PCB D Tesis 2017 Villanueva Viramontes Sara

Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C.
Posgrado en Ciencias Biológicas
ESTRUCTURA GENÉTICA DE Vanilla planifolia Andrews
SILVESTRE EN LA PENÍNSULA DE YUCATÁN, MÉXICO:
IMPLICACIONES PARA LA CONSERVACIÓN DE LA ESPECIE
Tesis que presenta
SARA VILLANUEVA VIRAMONTES
En opción al título de
DOCTOR EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
Opción Recursos Naturales
Mérida, Yucatán, México
2017
Este trabajo se llevó a cabo en la Unidad de Recursos Naturales del Centro de
Investigación Científica de Yucatán, y forma parte del proyecto titulado Diversidad
genética de Vanilla planifolia y sus parientes silvestres, en el que participé bajo la
codirección del Dr. Jaime Martínez Castillo y la Dra. Mariana Hernández Apolinar.
AGRADECIMIENTOS.
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por la beca otorgada
para realizer los estudios de Doctorado (Becaria: 255722).
A mis codirectors de tesis el Dr. Jaime Martínez Castillo y la Dra. Mariana
Hernández Apolinar por su dirección, apoyo y confianza en la realización de este trabajo
de investigación.
A los técnicos Ing. Alfredo Dorantes Eúan y Gabriel Rolando Dzib por su apoyo en
la exploración y colecta botánica; Biól. Verónica Limones Briones y QFB. Matilde Ortiz
García por su apoyo en la estandarización de los protocolos de laboratorio.
A los miembros de mi comité tutorial: Dr. Germán Carnevali Fernández-Concha y
Dra. Luz María Calvo Irabien por su apoyo, consejos y observaciones para el
enriquecimiento de este trabajo.
A los miembros de mi comité evaluador: Dra. Mariana Chávez Pesqueira, Dr.
Javier Orlando Mijangos Cortés, Dr. Rodrigo Duno de Stefano y Dr. Rubén Humberto
Andueza Noh.
DEDICATORIAS.
A Dios, por darme vida, por su amor y protección.
A mi esposo Carlos Fernando Regla Márquez, por su amor, apoyo y motivación día con
día.
A mis hijos Dante y Dania por alegrar y motivar mi corazón.
A mis padres María Yolanda Viramontes Saldivar y Gerardo J. Villanueva Cuevas, y mis
hermanos Gerardo y David que siempre me han brindado su amor y apoyo.
Nada tiene sentido en la evolución si no es a la luz de la Genética de Poblaciones
M. Lynch, 2007.
INTRODUCCIÓN.
1
CAPÍTULO I
4
ANTECEDENTES.
4
1.1 ESTADO DE CONSERVACIÓN GENÉTICA DE ESPECIES
VULNERABLES.
4
1.2 ESPECIE DE ESTUDIO: Vanilla planifolia Andrews.
10
1.3 ÁREA DE ESTUDIO: PENÍNSULA DE YUCATÁN, MÉXICO (PYM).
20
JUSTIFICACIÓN.
25
HIPÓTESIS.
26
OBJETIVO GENERAL.
27
OBJETIVOS ESPECÍFICOS.
CAPÍTULO II
27
28
WILD Vanilla planifolia AND ITS RELATIVES IN THE MEXICAN YUCATAN
PENINSULA: SYSTEMATIC ANALYSES WITH ISSR AND ITS.
28
2.1 INTRODUCTION.
28
2.2 METHODS.
32
2.3 RESULTS.
40
2.4 DISCUSSION.
50
CAPÍTULO III
56
ESTRUCTURA Y DIVERSIDAD GENÉTICA DE Vanilla planifolia SILVESTRE
EN LA PENÍNSULA DE YUCATÁN, MÉXICO.
56
3.1 INTRODUCCIÓN.
56
3.2 MATERIALES Y MÉTODOS.
59
i
3.3 RESULTADOS.
66
3.4 DISCUSIÓN.
81
CAPÍTULO IV
88
DISCUSIÓN GENERAL.
88
4.1 ESTADO DE CONSERVACIÓN DE Vanilla planifolia SILVESTRE.
88
4.2 CONCLUSIONES.
95
4.3 PERSPECTIVAS.
97
BIBLIOGRAFIA.
ii
98
LISTADO DE FIGURAS.
Figura 1.1. Vanilla planifolia silvestre. Fotos de Villanueva-Viramontes, S....................... 13
Figure 2.1. Flowers and vegetative structures of the Vanilla species reported for the
Yucatan Peninsula and used in the analysis with ISSR molecular markers. A  V.
planifolia wild (both photographs by Sara Villanueva [SV]). B  V. insignis (flower
photography by Leon Ibarra González, and leaves photography by SV). C  V. odorata
(flower photography by Manfred Speckmaier, and leaves photography by SV). D  V.
sp. nov. aff. V. phaeantha (both photographs by SV). E  V. pompona (both photos by
Verónica Borbolla).......................................................... ¡Error! Marcador no definido.
Figure 2.2. Assignment test of 88 wild individuals of Vanilla spp. collected in the Mexican
Yucatan Peninsula and 11 standard samples of Vanilla, using ISSR markers with
Structure. A) Kóptima = 5. B) Kóptima = 7. ......................................................................... 43
Figure 2.3. Neighbor-Joining dendrogram based on Jaccard similarity index (Jaccard,
1908) of 88 wild individuals of the Mexican Yucatan Peninsula and 11 standard
samples of Vanilla, using ISSR markers. The color in the branches is according to Fig.
2.2-A. .......................................................................................................................... 44
Figure 2.4. Principal Coordinates Analysis (PCoA) of 88 wild individuals of Vanilla in the
Mexican Yucatan Peninsula and 11 standard samples of Vanilla, using ISSR markers.
The color points are according to Fig. 2.2-A. ............................................................... 46
49
Figure 2.5. Vanilliodeae phylogeny. Tree with the highest posterior probability resulting
from the Bayesian phylogenetic inference. ML bootstrap values to the left of the
diagonal; Parsimony jackknife values to the right of the diagonal; and posterior
probability values above the branches. The phylogram in the lower left corner shows
the length of the branches. Trees were obtained from multiple sequence alignments of
nucleotides of Vanilla species using ITS...................................................................... 49
iii
Figura 3.1. Sitios de colecta de Vanilla planifolia. 1, 2 y 3 corresponden a los sitios donde
se colectaron los ejemplares de referencia (cultivados). 4 – 25 corresponden a los sitios
donde se colectó material vegetal de ejemplares silvestres de V. planifolia en la MYP.
.................................................................................................................................... 62
Figura 3.2 Patrón de agrupamiento de 7 individuos cultivados y 89 individuos silvestres de
Vanilla planifolia de la Península de Yucatán, México, mediante la determinación de
Kóptimas con el método de Evanno et al. (2005) y 14 loci de microsatélites. .................. 70
Figura 3.3. Mapa de distribución de las poblaciones de Vanilla planifolia y los subgrupos
genéticos en la MYP. La codificación de colores es de acuerdo a las Kóptimas de los
análisis de Structure.................................................................................................... 71
Figura 3.4. Análisis de Coordenadas Principales (PCoA) de Vanilla planifolia en la MYP.
La codificación de colores es de acuerdo a las Kóptimas de los análisis de Structure. .... 73
Figura 3.5. Prueba de Mantel. Aislamiento por distancia entre 89 individuos de Vanilla
planifolia silvestre en la Península de Yucatán, México............................................... 77
Figura 4.1. Distribución de Vanilla planifolia en México y Provincias biogeográficas de
México (Morrone, 2005). Puntos azules: registros de Soto-Arenas (2009; 1999) y
Cibrián (1999); puntos verdes registros de Villanueva-Viramontes et al., 2017. Mapa
tomado de Morrone, 2005: 1, California; 2, Baja California; 3, Sonora; 4, Altiplano
Mexicano; 5, Tamaulipas; 6, Península de Yucatán; 7, Sierra Madre Occidental; 8,
Sierra Madre Oriental; 9, Eje Volcánico Transmexicano; 10, Cuenca del Balsas; 11,
Sierra Madre del Sur; 12, Costa Pacífica Mexicana; 13, Golfo de México; 14, Chiapas.
.................................................................................................................................... 91
Figura 4.2. Distribución de Vanilla planifolia silvestre en México y Áreas Naturales
Protegidas-SIMEC. Círculos azules: registros de Soto-Arenas (2009; 1999) y Cibrián
(1999); círculos verdes: población VERDE-K2 y círculos rojos: población ROJO-K2
(exploración botánica del presente estudio). .............................................................. 94
iv
v
ABREVIATURAS
ISSR
Inter Simple Sequence Repeats
ITS
Interal Transcribed Spacer
MYP
Mexican Yucatan Peninsula
NOI
Nivel de Organización Interno
PYM
Península de Yucatán, México
SSR
Simple Sequence Repeat
vii
RESUMEN
En la conservación y el uso sustentable de los recursos genéticos, un aspecto importante
es evaluar los niveles de diversidad genética y conocer como esta diversidad está
organizada en el área de distribución natural de las especies. La presente tesis se centra
en el análisis de la diversidad y estructura genética de la vainilla (Vanilla planifolia
Andrews) a través de marcadores moleculares microsatélites, con el objetivo de aportar
conocimiento sobre el estado de conservación de sus poblaciones silvestres presentes en
la Península de Yucatán, México. Esta región presenta características ecológicas distintas
a otras áreas de México en donde se han encontrado individuos silvestres de V. planifolia,
lo cual puede proporcionar información valiosa de referencia sobre diversos aspectos
relacionados con el estado de conservación y el manejo de este importante recurso
forestal no maderable. Hasta antes del presente trabajo, no existían estudios que
incorporaran un número grande de individuos silvestres, lo que no permitía abordar los
procesos micro-evolutivos que han ocurrido en las poblaciones naturales de V. planifolia y
que afectan directamente el futuro de las mismas.
Este es el primer estudio que logra
determinar la existencia de dos poblaciones silvestres de V. planifolia con base en un
número mayor de individuos silvestres (89); lo que permitió, además, observar una
subestructura compleja al interior de estas poblaciones, logrando determinar hasta 10
subgrupos. Por otra parte, el presente estudio contribuye a la correcta determinación
molecular (usando marcadores moleculares ISSR e ITS) de tres especies de Vanilla
reportadas previamente en la Península de Yucatán (V. planifolia, V. odorata C. Presl y V.
insignis Ames), así como un nuevo registro (V. pompona Schiede) y una nueva especie
(V. sp. nov. aff. V. phaeantha). Además, los resultados contribuyen a la dilucidación de la
filogenia de las especies de Vanilla encontradas en la Península de Yucatán, México, con
respecto a algunas especies de Las Antillas, África y Asia. Los resultados del presente
trabajo aportan elementos que pueden ser utilizados para generar estrategias de
conservación y manejo sustentable de V. planifolia y de sus parientes silvestres, tanto en
su distribución natural como en el cultivo de todas las especies productoras de vainilla.
ABSTRACT
In the conservation and sustainable use of genetic resources, an important aspect is to
evaluate the levels of genetic diversity and to know how this diversity is organized in the
natural range of the species. The present thesis focuses on the analysis of the diversity
and genetic structure of vanilla (Vanilla planifolia Andrews) through molecular-markers
microsatellites with the objective of contributing knowledge about the conservation status
of its wild populations present in the Yucatán Peninsula, Mexico. This region presents
different ecological characteristics to other areas of Mexico where wild individuals of V.
planifolia have been found, which can provide valuable information of reference on diverse
aspects related to the state of conservation and the management of this important nontimber forest resource. Before the present study, there were no studies that incorporated a
large number of wild individuals, which did not allow to address the micro-evolutionary
processes that have occurred in the natural populations of V. planifolia and that directly
affect their future. This is the first study to determine the existence of two wild populations
of V. planifolia based on a greater number of wild individuals (89); which allowed, in
addition, to observe a complex substructure within these populations, managing to
determine up to 10 subgroups. On the other hand, the present study contributes to the
correct molecular determination (using molecular markers ISSR and ITS) of three Vanilla
species previously reported in the Yucatan Peninsula (V. planifolia, V. odorata C. Presl
and V. insignis Ames), as well as a new record (V. pompona Schiede) and a new species
(V. sp. nov. aff. V. phaeantha). In addition, the results contribute to the elucidation of the
phylogeny of Vanilla species found in the Peninsula, with respect to some Afro-Caribbean
and Asian species. The results of the present work provide elements that can be used to
generate strategies for the conservation and sustainable management of V. planifolia and
its wild relatives, both in their natural distribution and in the cultivation of all vanilla
producing species.
INTRODUCCIÓN.
INTRODUCCIÓN.
En las últimas décadas se ha producido un enorme interés por la diversidad, evolución y
recuperación del género Vanilla Mill. (Cameron, 2011; Havkin-Frenkel y Belanger, 2011;
Odoux y Grisoni, 2010; Bory, et al., 2008a). En parte, este interés se debe a que dentro de
este género se encuentra la segunda especia de mayor importancia comercial a nivel
mundial: la vainilla (Cameron, 2011). Esta especia se puede obtener de diferentes
especies de Vanilla e híbridos (Menchaca, 2009). Sin embargo, el 95% de la producción
mundial de vainilla se centra en una especie (Sasikumar, 2010; Lubinsky et al., 2008a):
Vanilla planifolia Andrews.
En Mesoamérica, los frutos de Vanilla planifolia fueron utilizados desde tiempos
prehispánicos para una variedad de propósitos: tributo, fragancia, condimento del cacao y
medicinal, entre otros (Hágsater et al., 2005). Inicialmente, la producción de vainilla
dependía de la cosecha de los frutos silvestres resultantes de la polinización natural
(Hernández-Apolinar, 2002). Posteriormente, esta producción formó parte de los periodos
de barbecho generados por el sistema milpa, derivando en el manejo de agro-bosques de
vainilla (Toledo et al., 2003). Actualmente, la producción de vainilla se basa en la
propagación vegetativa, la polinización manual (Bory et al., 2007) y el uso excesivo de
fungicidas y plaguicidas (Soto-Arenas, 2006). Estas condiciones han traído consigo
gastos de inversión altos y una disminución alarmante en la variación genética de los
cultivares como resultado de la casi nula emergencia de individuos provenientes de la
recombinación sexual (Cameron, 2011; Bory et al., 2008a; Soto-Arenas, 2006), llevando a
enlistar a la especie en la categoría de alto grado de erosión genética (FAO, 1995).
Vanilla planifolia es originaria de las selvas tropicales de México y América Central
(Hágsater et al., 2005; Soto-Arenas, 2003). En México, las poblaciones silvestres de V.
planifolia han sido severamente afectadas por la colecta excesiva e ilegal para el
establecimiento de plantaciones, al punto de llevar a la especie al borde de la extinción en
su hábitat natural (SEMARNAT, 2010; Soto-Arenas, 2006). Incluso, algunos autores han
aseverado que sólo existen cerca de 30 individuos silvestres (probablemente genotipos),
la mayoría de éstos distribuidos en el sureste de México y un par en Costa Rica (SotoArenas, 2006; Schlüter, 2002; Cibrián, 1999). Estas aseveraciones se basan en registros
de herbarios y muestras obtenidas en cultivo, la mayoría de éstos erróneamente
1
INTRODUCCIÓN.
determinados (Soto-Arenas, 2009); así como en muestras obtenidas únicamente de
cultivos (Cibrián, 1999; Smith, et al., 1992; Purseglove et al., 1981) o en el uso de un
número reducido de individuos silvestres (Soto-Arenas, 1999); por lo que pueden
representar limitaciones en el muestreo. Aun así, actualmente se considera que las
poblaciones silvestres de V. planifolia se encuentran amenazadas a nivel mundial debido
a su número reducido, por lo que han sido clasificadas en la categoría de Protección
Especial (CITES, 2017; SEMARNAT, 2010).
El presente trabajo tiene como objetivo central conocer el estado de conservación
de la diversidad genética de las poblaciones silvestres de Vanilla planifolia presentes en la
Península de Yucatán, México. Puesto que en la naturaleza los miembros de Vanilla
tienen una escasa floración que dificulta la correcta determinación de especies con
características vegetativas similares, y considerando que en la Península de Yucatán
crecen simpátricamente al menos cuatro especies de Vanilla, en esta investigación se
empleó como estrategia experimental el uso de información molecular para la correcta
determinación de los individuos silvestres de V. planifolia y su posterior selección para el
estudio de diversidad y estructura genética de esta especie.
El Capítulo 1 de la tesis presenta el marco teórico de esta investigación, se señala
la importancia de la diversidad genética y del uso de marcadores moleculares para la
conservación de las especies silvestres, se presenta a la especie de estudio y su
problemática, así como el área de estudio y la justificación del trabajo, para por último
establecer las hipótesis y los objetivos de la investigación. El Capítulo 2 presenta el uso
de marcadores ISSR e ITS como herramientas para la determinación de individuos
silvestres de Vanilla. Los resultados muestran que estos marcadores permitieron no solo
diferenciar entre las especies de Vanilla reportadas para la Península de Yucatán, sino
también ayudaron a identificar un nuevo registro de Vanilla para la región y una nueva
especie para la ciencia. El Capítulo 3 presenta un análisis poblacional de V. planifolia
usando marcadores microsatélites y 89 individuos silvestres. Los resultados arrojaron la
presencia de dos poblaciones ubicadas en zonas diferentes de la Península y mostraron
una estructura genética compleja al interior de estas poblaciones. El Capítulo 4 presenta
una discusión general sobre el estado de conservación de V. planifolia, integrando los
2
INTRODUCCIÓN.
resultados de los Capítulos 2 y 3, y discutiéndolos a la luz de los diferentes estudios
realizados en México, derivando en las conclusiones generales del trabajo y perspectivas.
3
CAPÍTULO I
CAPÍTULO I
ANTECEDENTES.
1.1 ESTADO DE CONSERVACIÓN GENÉTICA DE ESPECIES VULNERABLES.
La Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza (IUCN) establece que la
biodiversidad, entendida como la variedad de vida en la Tierra, puede abordarse desde
tres perspectivas: la diversidad de especies, la variación genética al interior de las
especies y la diversidad de los ecosistemas (McNeely et al. 1990). Con la finalidad de
impulsar estas tres perspectivas, fue aprobada la “Estrategia mundial para la
conservación de las especies vegetales” (Estrategia Mundial para la Conservación
Vegetal) en el 2002, en la Sexta reunión de la Conferencia de las Partes (COP) del
Convenio sobre Diversidad Biológica (CDB); misma que fue ratificada y actualizada a
través de la decisión X/17 (periodo 2011‐2020), en la versión X de 2010 de dicha
Conferencia y Convenio. En esta decisión, se define a la Estrategia mundial como un
“impulsor para el trabajo conjunto a todos los niveles de expresión de la diversidad, cuyo
fin es comprender, conservar y utilizar de manera sostenible la inmensa riqueza de la
diversidad mundial de especies vegetales, y al mismo tiempo promover la concientización
y crear la capacidad necesaria para aplicarla”.
La diversidad genética, es decir, la variación genética al interior de las especies es
una de las formas de la biodiversidad que deben ser conservadas (McNeely et al. 1990),
la cual se define como las variaciones heredables que ocurren en cada organismo, entre
los individuos de una población y entre las poblaciones dentro de una especie (Piñero et
al., 2008). Es decir, que lo que conocemos como biodiversidad se deriva de los procesos
evolutivos que operan sobre esas variaciones. Bajo este contexto, es de vital importancia
tanto para la conservación de los ecosistemas como para el bienestar social del hombre,
el conocimiento y comprensión de dicha variabilidad al interior de las especies (Piñero et
al., 2008), es decir, entre las las poblaciones y los individuos que las conforman.
Dado que los análisis genéticos proporcionan una fuente única de información
sobre las características biológicas de las especies (Esparza-Olguín, 2004; Abadie y
Berretta 2001), dichos análisis pueden guiar las estrategias de conservación y manejo de
4
CAPÍTULO I
los organismos enlistados en las diferentes categorías de protección especial (i.e. NOM059-SEMARNAT-2010; IUCN, 2017-1). De acuerdo con Lowe et al. (2005), Frankham et
al. (2002), Amos y Balmford (2001) y Raijmann et al. (1994), en el análisis de la diversidad
genética de las especies es importante tomar en cuenta otros elementos, tal es caso de
los factores genéticos de las poblaciones remanentes, los tamaños poblacionales
efectivos, la diversidad genética intra e inter poblacional y la distribución de la especie en
estudio, particularmente para las especies de distribución restringida y en peligro de
extinción. Estos aspectos, robustecen, a través de distinta información, la evaluación de
los efectos que tienen la fragmentación del hábitat y los cambios ambientales sobre los
genotipos de las poblaciones de las especies raras y/o en riesgo.
En lo relativo a la diversidad genética intrapoblacional, tanto para especies
comunes como raras o en riesgo, ésta es transcendental para la persistencia de las
poblaciones a largo plazo (Kahilainen et al., 2014). Esta importancia radica en dos
atributos primordiales: 1) en el potencial adaptativo de las poblaciones y 2) en la variación
genética neutral al interior de las poblaciones naturales. El primero es un reflejo de la
variación fenotípica que está determinada genéticamente (e.g. Hoffmann y Sgrò, 2011;
Bell y Collins, 2008; Blows y Hoffmann, 2005), cuya importancia será mayor a medida que
mayor sea el potencial adaptativo. El segundo atributo es un reflejo de la posible
reducción de la viabilidad genética, cuya importancia será mayor a medida que los
procesos de endogamia y deriva génica al interior de poblaciones sean mayores (O’Grady
et al., 2006; Frankham, 2005a; Spielman et al., 2004; Puurtinen et al., 2004; Reed y
Frankham, 2003). Este último caso, cobra mayor relevancia cuando se toma en cuenta el
tamaño efectivo de la población [número de individuos reproductivos que contribuyen
tanto demográficamente como genéticamente a la siguiente generación (Hedrick, 2000)]
de las especies raras o en peligro de extinción, debido a que la diversidad genética
neutral asociada a dicho tamaño poblacional puede reflejar la capacidad evolutiva y el
potencial adaptativo a largo plazo en este tipo de especies (Lanfear et al., 2014; Willi et
al., 2006; Frankham, 2005b; Robertson, 1960). Cabe señalar que, no se puede esperar
que esta diversidad sea directamente equiparada con la variación particular de cualquier
característica fenotípica (Reed y Frankham, 2001). En este contexto, la reducción de la
diversidad genética intrapoblacional, ya sea neutra o adaptativa, está relacionada con el
aumento del riesgo de extinción en las poblaciones silvestres.
5
CAPÍTULO I
En la conservación de las poblaciones silvestres, rara vez se ha considerado
abordar explícitamente la diversidad genética, a pesar de que este aspecto influye en su
viabilidad a largo plazo y el funcionamiento de los ecosistemas (GEO BON, 2011; Walpole
et al., 2009; Mace y Purvis, 2008). En México la aplicación de este enfoque ha sido
