Métodos 2do departamental

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE
BIOTECNOLOGÍA
LABORATORIO DE MÉTODOS INSTRUMENTALES AVANZADOS
“DEGRADACIÓN DE PARACETAMOL EN SUELO”
GRUPO 6AV4
EQUIPO 2
INTEGRANTES





DOMÍNGUEZ ALONSO MARCOS ALBERTO
MONROY AVALOS DIANA
NAVA NERI EDOARDO
ROMERO REYES MARTIN
TREJO DE LA ROSA MÓNICA MELISSA
DOCENTES
DR.FRANCO HERNÁNDEZ MARINA OLIVIA
CABRERA PÉREZ LAURA CRISTINA
Fecha de Entrega: 05 de Junio del 2019
OBJETIVOS
GENERAL
•
Evaluar y comparar la degradación de paracetamol de las diferentes
composiciones de los sistemas: suelo, composta o porcentajes suelo-composta a
partir de la actividad microbiana mediante equipos de análisis instrumental.
ESPECÍFICOS





Evaluar mediante UV-VIS, HPLC la degradación de un contaminante orgánico
como el paracetamol realizando ensayos a diferentes días (7, 14, 21, 42).
Cuantificar la degradación de paracetamol en distintas muestras de suelo y
composta.
Cuantificar el Oxígeno producido por los microorganismos.
Comparar la degradación de paracetamol en distintos tipos de microsistemas.
Identificar las problemáticas que existen en el mundo a causa.
INTRODUCCIÓN
El paracetamol es un fármaco conocido, y se encuentra comercializado en todo el mundo
desde hace décadas. Se considera un analgésico y antipirético eficaz y seguro para el
tratamiento sintomático del dolor y la fiebre. (Farré et al, 2014). Está ampliamente
disponible como un medicamento de uso frecuente. Anualmente se producen 145.000
toneladas de APAP en el mundo; pero a pesar de su seguridad cuando no se utiliza
correctamente, es uno de los fármacos más comunes responsables de reportes de
sobredosis en los centros de toxicología. Produce hepatoxicidad con dosis de 325 mg
que también pueden afectar los riñones, corazón y Sistema Nervioso Central (SNC);
generando insuficiencia hepática fulminante y en el peor de los casos la muerte
(Chalermrat et al., 2013).
Figura 1. Fórmula química del paracetamol.
En la fórmula química del paracetamol como se observa en la Figura 1, se encuentra
compuesta por una molécula del benceno además de la presencia de un grupo hidroxilo,
una amina secundaria, cetona y un radical metilo.
Entre los contaminantes orgánicos emergentes, se encuentran los productos
farmacéuticos; que debido a su amplio uso por humanos están abundantemente
distribuidos en los ecosistemas acuáticos y terrestres y presentes en las heces, residuos
sanitarios, plantas de tratamiento de aguas residuales –EDAR-. (Yangali et al., 2010).
Las fuentes de contaminación ambiental del paracetamol
La vía reportada para la contaminación ambiental del paracetamol es a través de su
excreción inalterada en la orina y las heces. En la Figura 2 se muestran las posibles
entradas de paracetamol al medio ambiente, en el caso de paracetamol que tienen una
baja volatilidad y la distribución de alta polaridad se hace principalmente por el transporte
acuoso (orina, heces, etc) o incluso a través de la dispersión de la cadena alimentaria.
Aunque existen otros mecanismos antropogénicos a través de los metabolismo postconsumo, su bioconversión en uno o más metabolitos puede ocurrir por la eliminación de
los hogares, hospitales a través de baños y por los impactos por actividades las EDAR
(Fent et al., 2006; Li et al., 2014).
Figura 2. Representación esquemática propuesta del destino ambiental del paracetamol y
metabolitos, en diferentes ecosistemas (Barrios, 2016).
 Degradación de paracetamol en sistemas suelo/agua
La degradación del paracetamol en sistemas suelo/agua fue investigado mediante una
combinación de estudios cinéticos y el análisis cuantitativo de las reacciones intermedias.
