentan una estatura más baja de lo normal, una velocidad de crecimiento disminuida y una edad ósea retrasada. También tiene un aspecto facial infantil, voz aguda, obesidad abdominal, etc. Para el diagnóstico de esta deficiencia juegan un papel importante las pruebas de laboratorio. También se debe confirmar el retraso en el crecimiento mediante el estudio de la talla, peso y velocidad de crecimiento. Para medir la talla se utiliza los estadiómetros. El diagnóstico temprano de la deficiencia de esta hormona es fundamental para un tratamiento efectivo. La hormona del crecimiento o somatotropina es un polipéptido producido por el lóbulo anterior de la hipófisis. El encargado de liberar el factor que permite la secreción de la hormona del crecimiento (GH) es el hipotálamo el cual actúa sobre la hipófisis sintetizando dicha hormona. Ésta estimula el crecimiento corporal ejerciendo su acción sobre los cartílagos de crecimiento de los huesos. Se libera mayoritariamente durante el sueño. Su modo de actuar en el organismo es de dos tipos: • Indirectos: 1·- Estimula el crecimiento, la síntesis proteica y la captación de aminoácidos por la célula. Este efecto del crecimiento tiene un péptido mediador somatomedina que se produce en el hígado en presencia de GH. 2·- Efectos metabólicos. 3·- Estimula la síntesis proteica. • Directos: estos tiene acción anti-insulínica. 1·- Estimula la lipólisis (hiperlipemia: incremento de la concentración plasmática de las diferentes fracciones lipídicas). 2·- Posee una acción hiperglucemiante (aumenta la glucosa). Factores de crecimiento Los factores que estimulan la producción de la hormona del crecimiento son: 1·- Hipoglucemia: son factores de crecimiento de tipo insulínico también denominados somatomedinas (que son sustancias intermedias). 2·- Ejercicio. 3·- Ingesta de proteínas. La GH al igual que otras hormonas sufre alteraciones que están producidas por un déficit (absoluto o relativo) o por un aumento de la misma. En los niños con déficit de esta hormona provoca una talla final baja. En los adultos este está relacionado con la disminución de masa muscular y ósea, aumento de grasa corporal e incluso con una menor calidad de vida. Estudio de la hormona de crecimiento en el laboratorio Se determina por radioinmunoensayo y radioinmunoanálisis (RIA). Los niveles en ayunas y en reposos en plasma tienen que ser menor a 10 mg/l. Otras pruebas a realizar son: • Estudio del metabolismo de los glúcidos. • Valoración basal de la GH. Cuando esta determinación se realiza por la mañana y en ayunas da valores menores a 5 ng/ml. • Niveles séricos de la IGFs (tipo de somatomidina). Estos informan sobre la secreción de GH y el estado de nutrición. De modo que si los niveles son elevados indican un exceso de GH y si son bajos indican que hay un defecto. • Pruebas de estimulación de la GH. Las más aceptadas son aquellas que contiene GHRH y las de hipoglucemia insulínica. En esta última se añade insulina que provoca una disminución de la glucosa y un aumento de la GH. Es un técnica similar a la PTOG, únicamente cambia la glucosa por la insulina. Esta técnica se realiza extrayendo sangre cada 30 minutos hasta llegar a las 2 horas. Se introduce insulina por vía intravenosa, esta prueba hay que realizarlas por la mañana. Cuando al menos dos test de esta prueba den valores insuficientes se considera que existe un déficit de GH. Se utiliza para el diagnóstico de enanismo en niños y cuando se sospecha déficit hormonal en adultos. • Pruebas de supresión o frenados: se realiza ante la sospecha de gigantismo o acromegalia. Las más utilizadas son la PTOG y pruebas con somatostatina y bromocriptina (son hormonas generada por la hipófisis que estimulan el crecimiento). • Pruebas de secreción espontánea integrada. En estás se valora la secreción de hormona durante 24 horas con una cierta frecuencia (cada 30 minutos) o su excreción en la orina. Esta pruebas se realizan ya que hay niños de baja talla que no presentan problemas de secreción sino una alteración de la misma. La utilidad de la determinación de la hormona del crecimiento nos sirve para diagnosticar gigantismo en niños o acromegalia en adultos cuando la GH está aumentada; en cambio cuando ésta está disminuida existe enanismo