limitado, a pesar de que el 4.46% de sus especies vegetales están en peligro de extinción
(Royo-Márquez et al., 2014). En parte, esto se debe a que la información está dispersa,
ya que los factores ambientales y genéticos que afectan directamente a la demografía de
las poblaciones están siendo evaluados con diferentes marcadores moleculares, por lo
que existe la necesidad de contar con un marco de referencia acerca de las técnicas
disponibles para el estudio genético de las poblaciones naturales en el país (CanalesDelgadillo et al., 2015).
Una forma de abordar la diversidad genética se plantea en la Estrategia Española
para la conservación y uso sostenible de los recursos genéticos forestales de España
(Ministerio
de
Agricultura
y
Pesca,
Alimentación
y
Medio
Ambiente,
http://www.mapama.gob.es/es/desarrollo-rural/temas/politica-forestal/recursos-geneticosforestales/rgf_estrategias_conservacion.aspx).
Esta
estrategia
se
basa
en
el
establecimiento de “Unidades de Conservación Genética”, cuya delimitación se basa en la
información de la diversidad genética de cada una de las especies que la conforman. Por
ello, la disponibilidad de datos genéticos (genotípicos y/o fenotípicos) es de vital
importancia para su elección. Sin embargo, en los casos en los que no existan datos
genéticos disponibles, la variación espacial y ecológica de la especie en cuestión es
tomada en cuenta, siendo conscientes de que éstas son solamente indicadores (con la
necesidad de validación) de la variación genética.
Cabe señalar que estas unidades de conservación genética deben aportar algún
valor adicional a la red de conservación de la biodiversidad en dicho país. De ahí que,
para valorar este aporte se considera su contribución a la diversidad genética de la
especie (variabilidad y diferenciación) y/o aportación al estado de conservación de la
especie. Esta caracterización debe ser común para las unidades de cada especie; por lo
que, en los planes específicos se deben fijar aspectos como los parámetros a estimar, tipo
e intensidad de muestreo, marcadores moleculares y caracteres adaptativos a evaluar,
6
CAPÍTULO I
métodos de análisis de los datos, entre otros (Plan Nacional de Conservación de
Recursos Genéticos Forestales, 2009).
1.1.1 Enfoques en el estudio del estado de conservación genética: marcadores
moleculares.
Todas las actividades de conservación de los recursos genéticos requieren la
caracterización de la diversidad presente, tanto en las pozas génicas como en los bancos
de genes (Karp et al., 1997). Dicha caracterización se ha llevado a cabo principalmente
mediante la aplicación de marcadores moleculares - segmentos de ADN claramente
identificables con posiciones conocidas en el genoma que permiten entender y conservar
la biodiversidad (Godoy, 2009; Freeland, 2005; Karp et al., 1997; Avise, 1994). A través
de éstos se ha permitido documentar los cambios genéticos que las poblaciones han
sufrido como consecuencia de la fragmentación y destrucción de sus hábitats;
confirmando así, las consecuencias negativas que los disturbios pueden tener en la
viabilidad poblacional y la evolución adaptativa (Godoy, 2009). A su vez, la aplicación de
marcadores moleculares, junto con la teoría evolutiva, aporta información sobre la historia
evolutiva (Avise, 2000), la demografía, la ecología y el comportamiento de las especies, la
cual puede ayudar en la evaluación de riesgos, la asignación de prioridades, la
delimitación de unidades y el diseño de estrategias de conservación ad hoc (Frankham,
2005; Crandall et al., 2000; Moritz, 1994).
Un aspecto relevante de los marcadores moleculares es que permiten observar
diferencias reales entre secuencias homólogas del ADN. Estas diferencias surgen por
cambios o re-arreglos (translocaciones, inversiones, inserciones y deleciones) entre las
pares de bases que constituyen la molécula de ADN (Valadez y Kahl, 2000). La
importancia de estos marcadores, por tanto, radica en la detección directa de variaciones
que experimenta un determinado organismo a nivel de ADN (Demey et al., 2003; Valadez
y Kahl, 2000). Es así como, las técnicas moleculares aportan métodos para la asignación
de muestras a especies (López-Giraldez et al., 2005; Gómez-Moliner et al., 2004;
Palomares et al., 2002), poblaciones o individuos (Mank y Avise, 2004; Berry et al., 2004),
de igual forma para la identificación de variedades y el rastreo de las relaciones entre
7
CAPÍTULO I
plantas y su linaje (Martínez-Castillo, 2007). De esta manera, estos enfoques moleculares
aportan herramientas eficientes para la conservación y la gestión de especies
amenazadas (Godoy, 2009). Particularmente, en esta investigación se usaron marcadores
moleculares microsatélites, ISSR e ITS, a continuación, se profundiza en éstos.
1.1.2 Microsatélites.
Los microsatélites o SSR (Secuencias Simples Repetidas) forman parte de un grupo
mayor de marcadores moleculares llamados VNTRs (Repeticiones en Tandem de Número
Variable) (FAO 2010). Son secuencias de ADN simples y cortas, cuyo motivo (secuencia
aleatoria de bases nitrogenadas) se encuentra repetido en serie a lo largo del genoma de
los
organismos
(Glaubitz
y
Moran,
2000).
La
unidad
básica
se
conforma
aproximadamente de 2-10 pares de bases. Estas secuencias son altamente variables en
el número de unidades que las integran, por lo que su análisis para la búsqueda de
polimorfismos es muy valioso (Valadez y Kahl, 2000). Las SSR se caracterizan por ser
marcadores altamente polimórficos, considerablemente informativos dado el alto nivel de
polimorfismo y codominancia (Rentería-Alcántara, 2007). Además, tienen un alto poder de
discriminación, el número de fragmentos o loci obtenidos es alto con respecto a otros
marcadores, la transferencia de fragmentos se da incluso dentro de subgéneros, la
reproducibilidad es muy alta y trabajar con ellos es de fácil a moderado (Glaubitz y Moran,
2000). Bory et al. (2008), aislaron y caracterizaron 14 loci de microsatélites en Vanilla
planifolia en ejemplares cultivados en la Isla Reunión. Estos fueron monomórficos dentro
de accesiones cultivadas, como se esperaba del probable único origen clonal de este
cultivo y los estudios genéticos anteriores. Estos marcadores fueron transferibles a V.
tahitensis y once loci fueron polimórficos entre estos dos taxones estrechamente
relacionados. Además, algunos de estos marcadores fueron transferibles y polimórficos a
través de otras quince especies americanas, africanas y asiáticas silvestres y revelaron
relaciones consistentes entre las especies, junto con un fuerte patrón de diferenciación del
género entre el Viejo Mundo y el Nuevo Mundo. Además de la utilidad para resolver los
patrones filogeográficos del género, la evaluación de la transferibilidad de estos
microsatélites en otras especies del género se llevó a cabo para determinar si estos
marcadores podrían ser útiles para otras cuestiones como la aparición de hibridaciones
interespecíficas naturales (Nielsen, 2000; Nielsen y Siegismund, 1999).
8
CAPÍTULO I
1.1.3 ISSR.
Las ISSRs (Inter-Secuencias Simples Repetidas) son otro tipo de marcadores
moleculares que permiten evaluar los niveles de variación genética en las regiones
internas de los microsatélites, las cuales se encuentran dispersas en varios genomas;
particularmente en el nuclear (González y Aguirre, 2007). Estos marcadores consisten en
un motivo repetido de dos o tres nucleótidos, que son complementarios a la secuencia del
microsatélite. Este motivo está diseñado para ensamblarse a las secuencias repetidas de
di y trinucleótidos, evitando los mononucleótidos del cloroplasto (Rocha-Munive et al.,
2014). Además de las secuencias repetidas, los iniciadores de ISSR incluyen un par de
bases arbitrarias en el extremo 3’. Estos nucleótidos extras juegan un papel muy
importante, ya que sirven como anclas, asegurando que la amplificación se lleve a cabo
siempre desde el extremo 5’ del microsatélite, en donde el iniciador (oligonucleótido) sitúa
dos regiones separadas por una secuencia genómica amplificable del ADN blanco. La
molécula generada, con un tamaño particular (peso molecular), se considera un “locus”,
que representa el segmento de ADN entre los microsatélites (Bornet y Branchard, 2001;
Zietkiewics et al., 1994). El resultado final de la reacción de PCR es un patrón variable de
bandas, las cuales representan las regiones amplificadas, detectando de esta manera, el
polimorfismo entre individuos de la misma población, ya que el análisis es sensible a la
presencia/ausencia del elemento genómico reconocido por el iniciador y a las diferencias
en la longitud de la secuencia intermedia amplificada (Zietkiewicz et al., 1994). Este
patrón característico de fragmentos se considera la “huella digital genética” de cada
individuo analizado.
1.1.4 Regiones ITS y el gen 5.8S.
Las secuencias de nucleótidos de los espaciadores transcritos internos (ITS) 1 y 2 de la
región nuclear del ADN ribosómico (ADNr) 18S-26S, son secuencias repetidas que están
organizadas en series sucesivas (i.e. tándem) en las regiones organizadoras del nucléolo
de los cromosomas de todos los eucariotas. Los ITS (espaciadores transcritos internos)
han sido ampliamente utilizados en análisis filogenéticos en los niveles de especie y
género, al proporcionar una valiosa fuente de caracteres variables (Pridgeon et al. 1997) y
9
CAPÍTULO I
al permitir estimar las relaciones intragenéricas (Bateman et al., 1997). Debido a las tasas
de evolución relativamente rápidas de los ITS, las secuencias de ADN de los ITS1 e ITS2
(presentes en la unidad de transcripción del ARN ribosomal: ARNr) han demostrado ser
útiles para resolver las relaciones filogenéticas de taxones estrechamente relacionados y
para distinguir especies dentro de estos (Oliverio et al., 2002; Weekers et al., 2001; Mai y
Coleman, 1997; Schlotterer et al., 1994; Baldwin, 1992). Además, el ITS proporciona
algunas señales que guían las regiones de codificación ribosómicas cuando se procesan
en ARNr 18S, 5.8S y 28S mediante la estructura de plegado de transcripción (van Nues et
al., 1995; van der Sande et al., 1992). En los estudios filogenéticos es importante ordenar
la alineación de secuencia fiable basada en estructuras secundarias, esta alineación
puede ser posible mediante el potencial para predecir la estructura plegable de los ITS
(Michot et al., 1999).
1.2 ESPECIE DE ESTUDIO: Vanilla planifolia Andrews.
El género Vanilla, es uno de los linajes más primitivos en la familia Orchidaceae (62
millones de años, Cameron, 2011; 2003; Soto-Arenas, 1999). Se trata de plantas
hemiepífitas que constituyen el único grupo de esta familia con hábito trepador (Carnevali,
2012; Anilkumar 2004; Soto-Arenas, 2003; Augstburger et al., 2000; Hernández-Apolinar,
1997). El género presenta una distribución pantropical, con alrededor de 110 especies
(Bory et al., 2008; Portères, 1954), y se cree que tuvo su origen en América (Bouetard et
al., 2010; Ramírez et al., 2007; Cameron, 2000; Cameron, 1999; Portères, 1951).
Particularmente, Vanilla planifolia (Figura 1.1) es originaria de las selvas tropicales
de México y América Central (Hágsater et al., 2005; Soto-Arenas, 2003; Portères, 1954).
Se desarrolla en selvas altas perennifolias y medianas subperennifolias contiguas a
sabanas inundables, generalmente sobre terrenos kársticos muy accidentados,
frecuentemente en la cima de lomeríos (Soto-Arenas, et al., 2009). La especie se localiza
desde el nivel del mar hasta aproximadamente los 1100 metros. de altitud (HernándezApolinar, 1997). Esta especie se distribuye en climas cálido-húmedos, generalmente con
una gran proporción de lluvia en el verano (Soto-Arenas, et al., 2009). En el caso
particular de la Península de Yucatán, V. planifolia se encuentra en clima cálido
subhúmedo con temperatura media mensual del mes más frío mayor de 18 °C, con lluvias
en verano y estación seca en el invierno (al menos un mes con menos de 60mm de
10
CAPÍTULO I
precipitación anual acumulada) con un porcentaje de lluvia que va entre 5 y >10.2 mm de
la anual, y un índice de Lang (estimador de eficiencia de la precipitación en relación con la
temperatura) entre <43.2 y 55.3 (Soto-Arenas y Solano-Gómez, 2007; Carnevali et al.,
2001). Además, se encuentra fuertemente asociada a cuerpos de agua dulce (cenotes,
aguadas, rejolladas).
Con base en Soto-Arenas et al. (2009), a continuación, se describen las
características taxonómicas de Vanilla planifolia. Esta orquídea presenta tallos cilíndricos
de 6.5-12 (-13) mm de grosor y 120 m de largo, suculentos, flexibles, de color verde
oscuro y lisos; los cuales están formados por entrenudos de 6-15.5 cm de largo. La planta
posee hojas elípticas-oblongas subsésiles a subpecioladas de 8.5-23 x 2-7.6 cm, con
márgenes frecuentemente paralelos, base obtusa o redondeada, abruptamente
acuminada o subacuminada en el ápice; coriáceo-carnosa, haz verde intenso a pálido,
lustroso, envés más pálido; con pecíolo acanalado, de 8-18 x 7-9 mm. La inflorescencia
en la especie llega a medir de 4-26.5 cm de largo, es un racimo helicoidal, muy raramente
ramificado, candelabriforme, con 7-35 flores; pedúnculo 1.5-5 cm de largo, 5-7 mm de
grosor, carnoso, con brácteas subdísticas, cimbiformes, recurvadas, triangular-ovadas,
subagudas, marginadas, raramente subfoliosas, hasta de 13 (-50) x 9 (-20) mm; raquis
3.5-21 cm de largo, 7-8 mm de grosor. Brácteas 5-10 x 3-4 mm, sésiles, ampliamente
ovadas o triangular-ovadas, agudas abajo, las distales obtusas-redondeadas, cóncavas,
carnosas y rígidas. Ovario 40-57 mm de largo, 3.5-4 mm de grosor, arqueado en la base,
recto, liso, verde, blanco en la base, con nectarios extraflorales. Flores de 39 mm de
ancho, sucesivas, algo vistosas, de 1-2 (-3) flores abiertas a la vez, segmentos
variablemente extendidos, más frecuentemente con los tépalos formando un ángulo de
40° respecto a la columna, efímeras, tépalos verde pálido a verde blanquecino, brillantes,
labelo amarillo pálido-crema con café ocre en la garganta y las papilas, o totalmente
verde-crema, papilas distales verdes, columna verde-blanquecina; fragancia débil,
herbácea, con notas a canela o similar a las flores nocturnas (Hymenocallis) (SotoArenas, et al., 2009). La floración de V. planifolia es gregaria, principalmente durante
marzo-abril. Cada flor permanece abierta aproximadamente de las 7:00 a las 15:00 horas.
Sin embargo, en la Península de Yucatán se ha observado que la apertura floral es a
partir de las 19:00 hrs a las 13: 00 hrs (obs. personal). V. planifolia es raramente visitada
por insectos, aunque se han visto abejas del género Euglossa, visitar las flores y portar
11
CAPÍTULO I
polen de esta especie (Hernández-Apolinar et al. 2016). Estas abejas son bien conocidas
como polinizadores a larga distancia (hasta 1700 metros, Tonhasca et al. 2003). Se ha
reportado también que las euglosinas permiten el mantenimiento de especies con poca
diferenciación morfológica, pero con distintas fragancias florales (Williams, 1982). La baja
visitación y la escasa producción de frutos (1 en 100-1000) y flores, sugieren la existencia
de un mecanismo de polinización por engaño lo cual ha sido planteado como
característico de poblaciones con muy bajas densidades (Ackerman, 1986). Las semillas
de las vainillas son probablemente dispersadas por murciélagos (Soto-Arenas, et al.,
2009) o algún otro animal que frecuente las copas de los árboles como monos araña,
saraguatos o aves (observaciones personales). V. planifolia parece ser una especie bien
adaptada a la hiperdispersión de sus poblaciones (Soto-Arenas, 1999), pudiéndose
encontrar 1 o hasta 10 individuos en un radio de 1 kilómetro, y encontrar otro(s)
individuo(s) en más de 57 kilómetros.
12
CAPÍTULO I
Figura 1.1. Vanilla planifolia silvestre. Fotos de Villanueva-Viramontes, S.
13
CAPÍTULO I
1.2.1 Breve historia del cultivo de la vainilla.
Hágsater et al. (2005), señalan que, en Mesoamérica, los frutos de la vainilla,
principalmente Vanilla planifolia, se han utilizado desde tiempos prehispánicos para una
variedad de propósitos: tributo, fragancia, condimento del cacao, medicinal, etc. por
diversos grupos indígenas, como los mayas, los aztecas y totonacas entre otros. Dicha
producción de vainilla dependía de la cosecha de los frutos silvestres, misma que era
resultado de la polinización natural de abejas endémicas de Mesoamérica (HernándezApolinar, 2002). A partir de esta información, es posible suponer que V. planifolia pudo
haber sido más abundante en aquel tiempo, e incluso que las condiciones ambientales
pudieron haber favorecido una mayor producción de frutos. Con el pasar del tiempo, esta
producción formó parte de los periodos de barbecho existentes en el sistema de
agricultura de roza, tumba y quema conocido como milpa, derivando esto en el manejo de
agro-bosques de vainilla (Toledo et al., 2001; Medellín-Morales, 1988; Kelly et al., 1952).
Algunos autores (Bory et al., 2008; Lubinsky et al., 2008; Hágsater et al. 2005; Fouché y
Jouve, 1999) indican que alrededor del Siglo XIX, Vanilla planifolia fue llevada desde
México a otros países tropicales de Asia y África en donde, en un principio, su cultivo no
fue exitoso por falta de polinizadores. Los totonacas fueron los primeros y únicos
exportadores de vainilla en el mundo por casi 200 años (Hágsater et al., 2005). Sin
embargo, el monopolio mexicano de la vainilla se vino abajo con el descubrimiento en
Bélgica (1836) de un método para su polinización manual, lo cual permitió a otros países
convertirse en productores de vainilla (Kourí, 2004). Actualmente, Indonesia es líder en la
producción de vainilla, mientras que México se encuentra en el cuarto lugar (después de
Madagascar y China) aportando el equivalente al 5.9% de la producción mundial
(FAOSTAT, 2010). La producción de vainilla en México está distribuida entre los estados
de Veracruz (51% de la producción nacional), Oaxaca (20%), Puebla (21%), San Luis
Potosí (6%), y los estados de Hidalgo, Chiapas y Quintana Roo que en conjunto producen
solo un 2% (SIAP, SIACON, SAGARPA, 2011).
14
CAPÍTULO I
1.2.2 Estudios de diversidad y relaciones genéticas en Vanilla planifolia que
incluyen individuos silvestres en México.
Existen varios estudios de diversidad genética en Vanilla planifolia cultivada tanto en
México como en el resto del mundo, en los cuales se han utilizado distintos marcadores
moleculares (Borbolla-Pérez et al., 2016; Ramos-Castella et al., 2016; Busungu, 2009;
Lubinsky et al., 2008; Bory et al., 2008; Sreedhar et al., 2007; Besse et al., 2004; Cibrián,
1999). En resumen, en las plantaciones estudiadas prácticamente no existe diversidad
genética (ver resumen abajo), lo cual es acorde con el modo vegetativo de dispersión de
la vainilla y la historia de reciente introducción en las regiones de cultivo. Se considera
que la mayoría de las accesiones cultivadas en el mundo se derivaron de una única
accesión, posiblemente el cultivar mexicano “Mansa” (Bory et al., 2008). Una de las
principales razones de que esto haya sucedido pudo ser la extensa propagación
vegetativa de este cultivar, eliminando de esta manera los clones autoincompatibles y no
productivos en las plantaciones (Soto-Arenas, 2009). La magnitud de la dispersión de este
único cultivar ha sido tan amplia que, actualmente, se encuentran individuos escapados
y/o naturalizados con igual información genética en todas las áreas tropicales del mundo
(Lubinsky et al., 2008), lo que obstaculiza el reconocimiento de ejemplares silvestres;
particularmente, en áreas fuera de su distribución natural.
A continuación, se presenta un resumen de los estudios realizados en el país
sobre diversidad genética de Vanilla planifolia, en los que resaltan su enfoque y zona de
estudio para los fines de la presente investigación:
a) Cibrián (1999), usando 7 loci de isoenzimas analizó una pequeña muestra de
individuos silvestres de Vanilla planifolia, así como la diversidad y estructura
genética de cultivares mexicanos de la misma especie colectados en los estados
San Luis Potosí, Veracruz, Oaxaca, Tabasco y Chiapas. Un aspecto importante en
el análisis de esta autora es que, estos individuos no representan poblaciones
naturales, ya que fueron colectados muy pocos individuos silvestres (solitarios) en
regiones muy diferentes y distantes. Los niveles de diversidad genética en este
estudio fueron comparados con el promedio de la variación genética encontrado
en otras especies de plantas, cuyo análisis también se basó en isoenzimas
(Hamrick y Godt, 1989; Loveless y Hamrick, 1984; Hamrick et al., 1979). Cibrián
15
CAPÍTULO I
reportó valores altos (87.5%) de loci polimórficos en las plantas provenientes de
Oaxaca, siendo los individuos silvestres aquellos que presentaron mayor variación.
En general, todas las localidades presentaron valores bajos de heterocigosidad
(HO=0.000 a 0.078), siendo los cultivares de Veracruz las menos variables. Por
otro lado, los análisis FST, fenéticos (UPGMA) y de parsimonia indicaron una
estructura genética al interior de las muestras de V. planifolia revisadas (Φ=0.18).
Estos niveles de diferenciación sugirieron que tanto la endogamia como la deriva
génica juegan un papel fundamental en la estructura genética de esta especie. De
la misma manera, el cultivar “Oreja de Burro”, el cual se caracteriza por ser
autoincompatible, fue uno de los más heterócigos. Estos resultados sugieren que
la polinización manual practicada en las plantaciones podría aumentar los niveles
de endogamia, al no existir un intercambio genético como el generado por la
reproducción sexual. Por otra parte, se observaron dos grupos que excluyen a los
individuos silvestres (i.e. individuos aislados de localidades de Tabasco, del Este
de Oaxaca y Chiapas), uno de los cuales correspondió al norte de Veracruz y el
otro al norte de Oaxaca. Cibrián concluyó que los valores de diversidad genotípica
no reflejan la existencia de una extensa propagación clonal y sugiere que las
técnicas de electroforesis sobre estimaron el número de genotipos existente.
b) Soto-Arenas (1999) analizó las relaciones filogenéticas de las especies
mexicanas de Vanilla, usando caracteres moleculares de la región ITS de los
genes ribosomales. Este autor encontró que las 10 especies de vainillas que se
desarrollan en México pertenecen a linajes distintos del género. Ocho de estas
especies forman parte del clado que incluye a las especies económicamente
más importantes (V. planifolia y V. pompona), las cuales representan una parte
significativa de los recursos genéticos de este cultivo. Mediante la evaluación
de la variación de los ITS, se determinó que son una herramienta útil para el
reconocimiento de material estéril dentro de este grupo. Los recursos genéticos
primarios de vainilla fueron conformados por los cultivares y especímenes
silvestres de V. planifolia. Con el objetivo de colectar datos que permitieran
establecer una genealogía en esta especie, así como para conocer el origen,
diseminación y procesos de domesticación en este cultivo, el autor obtuvo
secuencias nucleotídicas de regiones genómicas hipervariables. Sin embargo,