La biodegradación fue la vía predominante para la eliminación del paracetamol, mientras
que la hidrólisis u otra transformación química, junto con los procesos de adsorción
tuvieron una contribución casi nula a la degradación en incubación oscura. Bacillus
aryabhattai, cepa 1-Sj-5-2-5-M, Klebsiella pneumoniae, cepa S001, y Bacillus subtilis,
cepa HJ5 fueron las principales bacterias identificadas en la biotransformación del
paracetamol. Los principales productos de transformación primarios fueron oligómeros
de acetaminofén y p-aminofenol, con la adición inicial de 26.5 y 530 μM respectivamente.
Los oligómeros de acetaminofén representaron más del 95% de acetaminofén
transformado, lo que indica que casi no se generaron residuos unidos a través de la
transformación del medicamento en el sistema suelo/agua. (Chuanzhou, 2016).
Imagen 3. Vías de degradación del acetaminofén en sistema agua/suelo.
Técnica analítica recomendada para la cuantificación de paracetamol
En Toxicología en la última década, la cuantificación de las drogas y sus metabólitos ha
sido impulsada por el uso de la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) acoplada
al espectrómetro de masas con triple cuádrupolo debido a sus capacidades de alto
rendimiento, así como su selectividad y sensibilidad. El espectrómetro de masas se han
utilizado para adquirir datos de forma simultánea análisis combinado cualitativa y
cuantitativa de la muestra, pero la interpretación espectros sigue siendo un reto basado
sólo en los datos de baja resolución (Fahad et al., 2008).
La HPLC es capaz de separar macromoléculas y especies iónicas, productos naturales
lábiles, materiales poliméricos y una gran variedad de otros grupos polifuncionales de
alto peso molecular. Con una fase móvil líquida interactiva, otro parámetro se encuentra
disponible para la selectividad, en adición a una fase estacionaria activa. La HPLC ofrece
una mayor variedad de fases estacionarias, lo que permite una mayor gama de estas
interacciones selectivas y más posibilidades para la separación. En la Tabla 6 se
muestran algunas condiciones cromatográficas recomendadas por investigadores para
la cuantificación de paracetamol (Kawabata et al., 2012).
METODOLOGÍA
Se procede a realizar la degradación del paracetamol a partir de microcosmos, en donde
los microorganismos del suelo se encargaran de asimilar los compuestos de carbono.
Preparación de muestras
Para el sistema suelo/paracetamol se muele en un mortero paracetamol compromido de
500 mg y se añade a un frasco de plástico de aproximadamente 150 mL que contiene 20
g de suelo. Alternadamente, adicionar 250 mg de paracetamol a los X frascos que
contienen 10 g de suelo. Posteriormente, agregar a cada uno de estos frascos 6.3 mL de
agua, dando paso a la degradación microbiológica del medicamento.
El medio a evaluar es 100% suelo, el cual se adecua a un nivel de 40% de la CRA; el
valor y procedimiento se encuentra en el ANEXO 2, es recomendado dicho nivel para un
óptimo crecimiento microbiológico, las muestras una vez preparadas se les añade agua
con el fin de alcanzar ese nivel de CRA y la degradación se vea positivamente afectada
Preparación del microcosmo
El microcosmos; donde se va a llevar a cabo la acción metabólica de los
microorganismos del suelo, está compuesto de 3 frascos, dos de ellos contienen
muestra, con un peso de 20 g y 10 g de muestra respectivamente para cuantificación del
ión amonio (NH4+) y paracetamol restante respectivamente, el último frasco contiene
hidróxido de sodio; NaOH, además de estar en un ambiente húmedo. Teniendo un total
de 12 microcosmos a evaluar los días 7, 14, 21 y 42 por triplicado en cada caso.
La biodegradación de paracetamol será por medio de un proceso metabólico en el que
un sustrato es transformado biológicamente por un organismo, siendo en este caso que
los responsables de la degradación serán los microorganismos presentes en la muestra
de suelo, el frasco presente de NaOH sirve como una trampa para el CO2 formado en
la respiración de los organismos de acuerdo a la siguiente ecuación:
2NaOH + CO2
Na2CO3 + H2O
En donde el bióxido de carbono (CO2) reacciona con el hidróxido de sodio (NaOH) para
formar carbonato de sodio (Na2CO3) y agua.