hipofisario. Cuando hay una disminución de la GH también hay una disminución de otras hormonas, lo que nos indica la presencia de un tumor. Estudio del eje hipotálamo-hipofisario-tiroideo La hipófisis es un órgano impar, situada bajo el cerebro, en una cavidad bajo el cerebro, que se llama silla turca. La hipófisis es de un color rojizo y del tamaño de un guisante. Las hormonas producidas por la hipófisis son bastante numerosas, y se dividen en dos lóbulos: lóbulos anterior y lóbulo posterior. Hormona del lóbulo anterior • Hormona del crecimiento: tiene su origen en las células eosinófilas del lóbulos anterior de la hipófisis. Favorece el desarrollo de todo el organismo (en particular de la talla ya que interviene en los hueso). Es la hormona que determina la estatura. • Hormonas gonadotropas: son las que regulan las funciones de los órganos sexuales. Favorecen el desarrollo de estos órganos. • Hormonas que regulan la actividad de otra glándulas: regulación de la actividad del tiroides, de la corteza de las glándulas suprarrenales y de la paratiroides. •Hormonas metabólicas: su acción es reguladora sobre el metabolismo general, sobre el metabolismo de los azúcares (diabetes), sobre el metabolismo de las grasas (obesidad), sobre el metabolismo del agua (secreción de orina). Sobre los azúcares tienen una acción contraria a la de la insulina. Hormona del lóbulo posterior • Hormona adiuretina: actúa sobre la diuresis, es decir, sobre la eliminación de la orina frenándola. • Hormona vasopresina: contrae los vasos sanguíneos, aumentando así la presión arterial. • Hormona oxitocina: estimula las contracciones del uréter que en la mujer interviene en el parto. La hipófisis secreta varias hormonas, entre muchas encontramos: la adrenocorticotropina (tiene la función de estimular las glándulas suprarrenales y secretar cortisol, esteroides androgénicos,...); hormona estimulante de los melanocitos (tienen la función de regular la pigmentación de la piel); la hormona luteinizante y la foliculoestimulantes (actúan sobre las gónadas); hormona del crecimiento (favorece el crecimiento de músculos y huesos y regula el metabolismo) y por último la hormona estimulante del tiroides que es la que produce las hormonas tiroideas. El tiroides es un órgano con forma de mariposa situado en la parte anterior del cuello, abrazando la tráquea, inmediatamente por debajo de la manzana de Adán (o cartílago circoides de la laringe) y por encima del esternón. Las hormonas producidas por el tiroides se llaman tryyodotironina (T3) y tiroxina (T4). Su principal característica es que contienen yodo. Este yodo, proviene principalmente de fuentes externas a partir del agua y los alimentos ingeridos y es trasportado por la sangre. El tiroides tiene la capacidad de atraparlo e incorporarlo a un proteína llamada tiroglobulina, en la cual se almacenan las hormonas tiroideas. ¿Cómo se controla la producción de hormonas tiroideas? La síntesis de estas hormonas y su secreción están controladas por la hipófisis mediante un mecanismo muy sensible a las variaciones en las concentraciones de T3 y T4 en la sangre. Cuando la hipófisis detecta una disminución producen tirotropina (TSH: hormona estimulante del tiroides); la cual es liberada a la sangre. El hipotálamo sintetiza la hormona liberadora de tirotropina o TRH (estimula a la hipófisis para que sintetice TSH). Al llegar a las glándulas tiroideas, TSH activa diversos pasos en la fabricación y en la liberación de hormonas tiroideas almacenadas para que sean vertidos a la sangre. De esta forma, T3 y T4 llegan a los órganos donde ejercen su acción. Un vez las concentraciones de T3 y T4 en la sangre se elevan, se frena la producción de TSH y el tiroides también detiene la fabricación de sus productos. Esto es lo que se llama un sistema de control por retroalimentación negativa. Efectos que producen las hormonas tiroideas Las hormonas tiroideas estimulan procesos vitales en todo el organismo. Además, influyen en la maduración y el desarrollo de los tejidos, en la producción de energía y de calor, en el metabolismo de nutrientes, en las funciones metabólicos, cardíacas, respiratorias, sexuales y reproductivas. Cuando se rompe el equilibrio de producción y secreción de hormonas se producen las