16
CAPÍTULO I
la variación detectada resultó insuficiente para realizar un análisis que brindara
mayor información sobre la historia de V. planifolia. Basándose en los
resultados de los análisis con marcadores ITS, este estudio propone hipótesis
que cuestionan la clasificación infragenérica de Vanilla, la cual establece que
un complejo de especies y poblaciones estrechamente relacionadas no
corresponde con la clasificación taxonómica de las mismas, en otras palabras,
que la clasificación generalmente aceptada del género [Aphyllae (donde las
plantas tienen brácteas parecidas a hojas) y Foliosae (donde los bejucos tienen
hojas desarrolladas), Portéres, 1954] es incompatible con la filogenia. De esta
manera, el autor afirma que existen tres linajes que han divergido
considerablemente entre las especies mexicanas de Vanilla. Asimismo, sugiere
que el origen monofilético del grupo debe ser evaluado con un muestreo más
extenso en el que se incluyan especies de otras regiones. Se concluye que
gran parte de los recursos genéticos secundarios (especies estrechamente
relacionadas genéticamente) de V. planifolia se encuentran en México (sitio de
origen y domesticación de esta especie, Soto-Arenas, 1999), siendo el área
más probable de diversificación del clado que comprende a V. planifolia. Por
otra parte, debido a la frágil condición de conservación en que se encuentran
los recursos genéticos primarios de V. planifolia (los individuos silvestres y
cultivados), las especies cercanas representan una fuente de rasgos aún más
importante que para otros cultivos. Los ITS de las vainillas permitieron utilizar
esta región genómica para análisis filogenéticos, pero no genealógicos.
Asimismo, estos análisis permitieron rastrear la distribución de los cultivares y
algunos especímenes silvestres en México.
c) Schlüter et al. (2007) analizaron la variación y estructura genética de Vanilla
planifolia en México, usando marcadores de RAPD (Random amplified
polymorphic DNA - Fragmentos de ADN polimórficos amplificados al azar). Este
estudio incluyó 37 individuos de Vanilla distribuidos de la siguiente forma: 27 de V.
planifolia, 17 procedentes de cultivo [diez individuos de los cultivares: “Variegata”
(dos) de Florida y Veracruz, “Oreja de Burro” (dos) de Veracruz, y “Mansa” (seis)
de Veracruz y de San Luis Potosí (uno); e individuos cultivados (siete) de origen
desconocido: de Oaxaca (cinco),Tabasco (uno) y Costa Rica (uno)], seis individuos
17
CAPÍTULO I
silvestres: de Chiapas (uno), de Oaxaca (uno) y de Quintana Roo (cuatro), y cuatro
individuos cultivados de origen silvestre de Oaxaca (tres) y de Costa Rica (uno), o
escapados de cultivo. El resto comprendió un híbrido de V. planifolia x V. odorata
(de Costa Rica), dos individuos silvestres de Vanilla cf. helleri Hawkes, dos
individuos silvestres de V. insignis, dos individuos silvestres de V. odorata y tres
individuos cultivados de Vanilla tahitensis Moore (la cual, actualmente se sabe que
es un híbrido entre V. planifolia x V. odorata, Lubinsky et al., 2008b; Soto-Arenas y
Dressler, 2010). Los autores encontraron un fuerte componente geográfico
relacionado a la variación de los RAPD dentro de los ejemplares muestreados de
V. planifolia, con plantas que se desarrollan en Costa Rica separadas de las
plantas que se desarrollan en México. Para México se describieron dos grupos
principales de vainilla cultivada: el norte y el sur. El grupo norte consistió en su
mayoría de plantas cultivadas al norte de la Faja Volcánica (norte de Veracruz),
aunque también se incluyen algunas plantas cultivadas de Oaxaca. El grupo del
sur de México contenía plantas silvestres y cultivadas de origen silvestre del sur de
la Faja Volcánica (Oaxaca, Chiapas y Quintana Roo). Estos datos sugieren que las
plantas cultivadas del sur encontradas en el grupo norte "cultivado", pudieron
haber sido tomadas deliberadamente de Veracruz con el propósito de establecer
nuevas plantaciones. Por otra parte, al quitar los individuos traslapados se observa
una diversidad genética significativamente mayor al sur de la Faja Volcánica, en
comparación con el norte de México. Además, los nombres de los cultivares
(“Mansa”, “Oreja de Burro” y “Variegata”) utilizados en V. planifolia no parecen
reflejar los grupos definidos genéticamente. Las plantaciones en la región de
Veracruz se cree que son muy antiguas; y la mayoría de las plantaciones de
Oaxaca se establecieron a finales de la década de 1980, a partir de ejemplares
silvestres principalmente (Soto-Arenas, 1999). Los resultados de este estudio
sugieren que V. planifolia cultivada en México, se divide principalmente en dos
grupos genéticos: 1) al norte de la Faja Volcánica, el cual es un pequeño
remanente de individuos que fueron de origen silvestre en el pasado, y 2) al sur de
México, el cual es de origen silvestre e incluye a los especímenes silvestres
restantes. Los autores concluyen que el patrón básico de la distribución de la
diversidad genética de esta especie (de norte a sur) se ha complicado por el
movimiento mediado por el humano. De la misma manera concluyen que la
18
CAPÍTULO I
ausencia de estructura geográfica entre las muestras de Quintana Roo, Chiapas y
Oaxaca, donde cientos de kilómetros pueden separar diferentes genets, puede ser
el resultado de la migración de polen a larga distancia por las abejas euglossine y
la dispersión de la fruta por murciélagos.
d) Ramos-Castella et al. (2016), evaluaron la variabilidad molecular de los cultivares
“Mansa” y “Variegata” de Vanilla planifolia y de tres especies silvestres [V. odorata
(un individuo), V. insignis (tres individuos) y V. pompona (un individuo)], mediante
marcadores ISSR. Como V. planifolia es una especie establecida por esquejes, es
común que se observe la presencia del mismo genotipo en una plantación e
incluso en varias plantaciones. Debido a esto, los autores utilizaron la metodología
de agrupaciones genéticas o pozas génicas (i.e. ADN de un individuo por sitio o la
mezcla del ADN de tres a cinco individuos por sitio) para detectar la variación
genética entre los sitios de muestreo en los estados de Veracruz, Oaxaca y
Quintana Roo. Dentro del muestreo, se incluyeron dos pozas génicas silvestres
provenientes de Oaxaca (únicamente un individuo) y Quintana Roo (tres
individuos). El análisis molecular indicó 99.3% de polimorfismo entre todas las
especies y 70.45% dentro de V. planifolia. Al interior de esta última, se observaron
tres subgrupos. Las pozas génicas más diferenciadas de V. planifolia fueron del
cultivar “Rayada” y la poza génica silvestre de Oaxaca, seguida de la poza génica
silvestre de Quintana Roo. Todas las pozas génicas comerciales de V. planifolia
del cultivar “Mansa” constituyeron un solo grupo. El análisis de estructura genética
diferenció entre V. planifolia y las tres especies silvestres y entre las pozas génicas
de los cultivares “Mansa” y “Rayada” y las pozas génicas silvestres. Este análisis
también indicó la presencia de individuos mixtos. Los resultados sugieren de esta
manera, que las pozas génicas silvestres de V. planifolia (las más diferenciadas)
constituyen una de las fuentes primarias de variabilidad genética de la especie
más importantes para aumentar el acervo genético. Además de que es necesario
priorizar la conservación de estas pozas génicas debido a que son las más
amenazadas por la destrucción del hábitat y por ser reemplazadas por el cultivar
“Mansa”.
19
CAPÍTULO I
1.3 ÁREA DE ESTUDIO: PENÍNSULA DE YUCATÁN, MÉXICO (PYM).
En México, algunos sistemas de clasificación de la vegetación han reconocido hasta 50
tipos diferentes (González-Medrano, 2003; INEGI, 1989; Miranda y Hernández-X., 1963);
y se han definido provincias biogeográficas de acuerdo con los enfoques fisiográficos
(Ferrusquía-Villafranca, 1993), fitogeográficos (Rzedowski, 1978) y zoogeográficos
(Goldman y Moore, 1946; Moore, 1945). El número de provincias identificadas para el
país ha variado de acuerdo a los grupos biológicos en cuestión; sin embargo, la Península
de Yucatán (PYM, Península de Yucatán-México) siempre ha sido reconocida como una
unidad relativamente homogénea, independientemente del criterio elegido.
La PYM es una amplia planicie que se caracteriza por su relativamente reciente
identidad geológica (resultado de la emersión de la Placa del Caribe; Espinosa y
Ocegueda, 2008), su clima tropical, los tipos de suelos presentes, así como por su flora y
fauna (Espadas, 2004). Esta planicie rebasa los 200 m de elevación sobre el nivel del mar
solo en su extremo sur, además de que su carácter peninsular le confiere cierto grado de
aislamiento. Debido a que parte de la península se encuentra en el Golfo de México, y
también a la trayectoria de los grandes sistemas de vientos y subsidencias (Espinosa y
Ocegueda, 2008), la PYM es dominada por una corriente marina cálida que representa un
aporte significativo y constante de vapor de agua. Además, a pesar de su relativa pobreza
florística, la flora presenta una proporción considerable de especies endémicas.
La vegetación de la PYM ha sido descrita por Flores y Espejel (1994), Rzedowski
(1978) y Miranda (1958). La mayor parte de la superficie que comprende el estado de
Yucatán y en menor proporción en Campeche y Quintana Roo, está cubierta por selvas
bajas caducifolias. Cerca de la costa de los tres estados de la península se desarrolla la
vegetación halófila típica de la línea de costa, la duna costera y el matorral de duna
costera. En esta zona también son frecuentes varios tipos de manglar y marisma que
corresponden a un conjunto heterogéneo de todos los tipos anteriores de vegetación
incluyendo además al petén y a las sabanas húmedas. Los petenes son lugares cerca de
la costa donde aflora el drenaje subterráneo creando un oasis de aguadulce en una matriz
de suelos y vegetación halófita. Otro tipo de vegetación bastante frecuente son las selvas
bajas inundables, que forman grandes parches en varias zonas de la parte sur de la
península, sin embargo, también se encuentran parches dispersos en algunos lugares
20
CAPÍTULO I
más al norte. Las selvas bajas inundables son de varios tipos, esto según el tipo de planta
que las domina en biomasa y estructura: pucteales (dominados por Bucida buceras L.),
mucales (dominados por Dalbergia sp.) y, más frecuentemente, tintales (dominados por
Haematoxylum campechianum L.). Este tipo de vegetación tiene elementos florísticos
distintivos y estructurales, y está caracterizado notablemente por la gran biomasa y
diversidad de plantas epífitas. Las selvas alta subperennifolia y alta perennifolia ocupan
las áreas más húmedas en los estados de Campeche y Quintana Roo, y muestran
diferencias florísticas importantes que se reflejan en diversos esquemas biogeográficos
basados en clima, fisiografía y plantas (Lundell, 1934), aves, mamíferos y plantas
(Goldman y Moore, 1946), anfibios, aves, peces, mamíferos no voladores y reptiles
(Barrera, 1962), anfibios y reptiles (Lee, 1980) y árboles y sus endemismos (EspadasManrique et al., 2003; Ibarra-Manríquez et al., 2002).
Se han hecho varias propuestas de regionalización interna que reconocen desde
dos hasta cinco subunidades dentro de la PYM (Ibarra-Manríquez et al., 2002) y una de
las más consistentes divide a la región en una región norte seca y otra al sur, más
húmeda. Entre la selva baja caducifolia y la selva alta perennifolia, hay asociaciones
intermedias que se conocen como selva mediana. Éstas que pueden ser caducifolias o
subperennifolias. En general la altura y fisonomía son intermedias, así como también la
distribución espacial, ocupando una franja intermedia entre el extremo seco del norte y el
extremo húmedo al sur. Por otra parte, existen tipos de vegetación que ocupan áreas
menos extensivas en la PYM, las cuales están asociadas a fenómenos o condiciones
edáficas o geomorfológicas especiales. Entre estos tipos de vegetación se incluyen varios
tipos de comunidades vegetales que habitan suelos casi permanentemente saturados y
con una cobertura predominantemente herbácea, tales como los tulares, dominados por
Typha angustifolia L. y los carrizales, dominados por Phragmites communis Trin. Algunas
variantes de estos ecosistemas poseen plantas arbóreas que les confieren una fisionomía
distintiva, como lo son los tasistales, dominados por Acoelorraphe wrightii (Griseb. y H.
Wendl.) H. Wendl. ex Becc., y los "corchales" de Annona glabra L. De la misma manera,
en lugares donde hay pequeños desniveles se forman las "rejolladas" (n. f. Americanismo.
Depresión notablemente circular y muy fértil, resultado del derrumbe, siglos o milenios
atrás, de la bóveda de un cenote, en cuyo subsuelo permanece el agua de manera
subterránea; Montipedia, 2005), en los puntos más bajos del relieve. Por último, se
21
CAPÍTULO I
encuentran las llamadas sabanas, por su contribución a la diversidad de especies de la
provincia. En el sureste de Quintana Roo se encuentra la llamada Sabana del Jaguactal,
una sabana muy húmeda, establecida sobre suelos orgánicos ácidos donde hay
comunidades de Pinus caribaea Morelet (Flores y Espejel, 1994). Existe un fenómeno
muy distintivo de la PYM, el cual está estrechamente asociado al drenaje cárstico típico
del área, y es la formación de "cenotes". Estos son lugares donde el techo de una gruta o
caverna subterránea se ha desplomado, exponiendo una lámina de agua permanente del
drenaje subterráneo. Debido a la permanente humedad que les está asociada, los
alrededores y las paredes de estas oquedades, suelen estar habitadas por comunidades
diferentes de la matriz de vegetación circundante (usualmente más seca). Asimismo,
enclaves de vegetación húmeda más permanente, además de los cenotes, tales como los
petenes y las aguadas, también constituyen los hábitats de muchas especies que en la
región sólo crecen en estos ambientes. Por ello, todos estos tipos de vegetación, aun
cuando
ocupan
áreas
relativamente
restringidas
de
la
península,
contribuyen
substancialmente a la riqueza de especies de esta. Es además importante destacar que,
en cuanto a la conservación de esta provincia, la península enfrenta serios problemas de
deforestación. González-Iturbe et al. (1999) estimaron que el estado de Yucatán se ha
transformado cerca del 70% de la vegetación original en áreas de cultivo y vegetación
secundaria, en tanto que en los estados de Campeche y Quintana Roo se ha
transformado en vegetación secundaria aproximadamente el 50% de sus selvas. Datos de
CONAFOR del 1993 al 2002 indican que los estados de Campeche y Yucatán tuvieron
pérdidas de cobertura forestal de 30,968 y 23,007 ha/año respectivamente (CéspedesFlores y Moreno-Sánchez, 2010). Sin embargo, estas estimaciones no contemplan la
transformación de grandes extensiones de selva en el sur del estado de Quintana Roo en
cañaverales (observaciones personales, 2014).
La PYM resulta ser un área idónea para abordar la distribución y la diversidad
genética de la vainilla. En esta región existen condiciones ecológicas y fisiográficas
particulares que han permitido el desarrollo de cinco especies de Vanilla: V. insignis, V.
odorata, V. inodora, V. sp. nov. aff. V. phaeantha y V. planifolia, cuya presencia se ha
constatado en la península (obs. pers., Soto-Arenas, 2009; Carnevali et al., 2001) e,
incluso se ha observado que sus poblaciones pueden establecerse de manera simpátrica
(obs. pers.). Centrándose en V. planifolia, existen condiciones para su desarrollo en la
22
CAPÍTULO I
PYM, las cuales son contrastantes con las zonas de alta producción de vainilla en México,
y que tienen gran relevancia en términos de la conservación, el uso y el manejo de esta
especie.
Entre estas se destacan:
1) La existencia de individuos silvestres de Vanilla planifolia que no se han
contemplado en la distribución de la especie. Algunos de estos ni siquiera figuran
entre las colectas de herbarios y/o jardines botánicos.
2) El reciente establecimiento de plantaciones de vainilla, cuyo material vegetativo
proviene de poblaciones silvestres; particularmente por las comunidades locales
(e.g. la plantación Sr. Escárcega en Quintana Roo), desconociéndose el grado de
explotación.
3) La ausencia de un sistema de cultivo intensivo de vainilla, lo que sugiere una baja
extracción (ilegal) de plantas del medio natural. Estas condiciones podrían
asegurar niveles altos de variabilidad genética en las poblaciones silvestres y
tasas bajas de introgresión con los cultivares.
4) El buen estado de conservación de la vegetación de algunas zonas de la
península, lo que podría estar asegurando tasas altas de crecimiento de sus
poblaciones silvestres y, por consiguiente, niveles altos de variabilidad genética;
5) El desarrollo simpátrico de poblaciones de las otras especies de vainilla presentes
en la península (obs. pers.), lo que podría estar favoreciendo niveles altos de
hibridación que a su vez podrían ser usados en programas de mejoramiento
genético de esta especie (porcentaje de producción, tamaño de la vaina, calidad
en los aceites esenciales, entre otros).
Por otra parte, existe incertidumbre en la determinación de la especie cultivada. Dado el
parecido fenotípico de las especies que habitan la región, es posible que Vanilla planifolia
no sea la especie que esté siendo cultivada.
Con base en todo lo expuesto, se plantea evaluar el estado de conservación genético
de Vanilla planifolia silvestre en la Península de Yucatán. Para el primer acercamiento, se
23
CAPÍTULO I
evalúa la clasificación taxonómica del material vegetal de los individuos encontrados
mediante marcadores moleculares ISSR e ITS, para asegurar el análisis genético
exclusivo en V. planifolia. Posteriormente, mediante el análisis de la diversidad y
estructura genética de las poblaciones silvestres de V. planifolia, utilizando marcadores
microsatélites, se determina el número de poblaciones silvestres presentes en la región y
el nivel de variación presente en estas. Por último, se discuten los resultados genéticos
con base en la distribución de las poblaciones y la conservación y destrucción de su
hábitat. Bajo este contexto, se esperan niveles altos de estructura genética debido a la
distribución geográfica, a la hiperdispersión de los miembros de las poblaciones silvestres
de V. planifolia en la PYM y a bajos niveles de flujo génico entre estas. Además, se
espera encontrar niveles altos de diversidad genética comparados con los observados en
las plantaciones y a lo reportado en estudios previos, debido al buen estado de
conservación de algunas zonas de la PYM.
24
CAPÍTULO I
JUSTIFICACIÓN.
Con base en la información anteriormente vertida se reconoce que México es uno de los
países Mesoaméricanos de origen de Vanilla planifolia y el lugar donde se inició su
cultivo. Sin embargo, hoy día sólo es el 4º productor mundial, muy por debajo de los
productores líderes. Más preocupante aún es el vacío de información existente sobre el
estado de conservación actual de las poblaciones silvestres de esta especie, las cuales
representan un importante acervo genético que podría ser muy útil en el mejoramiento del
cultivo. Ante esta problemática, se deben abordar aspectos relevantes como la
determinación de poblaciones naturales de esta especie mediante análisis moleculares,
así como la evaluación de los niveles de diversidad genética y como ésta está distribuida
en las poblaciones silvestres presentes en las áreas de distribución natural de la especie,
como es el caso de la PYM. Abordar estos enfoques aportará conocimiento sobre el
estado de conservación genética de V. planifolia en su hábitat natural. Además, la
información generada permitirá diseñar planes efectivos de conservación y uso de las
poblaciones silvestres de V. planifolia que reduzcan su probabilidad de extinción local y
proponer planes de mejoramiento genético del cultivo. Su importancia es aún mayor si se
considera la acelerada pérdida de la biodiversidad en la PYM debida, principalmente, a la
destrucción y fragmentación del hábitat por actividades como el crecimiento de las
ciudades, la ganadería y la agricultura, las cuales han desplazado gran parte de la
vegetación original de esta parte de México.
25
CAPÍTULO I
HIPÓTESIS.
1. La distribución geográfica discontinua y el distanciamiento espacial entre las
poblaciones silvestres de Vanilla planifolia presentes en la PYM generan niveles
altos de estructura genética, aspecto que también se ve favorecido por bajos
niveles de flujo genético y procesos de aislamiento por distancia.
2. Considerando el buen estado de conservación de algunas zonas de la PYM en
donde se desarrolla Vanilla planifolia, sus poblaciones silvestres presentan niveles
de diversidad genética altos comparados con los reportados en cultivares en
estudios previos.
26
CAPÍTULO I
OBJETIVO GENERAL.
Analizar el estado de conservación genético de las poblaciones silvestres de Vanilla
planifolia presentes en la Península de Yucatán, México.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS.
1) Evaluar la capacidad de los marcadores ISSR para discriminar entre individuos
silvestres de Vanilla planifolia y los que pertenecen a otras especies de Vanilla
presentes en la PYM.
2) Contrastar los resultados de los ISSR con los obtenidos de un análisis
filogenético realizado con ITS.
3) Determinar el número de poblaciones silvestres genéticamente diferentes
presentes en la PYM.
4) Determinar la estructura y diversidad genética de Vanilla planifolia silvestre de la
PYM.
5) Discutir las implicaciones en el estado de conservación genética de Vanilla
planifolia en el contexto de la distribución de sus poblaciones silvestres presentes
en la PYM.
27
CAPÍTULO II
CAPÍTULO II
WILD Vanilla planifolia AND ITS RELATIVES IN THE MEXICAN YUCATAN
PENINSULA: SYSTEMATIC ANALYSES WITH ISSR AND ITS.
Vanilla planifolia SILVESTRE Y SUS PARIENTES EN LA PENÍNSULA DE YUCATÁN,
MÉXICO: ANÁLISIS SISTEMÁTICOS CON ISSR E ITS.
Sara
Villanueva-Viramontes1,
Fernández-Concha
1, 3, 4
Mariana
Hernández-Apolinar2,
Germán
Carnevali
, Alfredo Dorantes-Euán , Gabriel R. Dzib , Jaime Martínez1
1
Castillo1, *.
1
2
Centro de Investigación Científica de Yucatán, A. C. (CICY). Mérida, Yucatán, México.
Departamento de Ecología y Recursos Naturales, Facultad de Ciencias, UNAM. Cd.
México, México.
Herbario CICY, Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C. Mérida, Yucatán,
México.
3
Orchid Herbarium of Oakes Ames, Harvard University Herbaria, 22 Divinity Avenue,
Cambridge, Massachusetts 02138, U.S.A.
4
*
Corresponding author: [email protected]
Este es un artículo publicado en Botanical Sciences.
Vol 95, No 2 (2017). 169-187.
2.1 INTRODUCTION.
The genus Vanilla Mill. is composed of possibly more than 150 species. In 1954 Portères
reported 110 distinct taxa but much more have been described since (e.g., Soto-Arenas &
Dressler, 2010), and several more still await formal taxonomic recognition. The genus
features a Pantropical distribution and it probably originated in America (Bouetard et al.,
28
CAPÍTULO II
2010; Ramírez et al., 2007; Cameron, 2000). Vanilla taxonomy has hampered by several
factors, including the following:

The difficulty of finding and collecting individuals with fertile structures in the field as a
result of the ephemeral, gregarious flowering that usually happens high in the canopy of
the forests (Soto-Arenas & Dressler, 2010; Schlüter, 2002).

Flowers, which are fundamental for identification of species, are poorly preserved in
herbaria. Usually, herbarium species are sterile or include a single flower, often poorly
preserved and irretrievably flattened (or altogether glued to the herbarium sheet) flower.

The rarity or inaccessibility of many of the species.

The fact that many species are vegetatively indistinguishable.

The enormous vegetative variation and phenotypic plasticity associated with the
hemiepiphyte growth habit including leaves of different morphologies and sizes in the
same individual as a response to age, vegetative development, and light exposure
(Ray, 1990; Putz & Holbrook, 1986).
Vanilla planifolia Andrews has great economic importance, being the source of
approximately 95% of the world’s vanilla extract production (Lubinsky et al., 2008a). The
vanilla is the second-most important spice in gastronomy and the cosmetic industry and is
one of the most popular flavorings (Álvarez et al., 2013; Cid-Pérez & López-Malo, 2011).
Vanilla cultivation typically features vegetative propagation and hand-pollination, which
ensures fruit production, albeit seeds are never harvested, and plants are never raised
from seeds. Vegetative reproduction, plus the lack of new genotypes incorporated via
seed, have in combination drastically reduced genetic variation in vanilla plantations
(Minoo et al., 2008; Soto Arenas, 1999; Smith et al., 1992). Because of this, FAO (1995)
lists cultivated V. planifolia as species with a high degree of genetic erosion. Furthermore,
wild populations of V. planifolia have been severely damaged by natural habitat
destruction and illegal extraction for replenishment of commercial plantations, nearly
driving the species to the brink of extinction, at least locally (Menchaca, 2010; Soto-Arenas
& Solano-Gómez, 2007; Soto-Arenas, 2006). Due to this, V. planifolia has a “special
29
CAPÍTULO II
protection” status (SEMARNAT, 2010) in Mexico. As a member of the Orchidaceae, it is
included in Appendix 2 of CITES (CITES, 2017).
Vanilla planifolia is reported as native from southeastern of Mexico, Guatemala,
Belize, and Costa Rica. However, a clear picture of its distribution is still uncertain (SotoArenas, 1999) because relatively few wild individuals have apparently been collected
(fewer than 30 individuals, according to Schlüter et al., 2007 and Soto-Arenas, 2006).
There are also several vegetatively similar species. To make matters worse, flowers in the
herbaria are difficult to reconstruct; thus, a significant portion of specimens are probably
misidentified as V. planifolia in many herbaria (Soto-Arenas & Dressler, 2010; SotoArenas, 2009). These errors of identification have also been reported in vanilla plantations
in Mexico, as we have been able to corroborate in the Mexican states of Quintana Roo
(Villanueva-Viramontes, pers. obs.), and Oaxaca (M. Hernández-Apolinar, pers. obs.). The
literature also reports this from other countries, such as Ecuador and Guatemala (SotoArenas & Dressler, 2010). Some of these plantations include, along with true V. planifolia,
individuals of species such as V. insignis Ames, V. cribbiana Soto Arenas, V. odorata C.
Presl., V. pompona Schiede, and V. sp. nov. aff. V. phaeantha (Soto-Arenas & Dressler,
2010).
In the Mexican Yucatan Peninsula (MYP), wild individuals of V. planifolia have
been collected, but only a few of them have been included in previous studies of this
species (Schlüter et al., 2007; Cibrián, 1999). Furthermore, at least four additional species
of the genus have been reported as growing actually or potentially sympatric with V.
planifolia in this region: Vanilla insignis, Vanilla odorata, Vanilla inodora Schiede, and
Vanilla sp. nov. aff. V. phaeantha (Soto-Arenas, 2009; Carnevali et al., 2001). This
sympatry complicates sampling of wild individuals of V. planifolia whenever fertile
structures are wanting.
During the last few decades, DNA markers have proven to be a powerful tool for
accurate taxonomic determination (Nagy et al., 2012). The ISSR (Inter Simple Sequence
Repeats; Zietkiewicz et al., 1994) is one of these markers. They are especially robust
because allow discriminating between individuals of genetically close species or between
varieties of the same species (Reyes-Alemán et al., 2013; Elmeer & Almaki, 2011;
Pharmawati et al., 2005). Also, the ISSR, compared with others molecular tools, generate
30
CAPÍTULO II
a high number of molecular markers with little effort; and is a relatively simple, costeffective technique (Bornet et al., 2002; Godwin et al., 1997). Verma et al. (2009) used 10
ISSR primers to assess the genetic relationships of seven species and two hybrids of
Vanilla: V. albida Blume, V. aphylla Eggers, V. andamanica Rolfe, V. planifolia, V. wightii
Lindl. ex Wight, V. parishii Rchb. f., V. walkeriae Wight, V. x tahitensis J.W. Moore and the
hybrid V. planifolia♀ V. wightii♂. They found low levels of variation among individuals of V.
planifolia, V. tahitensis and V. aphylla, suggesting close relationships whereas there was
also high affinity among V. planifolia and V. tahitensis, and between V. albida and V.
aphylla. Vanilla andamanica was only distantly related to the other species, possibly
reflecting a distant phylogenetic relationship. Ramos-Castella et al. (2016), using five of
the same ISSR primers of Verma in three species of Vanilla from Mexico, found a clear
differentiation between V. planifolia and the other three cultivated species from the wild (V.
pompona, V. insignis and V. aff. odorata).
On the other hand, the sequences of the ITS (Internal Transcribed Spacer) 1 and 2
of the region 18S - 26S ribosomal DNA, usually display a high variability that allows for the
broader molecular identification of organisms (Coleman, 2003). ITS have been used in
several molecular phylogenies of Vanilloideae (Soto-Arenas & Dressler, 2010; Poeaim et
al., 2011; Cameron, 2009), providing a rich source of variable characters at several
taxonomic levels, including species.
Wild populations of Vanilla planifolia are of utmost importance for the species’
conservation and its genetic improvement. As discussed earlier, the preservation of this
species (and of related taxa) is currently hindered by the difficulties associated with
identifying the species of Vanilla in the wild. Taking into account that ISSR molecular
markers are apparently easy to use and powerful in genetic discrimination, they may
provide accurate determinations of non-fertile, wild-collected individuals of Vanilla taxa, as
well as of V. planifolia populations and varieties. Thus, the objectives of this study were the
following:
1. To assess the power of ISSR markers to discriminate between wild individuals of V.
planifolia and those belonging to other species growing naturally in the Mexican
Yucatan Peninsula.
31
CAPÍTULO II
2. Contrast the results with those of a phylogenetic analysis of Vanilla ITS sequences.
2.2 METHODS.
2.2.1 Plant material. Leaves of 88 wild specimens of Vanilla spp. from the MYP were
considered in this study (Table 2.1). These samples were deemed wild because they were
collected in natural settings without evidence of human management. Hereafter, these
samples will be referred to as MYP, followed by an identifying consecutive numbering plus
a key to the region where they were collected (Table 2.1). Of all specimens studied, only
two of them were found fertile and positively confirmed as V. planifolia (“MYP1-CY” and
“MYP2-CY”, both from the same population) (Fig. 2.1-A). The other specimens were
infertile and only leaves were collected from them. However, we could observe
morphological differences in leaf and stem in some of these samples. The detailed
information about the collecting sites of the samples is not provided for protection reasons.
Sterile vouchers were collected by location and deposited in the herbarium of CICY.
In the ISSR analysis, we included 11 cultivated individuals as controls (standard
samples) (Table 2.1). These individuals belong to the four species of Vanilla reported for
the MYP and distributed as follows:
1. Three individuals of Vanilla planifolia, originating from Puebla and Veracruz [“varieties”
“Mansa” (M), “Variegata” (V) and “Oreja de Burro” (OB)].
2. Two individuals of Vanilla insignis [one from Puebla (P), another from CICY’s Jardín
Botánico Regional Roger Orellana (JBR-RO) – Fig. 2.1-B].
3. A single individual of de Vanilla odorata from Veracruz (Fig. 2.1-C).
4. Four individuals of Vanilla sp. nov. aff. V. phaeantha grown at the JBR-RO (Fig. 2.1D). These have locality data and have been documented in bloom. This taxon still
awaits formal description.
Also, a single individual of Vanilla pompona originally from the state of Puebla (Fig. 2.1-E),
a species that could potentially occur in the MYP.
32
CAPÍTULO II
Table 2.1. Geographical origin and description of the control samples and wild
specimens of Vanilla collected in the MYP.
Species
V. planifolia
var. Mansa
var. Variegata
var. Oreja de
Burro
Code
Number of
samples
M
V
1
1
OB
1
1
1
V. pompona
V. odorata
V. insignis
V. sp. nov. aff. V.
phaeantha
V. spp.
2
4
MYP
88
Origin
Taxonomic
characteristics
Puebla; MH
Puebla; MH
Veracruz; MH
Soto-Arenas, 2009
Puebla; MH
Veracruz; C-AR
Puebla; MH /JBR*;
GC
CY- JBR; GC
CY, CQ, SQ, SC y
SET;
SV
No taxonomic
determination
Note: JBR: Jardín Botánico Regional Roger Orellana. MPY: Mexican Yucatan Peninsula.
Regions: CY: Center of Yucatan; CQ: Center of Quintana Roo; SQ: Southern Quintana
Roo; SC: South Campeche; and SET: Southeastern Tabasco. *: Unknown origin. MH:
Mariana Hernández Collection. SV: Sara Villanueva Collection. GC: Germán Carnevali
Collection. AR: Alma Ramos Collection.
33
CAPÍTULO II
Figure 2.1. Flowers and vegetative structures of the Vanilla species reported for the
Yucatan Peninsula and used in the analysis with ISSR molecular markers. A  V. planifolia
wild (both photographs by Sara Villanueva [SV]). B  V. insignis (flower photography by
Leon Ibarra González, and leaves photography by SV). C  V. odorata (flower
photography by Manfred Speckmaier, and leaves photography by SV). D  V. sp. nov. aff.
V. phaeantha (both photographs by SV). E  V. pompona (both photos by Verónica
Borbolla).
34
CAPÍTULO II
2.2.2 DNA extraction and ISSR technique. Total genomic DNA was extracted from fresh
leaves following a modification of Dellaporta et al. (1983) procedure, which involved a
single protein washout using phenol:chloroform:isoamylic. DNA was quantified with an ND1000 spectrophotometer (Nanodrop, USA) and its quality assessed by 0.8% agarose gel
electrophoresis (Sambrook et al., 1989) and by PCR amplification of the 18S constitutive
gene.
Three of the 10 ISSR primers specifically designed for Vanilla by Verma et al.
(2009) were employed in this study: C07, C09 y T06. Amplifications were performed in a
total volume of 20 µl, including 20 ng/µl of DNA, 200 mM of dNTPs (Invitrogen), 1.5 mM
MgCl2, 60 pg. of primer, 2.5 µl buffer 10x of Taq DNA polymerase, and 1.5 U Taq DNA
polymerase (Invitrogen). Amplification conditions were as follows: an initial step of 5
minutes at 94°C, followed by 35 cycles, each consisting of 30 seconds at 94°C for
denaturing, 90 seconds at 50-54°C (depending upon primer used) for aligning and 90
seconds at 72°C for elongation, and 5 minutes at 72°C for final extension. Amplifications
were performed at least twice and only reproducible products (bands) were considered for
data analyses. Amplified PCR products were screened by agarose gel electrophoresis with
1.5% buffer TBE 0.5X (pH 8.3) and finally stained with ethidium bromide (Sambrook et al.,
1989). Resulting gels were photographed and visually read with a 1 kb molecular marker
as a reference for fragment length assessment.
2.2.3 Genetic relationships based on cluster analysis of the ISSR. Both monomorphic
and polymorphic bands considered for analyses and only well-defined bands (color
intensity and reproducibility) were included. The basic assumption was that bands of
identical molecular weight regardless of whether belonging to individuals of the same or
different population/species, represented the same allele. We compiled a database for
each primer, recording the presence/absence of particular bands as 1or 0, respectively.
We performed a clustering analysis of both the standard samples as well as the
MPY samples. Three different approaches followed for analyses:
1)
An assignment test of individuals using a Bayesian approach implemented in
Structure 2.3.1 (Pritchard et al., 2000). Because individuals included in the
analyses were referable to several species, the program was run under the no-
35
CAPÍTULO II
admixture model. This model assumes that all of the genetic material of a
particular individual comes from a single genetic pool (i.e. that no individual is
hybrid). Based on this, we used the sampling location as LOCPRIOR in all
analyses performed (Tucker et al. 2012). The program ran under the following
specifications: independent allelic frequencies, burn-in a period of 100,000, and
200,000 iterations after this period to allow the Markov chain reach stationarity.
Because there are at least four different Vanilla species reported for the MYP (see
above), the analysis tested several values of K (K= 4 through K=10). The most
likely K value (K
optimal1)
was estimated according to Evanno et al. (2005)
implemented in Structure-Harvester program (Earl & vonHoldt, 2012). Graphics
output from Structure was edited in Microsoft PowerPoint 2013.
2)
A Neighbor-Joining analysis (Saitou & Nei, 1987) to generate similarity clusters
with Jaccard’s Similarity Index (Jaccard, 1908). A frequency tree (Hampl et al.,
2001) was constructed with the program FreeTree 0.9.1.50 (Pavlícek et al., 1999),
with a bootstrap resampling of 1000 iterations. The output trees visualized in
FigTree versión 1.4.2 (Rambaut, 2006-2014).
3)
A Principal Coordinates Analysis (PCoA), which allows for the recognition of
spatial clustering of genotypes, without altering data and only inputting the genetic
similarity matrix. This analysis conducted in GenAlEx 6.2 (Genetic Analysis in
Excel) (Peakall & Smouse, 2006). The two-dimensional PCoA graphic constructed
with the Gnuplot 3.7 freeware <http://www.gnuplot.info/>.
2.2.4 Phylogenetic inference based on ITS. With the goal of obtaining an independent
corroboration of the clustering patterns emerging from the ISSR analyses, we performed a
phylogenetic analysis of the nuclear ITS (ITS 1 and 2) region. This study included all the
individuals considered in the ISSR analysis and relevant outgroups (see below),
representing both tribes (Pogonieae and Vanilleae) of Subfamily Vanilloideae (Chase et
al., 2015).
36
CAPÍTULO II
Taxon sampling, consisting of 121 terminals putatively representing 25 species, was
devised to test the following three hypotheses:
a) Vanilla is monophyletic.
b) The Vanilla’s Afro-Caribbean Clade (Cameron, 1999) is monophyletic and sister to
the rest of the genus.
c) That all individuals tentatively referred to V. planifolia (on morphological grounds or
ISSR data) fall in a clade.
To polarize phylogenetically informative character states, a species of the distantly related
genus Cleistes Rich. ex Lindl. (tribe Pogonieae), Cleistes paranaensis Schltr. was
employed a functional outgroup. This taxon was identified as basal in a recent
phylogenetic analysis of the genus (Pansarin et al., 2008). The outgroup of the
phylogenetic analysis consisted of the following taxa (Table 2.2):
1) Two species of Cleistes (Tribe Pogonieae): C. uliginosa Pabst and C. pusilla
Pansarin.
2) Three species of Epistephium Kunth: E. lucidum Cogn., E. subrepens Hoehne, and
E. parviflorum Lindl.
3) The single species of Clematepistephium N. Hallé: C. smilacifolium (Rchb. f.) N.
Hallé.
The ingroup of the analysis consisted of several different Vanilla species, representing
both morphological variation and geographical distribution of the genus, although
Neotropical taxa thought to be related to V. planifolia constitute the bulk of the sample.
Species included are:
1) Five members of the Afro-Caribbean clade of Vanilla: V. roscheri Rchb. f., V.
africana Lindl., V. siamensis Rolfe ex Downie, V. imperialis Kraenzl. and V.
barbellata Rchb. f.
2) Two taxa occurring in Asia: V. shenzhenica Z.J. Liu & X. Qi Chen and V. aphylla.
37
CAPÍTULO II
3) Nine Neotropical taxa occurring in the continental mainland: V. sp. (Venezuela), V.
grandiflora Lindl. (Panama), V. dressleri Soto Arenas (Panama), V. cribbiana Soto
Arenas (Panama), V. planifolia (Puebla-Veracruz; and Genbank’s clone 19), V.
pompona (Puebla; Genbank’s clone 8), V. odorata, V. insignis, V. sp. nov. aff. V.
phaeantha.
4) The hybrid Vanilla x hirsuta M.A. Clem. & D.L. Jones (V. odorata × V. planifolia).
5) All the wild-collected Vanilla individuals also analyzed in the ISSR study.
The ITS region was amplified following Poeaim et al. (2011), and using primers ITS1 and
ITS4 (White et al., 1990). Amplification reactions performed in 30 µl containing 50 ng/µl of
DNA, 1.25 nm of dNTPs, 3 mM of MgCl2, 20 pmol of each primer, 1.5 U Taq polymerase,
and the buffer provided by the manufacturer (Qiagen). The PCR protocol was as follows:
an initial denaturalizing at 95°C for 5 minutes, followed by a sequence of 30 cycles
consisting each of 1.5 minutes of denaturalizing at 94°C, 2 minutes of annealing at 55°C,
and 1 minute of extension at 72°C, ending in a 10-minute final extension period at 72°C.
PCR products amplified were screened and evaluated in an agarose gel stained with
ethidium bromide, using a molecular weight marker of 100 pb. PCR products were later
sent for sequencing at Macrogen (http://www.macrogen.com).
DNA sequences were edited with Sequencher 5.3 <http://www.genecodes.com>
(accessed:14, 2015). Alignments were performed with Muscle (Edgar, 2004) with the
default parameters as available at the CIPRES Science Gateway (Miller et al., 2010).
Afterward, the resulting alignment was visually refined in BioEdit v. 5.0.6 (Hall, 2001).
Average sequence length was 746 bp. To select the model of nucleotidic substitution that
best fit the data, jModelTest2 (Darriba et al., 2012; Guindon & Gascuel, 2003) was
employed. The model selected was GTR + G.
38
CAPÍTULO II
Table 2.2 GenBank specimens used as outgroups in the analysis of ITS.
Accession
Species
EU498152.1
C. paranaensis
EU498153.1
C. pusilla
EU498158.1
C. uliginosa
FJ425836.1
E. lucidum
FJ425837.1
E. subrepens
FJ425828.1
E. parviflorum
FJ425838.1
C. smilacifolium
FJ425835.1
V. barbellata
FJ425830.1
V. imperialis
FJ425834.1
V. africana
FJ425840.1
V. roscheri
GQ867246.1
V, planifolia - clone 19
GQ867237.1
V. pompona – clone 8
AF151006.1
V. aphylla
JF825978.1
V. siamensis
JF796930.1
V. shenzhenica
AF391785.1
V. hirsuta
C-GC
V. grandiflora
C-GC
V. dressleri
C-GC
V. cribbiana
Reference
Pansarin et al., 2008
Cameron, 2009
Belanger y Havkin-Frenkel, 2011
Cameron y Chase,1999
Li et al., 2011
Clements et al., 2002
Panamá; Germán Carnevali
Collection, 2016.
Note: C-GC: Germán Carnevali Collection.
Nucleotide sequence data of the ITS region used for phylogenetic inference were analyzed
under three different paradigms: Bayesian Inference, Maximum Likelihood, and Maximum
Parsimony. The first two were implemented through at the CIPRES Science Gateway
(Miller et al., 2010). Conditions for each analysis were as described below:
1. Bayesian inference (Yang & Rannala, 1997): This analysis was conducted in
MrBayes 3.2.6 (Ronquist et al., 2012). Two independent threads of four chains each
39
CAPÍTULO II
were run with MCMC chain length of 50.000,000 generations. Parameters and
convergence of trees were assessed with Tracer v.1.6 (Rambaut et al., 2014).
2. Maximum likelihood: Implemented in RAxML 8 (Stamatakis, 2014). The support for
nodes were assessed with 1,000 bootstrap iterations.
3. Maximum Parsimony: The shortest trees were estimated with NONA (Goloboff,
1999) through the Winclada 1.00.08 shell (Nixon, 1999-2002). 1,000 iterations of the
Parsimony Ratchet (Vos, 2003; Nixon, 1999) algorithm were run. Characters were
coded as unordered and of uniform weight (Fitch parsimony); gaps coded as missing
characters. Support for clades was assessed with 1,000 iterations of a Jackknife
analysis (Felsenstein, 2004).
The primary objective of the three analyses was the qualitative assessment of the
degree of congruence between the topologies yielded by them. Consensus trees were
visualized in FigTree and edited with Paint of Microsoft Windows version 1511 to include
clade support values 80% or higher of posterior probabilities, parametric bootstrap, and
Jackknife.
2.3 RESULTS.
This section will present the results of the ISSR analyses first and then the phylogenetic
ITS analysis, along with a description of their congruence or lack thereof.
2.3.1 Genetic relationships based on cluster analysis of the ISSR. 84 loci amplified
with the three ISSR primers. Evanno’s method estimated a K = 5, which correlate with the
following color-coded aggregations (Fig. 2.2-A):
1. “YELLOW”: This group aggregated some of the standard samples of Vanilla
planifolia (the "Mansa” and “Variegata” cultivars) along with 31 wild-collected
specimens from the MYP (including the MYP1-CY y MYP2-CY specimens identified
as V. planifolia using floral structures). These individuals share characteristics in
leaf morphology (elliptic-obtuse in shape) and smooth stem-like V. planifolia. Within
this group, the individuals MYP24-SQ and MYP80-CQ presented some degree of
“green” ancestry (75% and 62% respectively).
40
CAPÍTULO II
2. “GREEN”: This group aggregated the standard sample of Vanilla planifolia var.”
Oreja de Burro” along with 23 additional wild specimens from the MYP. This group
has the same leaf morphological characteristics of the “yellow” group.
3.
“RED”: This color signaled the standard samples of Vanilla odorata, V. insignis,
and V. pompona, along with 14 wild-collected individuals. Within this group
differences in leaf (falcate-lanceolate, linear, and elliptic) and stem (rough, thick,
smooth, thin) morphology were found.
4. “BLUE”: This color category characterized the JBR-RO cultivated specimens of
Vanilla sp. nov. aff. V. phaeantha (originally from central Yucatan) and an
additional seven wild individuals. All member of this group share characteristics in
leaf shape (linear) and stem surface(rough-thick) morphology.
5. “FUCHSIA”: This group consisted of 13 wild specimens. These specimens have a
morphology similar to individuals assigned to V. planifolia.
According to Meirmans (2015), considering different values of K may reflect different
genetic and demographic processes and thus ensure a better biological interpretation of
the data. In this study, we found that the second-highest K value was 7 (Figure 2.2-B):
1.
“BLUE”: In this group, the yellow and fuchsia previous color categories (K = 5;
Figure 2.2-A) were aggregated, including the standard samples of the “Mansa” and
“Variegata” cultivars of V. planifolia.
2.
“OCHRE”: This group is practically equal that former green group (K = 5; Figure
2.2-A) including standard sample of variety “Oreja de Burro” of V. planifolia. Within
this group appear the wild individuals MYP24-SQ and MYP80-CQ, which have a
higher degree “ochre” ancestry (45% and 30% respectively).
3.
“AQUA”: This color signaled the standard sample of V. odorata with five wildcollected individuals. Three of these (MYP82-SC, MYP83-SC, and MYP84-SC)
individuals present different degree of “green” and “yellow” ancestry (i.e. admixed
individuals). All these individuals were present in the former red group (K = 5;
Figure 2.2-A).
41
CAPÍTULO II
4.
“YELLOW”: This color category is composed by V. insignis specimens and two
wild-collected individuals. These individuals also were grouped in the former red
category (K= 5; Figure 2A).
5.
“RED”: This group consisted of the standard sample of V. pompona and seven wild
specimens. In the same way, these individuals are grouped into the former red
category (K = 5; Figure 2.2-A).
6.
“FUCHSIA”: This group is maintained as in the K = 5 (the old blue group).
7.
“GREEN”: An unknown wild genotype that composes part of the ancestry of three
individuals, namely MYP82-SC, MYP83-SC, and MYP84-SC (i.e. admixed
individuals). These individuals were assigned to the “aqua” group according to their
high ancestry coefficient derived from this group.
The Neighbor-Joining analysis aggregated the genotypes analyzed in two (A and B) highly
supported (100% bootstrap) major clusters (Figure 2.3), within which several subgroups
were retrieved; these are color coded according to with the observed in the Structure
analysis (Figure 2.2-A):
1. The A cluster aggregated all the standard samples of Vanilla planifolia and 67 wild
MYP specimens. Three subclusters contained: A1 (13 individuals), A2 (13
individuals, including MYP2-CY, identified as V. planifolia), and A3 (41 wild
individuals along with the standard samples of the three varieties of V. planifolia,
and the MYP1-CY, also identified as V. planifolia using floral material).
2. The B cluster consisted of the remaining standard samples and further wild MYP
specimens. Two highly supported subclusters were included: B1 (86% support by
the bootstrap) this subcluster contained the standard samples of V. odorata, V.
pompona, and V. insignis, along with 14 wild specimens. B2 (99% bootstrap)
included the JBR individuals of V. sp. nov. aff. V. phaeantha and seven wild MYP
samples.
42
CAPÍTULO II
Figure 2.2. Assignment test of 88 wild individuals of Vanilla spp. collected in the Mexican Yucatan Peninsula and 11 standard
samples of Vanilla, using ISSR markers with Structure. A) Kóptima = 5. B) Kóptima = 7.
43
CAPÍTULO II
Figure 2.3. Neighbor-Joining dendrogram based on Jaccard similarity index (Jaccard,
1908) of 88 wild individuals of the Mexican Yucatan Peninsula and 11 standard samples
of Vanilla, using ISSR markers. The color in the branches is according to Fig. 2.2-A.
44
CAPÍTULO II
The PCoA analysis identified four principal clusters (Figure 2.4). Also, color coded is
according to Figure 2.2-A. These clusters were mostly “pure-colored”; except an assortedcolor (yellow/fuchsia) cluster. The YELLOW/FUCHSIA group included the “Mansa” and
“Variegata” cultivars of Vanilla planifolia and 44 wild-collected MYP specimens, the MYP1CY and MYP2-CY among them. The GREEN group comprised the standard samples of V.
planifolia var. “Oreja de Burro” and 23 wild MYP individuals. The BLUE group contained
the standard samples of V. sp. nov. aff. V. phaeantha and seven wild MYP individuals.
Lastly, the RED group included V. pompona, V. odorata, and V. insignis with the remaining
(14) wild individuals. These groups feature morphological coherence, except for the red
group. The principal coordinates 1 and 2 explained 38.69% and 12.77% of total variation,
respectively.
In summary, the three clustering methods identify genetic relationships with
relatively congruent patterns where there are at least four genetic groups and Vanilla
planifolia isolated from the other species that occur wild in the MYP. It also identifies a
genetic group that appears to correlate with morphologically distinctive plants and that will
eventually be proposed as a new taxon (V. sp. nov. aff. V. phaeantha).
45
CAPÍTULO II
Figure 2.4. Principal Coordinates Analysis (PCoA) of 88 wild individuals of Vanilla in the Mexican Yucatan Peninsula and 11
standard samples of Vanilla, using ISSR markers. The color points are according to Fig. 2.2-A.
46
CAPÍTULO II
2.3.2 Phylogenetic inference of Vanilla based on ITS. Including gasp, the matrix
analyzed consisted of 1,018 sites with an average of 698 pb per taxon. We feature here
the the Bayesian inference majority (80%) consensus tree (Fig. 2.5). Including the
bootstrap values from the ML analysis and jackknife values exceeding 80% from the
parsimony analysis (589 informative sites [57.7%], L: 3775, CI: 35, RI: 54). Basal nodes
were fully resolved and strongly supported. However, there was not resolution within the
American Vanilla taxa, due to collapse/lack of support for several clades.
In our analyses, the most highly supported topology retrieves Vanilla as
monophyletic (1.0:87/88) and sister to Clematepistephium (1.0), being both members of
tribe Vanilleae, in congruence with previous analyses (e.g., Bouetard et al., 2010;
Cameron, 2009). The Afro-Caribbean clade, represented in this analysis by Vanilla
aphylla, V. shenzhenica, V. imperialis, V. siamensis, V. africana, V. roscheri, and V.
barbellata, is strongly supported (1.0:97/100). This clade is sister to the remainder of the
genus, composed in this study only of American species, hereafter referred to as the
American Clade (AC). The Afro-Caribbean clade includes West Indian taxa as well as
Paleotropical taxa, mainly from Africa and tropical Asia, some of which are aphyllous.
The AC resolved as a trichotomy in our analyses, including Vanilla bahiana in an
isolated position, along with a highly supported (p.p. 1.0) metaphyletic complex (i.e.,
monophyletic but lacking interal resolution) composed of V. grandiflora, V. pompona
(Puebla and clone 8) and several MYP wild, sterile genotypes most likely attributable to V.
pompona (1.0:93/95). This clade is vegetatively characterized by succulent plants with
large, massive leaves. It roughly corresponds with the “RED” group identified by the ISSR
analysis. It is noteworthy that V. pompona has not been reported from the MYP, and if
eventually confirmed by flowering material, it would constitute a first report for the area.
The third clade contains all the remaining species, represented by one or several
samples, in the analysis. Within the third clade, two sister groups are readily identifiable.
One of these clades is formed only by V. dressleri + V. cribbiana (DC-clade), composed of
tropical rainforest, shade-loving species with thinly textured leaves and narrow stems. The
DC-clade is sister to a poorly supported, metaphyletic group, consisting of four clades, one
lacking support, whereas the other three have posterior probabilities equal or smaller than
47
CAPÍTULO II
0.85. Each of these clades roughly corresponds to additional four species of Vanilla known
from the MYP. Similarly, these clades correspond with the color-coded groups recovered
by the ISSR analyses. They are described below:

The first, or BLUE-clade, includes all the samples positively identified as Vanilla
sp. nov. aff. V. phaeantha, along with six wild MYP individuals, which most likely
represent the same species. This clade includes a sample of a Venezuelan
species (Carnevali s.n, CICY), also closely related to V. phaeantha but differing
in floral details.

RED-clade A: This highly supported (1.0:98/97) clade aggregates the standard
sample of V. odorata, along with three wild MYP individuals (MYP76-CQ,
MYP75-CQ, and MYP74-CQ). The analysis retrieves V. hirsuta as sister to the
core of this clade. Vanilla hirsute is thought to be a hybrid of V. odorata and V.
planifolia. This relationship, however, is poorly supported.

RED-clade B. This clade contains the two standard samples of Vanilla insignis
and receives an intermediate to moderately high level of support (0.85: /95).