Se le agrego una pequeña porcion de agua al contenedor del microcosmos para propiciar
un ambiente humedo el cual favorecera a la actividad microbiana. (ANEXO 2)
Extracción de NH4+ y paracetamol.
Esta etapa se llevó a cabo de la siguente manera:


Para el frasco de 20 g la extracción de NH4+ se realiza con agua, para su posterior
análisis con espectrofotometría UV-Vis
Para el frasco de 10 g la extracción de paracetamol se realizó con metanol
(CH3OH) debido la solubilidad del medicamento en presencia del mismo, esto con
el fin de cuantificarlo cualitativamente mediante la técnica de HPLC e IR, y
cuantitativamente mediante la técnica de UV-Visible.
Una vez transcurridos los días previstos en resguardo para que la actividad metabólica
de los microorganismos presentes se llevara a cabo, siendo estos 7, 14, 21 y 42 días a
condiciones ambiente, proceder con la extraccion depositando el contenido de los
frascos en matraces erlenmeyer donde posteriormente a los matraces con 20 g de suelo
se les vertio 80 mL de K2SO4 y a los que contenian 10 g de suelo se les vertio 30 mL de
metanol, despues de esto se procedio a la agitación manual durante 30 minutos, en
seguida con la ayuda de un papel filtro previamente humedecido respectivamente para
cada muestra; ya sea metanol o agua, un embudo y de un matraz o vaso de precipitado
para recuperar el filtrado, se procedió a realizar la extracción de los residuos de la
degradación del medicamento
Conservación
El filtrado fue colocado en frascos, los cuales se mantuvieron en refrigeración para llevar
a cabo, posteriormente su análisis y lecturas en UV-VIS.
RESULTADOS
Para el cálculo de la concentración de paracetamol en las muestras, fue necesario
elaborar una curva tipo en el espectrofotómetro a las concentraciones determinadas
(Anexo 2). Dichas mediciones en el espectrofotómetro, al realizar el grafico
correspondiente, da como resultado una ecuación (Ec.1) para calcular la concentración
de paracetamol con respecto a la absorbancia de la muestra.
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 = 0.977 ∗ [𝐶𝑝𝑎𝑟𝑎𝑐𝑒𝑡𝑎𝑚𝑜𝑙 ] − 0.0273
Ec. 1
La cual se despeja obteniendo la Ec.2
[[𝐶𝑝𝑎𝑟𝑎𝑐𝑒𝑡𝑎𝑚𝑜𝑙 ]] =
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎+0.0273
0.977
Ec.2
A partir de ello se realizaron los cálculos correspondientes a la cantidad de paracetamol
que no fue degradado en el suelo.
Tabla 2. Cálculo de la cantidad de paracetamol no degradado en las muestras de 10 gramos
DIA
0
0
0
7
7
7
14
14
14
21
21
21
42
42
42
ABS.
0.581
0.609
0.604
0.706
0.809
0.807
0.662
0.844
0.617
0.895
0.583
0.629
0.701
0.847
0.805
𝑪𝒑𝒂𝒓𝒂𝒄𝒆𝒕𝒂𝒎𝒐𝒍 Factor de dilución
[µg/mL]
[µg/mL]
6.226
6.513
6.462
7.506
8.560
8.539
7.055
8.918
6.595
9.440
6.247
6.718
7.454
8.949
8.519
6226.203
6512.794
6461.617
7505.629
8559.877
8539.406
7055.271
8918.117
6594.678
9440.123
6246.673
6717.503
7454.452
8948.823
8518.936
[C] [mg/mL]
mg*Vol.total
[mg]
[mg/kg]
6.226
6.513
6.462
7.506
8.560
8.539
7.055
8.918
6.595
9.440
6.247
6.718
7.454
8.949
8.519
186.786
195.384
193.849
225.169
256.796
256.182
211.658
267.544
197.840
283.204
187.400
201.525
223.634
268.465
255.568
18678.608
19538.383
19384.852
22516.888
25679.632
25618.219
21165.814
26754.350
19784.033
28320.368
18740.020
20152.508
22363.357
26846.469
25556.807
Tabla 3. Constantes y parámetros auxiliares para el cálculo de la concentración de paracetamol
en las muestras de 10 gramos.
