Acidos nucleicos presentacion

TEMA 6.
ACIDOS NUCLEICOS: QUIMICA DE LOS ACIDOS NUCLEICOS.
ESTRUCTURA DE ADN.
5’
3’
Hidrólisis alcalina suave de ARN
O
N
O
NH2
N
NH
NH
O
N
CH2 O
N
O
NH2
N
H2C
H2C
O
O P
O
O
O
O
ONH2
O P
O
N
O
CH2
O
N
O
N
P
O
O
-
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O
N
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O
O
O P O-
N
O
O
O
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O
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O
O-
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O-
N
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O
O
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H
O
O
O
CH2
NH2
P
O-
N
HO
N
CH2 O
N
N
O P O
O-
HO
P
O
O
OO
P OO-
NH2
N
N
CH2 O
O
O
O
N
P OO-
O
OH
-
O
O P
N
CH2 O
O-
N
NH
OH
HN
CH2
N
O P O
O
HO
HO
N
O
O
N
O
O
O P
OO
O
O
NH2
N
O
CH2
O-
O
CH2
O
O P
HO-
O
NH
OH
CH2 O
N
O
O
O
N
H
HN
O
OH
O
O
OH O
-
N
N
CH2
N
O
O
CH2
O
OH NH2
O
O P O O
OH
NH2
N
NH2
N
OH
N
N
N
NH2
Hidrólisis ácida suave de ADN
O
O
NH
NH
N
O
N
O
O
O
H
O
H
H
O
H
P
O
NH2
H
H
N
N
O
ON
N
O
O
H
H
O
H
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H
O-
O
OH
O
H
O
H
H
O
H
P
O
NH2
H+
H
N
O-
N
H
suave
O
O
NH2
H
H
O
H
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O-
N
O
O
O
O
O
H
O
H
H
H
O
H
O
H
H
N
NH
O
O-
P
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O
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NH2
H
H
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H
H
O-
P
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OH
O
O
H
O
H
H
O
H
P
O
O-
H
H
O
H
H
O
H
P
O
O-
H
5’
3’
3’
5’
Conformación de desoxirribosa
Apareamiento de bases
Giro a derechas
Conformación del enlace glicosídico anti
Conformación de desoxirribosa
Apareamiento de bases
Giro a derechas
Conformación del enlace glicosídico anti
Conformación de desoxirribosa
Pirimidinas
Purinas
Conformación del enlace glicosídico:
sym purinas
anti pirimidinas
Apareamiento de bases
Giro a izquierdas
Secuencias que adoptan estructuras inusuales
Secuencias palindrómicas:
regiones de ADN de doble hebra con
secuencias de bases que se repiten
en forma invertida entre ambas
cadenas presentando doble simetría
Son potenciales formadoras de:
Horquillas (ADN simple hebra y ARN)
Estructuras cruciformes (ADN duplex)
Secuencias que adoptan estructuras inusuales
Repeticiones espejadas: regiones de ADN de doble hebra que no tienen
secuencias complementarias en la misma cadena. Se encuentran en moléculas
de ADN largas (varios miles e pares de bases)
Estructuras de 3 o 4 hebras: ADN triplex y ADN cuadruplex
ADN triplex: se presenta en segmentos polipirimidinicos y polipurunicos
Apareamientos de bases
Las hélices triplex son más estables a pH ácido
porque C tiene que estar protonada C+ (pKa en la
hebra 7,5, pKa normal 4,2)
Paralelas
Antiparalelas
H-ADN: Hélice triplex en trayectos polipirimidina o polipurina
Con repeticiones espejadas
Repetición espejada
(pertenece a la misma hebra)
ADN cuadruplex
En secuencias con alta proporción de Guanina
Posibles orientaciones de las
hebras
Desnaturalización
Las soluciones de ADN nativo son
muy viscosas a pH 7 y 25ºC
rápido
lento
Al aumentar temperatura o variar el pH
a situaciones extremas la viscosidad
decrece abruptamente
Densidad de flotación
Efecto hipercrómico:
Aumento de
absorbancia
a 260 nm que
manifiesta una
estructura bicatenaria
al perder su
estructura nativa o
plectonémica
Estimación del porcentaje de pares
de bases en función de la magnitud
del efecto hipercrómico
Temperatura media de fusión:
Temperatura a la cual se alcanza
el 50 % de desnaturalización
Tm y complejidad del ADN
ADN parcialmente desnaturalizado
Las flechas indican regiones ricas en A=T
Estimación del porcentaje de pares
de bases en función de Tm
TEMA 6.
ACIDOS NUCLEICOS: ESTRUCTURA DE RNA.
SECUENCIAMIENTO DE ADN.