GREEN-YELLOW/FUCHSIA clade: This moderately supported (0.82) clade
includes individuals positively identified or presumed to be Vanilla planifolia.
Two subclades are retrieved, the first of which (green) includes the standard
samples of V. planifolia var. “Oreja de Burro” along with 24 wild MYP individuals.
Support is high at 0.96. The second subclade (yellow/fuchsia) contains the
standard samples of the “Mansa” and “Variegata” cultivars of V. planifolia. It also
includes 47 wild individuals, two of which are noteworthy (MYP1-CY, and MYP2CY) because these have been seen in bloom and positively identified as V.
planifolia.
48
CAPÍTULO II
Figure 2.5. Vanilliodeae phylogeny. Tree with the highest posterior probability resulting from the Bayesian
phylogenetic inference. ML bootstrap values to the left of the diagonal; Parsimony jackknife values to the right of the
diagonal; and posterior probability values above the branches. The phylogram in the lower left corner shows the length
of the branches. Trees were obtained from multiple sequence alignments of nucleotides of Vanilla species using ITS.
49
CAPÍTULO II
2.4 DISCUSSION.
There is currently a void in our knowledge of the genus Vanilla. This vacuum ranges from
basic biology including aspects of its systematics, phylogenetics, ecology and physiology
through more applied aspects such as the conservation status of its species (AzofeifaBolaños et al., 2014; Herrera-Cabrera et al., 2012; Gigant et al., 2011). At the most basic
level, the identity, distribution, and circumscription of Vanilla taxa constitute the
cornerstone to addressing problems related to the successful conservation and
sustainable exploitation of the species of the genus.
Recently, it has become apparent that DNA molecular markers are powerful to help
in the characterization of Vanilla species. These markers provide a tool from the
population to the species-level identification of individual plants (Nagy et al., 2012). This
characteristic is particularly useful in this genus where plants are most frequently collected
sterile, are intrinsically variable and phenotypically plastic according to growing conditions,
are difficult to the get established and flowered in cultivation, and many species are
vegetatively very similar or practically identical.
In Vanilla, only 47 of about 110 species recognized in the genus, have been
included in any molecular analysis, and most of them only in phylogenetic studies (SotoArenas & Dressler, 2010; Soto-Arenas & Cribb, 2010; Minoo et al., 2008; Soto-Arenas,
2003). A few studies have included purported Vanilla species (e.g. V. tahitensis; Besse et
al., 2004) that were later more correctly identified as hybrid taxa (e.g., Lubinsky et al.,
2008b). In other cases, these hybrids had proposed as new species only to be later more
correctly recognized as nothotaxa (e.g. V. hirsuta; Soto-Arenas & Dressler, 2010).
Molecular characterization for Vanilla species is particularly relevant for V.
planifolia, the most commonly cultivated taxon of the genus and upon which most of the
world’s commercial production of vanilla based (Bory et al., 2008a; Lubinsky et al., 2008a).
Furthermore, this characterization is very important because natural populations of this
species have become severely threatened due to illegal extraction of wild individuals for
introduction into plantations, both historically and recently (Soto-Arenas, 2006). Moreover,
destruction of natural habitats has recently become an even larger threat to the continued
50
CAPÍTULO II
wild survival of V. planifolia. This study is the first to employ molecular markers to
characterize a relatively large number of wild V. planifolia individuals, along with its
sympatric congeners in an area of its natural distribution, the MYP.
2.4.1 Clustering pattern of Vanilla species in the MYP. The several approximations
used in this study with ISSR markers retrieved largely congruent clustering patterns.
Vanilla planifolia and V. sp. nov. aff. V. phaeantha were clearly identified with the ISSR
markers. The standard samples of V. pompona, V. odorata, and V. insignis were closely
related to each other, probably because only a few individuals per species were tested.
Three individuals of V. odorata identified by vegetative morphological features (mainly the
narrow, falciform leaves), upon analyses, demonstrated to have a close genetic
relationship with the group constituted by V. pompona - V. insignis - V. odorata. These
individuals were included in the clade of V. odorata in the ITS phylogeny. The small
number of wild-collected individuals in the MYP referable to these species suggest they
are extremely rare in the area.
It is interesting to notice that the second highest delta K value obtained revealed a
K= 7. These seven genetically different groups of individuals are ascribable to (and contain
standard samples of) species previously known from the MYP (V. planifolia, V. insignis, V.
odorata, and V. sp. nov. aff. V. phaeantha). In the fifth group, a few wild MYP individuals
clustered together with the V. pompona standard sample, and if morphologically
confirmed, it would constitute the first record for this species that mainly known from the
western drainage of Megamexico. Vanilla planifolia var. “Oreja de Burro” was retrieved in
the sixth group. And finally, the seventh ancestral genotypic contribution (20-35%, “green”,
as a yet unidentified wild genotype) is present in three individuals (MYP82, MYP83, and
MYP84) from southern Campeche. These individuals include in their genetic makeup
about 50% V. odorata and a smaller genetic contribution from V. insignis. However, in the
PCoA, these individuals are not genetically close to V. odorata even though featuring an
ancestry coefficient exceeding 50%. Similarly, this K= 7 brings together two wild
individuals to V. insignis (MYP86-SC and MYP87-SC), which are placed by the PCoA
closest to V. pompona. Interestingly, although there is no clear evidence that V. pompona
occurs natively in the MYP (Soto-Arenas, 2009; Carnevali et al., 2001), seven MYP wild
individuals were identified as this species by the K=7 (Fig. 2.2-B). We identified these
51
CAPÍTULO II
sterile individuals as V. planifolia relying upon their vegetative structures. These two
species are vegetatively similar, especially when juvenile, but eventually, V. pompona
develops larger, heavier, much thicker leaves than those commonly found in V. planifolia
(Fig. 2.1-A and E). Floral features of course, readily diagnose both species.
Regarding Vanilla planifolia, the finding of three subgroups within this species is
probably attributable to the inclusion of a larger number of samples with a similar
vegetative morphology, and therefore a greater probability of identifying an increased
number of genotypes referable to the species and thus of detecting genetic or
phylogenetic structure within the species. It is known that both self-compatible and selfincompatible individuals occur in V. planifolia. The last type, includes the entity commonly
referred to as “Oreja de Burro” (Soto-Arenas, 2009). Although the literature describes
significate morphological features for the “Mansa” and the “Oreja de Burro” entities
(Castillo & Engleman, 1993), we were unable to identify wild MYP morphotypes
unambiguously referable to them. However, the standard sample “Oreja de Burro”
morphotype was retrieved widely apart from the standard samples of the “Mansa” and
“Variegata” morphotypes in the Structure and the PCoA analyses, thus suggesting
phylogenetic structure within V. planifolia.
A noteworthy finding from both the ISSR and the phylogenetic analyses was the
precise identification of a group of individuals morphologically referred to Vanilla sp. nov.
aff. V. phaeantha. This entity, albeit closely related to the West Indian V. phaeantha and
initially identified as such (Soto-arenas & Dressler, 2010) is easily differentiated by the
presence of several prominent, deep yellow rows of teeth emerging the labellum throat
and reaching the labellum margin, which is also slightly fimbriated (Figure 2.1-D). This new
taxon is in the process of being formally proposed.
Although the ISSR markers displayed high efficiency for the discrimination of
individuals as belonging to clades or genetic groups associated with standard samples of
species involved in the study, some individuals were difficult to assign. A preliminary
classification based on stem and leaf macro-morphology indicated that some wild
iindividuals possibly belong to Vanilla insignis but the genetic analysis indicates they are
best referred (or genetically closer) to V. sp. nov. aff. V. phaeantha, and secondly a cluster
of eight individuals similar to V. planifolia but genetically related to the group comprised by
52
CAPÍTULO II
V. pompona -V. odorata - V. insignis. These examples reveal how the comparison of
individuals at different stages of development can be misleading in this genus, where
plants are phenotypically plastic according to age and exposition, as previously pointed out
by Putz and Holbrook (1986) and Ray (1990).
2.4.2 Phylogenetic relationships of the Vanilla species in the MYP. The most probable
cladograms obtained in our phylogenetic inferences retrieved clades whose composition
was entirely coherent with patterns of aggregation identified in the ISSR analysis. An
example of this is the recovery of clades consisting Vanilla sp. nov. aff. V. phaeantha and
V. planifolia (Figs. 2.4 and 2.5). This finding reinforces the notion that ISSR markers are
robust as species-level discriminators of taxa, in this particular case in Vanilla.
Only a fraction of the species of the genus have been included in phylogenetic
inferences, and there has not been an exhaustive phylogenetic analysis of Vanilla to date
(Poeaim et al., 2011), the closest being the one by Soto-Arenas and Dressler (2010),
which included only 15 species-level taxa. Furthermore, novelties within the genus are still
being reported (e.g. V. rivasii Molineros, R. T. González, Flanagan & J. T. Otero,
Molineros-Hurtado et al., 2014; V. labellopapillata A.K. Koch, Fraga, J.U. Santos & Ilk.Borg., Koch et al., 2013; V. paludosa Pansarin, J.M. Aguiar & A. C. Ferreira, Pansarin et
al., 2012).
The resolution of the clades with different methods evaluated agrees with that
reported by Soto-Arenas and Dressler (2010), Cameron (2009), Pansarin et al. (2008),
Cameron and Molina (2006). It is important to note that Vanilla hirsuta is synonymous with
V. tahitensis J.W. Moore, which has a recent hybrid origin (V. planifolia x V. odorata; SotoArenas & Dressler, 2010). Therefore, its proximity to the individual genetic relationship of
the standard sample of V. odorata and wild individuals identified as belonging to this
species, is not surprising. Moreover, V. bahiana described in Brazil, appears to be very
similar, both morphologically and genetically, with V. phaeantha (Soto-Arenas, 2009).
However, in each of the methods evaluated in this study, this species showed a closer
relationship with V. pompona, which strengthens the hypothesis that V. sp. nov. aff. V.
phaeantha is a different species to V. phaeantha.
53
CAPÍTULO II
Except for V. planifolia “Oreja de Burro” (in the parsimonious analysis), all the
specimens referred by us to V. planifolia on morphological grounds constituted a
monophyletic assemblage. Flowers of this entity have yet to analyze by us to confidently
assess its relationships. Other individuals remained unidentified at this stage and placed at
intermediate positions. The phylogenetic analysis retrieved a clade consisting mainly of
specimens of V. planifolia. However, nested within it there were three individuals assigned
to the V. pompona-V. odorata-V. insignis group (red group in K= 5) by the STRUCTURE
analysis of the ISSR data. This same analysis (but with K= 7) grouped two of these
individuals with V. odorata (red group). The remaining genotype is possibly a complex
hybrid containing in its ancestry V. odorata (50% aqua of its genetic makeup), V. sp. (35%
green) and V. insignis (15% yellow), where the unknown taxon is likely to be a wild
genotype of V. planifolia. From this perspective, individuals were retrieved in intermediate
or conflicting positions could be interpreted either as belonging to additional Vanilla
especies. Yet to be formally identified (with floral material) in our area, or interspecific
hybrids.
Natural hybridization has long been known to be frequent in several groups of the
Orchidaceae (e.g., Adams & Anderson, 1958) including Vanilla (Lubinsky et al., 2006).
Examples include introgression of V. claviculata (W. Wright) Sw. with V. barbellata Rchb.f
in Puerto Rico (Nielsen, 2000; Nielsen & Siegismund, 1999). Also, AFLP and SSR
markers have suggested the possibility of interspecific hybrids between Neotropical
species of Vanilla such as V. bahiana, V. planifolia, or V. pompona (Bory et al., 2008b ;
Bory, 2007). So, interspecific hybridization may be common whenever closely related taxa
occur in sympatry (Bory et al., 2008b). Nevertheless, not all morphological variation (or
polymorphisms) within Vanilla species is to be attributable to interspecific hybridization. As
in other species, this variation could be due to genetic drift, disruptive selection, or even
directional selection resulting from an evolutionary response to local conditions (Ackerman
et al., 2011). Also, there is a component of this variation associated with phenotypic
plasticity arising from differences in life stages and different growth conditions (van
Kleunen & Fischer, 2005).
2.4.3 Implications for the conservation and sustainable use. Wild relatives of crops
constitute an imperative source of genes associated with the resistance to pests and
54
CAPÍTULO II
diseases or with higher yields under a variety of conditions (Fisher, 2012; Hunter &
Heywood, 2011; Hajjar & Hodgkin, 2007). They are also relevant as a source of nutrients,
medicine and other traditional uses for communities and for the maintenance ecosystemic
services (Hoyt, & Brown, 1992). However, before these wild relatives can be utilized in a
sustainable manner, it is first necessary to determine to which species belong.
In concordance with Verma et al. (2009), our study showed that the ISSR can be
used to identify Vanilla species presents in the MYP. We found higher levels of genetic
variation in wild samples than commonly found in vanilla plantations and that might be a
result of sexual reproduction and generation from seed, as indicated by the presence of
pods in some of the wild populations studied. This point is an indicative of the relevance of
these reservoirs of potentially important alleles for the improvement of V. planifolia as a
crop, and as such, they should be protected.
Thus, the MYP, where the species is still plentiful (yet occurring as small, widely
dispersed populations) should be considered of utmost importance for the conservation of
V. planifolia as a genetically healthy wild taxon, and as a source of alleles for its
improvement as a crop.
Acknowledgments.
The authors thank Biol. Veronica Limones Briones for their collaboration in lab work, and
Ana Maria Hernández Hernández and Carlos Fernando Regla Márquez in the edition of
graphics, and Verónica Borbolla, Manfred Speckmaier (Universität Wien, Core Facility
Botanischer Garten) and Leon Ibarra González (Research of the Brigada de Educación
para el Desarrollo Rural no. 3 (DGETA) and the Fundación Produce, A.C., Quintana Roo)
for the pictures of the vanillas. The first autor thanks the National Council for Science and
Technology (CONACYT) for the scholarship for postgraduate studies.
55
CAPÍTULO III
CAPÍTULO III
ESTRUCTURA Y DIVERSIDAD GENÉTICA DE Vanilla planifolia SILVESTRE EN LA
PENÍNSULA DE YUCATÁN, MÉXICO.
3.1 INTRODUCCIÓN.
Uno de los objetivos centrales para la conservación a largo plazo de las especies
amenazadas es asegurar la persistencia de su diversidad genética, al señalarse que altos
niveles de diversidad promueven una mayor capacidad de adaptación ante cambios
ambientales (Kahilainen et al., 2014). Dado que las especies amenazadas presentan
tamaños poblacionales reducidos, se ha convocado a que en la planificación de
estrategias de conservación se tomen en cuenta explícitamente a los procesos evolutivos
que afectan la diversidad genética de estas especies en alguno de sus niveles de análisis
(i.e. individual, entre e intrapoblacional) (Ponce-Reyes et al. 2014; Vasconcelos et al.,
2012; GEO BON, 2011; Laikre, 2010; Mace y Purvis, 2008). Sin embargo, este enfoque se
ha considerado en un número reducido de especies amenazadas, tal es el caso de
especies de interés económico (Sarukhán et al., 2009), domesticadas (Walpole et al.,
2009), comunidades forestales de edad avanzada (Hamrick et al., 2006), recursos
genéticos animales (Segura-Correa y Montes-Pérez, 2001) y Agave victoria-reginae
(Eguiarte et al., 1999).
Vanilla planifolia Andrews es una especie Neotropical, hemiepífita de la familia
Orchidaceae, uno de los grupos más grandes y antiguos de plantas con flores con una
edad evolutiva calculada entre 80 y 120 millones de años (Cameron, 2011), donde el
género Vanilla es el único grupo con plantas totalmente trepadoras (Carnevali, 2012;
Havkin-Frenkel et al., 2011). La distribución original de V. planifolia no se conoce con
precisión (Soto-Arenas, 2009); sin embargo, parece tener una distribución restringida al