Tabla de valores
constantes
b
m
Dilución
Vol. Total
Suelo
-0.0273
0.0977
1000
30
1000
De acuerdo a los cálculos realizados se obtuvieron los promedios de las muestras
triplicadas para obtener las concentraciones finales en cada uno de los días analizados.
Tabla 4. Valores promedios de las muestras triplicadas para graficar y posterior análisis
DIA
0
7
14
21
42
Abs
(promedio)
0.598
0.774
0.708
0.702
0.784
[C] [ug]
Con*Dilucion
[µg]
6400.205
8201.638
7522.689
7468.100
8307.404
6.400
8.202
7.523
7.468
8.307
[C] [mg]
mg*Vol.total
[mg/ml]
192.006
246.049
225.681
224.043
249.222
6.400
8.202
7.523
7.468
8.307
[mg/kg]
19200.614
24604.913
22568.066
22404.299
24922.211
Concentración paracetamol [mg/kg]
Concentración de paracetamol
30000,000
25000,000
20000,000
15000,000
10000,000
5000,000
y = 91,691x + 21200
R² = 0,4177
0,000
0
10
20
30
40
50
Tiempo [Días]
Gráfica 1. Concentración de paracetamol en muestras de suelo
Asimismo, de las concentraciones reportadas se procede a realizar el cálculos de las
desviaciones estándar para establecer el margen de error en el análisis.
Tabla 5. Desviación estándar
Muestra
0
7
14
Desviación
estándar
2.38 %
8.13%
16.67%
23.84%
9.31%
21
42
Tabla 6. Producción de CO2 por la actividad microbiana
Día
Muestra
Gasto
HCl [mL]
7
7
14
14
21
21
21
42
42
42
1
3
2
3
1
2
3
1
2
3
1.2
4.5
3
4.5
4.5
3.3
6
2.2
3.5
7.3
Conc.
NaHCO3
[N]
0.012
0.045
0.03
0.045
0.045
0.033
0.06
0.022
0.035
0.073
Peso NaHCO3
producido [g]
Peso Na2CO3
producido [g]
0.02016
0.0756
0.0504
0.0756
0.0756
0.05544
0.1008
0.03696
0.0588
0.12264
0.0254
0.095
0.0636
0.0954
0.0954
0.06996
0.1272
0.04664
0.0742
0.15476
Peso CO2
producido
[g]
0.01056
0.0396
0.0264
0.0396
0.0396
0.02904
0.0528
0.01936
0.0308
0.06424
Tabla 7. Parámetros auxiliares para el cálculo de la producción de CO2
Tabla de valores constantes
Datos
Valor
Concentración del ácido
0.1
Volumen de muestra
10
Volumen total de la botella de
0.02
NaOH
Peso equivalente NaHCO3
84
Peso NaHCO3
84
Peso Na2CO3
106
Peso CO2
44
Muestra suelo
30
Unidades
eq/L
mL
L
Tabla 8. Promedios de la concentración de CO2
Valores de gráfica
Día
Promedio [mg
CO2/kg]
7
14
21
836
1100
1349.333
g/eq
g/mol
g/mol
g/mol
g
Prod. CO2
total [mg
CO2/kg]
352
1320
880
1320
1320
968
1760
645.333
1026.667
2141.333
42
1271.111
Gráfica 2. Cantidad de CO2 producido por la actividad microbiana
DISCUSIÓN
En el gráfico 1 se muestra la degradación del paracetamol en el suelo propuesto en este
estudio. Es importante analizar que a pesar de tener variaciones, no se observa una
degradación del compuesto en el suelo, es decir, se mantiene constante. Esto se
confirma a partir de la desviación estándar (Tabla 5) en donde se obtienen valores
superiores al rango de error aceptable o “error estándar” que es del 5%, esto explicaría
las alteraciones en las concentraciones dentro del gráfico lo cual es posible atribuir
principalmente al analista.