Estructura secundaria de ARN
Otras bases nitrogenadas presentes en ARN
Las bases son modificadas en reacciones postranscripcionales
ARNm
5’cap del ARNm
ARNt
ARNt para Ala de levaduras
Estructura tridimensional de un ARNt
Estructura general y forma de unión un aminoácido al extremo 3’ terminal de
un ARNt
Aminoacil ARNt sintetasas
Mecanismo de aminoacilación de ARNt
Catalizado por ARNtsintetasas
ARNr
Estructura secundaria de ARNr bacterianos
Algunos apareamientos
encontrados en ARNr
Mutaciones: su naturaleza molecular
Deleciones e inserciones
Mutaciones: su naturaleza molecular
Transiciones y transversiones
Ejemplos
Transversión
Transversión
Transición
Agentes mutagénicos : Radiaciones
Formación de dímeros de timina
Mecanismo general de reparación catalizado
por la fotoliasa
Agentes alquilantes
Reparación
Metiltransferasas
Dioxigenasas
Desaminación de bases: ácido nitroso
Derivados de bases con
actividad farmacológica
Derivados de nucleósidos con actividad farmacológica
Secuenciamiento de ADN
A- Método de Maxam-Gilbert
1- Clivaje con enzimas de restricción
Sitios de corte de diferentes enzimas
Gel de un mismo fragmento digerido
con diferentes enzimas de restricción
2- Marcaje con 31P del grupo 5’-terminal de cada fragmento (enzimaticamente)
y separación de ambas hebras
Ejemplo de pasos 1 y 2
3- Clivaje químico selectivo
Dividir en 4 alícuotas la muestra correspondiente a una cadena
marcada y realizar en paralelo reacciones químicas de forma de
obtener:
a) Clivajes a nivel de G
b) Clivajes a nivel de G y A
c) Clivajes a nivel de C
d) Clivajes a nivel de T y C
a) Metilación y clivaje de la cadena a nivel de G
CH
O
O
CH33
N
N
N
NH
O
CH3
O
N
NH
NH
NH
N
N
O
O
P
N
NH2
O
O
O
(CH3)2SO4
O
P
P
O
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O
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O
O
O
O
P
P
O
O
O
O
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O-
O
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O
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O
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O
NH2
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N
O
O
O
N
O
O-
HN
O
P
O
O-
H
O-
NH2
b) Hidrólisis ácida suave y clivaje a nivel de A y G
O
O
O
NH
NH
N
O
N
O
O
O
H
O
H
H
O
H
P
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N
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O
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H
O
H
O
P
O
NH2
H
O
H+
H
N
suave
-
N
H
O
O
H
O
H
H
O
O
H
N
O-
N
NH2
O
H
O
H
H
O
H
H
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P
O
N
O
N
NH2
H
O
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O
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O-
H
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H
O-
P
O
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P
H
N
OH
O
O
O
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O
OH
O
O
O-
NH2
H
P
O
P
H
N
O
OH
O
O
H
O-
O
O-
O
O
P
H
OOH
O
H
O
OH
O
H
P
O
O-
c y d) Reacción con hidracina y clivaje de la cadena a nivel de T y C
OH
OH
O
HN
HN
HN
O
O
-
O
P
O
O
O
O
N
-O
O
N
N
O
O
O
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NN
CH
CH33
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OO
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H
HH
O
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P
P
O
O
OO
OO- O
O
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O
OO
--
O
O-H
H
H
NHNH
NHNH22
OO
PP
O
NH2NH2
-
O
O
O
HH
NN
NH
NH22 HN
HN
HH
OO
OO PP
OO- -
O
O
O
OO
N
H
N
O
3-ceto-4-metilpirazol
O
-
O
P
CH3
O
O
-
OH
O
O-
P
O
OH
-O
OO
P
O
P
O
O-
N
H
H
O
-
P
O
NH2
OH
N
OO OH H
O P
H
O
O
O
-O
O
OOH
O
O
O
P
H
O
H
O
-
O
H
O
H2O
P
O-
O
-
O
O
El clivaje selectivo en C se leva a cabo realizando la reacción con hidracina en
solución de NaCl 5M.
4- Separación electroforética en (gel de poliacrilamida) de cada mezcla de
productos de reacción. La técnica presenta sensibilidad para diferenciar hasta 600
fragmentos que difieran en solo un nucleótido.
Revelado por autorradiografía dónde solo son visibles los fragmentos que
contienen 32P
5-Interpretación de resultados (Los primeros nucleótidos a partir del extremo 5’terminal no pueden ser identificados, T en el ejemplo)
Comparación y superposición con otros fragmentos
Método de Sanger o de los didesoxinucleótidos
Frederick Sanger Premio Nobel 1958 (Determinación de la estructura de insulina) y 1980 (Método
de secuenciación de ADN)
Variante utilizando ddNTPs marcados fluorescentes
BIBLIOGRAFÍA
-BIOCHEMISTRY. Lubert STRYER 3 Edition 1998. Ed. Freemon
-BIOORGANIC CHEMISTRY Hermann Dugas. 3rd Edition 1996. Springer Verlang
-BIOQUÍMICA. D.y J. Voet 1992. Ed. Omega
-BIOQUIMICA. Albert L. LEHNINGER. 2da. Ed. Ediciones Omega
-PRINCIPIOS DE BIOQUIMICA. Albert L. LEHNINGER. Ediciones Omega
-BIOQUIMICA. Mathews, C and Van Holde, K E. Ed. McGraw- Hill Interamericana.
Segunda edición. 1998.
-ORGANIC CHEMISTRY. 2da. Edition.G.Marc LOUDON. Editorial Benjamin
-ORGANIC CHEMISTRY. J. Mc MURRY. 3ra Edición 1994. Ed Interamericana
-QUIMICA ORGANICA. Francis Carey ·3 Edicion 1999. Ed. Mc Graw Hill.
-ORGANIC CHEMISTRY J. Clayden, N. Greeves, S. Warren, and P. Wothers,
2000.Oxford University Press.
-QUIMICA ORGANICA. ESTRUCTURA Y FUNCION. Vollhardt, P and Schore,
N. Ed. Omega. 3ra Edición, 2000.