sureste de México y Centro América (Kew, 2016; Soto-Arenas y Dressler, 2010; SotoArenas, 2009). En la naturaleza, esta especie presenta poblaciones hiperdispersas con
baja densidad de individuos (Soto-Arenas, 2009; 1999; Cibrián, 1999). V. planifolia
raramente es visitada por insectos (Soto-Arenas, 2009); no obstante, se han observado
abejas del género Euglossa visitar las flores y portar polen de esta especie (Hernández-
56
CAPÍTULO III
Apolinar obs. pers.). Cabe mencionar que no se conoce con certeza a los dispersores de
semilla de V. planifolia (Soto-Arenas et al., 2009).
Vanilla planifolia posee gran importancia económica a nivel internacional, ya que
de su cultivo se obtiene uno de los saborizantes más populares del mundo, la vainilla. De
esta especie se obtiene el 95% de las vainas de vainilla comercializadas en el mundo
(Lubinsky et al., 2008a). V. planifolia está amenazada de extinción local en su hábitat
natural por la destrucción del mismo y por la extracción excesiva de individuos para el
establecimiento de plantaciones (CITES, 2017; SEMARNAT, 2010; Soto-Arenas, 2009,
2006; Duval et al., 2006). Pese a este riesgo de extinción y a la importancia que podrían
significar sus poblaciones silvestres en el mejoramiento genético del cultivo, existe un
vacío de conocimiento sobre la biología y el estado conservación de esta orquídea en su
hábitat natural (Azofeifa-Bolaños et al., 2014; Herrera-Cabrera et al., 2012; Gigant et al.,
2011).
Muy pocos proyectos de conservación han considerado la importancia de conocer
la diversidad genética de las poblaciones silvestres de V. planifolia. Azofeifa-Bolaños et al.
(2014) realizaron una propuesta para la conservación de las especies de Vanilla (incluida
V. planifolia) presentes en Costa Rica. Esta propuesta contempló la colecta de
germoplasma silvestre, su caracterización mediante marcadores moleculares de ADN y la
generación de un sistema de producción de semillas para el establecimiento de un banco
de germoplasma. En México, centro de origen del cultivo de la vainilla (Soto-Arenas,
2009), se han llevado a cabo propuestas prácticas de conservación de sus cultivares; ya
sea: quimiotipos (Salazar-Rojas, et al., 2011) o germoplasma (explantes y esquejes;
Bello-Bello et al., 2015; García-Núñez, 2013). Asimismo, el Gobierno Federal estableció la
Red Vainilla (SINAREFI-SAGARPA) que tiene como fin rescatar y conservar el género
Vanilla en sus diferentes niveles: a) bancos de germoplasma, b) conservación in-vitro y c)
crioconservación (SAGARPA, 2012). Sin embargo, en estos esfuerzos de conservación
no se ha contemplado el estudio de la diversidad genética de la especie en su hábitat
natural, particularmente la de sus poblaciones silvestres.
En México se han colectado individuos silvestres de Vanilla planifolia en Oaxaca,
Tabasco, Chiapas, Campeche, Quintana Roo, Yucatán (Villanueva-Viramontes et al.,
2017; Soto-Arenas, 2009; Schlüter, 2007; 2002; Soto-Arenas, 2006; 1999; Cibrián, 1999)
57
CAPÍTULO III
y probablemente Veracruz (Soto-Arena, 2009). Se conoce que esta especie ha sido
ampliamente cultivada desde el Siglo XVIII en Veracruz, Puebla y San Luis Potosí
(Menchaca, 2009). Sin embargo, hoy en día se especula que las poblaciones silvestres de
V. planifolia de estos lugares han desaparecido, o bien, que las plantaciones de esta
especie en estos lugares provienen de otras regiones, como el sureste de México (SotoArenas, 2009; Lubinsky et al. 2008). Por otra parte, se ha señalado que el cultivar “Mansa”
actualmente se encuentra escapado y/o naturalizado en las áreas tropicales en donde se
ha llevado a cabo su cultivo (Soto-Arenas, 2009; Lubinsky et al., 2008a; Schlüter et al.,
2007), aspecto que obstaculiza el reconocimiento de ejemplares silvestres.
La Península de Yucatán, México (MYP), es uno de los hábitats naturales donde
aún se pueden encontrar individuos silvestres de Vanilla planifolia (Villanueva-Viramontes
et al., 2017; Soto-Arenas, 2009; Schlüter, 2007). En esta región aún existen grandes
extensiones forestales con buen estado de conservación (dentro de los ejidos) y Áreas
Naturales Protegidas (SEDUMA, 2012), lo que podría estar asegurando tasas altas de
crecimiento de las poblaciones silvestres de V. planifolia, y con ello, niveles altos de
variabilidad genética intrapoblacional. De acuerdo con Kahilainen et al. (2014), la
diversidad de especies dentro de una comunidad y la diversidad genética intrapoblacional
están positivamente correlacionadas, debido a las influencias paralelas de las
características ambientales (área, conectividad y heterogeneidad ambiental) en ambos
niveles de diversidad. En la MYP existen condiciones ambientales particulares, siendo un
centro de endemismo importante para muchas especies vegetales (Rzedowski, 1978) y
una de las regiones de México donde es posible encontrar mayor riqueza de especies
(Sánchez y Pérez-Hernández, 2005; Escalante et al., 1998). La correlación positiva entre
diversidad de especies de una comunidad y la diversidad genética intrapoblacional puede
proporcionar información útil para la conservación de las especies, al considerar las
diferencias de la composición entre las localidades, ya que los mecanismos que hay
detrás también pueden impulsar las correlaciones entre la diferenciación de la comunidad
y composiciones genéticas de las poblaciones silvestres (Kahilainen et al., 2014); en este
caso, las de V. planifolia.
Aunado a lo antes señalado, el desarrollo simpátrico de poblaciones de las otras
especies de vainilla presentes en la MYP como V. odorata C. Presl, V. insignis Ames, V.
58
CAPÍTULO III
sp. nov. aff. V. phaeantha (Sara Villanueva, obs. pers.), también podría estar favoreciendo
niveles altos de hibridación inter-específica y con ello, niveles de diversidad genética altos
en V. planifolia. Por último, la MYP presenta condiciones contrastantes con las zonas de
alta producción de vainilla en México, ya que no existe un manejo comercial intensivo de
vainilla, por lo que esta región tiene gran relevancia en términos de la conservación, el
uso y el manejo de esta especie.
En el contexto antes señalado, los objetivos de este trabajo fueron: 1) determinar
el patrón de agrupamiento genético de los individuos silvestres de V. planifolia colectados
en la MYP; 2) evaluar los niveles de diversidad genética de los grupos identificados
(poblaciones genéticas) y, 3) comparar la diversidad genética encontrada en V. planifolia
silvestre de la MYP con lo reportado en la literatura.
3.2 MATERIALES Y MÉTODOS.
3.2.1 Material vegetal y extracción de ADN. Un total de 89 individuos silvestres de
Vanilla planifolia fueron colectados en veintitrés sitios en la MYP (Cuadro 3.1, Figura 3.1).
Estos fueron considerados como silvestres (“W”) debido a la ausencia de evidencias de
manejo humano y por encontrarse en áreas de selva alejadas de comunidades humanas.
La colecta de material vegetal consistió en dos hojas por individuo (método no invasivo).
La mayoría de los individuos fueron colectados sin estructuras reproductivas que
permitieran su adecuada identificación taxonómica, por lo que su pertenencia a V.
planifolia fue avalada con información molecular (Villanueva-Viramontes et al., 2017). La
colecta se realizó entre 2013 y 2015. La ubicación exacta de los individuos colectados se
reserva por motivos de conservación. A cada individuo se le asignó una clave de
identificación, la cual hace referencia al número identificador del individuo, a la región
(norte: N; centro: C; y sur: S) y al sitio donde éste fue colectado (e.g. “W”1-N4, individuo
silvestre 1 de la región norte de la MYP del sitio 4, ver Figura 3.1). Siete individuos
cultivados pertenecientes a los cultivares “Mansa” (“M”), “Variegata” (“V”) y a la variedad
“Oreja de Burro” (“OB”), la cual se caracteriza por ser autoincompatible, fueron incluidos
en el análisis como grupo externo para polarizar los datos (Cuadro 3.1, Figura 3.1). Las
muestras de estos individuos se colectaron en Veracruz (sitio 1), Puebla (sitio 2) y Oaxaca
(sitio 3), ya que aparentemente estas regiones son diferentes genéticamente de la MYP
59
CAPÍTULO III
(Schlüter et al., 2007). La extracción y cuantificación de ADN se realizó de acuerdo a la
metodología descrita por Villanueva-Viramontes et al. (2017).
3.2.2 Técnicas de SSR. Se aplicaron 14 iniciadores de loci microsatélites (SSR, por sus
siglas en inglés) (Cuadro 3.2) que demostraron su utilidad en un estudio previo para
Vanilla (Bory et al., 2008c). Las condiciones para la amplificación por PCR se
establecieron de acuerdo a Bory et al. (2008c), usando un termociclador GeneAmp PCR
System
9700
(Ampplied
Biosystems).
La
electroforesis
se
realizó
en
geles
desnaturalizantes de poliacrilamida al 5%. Se utilizaron marcadores de peso molecular de
10 pb, 50 pb y 100 pb como referencia, dependiendo del tamaño del fragmento esperado.
La visualización de los productos amplificados se llevó a cabo con la técnica de tinción
con plata (Christensen et al., 1999). Las bandas de peso molecular idéntico se tomaron
como el mismo alelo, debido a que los alelos correspondientes a un locus marcan las
regiones cromosómicas homologas a las que se encuentran ligados (Rallo et al., 2002;
Katzir et al., 1996).
60
CAPÍTULO III
Cuadro 3.1. Origen geográfico y número de muestras por sitio de colecta de los
ejemplares de referencia y de los ejemplares silvestres de Vanilla planifolia.
Variedad
“M”
“OB”
“M”
“V”
“M”
“W”
“W”
“W”
Región
Sitio
Veracruz
1
Puebla
2
Oaxaca
3
3
1
1
1
1
MYP
4
5
6
7
31
3
1
9
Centro
8
9
10
11
12
1
1
1
6
4
Sur
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
1
3
2
1
1
4
1
5
2
4
2
2
4
Norte
Numero de muestras
“M”: var. “Mansa”; “V”: var. “Variegata”; “OB”: var. “Oreja de Burro”; “W”: silvestre.
61
CAPÍTULO III
Figura 3.1. Sitios de colecta de Vanilla planifolia. 1, 2 y 3 corresponden a los sitios donde se colectaron los ejemplares de
referencia (cultivados). 4 – 25 corresponden a los sitios donde se colectó material vegetal de ejemplares silvestres de V.
planifolia en la MYP.
62
F: TGGATGTGCATTTGTG;
R: CGCATTCATTCACTTGT
F: TATAGATGCACACGAGC;
R: TCACATCCCTACATGC
F: TTTGCTTGAACGTATGTC;
R: GCAAACATAGAAATGCAC
F: GCACATAAATACCTTACACC;
R: GTTCACGTCAGTGTGCT
F: AGTGTCTTTGTGTGCCT;
R: TAGATAGTAAACCCATACTCAC
F: TATGTGTGAGAGGGTGC;
R: CAATTAGTCACATCCATAAAC
F: AAGTGCCCAATCTATC;
R: TGGATTCACCATGAC
F: CAAAACACAAGGAAATGC;
R: TGCAAGCCCACAAGT
F: GTGTAGCGGTTCATACAA;
R: CATTCATGGAAGTGGAG
F: GCACATACATGCTTATTG;
R: CATGTTCTTATTTGAGTGG
F: AACATGCACAAGAAAG;
R: TTTATGCACCTTGTTAG
F: ATTTCCTCCCTCACTGTA;
R: AATCTCAGGTGCTATTGG
F: CATGCTTACATCTTTGTGTT;
R: TAATGGACATGCACACTC
F: CTATGTGCGCTTTGG;
R: CACTCAAGAACATGCAAC
mVplCIR002
(TG)7
(GT)6 Nx (TG)7
(TG)9
(CA)9
(CA)9
(TG)8
(CA)9
(TG)9
(TG)9
(TG)6 Nx (TG)7 Nx
(TG)6
(CA)7 Nx (CA)6 Nx
(CA)10
(TG)9
(CA)7
(TG)8
Motivo repetido
224
301
346
190
223
231
197
222
320
280
346
259
349
222
Tamaño /
clone (pb)
63–55
63–55
60–53
60–53
63–55
63–55
60–53
60–53
60–53
60–53
60–53
60–53
60–53
60–53
T / alineamiento
(8C)
EF486657
EF486656
EF486655
EF486654
EF486653
EF486652
EF486651
EF486650
EF486649
EF486648
EF486647
EF486646
EF486645
EF486644
Accesión /
GenBank
El motivo repetido y el tamaño en número de pares de bases se refieren a los alelos de los clones secuenciados. También se
dan la temperatura (T) de alineamiento para la PCR, y los números de acceso del GenBank. Tomado de Bory et al. (2008c).
mVplCIR050
mVplCIR047
mVplCIR031
mVplCIR028
mVplCIR026
mVplCIR025
mVplCIR022
mVplCIR019
mVplCIR016
mVplCIR015
mVplCIR010
mVplCIR005
mVplCIR003
Secuencias de los iniciadores (5’
– 3’)
Locus SSR
Cuadro 3.2. Secuencias de 14 loci de microsatélites en Vanilla (F para el cebador directo y R para el cebador inverso).
CAPÍTULO III
63
CAPÍTULO III
3.2.3 Análsis de datos.
3.2.3.1 Patrón de agrupamiento y estructura genética. Como paso inicial, se evaluó el
patrón de agrupamiento de los individuos mediante dos enfoques:
1) Una prueba de asignación de individuos mediante un enfoque bayesiano
implementado en Structure 2.3 (Pritchard et al., 2010), el cual asigna genotipos
individuales a un número predeterminado de poblaciones (K) que cumplen con los
requisitos en términos de Hardy-Weinberg y de equilibrio de ligamiento (MartínezCastillo et al., 2014). El programa se ejecutó bajo el modelo admixture (Pritchard et
al., 2000), el cual supone que cada individuo extrae alguna fracción de su genoma
de cada una de las poblaciones, asignándose probabilísticamente a una población
o conjuntamente a dos o más poblaciones si sus genotipos indican que se
mezclan (Martínez-Castillo et al., 2014). Utilizamos el sitio de colecta como
LOCPRIOR en todos los análisis realizados (Tucker et al. 2012; Hubisz et al.,
2009), ya que esto permite al programa usar información sobre ubicaciones de
muestreo para ayudar a agrupar con datos débiles, para detectar migrantes o para
predefinir algunas poblaciones. El programa se ejecutó bajo las siguientes
especificaciones: frecuencias correlacionadas, período de quema de 100,000 y
200,000 iteraciones después de este período para permitir que la cadena de
Markov alcanzara la estacionalidad. Debido a que hay 25 sitios de colecta
diferentes, el análisis probó varios valores de K (K = 1 a K = 25). El valor más
probable de K (Kóptima) se estimó de acuerdo con el método de Evanno et al. (2005)
implementado en el programa Structure-Harvester (Earl y vonHoldt, 2012). La
gráfica resultante del análisis de asignación de individuos fue editada en Microsoft
Power Point 2013.
2) Un análisis de coordenadas principales (PCoA, Principal Coordinates Analysis).
Este análisis permite el reconocimiento de la agrupación espacial de los genotipos,
sin alterar los datos con sólo introducir la matriz de similitud genética. Se
delimitaron los grupos genéticos con base en los coeficientes de ancestría
definidos en los análisis de agrupamiento bayesiano. Este análisis se realizó en
GenAlEx 6.2 (Genetic Analysis in Excel) (Peakall y Smouse, 2006).
64
CAPÍTULO III
A partir de este momento, llamaremos población a cada uno de los grupos genéticos
identificados mediante estos enfoques (Kóptima, Structure y PCoA).
Una vez determinado el patrón de agrupamiento, se determinó la estructura
genética de las poblaciones silvestres de Vanilla planifolia identificadas en la MYP,
mediante los siguientes análisis:
1) Se estimaron los valores de RST entre las poblaciones.
2) Se realizó un análisis de varianza molecular de tipo jerárquico (AMOVA, Analysis
of molecular variance; Excoffier et al., 1992), considerando dos niveles: entre las
poblaciones y entre los individuos dentro de las poblaciones.
3) Se evaluó el aislamiento por distancia, mediante la prueba de Mantel (Sokal, 1979;
Mantel, 1967), utilizando las matrices de distancias genéticas de Nei (1978) y
distancias geográficas de los sitios de colecta. Su significancia fue probada con
1,000 permutaciones.
Estos tres análisis se llevaron a cabo en GenAlEx 6.2 (Genetic Analysis en Excel) (Peakall
y Smouse, 2006).
3.2.3.2 Diversidad genética. En primera instancia, se realizaron pruebas para determinar
la presencia de alelos nulos y errores de puntuación en cada población (de acuerdo con la
Kóptima obtenida) con el programa MICROCHECKER (Van Oosterhout et al., 2004), y de
esta manera evaluar la calidad de los datos de SSR utilizados. Se aplicó el ajuste de
Bonferroni para comparaciones múltiples (Rice, 1989).
La diversidad genética se determinó para cada población y subgrupos observados
al interior de estas, con base en los siguientes estimadores: porcentaje de loci
polimórficos (%P), número de alelos (A); número efectivo de alelos (Ne); Heterocigosidad
esperada (HE) y observada (HO); y el coeficiente de endogamia (FIS). Los programas
usados fueron Arlequin 3.5.2.1 (Excoffier, 2010) y GenAlEx 6.2 (Peakall y Smouse, 2006).
65
CAPÍTULO III
3.3 RESULTADOS.
3.3.1 Patrón de agrupamiento y estructura genética.
Prueba de asignación de individuos. Se estimó la primer Kóptima= 2, la cual señaló la
existencia de las siguientes agrupaciones codificadas por colores según el programa
Structure (Figura 3.2; Cuadro 3.3):
1. ROJO-K2: Este grupo agregó todas las muestras de referencia de Vanilla planifolia
(los cultivares "Mansa", "Variegata" y “Oreja de Burro”), junto con 55 individuos
silvestres colectados en los sitios de colecta N4-7 y C8-12. De éstos, 33 individuos
presentaron el 100% de ancestría “ROJO-K2”, el resto presentó diferentes niveles
de ancestría “VERDE-K2” menores al 50%.
2. VERDE-K2: En este grupo se agregaron el resto de los individuos (34), de los
sitios C11, S13-25, además de dos individuos del sitio 4 (MYP1-CY y MYP5-CY).
Díez individuos (incluidos los individuos del sitio 4) presentaron el 98% de
ancestría “VERDE-K2”, mientras que el resto presentó diferentes niveles de
ancestría “ROJO-K2” (menores al 50%).
Ambos grupos presentan una distribución geográfica bien delimitada (Figura 3.3). El grupo
ROJO-K2 se encuentra a partir del centro hacia el norte de la PYM, mientras que el grupo
VERDE-K2 se encuentra en la franja sur de la misma. El sitio 11 es el único donde están
presentes individuos de ambos grupos.
Considerando lo señalado por Meirmans (2015), que valores diferentes de Kóptima
pueden reflejar diferentes procesos genéticos y demográficos que nos permitan mejorar la
interpretación biológica de los datos, se realizó un segundo análisis partiendo de la primer
K (2 - 25). Este segundo análisis mostró dos valores de K bien definidos: K=5 y K=11 (Ver
Figura 3.2 y Cuadro 3.3):