Con lo anterior podemos decir que la molécula de paracetamol no tiende a oxidarse en
el suelo al 100%; es decir, se considera un contaminante recalcitrante que por su
estructura muy estable químicamente, se resisten a la degradación a partir de los
microorganismos o de cualquier degradación biológica/química (Javier Cervantes, 2008).
Si las condiciones del medio fueran lo suficientemente oxidante se degradaría una gran
cantidad del compuesto y gráficamente se vería una curva con decremento así como un
mayor desprendimiento de dióxido de carbono.
La adsorción de dióxido de carbono usando soluciones alcalinas se ha explorado ya por
más de medio siglo (Spector and Dodge, 1946; Tepe and Dodge, 1943) que ha
demostrado bueno resultados con respecto a la captura del gas.
El CO2 es producido a partir de la respiración celular de los microorganismos presentes
en el suelo, que reacciona con el NaOH presente en el microcosmo de la siguiente
manera
2 𝑁𝑎𝑂𝐻 + 𝐶𝑂2 → 𝑁𝑎2 𝐶𝑂3 + 𝐻2 𝑂
𝑁𝑎2 𝐶𝑂3 + 𝐻𝐶𝑙 ↔ 𝑁𝑎𝐻𝐶𝑂3 + 𝑁𝑎𝐶𝑙
𝑁𝑎𝐻𝐶𝑂3 + 𝐻𝐶𝑙 ↔ 𝐻2 𝐶𝑂3 + 𝑁𝑎𝐶𝑙
Al ser un subproducto de la respiración celular y de la degradación del paracetamol se
espera que vaya en aumento conforme al tiempo, como se observa en la Gráfica 3. En
los días 7, 14 y 21 existe un aumento progresivo esperado, salvo en el día 42 donde se
ve una baja del 5.8% con respecto al último día, siendo una variación no tan relevante
pues se mantiene en el rango; sin embargo, a pesar de que no se tiene degradación
biológicamente del paracetamol en el suelo, es correcto obtener estos resultados, pues
demuestra que existen microorganismos que generan CO2 a partir de los nutrientes del
suelo.
CONCLUSIONES



Los primeros resultados cuantitativos por UV-VISIBLE nos muestran que no
existe degradación del compuesto paracetamol en el suelo.
En la composición de 100% suelo el paracetamol funge como un compuesto
recalcitrante.
La producción de CO2 se atribuye a la presencia de los microorganismos que
degradan los nutrientes en el suelo.
BIBLIOGRAFÍA Y REFERENCIAS

M. Farré, S. Abanades, Y. Álvarez (2014), Paracetamol, Unidad de Farmacología,
Institut Municipal d’Investigació Médica. Hospital del Mar, Universidad Autónoma
de Barcelona, Barcelona
 Yangali-Quintanilla, V.; Kyu Maeng, S.; Takahiro F.: Kennedy, M.; Gary, A. (2010).
Proposing nanofiltration as acceptable barrier for organic contaminants in water
reuse. Journal of Membrane Science.
 Chalermrat, B. & Rajender, K. (2013). Acetaminophen-related Hepatotoxicity.
Clinics in Liver Disease.
 Fent, K.; Weston, A.; Caminada, D. (2006). Ecotoxicology of human
pharmaceuticals. Revista Aquatic Toxicology.
 Li, J.; Qingfu, Y.; Gan, Y. (2014). Degradation and transformation products of
acetaminophen in soil. Rev Water Research.
 R. Barrios, C. Sierra, J. Jaimes, (2016) Efectos tóxicos del paracetamol en la salud
humana y el medio ambiente, Universidad de Cartagena, Cartagena de Indias,
Colombia.
