Fraccionamiento subcelular por centrifugación diferencial

Fraccionamiento subcelular por centrifugación
diferencial
Fórmula para el cálculo del campo centrifugo desde g a rpm
RCF = 1,12 x 10-5 x (rpm)2 x R (cm)
Resultados:
campo centrifugo relativo
rpm
(redondeado)
2800
9000
13800
42100
13600
radio medio en cm
7,75
xg
700
7000
17000
105000 ultracentrifuga
16000
radio de ultracentrifuga
cm
4
Cálculo:
Para la 1ª:
rpm =
√ (RCF/ (1,12 x 10
-5
x R (cm))
√
para valor de 700 x g entonces: rpm = (700/ (1,12x10-5 x 7,75) = 2839,8 ≈ 2800 rpm ya hemos
redondeado porque la centrifuga va de 100 en 100 unidades de rpm.
7,75 es el radio medio determinado según el volumen de forma visual.
Para el resto de las fraciones se calcúla igual. Ver tabla.
Determinacion de proteínas
Calculos para el procedimiento experimental:
1.
2.
preparacion de la dilución 1/10 de la muestra
primero hacemos la solución de 500 μl añadimos 450μl de agua destilada y 50μl de muestra;
total 500μl.
De esta solución se coge el vol. de muestra de tabla y se adiciona agua hasta completar 1ml.
Muestra μl
Agua destilada μl
25
975
50
950
100
900
preparacion de albumina
partimos de 0,5mg /ml  500μg/ml
tenemos que añadir una cantidad de albumina de 0, 50, 150, 250 μg de albumina en un
volumen final de 1ml.
Resultados:
Cantidad de Albumina μg
Vol de sol. Albumina μl Vol agua destilada μl
0
0
1000
50
100
900
150
300
700
250
500
500
Calculos:  CV=C’V’
500μg/ml x V= 50 μg/ml x 1ml; V = (50 μg/ml x 1ml)/ 500μg/ml = 0,1ml = 100μl de vol de sol. Albumina
el agua destilada que hay que añadir hasta 1000μl es la resta.
el resto de los calculos identicos.
Las determinaciones colorimétricas se basan en la Ley de Lambert - Beer que relaciona la
concentración con la absorbancia:
ε
50 =
(A50 / dc);
datos
patrón
μg/ml
50 =
150 =
(A150 / dc);
ε
250 =
(A250 / dc);
A   cd
ab
0
50
150
250
ε
ε
ε
ε
 
0
0,271
0,366
0,478
A
dc
c 
A
d
(A50 / dc)  olun
ε
/ dc)  ε
150 =
(A150 / dc) 
150 =
(0,366/1x150) = 2,44x10-3
250 =
(A250
250 =
(0,478/1x250) =1,912x10-3
la media obtenemos los dos últimos valores la media de
ε = 2,176x10
para nuestra muestra calculamos la concentración, c = A /
datos:
s700
ab
cit
ab
25
0,06
25
0,035
50
0,112
50
0,07
100
0,213
100
0,137
-3
μg/ml  2,176 mg/ml
ε d;
micro
25
50
100
ab
mit
0,017
0,035
0,065
ab
25
50
100
Fracción S 700:
C25 = 0,06 / 2,176x10-3 x ( 10 x 1000 / 1000 x 25)= 11.02mg/ml; donde 0,4 sale del frato de transformar los
 gprot / 25  lfracion _ dilu en mgprot / mlfracion _ conc :
( x  gprot / 25  lfracion _ dilu )  ( y  gprot / 25  lfracion _ conc  (10 " primerfact ordediluci ón " )) 
 ( z  gprot / 1mlfracion _ conc  (1000 / 25 ))  ( wmgprot / mlfracion _ conc )
Todos se calcula igual, con lo que se resumen en la tabla:
media
calculo de concentraciones
en mg/ml
S700 citosol microsomal mitocondrial
11,02
6,43
3,12
1,80
10,29
6,42
3,21
2,38
9,78
6,29
2,98
2,66
10,36
6,38
3,10
2,28
0,01
0,026
0,058
Gráfica :
0,6
absorbancia
0,5
y = 0,0021x
R2 = 0,9631
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
50
100
150
200
250
concentracion de albumina (microg/ml)
patron
μg
ab
0,00
50,00
150,00
250,00
0,00
0,27
0,37
0,48
s70'0
ab
25,00
50,00
100,00
Prot
Prot
mg/ml
cit
ab
mg/ml
0,06
28,57
11,43
25,00
0,04
16,67
6,67
0,11
53,33
10,67
50,00
0,07
33,33
6,67
0,21
101,43
10,14
100,00
0,14
65,24
6,52
media
10,75
media
6,62
micro
ab
25,00
50,00
100,00
Prot
mg/ml
mit
ab
0,02
8,10
3,24
25,00
0,04
16,67
3,33
50,00
0,07
30,95
3,10
100,00
media
3,22
Prot
mg/ml
0,01
4,76
1,90
0,03
12,38
2,48
0,06
27,62
2,76
media
2,38
300
Determinación de las enzimas marcadoras
para calcular la actividad enzimatica especifica necesitamos
 Cuantificacion de la sporteinas en las diferentes fraciones
Calculos:
Fracion S700
Oxidasa y reductasa
Factor de dilución= (10,37mg/ml)/(1mg/ml)= 10,37
Factor de dilución= vol. diluido/ 100μl = 10,37; vol. diluido= 1037μl;
Vol.diluyente (TES0,25)= 1037-100= 937μl = 0,937ml
CPC = VMC x CPM = 25x10-3 x 1= 0,025
Deshidrogeneasa
Factor de dilución= (10,37mg/ml)/(0,1mg/ml)= 103,7
Factor de dilución= vol. diluido/ 25μl = 103,7; vol. diluido= 2592,5μl;
Vol.diluyente (TES0,25)= 2592,5-25= 2567,5μl = 2,567ml
CPC = VMC x CPM = 25x10-3 x 0,1= 0,25
VR= 1000μl = 10-3 l
Así con todas la fraciones, ver tabla.
s700
concentracion
(mg/ml)
10,37
factor d edilución
10,37
vol. diluyente
0,937
CPM (mg/ml)
1
CPC
0,025
mit
103,7
2,567
0,1
0,25
micro
2,29
2,29
0,129
1
0,025
22,9
0,547
0,1
0,25
cit
3,1
3,1
0,21
1
0,025
31
0,75
0,1
0,25
6,38
6,38
0,539
1
0,025
63,8
1,572
0,1
0,25
Variación de absorbancia por minuto
Calculos:
Para S700
ΔA/min1 = A60 – A 0 = -0,023 – (- 0,039)= 0,016
ΔA/min2 = A70 – A 10 = -0,021 – (- 0,037)= 0,016
ΔA/min3 = A80 – A 20 = -0,023 – (- 0,035)= 0,009
ΔA/min4 = A90 – A 30 = -0,023 – (- 0,035)= 0,012
Idem para el resto de las fraciones subcelulares.
Resultados:
tiempo
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
absorbancia
reductasa
s700
mit
cit
micro
ΔA/min
-0,039
-0,036
-0,061
-0,015
-0,037
-0,039
-0,051
-0,012
-0,032
-0,044
-0,058
-0,01
-0,035
-0,046
-0,056
-0,008
-0,033
-0,048
-0,052
-0,002 media
en valor
-0,028
-0,049
-0,054
0 absoluto
-0,023
-0,051
-0,054
0,003
-0,021
-0,052
-0,052
0,006
-0,023
0,053
-0,052
0,01
-0,023
-0,055
-0,052
0,012
1
2
3
4
s700
mit
cit
micro
0,016
-0,015
0,007
0,018
0,016
-0,013
-0,001
0,018
0,009
0,097
0,006
0,02
0,012
-0,009
0,004
0,02
0,01325
0,015
0,004
0,019
-0,01256
-0,0225 -0,00325 -0,01925
tiempo
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
absorbancia
oxidasa
s700
mit
cit
micro
ΔA/min
1,196
1,175
1,21
1,163
1,185
1,159
1,208
1,164
1,144
1,145
1,208
1,163
1,127
1,131
1,209
1,162
1,112
1,116
1,209
1,163 media
en valor
1,102
1,098
1,208
1,165 absoluto
1,099
1,081
1,21
1,161
1,096
1,061
1,209
1,162
1,095
1,041
1,208
1,163
1,094
1,021
1,208
1,164
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Cálculos de la actividad enzimatica específica:

AEE nmol  min
1
mgprot  
1
Calculo para la DH
 A / min  10
3
 10
9
6 , 22  10  1  0 . 25
3
Cálculo para la reductasa y oxidasa
AEE 
 A / min  10
3
 10
9
29 , 5  10  1  0 . 025
3
Ejemplo S700 para la oxidasa
AEE 
1
2
3
4
mit
-0,097
-0,089
-0,049
-0,033
-0,067
-0,094
-0,098
-0,104
-0,11
-0,1015
0,0595 0,103375
cit
0
0,001
0
-0,001
0
micro
-0,002
-0,002
0
0,002
-0,0005
0 0,000125
Deshidroabsorbancia
geneasa
s700
mit
cit
micro
ΔA/min
s700
mit
cit
micro
0,495
0,44
0,493
0,467
1
-0,028
-0,007
-0,042
-0,006
0,491
0,437
0,485
0,469
2
-0,03
-0,005
-0,043
-0,009
0,486
0,437
0,481
0,467
3
-0,031
-0,006
-0,048
-0,009
0,481
0,435
0,471
0,468
4
-0,031
-0,005
-0,046
-0,011
0,476
0,436
0,464
0,464 media
-0,03 -0,00575 -0,04475 -0,00875
en valor
0,472
0,433
0,456
0,463 absoluto
0,0305 0,005438 0,045438 0,009437
0,467
0,433
0,451
0,461
0,461
0,432
0,442
0,46
0,455
0,431
0,433
0,458
0,45
0,43
0,425
0,457
tiempo
AEE 
s700
0 , 067  10
3
 10
9
29 , 5  10  1  0 . 025
3
 90 ,84
 A / min  VR  10

M
 d  CPC
9
s700
Citocromo
c oxd.
NADPH
citocromo
c Red
Lactato
DH
mit
micro
Σ de
fraciones
cit
90,84
136,94
0,67
0
137,61
17,62
14,91
25,76
5,42
46,09
19,29
3,21
nmol/min*mg prot
5,14
28,74
37,09
Cálculo del porcentaje de cada enzima marcadora en las distintas fraciones:
Porcentaje de marcadora en cada fracción = [ AEE de la marcadora en la fracción / Σ AEE de la marcadora en
las 3 fraciones] x 100
Para la fracion mitocondrial
porcentaje = (90,84/ 137,61) x 100 = 99,53 %
resto de los caluculos son identicos, los resultados se expresan en la tabla.
mit
Citocromo
c oxd.
NADPH
citocromo
c Red
Lactato
DH
micro
cit
99,53%
0,47%
0%
32,35%
55,89%
11,76%
8,65%
13,85%
77,50%
Existencia de contaminación:
En 
F mitocondrial
F microsomal
F citosolica
F mitocondrial
-----------------------------+
+
F microsomal
------------------------------+
F citosolica
-+
------------------------------