K= 5 (grupos definidos por Structure por categoría de color):
a) Rojo-K5: este grupo consistió de 21 individuos silvestres (pertenecientes a
los sitios C11, S13-22, S24-25). De éstos, 4 individuos presentaron el 100%
de ancestría “Rojo-K5” y el resto con diferentes niveles de ancestría (desde
40% al 2%) “Azul-K5”, “Verde-K5”, “Fucsia-K5” y “Amarillo-K5”.
66
CAPÍTULO III
b) Verde-K5: en esta categoría de color se agruparon 22 individuos silvestres
(pertenecientes a los sitios N4, N6-7, C8-10, C12 y S25). De estos
individuos, 8 presentaron el 100% de ancestría “Verde-K5”, el resto
presentaron diferentes niveles de ancestría (desde el 40% al 2%) “FucsiaK5”, “Rojo-K5”, “Azul-K5” y “Amarillo-K5”.
c) Azul-K5: 37 individuos fueron agrupados en esta categoría [incluidos los
individuos de referencia de los cultivares “Mansa”, “Variegata” y “Oreja de
Burro” de Veracruz (3) y Puebla de Vanilla planifolia]. Los individuos
silvestres en este grupo (32) pertenecen a los sitios N4-5, C11 y S20 (la
mayoría de los individuos del sitio 4 con un 100% de ancestría “Azul-K5”).
De estos individuos, 12 presentaron diferentes niveles de ancestría (desde
el 40% al 4 %) “Verde-K5”, “Fucsia-K5”, “Amarillo-K5” y “Rojo-K5”.
d) Amarillo-K5: en este grupo se incluyeron 8 individuos silvestres
pertenecientes a los sitios N4-5, C11 y S20. De éstos, solo 2 presentaron el
100% de ancestría “Amarillo-K5”, el resto presentó diferentes niveles de
ancestría (del 45% al 2%) “Azul-K5” y “Rojo-K5”.
e) Fucsia-K5: esta categoría agrupó a 6 individuos silvestres pertenecientes a
los sitios S18, S22-23, y a 2 individuos de referencia del cultivar “Mansa” de
Veracruz y Oaxaca. Todos estos individuos presentaron diferentes niveles
de ancestría (desde 35% al 1% “Azul-K5”, “Verde-K5” y “Rojo-K5”).
La mayoría de estos grupos presentaron un patrón bien delimitado y
aparentemente continuo en su distribución geográfica a excepción del grupo Azul-K5, el
cual parece brincar algunos de los sitios del subgrupo Verde-K5 (Figura 3.3). Sin
embargo, todos los grupos K5 se mantuvieron dentro de los límites correspondientes a los
grupos K2.