 L. Chuanzhou, L. Zhonghui, Z. Xu, L. Yingbao (2016), School of Resources and
Environmental Science, Wuhan University, Wuhan, 430079, PR China
 Kawabata, O.; Sugihara, K.; Sanoh, S.; Kitamura, S.& Ohta, S. (2012). Ultravioletphotoproduct of acetaminophen: Structure determination and evaluation of
ecotoxicological effect. Rev Journal of Photochemistry and Photobiology A:
Chemistry.
 Fahad, A.; Edward, B.; Steven, B.; (2008). Estimated risk of hepatotoxicity after an
acute acetaminophen overdose in alcoholics. Revista Alcohol
 Spector, N.A., Dodge, B.F., 1946. Removal of carbon dioxide from atmospheric
air. Trans. Am. Inst. Chem. Eng. 42, 827–848.
 Tepe, J.B., Dodge, B.F., 1943. Absorption of carbon dioxide by sodium hydroxide
solutions in a packed column. Trans. Am. Inst. Chem. Eng. 39, 255–276.
ANEXOS
Anexo 1.Memoria de cálculos
Tabla 1. Valores del peso de suelo
Peso de suelo seco wss(g)
20
Peso de suelo húmedo wsh(g)
39
Tabla 2. Valores del peso del papel
Peso de papel
seco; wps(g)
Peso del papel
húmedo; wph(g)
Cantidad de agua
en papel; H2O(g)
1.8
1.9
1.8
5.5
6.4
5.3
3.7
4.5
3.5
Relación de agua
absorbida;
H(gH2O/gpapel)
2.0556
2.3684
1.9444
PROMEDIO 2.1228
Humedad (%H)
%𝐻 =
𝑤 𝑓𝑟𝑎𝑠𝑐𝑜 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 − 𝑤 𝑓𝑟𝑎𝑠𝑐𝑜 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑠𝑒𝑐𝑎
𝑤 𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑠𝑢𝑒𝑙𝑜
%𝐻 =
5.5 − 1.8
= 2.0556
1.8
Capacidad de retención de agua (CRA)
CRA = 100*[wsh - wss - wps - (wps*H)]/wss
CRA = 100*[39g – 20g – 1.8333 - (1.8333*2.1228)]/20
CRA = 66.37 g H2O
El valor resultante de 66.37g es estimado a un 100% de la capacidad de retención
de agua del suelo; sin embargo, en la presente práctica es necesario un ambiente
con el 40% de la CRA, por lo tanto el valor correspondiente es el resultado del 100%
de la CRA multiplicado por la fracción correspondiente de interés, lo cual nos da
una masa de agua de 26.55g.
𝐶𝑅𝐴 = (66.37g H2O ∗ 0.4) = 26.55𝑔 𝐻2𝑂
Anexo 2. Curva tipo
Tabla 1. Absorbancias y concentraciones elaboradas para la curva tipo de paracetamol
Curva tipo
Conc.
Abs
[µg/mL]
10
0.958
5
0.442
2.5
0.217
1.25
0.11
0.625
0.03
Curva tipo de la concentración de paracetamol
1,2
Absorbancia
1
y = 0,0977x - 0,0273
R² = 0,9988
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
2
4
6
8
10
Concentración [µg/mL]
Gráfica 1. Curva tipo de la concentración de paracetamol
12
Anexo 3. Memoria fotográfica
Figura 1: Preparación de los frascos de NaOH
Figura 2: Adición de agua al suelo
Figura 3: homogenización del suelo con paracetamol
Figura 4: preparación de los microcosmos
Figura 5: almacenamiento de los microcosmos
Figura 6: agitación de las muestras para extracción
Figura 7: preparación de las muestras para filtrado
Figura 8: Filtrado de las muestras con K2SO4
Figura 9: Filtrado de las muestras con metanol
Figura 10: Preparación de diluciones 1:500
Figura 11: Titulación con HCl 1 N
Figura 12: Titulación
Figura 13: Titulación con HCl 1N
Figura 14: Titulación con HCl 0.1 N
Figura 15: Titulación con HCl 0.1 N