alteraciones funcionales de la glándula. Cuando disminuye la cantidad y actividad de T3 y T4 en los órganos blanco se produce hipotiroidismo. Por el contrario cuando hay exceso se produce hipertiroidismo. Las funciones del tiroides son las siguientes: • Acelera la combustión de los alimentos (proteínas, hidratos de carbono), elevando el nivel del “metabolismo basal”. • Favorece la eliminación del agua, de los tejidos. • Determina el crecimiento en estatura y en peso de los niños. • Favorece el desarrollo de los órganos sexuales e interviene en los cambios de la adolescencia. • Exalta la función del corazón, de los pulmones, y favorece el desarrollo de la inteligencia, de las cualidades intelectuales. Hipotálamo Estructura diencefálica situada en la base del cerebro, debajo del hipotálamo y repartida por la pared inferior y lateral del tercer ventrículo. El hipotálamo está formado por numerosos núcleos de sustancia gris. Está unido a la hipófisis mediante un importante haz de fibras, formando el denominado “eje hipotalámico-hipofisario” que regula la homeostasis del medio interno y el control de las funciones neuroendocrinas. Ciertas zonas del hipotálamo forman parte también del sistema límbico, cerebro visceral o cerebro emocional de Papez, constituyendo su centro de mando o parte efectora que regula la vida emocional o afectiva. Al hipotálamo llegan aferencias del sistema motor, olfativo, gustativo, visual,... así como de otras áreas del sistema límbico. A su vez, envía información a la mayor parte de las estructuras cerebrales. Además, el hipotálamo está íntimamente relacionado con los reacciones y enfermedades psicosomáticas. Métodos diagnósticos La mayoría de las enfermedades tiroideas se manifiestan por alteraciones cualitativas o cuantitativas en las secreción de hormonas, en el aumento del tamaño de la glándula o en ambas. Así cuando disminuye la cantidad y actividad de T3 (L-Tironina) y T4 (LTiroxina) en los órganos blanco, se produce hipotiroidismo. Por lo contrario cuando hay exceso de hormonas se produce hipertiroidismo o tirotoxicosis. ¿En qué consiste el hipotiroidismo? El hipotiroidismo se refiere a cantidad o actividad insuficiente de hormonas tiroideas (T3 y T4) para ejercer sus acciones en los diferentes órganos. La causa más frecuente es la disminución de la producción de hormona en la glándula tiroides, esto ocurre como consecuencia de perdida de tejido glandular secundario a inflamación, cirugía o irradiación o por alteración en la síntesis hormonal debido a defectos congénitos en la maquinaria de las células o deficiencia de yodo o la administración de sustancias externas que bloquean la síntesis normal. En otros casos el hipotiroidismo puede deberse a lesiones tumorales, vasculares, inflamatorias, quirúrgicas o traumáticas de la hipófisis que reducen la producción de TSH ó del hipotálamo que afectan a la producción de TRH. Manifestaciones del hipotiroidismo Las manifestaciones son variables según la edad de aparición y la severidad del déficit de hormonas tiroideas. El hipotiroidismo congénito aparece cuando el tiroides fetal no funciona bien. El recién nacido tiene poca actividad, duerme mucho, como poco, tiene estreñimiento y sufre ictericia prolongada. Si el déficit no se repone, ocurre retardo del desarrollo físico y mental irreversibles y puede conducir al cuadro llamado cretinismo. En los adultos, los síntomas suelen ser inespecíficos y pueden progresar poco a poco. Pueden ser los siguientes: Cabello escaso y seco Sordera Frecuencia cardiaca disminuida Presión arterial alta Piel seca y fría Inflamación Estreñimiento Dolor y sensibilidad muscular Ronquera Depresión, lentitud de pensamiento, etc. Como vemos, es un cuadro caracterizado por disminución y lentificación de gran cantidad de actividades vitales. En casos extremos este cuadro se llama mixidema que puede progresar, sin tratamiento a coma y muerte. Las causas más frecuentes de hipotiroidismo El hipotiroidismo primario es el más frecuente; es decir el causado por defecto en la glándula misma. Muchas veces no se logra saber cual es la razón del defecto en la síntesis de hormonas tiroideas y se habla de hipotiroidismo primario ideopático. Otras veces es secundario al tratamiento con cirugía o yodo radiactivo de enfermedades de la glándula tiroides o la irradiación del cuello. El déficit de yodo impide la síntesis normal de hormonas tiroideas. Otra causa frecuente es la tiroiditis crónica autoinmune. El hipotiroidismo de causa central (por lesiones de hipófisis o hipotálamo) es poco frecuente. Diagnóstico de hipotiroidismo De acuerdo con los hallazgos clínicos, se mide la concentración de hormonas en la sangre (T3, T4, TSH). En el hipotiroidismo primario, T3 y T4 suelen estar por debajo de los niveles normales y TSH se encuentra elevada. Dada la alta sensibilidad de la hipófisis para detectar descensos mínimos de T3 y T4, en ocasiones la concentración de estas hormonas son normales pero TSH está elevada indicando que existe deficiencia tiroidea. En el hipotiroidismo central tanto las hormonas tiroideas como la TSH están bajas. ¿Qué es el hipertiroidismo? Hipertiroidismo o tirotoxicosis se refiere a la presencia de cantidades excesivas de hormonas tiroideas en los órganos blanco. Las causas pueden ser: • Producción excesiva de hormonas por la glándula tiroides como ocurre en la enfermedad de Grave. • Liberación de gran cantidad de hormona almacenada como ocurre en casos de tiroiditis (inflamación del tiroides autoinmune o viral). • Estimulación exagerada de la síntesis de hormonas tiroideas por secreción excesiva de TSH a partir de ciertos tumores de la hipófisis. Manifestaciones clínicas Los síntomas suelen ser más llamativos que los de hipotiroidismo. Son los siguientes: Calor desproporcionado con la temperatura ambiental Sudoración intensa Pérdida de peso a pesar de apetito normal o aumentado Nerviosismo, irritabilidad, temblor de manos e insomnio Debilidad muscular poca tolerancia al ejercicio Taquicardia y palpitaciones Diarrea y alteraciones menstruales En casos de larga duración se pueden presentar complicaciones cardiovasculares y osteoporosis. Causas más frecuentes de hipertiroidismo En ocasiones una porción de la glándula se independiza y se produce grandes cantidades de hormonas sin responder a ningún control. Se puede tratar de un adenoma (tumor benigno de la glándula tiroides) tóxico o de un bocio simple de larga evolución tóxico. En etapas iniciales de tiroiditis autoinmune se puede producir tirotoxicosis transitoria por liberación de las hormonas al destruirse la glándula, antes de que ocurra hipotiroidismo. La tiroides subaguda suele aparecer después de un episodio viral. Para el diagnóstico de las enfermedades tiroideas se dispone de diversos métodos que permiten establecer con exactitud el tipo de patología presente: • La determinación de T3 y T4 libres y de la hormona estimulante del tiroides, TSH, parece ser la mejor forma de detectar alteraciones en la función tiroidea. La prueba del TSH informa acerca del nivel de secreción hipofisario, y en consecuencia del estado de la glándula. Si los niveles son normales, el diagnóstico es de eutiroidismo. Si los niveles son altos se sospecha de hipotiroidismo. En este caso la prueba de la T4 libre dará la confirmación en caso de ser baja, mientras que si es normal, habrá que investigar los anticuerpos antimicrosomiales en busca de patología autoinmune. Cuando los niveles de TSH son bajos se plantea el estudio de hipertiroidismo y al realizar la prueba de la T4 los valores son elevados se confirmará el hipertiroidismo. Sin embargo, si los niveles de T4 son normales, se realiza una medida de T3 que si es elevada confirmará el hipertiroidismo y si es normal orientará hacia eutiroidismo. • La detección de anticuerpos antitiroideo circulantes frente al receptor tiroideo o frente a estructuras tiroideas (antitiroglobulina, antiperoxidasa tiroidea) es interesante ya que en algunas patologías se desarrollan estos anticuerpos como la enfermedad de Graves-Basedow o en la tiroiditis de Hashimoto. • La prueba de la estimulación con TRH evalúa el estado funcional de los mecanismos secretores de la TSH. La técnica consiste en la inyección IV de TRH. En los individuos normales, la TSH comienza a aumentar en plasma a los pocos minutos de la inyección, alcanzando el pico máximo entre los 20 y los 45 minutos posteriores y cayendo a continuación rápidamente. En la tirotoxicosis se observa ausencia de respuesta o respuesta disminuida de la TSH.