K= 11 (grupos definidos por Structure por categoría de color de más del 30% de
ancestría; Figura 3.2; Cuadro 3.3):
a) rojo-K11: este grupo consistió de tres individuos silvestres pertenecientes a
los sitios S22 y S25 (con más del 75% de ancestría “rojo-K11”). Los tres
67
CAPÍTULO III
individuos presentaron niveles bajos (muy similares) de ancestría “ocreK11”, “turquesa-K11”, “aguamarina-K11”, “púrpura-K11” y “amarillo-K11”.
b) verde-K11: en esta categoría de color se agruparon 4 individuos silvestres
de los sitios N5, C11 y S20 con coeficientes de ancestría muy similares
entre ellos (entre 55% y 60% de ancestría “verde-K11”), con 30% de
ancestría “siena-K11”, de 4% a 10% de ancestría “púrpura-K11”, y de 1% a
5% de ancestría “fucsia-K11”.
c) azul-K11: este grupo se constituyó por 5 individuos silvestres de los sitios
C11, S13, S15-17. Todos con más del 30% de ancestría “azul-K11” y
diferentes niveles de ancestría (del 30% al 1%) “ocre-K11”, “amarillo-K11”,
“turquesa-K11”, “rojo-K11”, “verde-K11”, “fucsia-K11” y “púrpura-K11”.
d) amarillo-K11: 3 individuos silvestres (pertenecientes a los sitios S15, S1819) conformaron este grupo con más del 60% de ancestría “amarillo-K11”.
Estos individuos presentaron diferentes niveles de ancestría (desde 25% al
1%) “azul-K11”, “roja”, “turquesa-K11”, “ocre-K11”, “siena-K11”, “verde-K11”
y “púrpura-K11”.
e) fucsia-K11: en este grupo se colocaron 7 individuos silvestres (incluidos en
el grupo “Amarillo-K5”) de los sitios N4, C11 y S20. Estos individuos
presentaron más del 40 % de ancestría “fucsia-K11” y diferentes niveles de
ancestría (desde el 25% al 1 %) “verde-K11”, “siena-K11” y “púrpura-K11”.
f)
aguamarina-K11: los 5 individuos silvestres (pertenecientes a los sitios
S22-23) que conformaron este grupo presentaron más del 80 % de
ancestría “aguamarina-K11” con diferentes niveles (desde el 15% al 1%) de
ancestría “turquesa-K11”, “siena-K11”, “azul-K11”, “verde-K11” y “rojo-K11”.
Este grupo mantienen la misma relación que el grupo “Fucsia-K5”.
g) ocre-K11: esta categoría agrupó a 5 individuos silvestres de los sitios S18,
S24-25, con más del 50% de ancestría “ocre-K11” y diferentes niveles de
ancestría (desde el 15% al 1%) “rojo-K11”, “turquesa-K11”, “amarillo-K11”,
“siena-K11”, “púrpura-K11”, “verde-K11” y “azul-K11”.
68
CAPÍTULO III
h) púrpura-K11: en esta categoría se agruparon 5 individuos silvestres (de los
sitios S14 y S21) con un porcentaje de ancestría “púrpur-K11” mayor al 60.
Estos individuos presentaron diferentes niveles de ancestría (del 30% al
1%) “verde-K11”, “siena-K11”, “rojo-K11” y “turquesa-K11”.
i)
siena-K11: este grupo se mantuvo prácticamente igual al grupo “Azul-K5”
con 34 individuos. En este grupo se incluyeron 4 individuos de referencia
de los cultivares “Mansa”, “Variegata” y “Oreja de Burro” (Veracruz y
Puebla) de Vanilla planifolia con diferentes niveles de ancestría “siena-K11”
que van desde el 98% al 28%, y diferentes niveles de ancestría (desde 2l
40% al 1%) “verde-K11”, “gris-K11”, “fucsia-K11” y “azul-K11”. 21 individuos
silvestres (de los sitios N4-5, C11, S18 y S20) presentaron el 100% de
ancestría “siena-K11” (la mayoría del sitio 4), mientras que el resto
presentó diferentes niveles de ancestría (del 30% al 1%) “fucsia-K11”,
“verde-K11”, “turquesa-K11”, rojo-K11”, “amarillo-K11”, “azul-K11” y “grisK11”.
j)
turquesa-K11: Con 22 individuos silvestres (de los sitios N4, N6-7, C8-10,
C12 y S25), este grupo se mantuvo prácticamente igual que el grupo
“Verde-K5”. Todos los individuos presentaron una ancestría “turquesa-K11”
del 50% al 99% y diferentes niveles de ancestría “siena-K11”, “rojo-K11”,
“aguamarina-K11”, “azul-K11”, “amarilla-K11”, “púrpura-K11”, “verde-K11” y
“fucsia-K11” (del 30% al 1% respectivamente).
k) gris-K11: este último grupo fue constituido por 3 de los ejemplares de
referencia de la variedad “Mansa” de Vanilla planifolia de Veracruz y
Oaxaca, con más del 80% de ancestría “gris-K11” y diferentes niveles de
ancestría (desde el 10% al 1%) “siena-K11”, “púrpura-K11”, “turquesa-K11”,
“amarillo-K11”, “verde-K11” y “rojo-K11”.
Los subgrupos de K11 no presentaron un patrón geográfico definido, ya que hay
por lo menos un miembro de estos grupos presentes en varios sitios, e incluso brincan los
límites de los grupos K2 y K5 (Figura 3.3).
69
CAPÍTULO III
Figura 3.2 Patrón de agrupamiento de 7 individuos cultivados y 89 individuos silvestres de Vanilla planifolia de la
Península de Yucatán, México, mediante la determinación de Kóptimas con el método de Evanno et al. (2005) y 14 loci de
microsatélites.
70
CAPÍTULO III
Figura 3.3. Mapa de distribución de las poblaciones de Vanilla planifolia y los subgrupos genéticos en la MYP. La
codificación de colores es de acuerdo a las Kóptimas de los análisis de Structure.
71
CAPÍTULO III
Análisis de Coordenadas Principales. El PCoA mostró la existencia de dos grandes
grupos (líneas entrecortadas; Figura 3.4): “ROJO-K2" y “VERDE-K2” (codificados con el
color de las Kóptimas del análisis de Structure, Figura 3.2). Ambos grupos son acordes con
la K= 2 del análisis de Structure. El grupo “ROJO-K2” contiene dos nubes de puntos más
compactas, las cuales corresponden a los grupos “Azul-K5” y “Verde-K5” (grupos K5
corresponden a las líneas punteadas, Figura 3.4) del análisis de Structure, y tres
individuos del grupo “Fucsia-K5, de los cuales dos son ejemplares de referencia del
cultivar “Mansa” (Veracruz y Oaxaca), y el tercero pertenece al sitio 18. El grupo “VERDEK2” presenta una nube de puntos más dispersa, en la cual se observan los grupos
“Amarillo-K5”, “Rojo-K5” y el resto de los individuos del grupo “Fucsia-K5”. En este análisis
de PCoA, dos individuos del grupo “Azul-K5” (de los sitios 4 y 5) del análisis de Structure,
se encuentran dentro del grupo “VERDE-K2”. Las coordenadas principales 1 y 2
explicaron el 22.92% y el 13.15% de la variación total, respectivamente.
A continuación, se presentan los subgrupos K11 (círculos codificadas por colores
de acuerdo a la K= 11 de la Figura 3.2) anidados en las poblaciones K5 de la siguiente
manera (Cuadro 3.3, Figuras 3.3 y 3.4):

Los subgrupos “siena-K11” y “verde-K11” se encuentran dentro del grupo
“Azul-K5”

El subgrupo “turquesa-K11” corresponde al grupo “Verde-K5”.

El subgrupo “fucsia-K11” corresponde al grupo “Amarillo-K5”

Los subgrupos “púrpura-K11”, “amarillo-K11”, “ocre-K11”, “rojo-K11” y
“azul-K11” se encuentran dentro del grupo “Rojo-K5”.

72
El subgrupo “aguamarina-K11” se encuentra dentro del grupo “Fucsia-K5”.
CAPÍTULO III
Figura 3.4. Análisis de Coordenadas Principales (PCoA) de Vanilla planifolia en la MYP. La codificación de colores es de
acuerdo a las Kóptimas de los análisis de Structure.
73
CAPÍTULO III
Cuadro 3.3. Individuos silvestres de Vanilla planifolia agrupados por poblaciones y
subpoblaciones según los valores de K. La codificación de colores es de acuerdo a las
Kóptimas de los análisis de Structure.
ID
K2
OB
M1
V
M4
W89-N
W2-N
W3-N
W4-N
W6-N
W7-N
W8-N
W9-N
W10-N
W11-N
W12-N
W13-N
W14-N
W15-N
W16-N
W17-N
W18-N
W19-N
W20-N
W21-N
W22-N
W23-N
W24-N
W25-N
W26-N
W36-S
W31-N
W39-C
K5
K11 Sitio ID
1
1
2
2
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
20
5
11
W40-C
W41-C
W30-N
W35-S
M2
W54-N
W55-N
W56-N
W57-N
W45-N
W46-N
W47-N
W48-N
W49-N
W50-N
W51-N
W52-N
W53-N
W59-N
W66-C
W67-C
W68-C
W69-C
W70-C
W73-C
W74-C
W63-S
M5
M3
W75-S
W76-S
W77-S
K2
K5
K11 Sitio ID
11
11
5
20
1
4
4
4
4
7
7
7
7
7
7
7
7
7
6
8
12
12
12
12
9
10
18
3
1
22
22
22
W78-S
W79-S
W71-S
W29-N
W1-N
W5-N
W32-S
W33-S
W34-S
W37-C
W38-C
W27-S
W28-S
W42-S
W43-S
W44-S
W61-S
W62-S
W64-S
W65-S
W72-S
W84-S
W83-S
W58-S
W60-S
W85-S
W86-S
W80-S
W81-C
W82-S
W87-S
W88-S
K2
K5
K11 Sitio
23
23
25
5
4
4
20
20
20
11
11
21
21
14
14
14
15
19
18
22
25
25
25
24
24
18
18
15
11
16
13
17
Variedades de Vanilla planifolia: OB: Oreja de Burro; M: Mansa; V: Variegata; W: silvestre.
Regiones de la PYM: N: norte; C: centro; S: sur.
74
CAPÍTULO III
Combinando los resultados de estos análisis (Kóptima, Structure y PCoA), podemos
selañar la existencia de grupos genéticos bien definidos de Vanilla planifolia silvestre en la
PYM. Estos grupos fueron identificados en cada nivel de organización interno (NOI), los
cuales llamaremos de la siguiente manera: K= 2, “poblaciones”; K= 5, “subpoblaciones”; y
K= 11, “familias”. Cabe señalar que la familia “gris-K11” se retiró de los análisis por
corresponder al grupo de los cultivados.
Estructura genética. El coeficiente de diferenciación genética RST varió de 0.023 a 0.466
entre cada NOI de Vanilla planifolia (Cuadro 3.4), con un valor medio de 0.28, mostrando
una alta estructura genética al interior de los tres NOI. El AMOVA reveló que, a nivel de
poblaciones, el 6% de la variación genética se repartió entre estas y el 94% se encuentra
dentro de las mismas. En general, se observó un mayor porcentaje de variación genética
al interior de cada uno de los NOI (Cuadro 3.4). También, se pudo observar que cuando
más se profundiza en los NOI, la estructura genética aumenta.
Se detectó un efecto significativo de aislamiento por distancia a nivel de las
poblaciones y a nivel de las familias, ya que la correlación entre distancias genéticas y
geográficas fue altamente significativa en todos los NOI (P > 0.010), como lo demostró
una prueba de Mantel (ver valores de R2 en la figura 3.5).
75
CAPÍTULO III
Cuadro. 3.4. Análisis de varianza molecular en los diferentes niveles de
organización interna (NOIs) de Vanilla planifolia silvestre de la Península de
Yucatán, México, e índice de diferenciación genética (RST), usando 14 loci de
microsatélites.
Fuente de
variación
Suma de los
cuadrados
Componentes
de la varianza
Porcentaje
de variación
RST
K2
Entre las
poblaciones
40042.39
397.18
6%
0.059
Dentro de las
poblaciones
1109560.66
6304.32
94%
Total
1149603.06
6701.50
100%
197994.620
1337.464
20%
930284.931
1128279.551
5377.370
6714.834
80%
100%
309338.572
1857.056
27%
824617.652
1133956.225
4908.438
6765.495
73%
100%
K5
Entre las
subpoblaciones
Dentro de las
subpoblaciones
Total
0.199
K11
Entre las familias
Dentro de las
familias
Total
76
0.274
CAPÍTULO III
Figura 3.5. Prueba de Mantel. Aislamiento por distancia entre 89 individuos de Vanilla
planifolia silvestre en la Península de Yucatán, México.
77
CAPÍTULO III
3.3.2 Diversidad genética. El análisis de MICROCHECKER indicó la presencia de alelos
nulos en algunos loci en los dos NOI superiores de Vanilla planifolia (en las poblaciones y
en algunas subpoblaciones; e.g. loci mVplCIR010). Sin embargo, a nivel de familias no
fueron detectados alelos nulos. Con base en esto, se propone el uso de estos catorce loci
de SSR como un conjunto adecuado para evaluar la diversidad genética al interior de
Vanilla planifolia.
Se identificaron un total de 110 alelos en los catorce loci analizados. El locus con
mayor número de alelos fue el mVplCIR026 (14), mientras que el locus con menor número
de alelos fue el mVplCIR003 (3). Se detectaron diferentes loci monomórficos entre los
NOI. El porcentaje de loci polimórficos fue del 14.29% al 100% dentro de cada NOI,
siendo la población “VERDE-K2”, la subpoblación “Rojo-K5” y la familia “azul-K11” las que
tienen el 100%, y la familia “verde-K11” la que tiene el menor valor. El número promedio
de alelos entre los loci entre NOIs varió de 2.31 (± 0.10) a 5.571 (± 0.59), siendo la
población “VERDE-K2”, la subpoblación “Rojo-K5” y la familia “azul-K11” las que
presentaron los valores más altos (Cuadro 3.5). El número efectivo de alelos osciló entre
1.114 y 3.722. La heterocigosidad observada varió entre los NOI de 0.107 a 0.743, siendo
la familia “azul-K11” la que tuvo el valor más elevado, y la familia “verde-K11” la que tuvo
el menor valor; mientras que la heterocigosidad esperada varió entre los NOI de 0.063 a
0.646, siendo la población “VERDE-K2” la que tuvo el mayor valor, y la familia “verde-K11”
la que tuvo el menor valor. Resumiendo, la población “VERDE-K2”, la subpoblación “RojoK5” y la familia “azul-K11” parecen ser los NOI con niveles de diversidad mayores. El
coeficiente de endogamia mostró valores positivos de endogamia para los dos NOI
superiores (poblaciones: 0.313 y subpoblaciones: 0.190), mientras que, para el nivel de
familias el valor fue negativo (-0.130).
78
CAPÍTULO III
Cuadro 3.5. Resumen estadístico de la diversidad genética de Vanilla planifolia
silvestre, en los tres niveles de estructura genética en la MYP hallados en este estudio,
usando 14 loci de microsatélites. Número de alelos (Na); número de alelos efectivos
(Ne); heterocigosidad observada (HO); heterocigosidad esperada (HE); el coeficiente de
endogamia (FIS); y porcentaje de loci polimórficos (%P). ES = error estándar.
Na
K2 (Poblaciones)
ROJO
Promedio
3.714
ES
0.539
Ne
1.596
0.213
HO
0.172
0.056
HE
7.429
0.817
3.722
0.506
0.419
0.045
0.646
0.057
Total
Promedio
ES
5.571
0.599
2.659
0.338
0.295
0.043
0.454
0.057
K5
(Subpoblaciones)
Amarillo
Promedio
3.286
ES
0.474
2.596
0.366
0.265
0.077
0.487
0.080
Fucsia
Promedio
ES
2.286
0.412
2.571
0.429
1.393
0.155
1.925
0.303
0.178
0.075
0.279
0.083
100.00%
0.313
0.060
64.29%
71.43%
0.342
0.075
4.929
0.633
2.950
0.403
0.510
0.064
0.575
0.056
Verde
Promedio
ES
2.786
0.366
1.307
0.128
0.162
0.067
0.169
0.053
Total
Promedio
ES
3.171
0.234
2.034
0.149
0.279
0.035
0.354
0.034
89.29%
10.71%
78.57%
0.198
0.061
Rojo
Promedio
ES
%P
78.57%
0.262
0.069
VERDE
Promedio
ES
Azul
Promedio
ES
FIS
100.00%
78.57%
0.190
0.072
78.57%
5.98%
79
CAPÍTULO III
Cuadro 3.5 - continuación.
Na
K11 (Familias)
aguamarina
Promedio
2.143
ES
0.345
amarillo
Promedio
ES
azul
Promedio
ES
2.357
0.248
2.714
0.221
Ne
1.752
0.279
2.011
0.187
2.407
0.220
HO
0.279
0.087
0.619
0.098
0.743
0.077
HE
0.253
0.081
0.456
0.077
ocre
Promedio
ES
2.500
0.251
2.123
0.213
0.544
0.099
0.453
0.063
rojo
Promedio
ES
1.786
0.155
1.617
0.180
1.574
0.131
0.243
0.113
0.429
0.106
78.57%
85.71%
57.14%
0.281
0.072
71.43%
0.305
0.058
siena
Promedio
ES
3.000
0.445
1.410
0.139
0.198
0.073
0.219
0.058
turquesa
Promedio
ES
2.786
0.366
1.307
0.128
0.162
0.067
0.169
0.053
verde
Promedio
ES
1.143
0.097
1.114
0.080
0.107
0.077
0.063
0.043
Total
Promedio
ES
2.314
0.103
1.772
0.073
0.358
0.032
0.322
0.022
80
100.00%
0.541
0.038
2.401
0.352
1.857
0.254
85.71%
0.440
0.057
2.857
0.430
%P
64.29%
0.290
0.074
fucsia
Promedio
ES
púrpura
Promedio
ES
FIS
78.57%
78.57%
14.29%
-0.130
0.074
71.43%
7.38%
CAPÍTULO III
3.4 DISCUSIÓN.
Los marcadores moleculares de ADN, como los microsatélites, han sido frecuentemente
utilizados para resolver cuestiones relacionadas con la conservación de la diversidad
genética y la determinación de la estructura poblacional, principalmente de aquellas
especies que se encuentran amenazadas (González, 2003). En el presente trabajo se
estudia por primera vez la diversidad y estructura genética de poblaciones silvestres de
Vanilla planifolia, especie en peligro de extinción en su hábitat natural (Soto-Arenas, 2009,
2006; Duval et al., 2006). Gracias al número alto de individuos analizados (89) en
comparación con los estudios anteriores en esta especie (Ramos-Castella et al., 2016;
Schlüter et al., 2007; Cibrián, 1999), este trabajo logró identificar poblaciones naturales y
una subestructura al interior de las mismas (subpoblaciones y familias), a pesar de la
distribución híperdispersa de los individuos, lo cual es un aspecto típico del
comportamiento poblacional de esta especie. Por otro lado, la presencia de individuos
mezclados (admixed) en la amplia muestra estudiada, dificultó la determinación precisa de
los límites geográficos de las subpoblacionales y familias encontradas.
Patrón de agrupamiento y estructura genética. En el presente trabajo fue posible
determinar dos poblaciones de Vanilla planifolia silvestre al interior de la MYP:
1) Nornoreste-centro (“ROJO-K2”) con al menos 55 individuos distribuidos en 4
localidades del norte y 5 localidades del centro de la península.
2) Sursuroeste (“VERDE-K2”) con al menos 34 individuos distribuidos en 14
localidades.
En las regiones abarcadas por ambas poblaciones existen reportes de otros sitios
de colecta de V. planifolia. Sin embargo, para este estudio no se pudo acceder a estos
sitios durante la exploración botánica y con ello constatar la presencia de la especie, lo
cual fue debido a las inclemencias del clima, presencia de lagartos y a la inseguridad en
las localidades colindantes a las fronteras con Belice y Guatemala.
La mayoría de las localidades de la población del Nornoreste-centro tienen una
distribución a manera de parches con una distancia máxima de 127.70 km (N6 – N7) y
mínima de 44.29 km (C9 – C11) entre localidades, con una densidad de individuos menor
81
CAPÍTULO III
a diez por localidad. Por otra parte, las localidades de la población del Sursuroeste
presentaron una densidad de individuos menor a cinco por localidad. Los individuos de
esta población tienen una distribución aparentemente más continua en la región, con una
distancia máxima de 98.17 km (S24 – S25) y mínima de 6.92 km (S13 – S21) entre
localidades. Cabe señalar que las localidades en la MYP donde se colectaron los
ejemplares silvestres de V. planifolia utilizados en este estudio, se encuentran cercanas a
cuerpos de agua (lagunas, cenotes, zonas inundables) en un rango de 100 a 400 metros,
en matrices de selvas mediana subcaducifolia, mediana subperennifolia y alta
perennifolia, a excepción de las localidades N4 y N7 que se encuentran dentro de
rejolladas rodeadas de selva baja subcaducifolia.
Las dos poblaciones de Vanilla planifolia silvestre reportadas en este trabajo
presentan una subestructura compleja. Se encontraron cinco subpoblaciones en la PYM:
dos en la región norte-centro (“Verde-K5” y “Azul-K5”) y tres en la región sur (“AmarilloK5”, “Fucsia-K5” y “Rojo-K5”). Dentro de estas subpoblaciones se encontraron 10 familias.
Es importante señalar que la familia “gris-K11”, no se detectó al interior de la PYM al estar
compuesta por las plantas de referencia del cultivar “Mansa” de Veracruz (M2 y M3) y
Oaxaca (M5), sin embargo, los individuos de esta familia tienen una estrecha relación
genética con las subpoblaciones “Fucsia-K5” (M3 y M5) y “Azul-K5” (M2). La familia con la
distribución más amplia fue la “turquesa-K11”, cuyos individuos se localizaron en tres
localidades del norte (4, 6, 7), cuatro localidades del centro (8, 9, 10, 12) y una del sur (25,
la más distante). Las familias “púrpúra-K11”, “aguamarina-K11” y “amarillo-K11”
presentaron una distribución restringida en el centro de la población Sursuroeste.
La manera en la que están distribuidos los individuos de las 10 familias de Vanilla
planifolia silvestre encontradas en la MYP parece indicar, por un lado, una dispersión
ocasional de semillas y/o polen de esta especie a larga distancia [Euglossa, murciélagos
(Soto-Arenas, 2009; Schlüter et al., 2007)], u otros animales que visitan la copa de los
árboles hospederos de manera ocasional (e.g. monos araña, saraguatos o aves; Sara
Villanueva Viramontes, observaciones personales). Por otro lado, esta distribución
disyunta de las familias parece indicar una distribución más amplia de V. planifolia en la
MYP en el pasado reciente, la cual se ha visto afectada por la destrucción de su hábitat
durante las últimas cinco décadas (Zamora-Crescencio et al. 2011; Allen et al., 2003),
82
CAPÍTULO III
provocando la posible extinción de individuos y/o familias intermedias entre las
localidades estudiadas.
Los estudios que contemplan el análisis de estructura genética en Vanilla con los
cuales podemos hacer una comparación, a groso modo, por incluir plantaciones de V.
planifolia (entre otras especies analizadas) y algunos pocos individuos silvestres de esta
especie en México, se presentan a continuación:
-
Cibrián (1999), usando siete loci de isoenzimas, analizó la estructura genética
de 96 individuos de Vanilla planifolia de 26 cultivares mexicanos en San Luis
Potosí, Veracruz, Oaxaca, Tabasco y Chiapas. Seis de estos cultivares con
origen silvestre (Oaxaca) y dos individuos silvestres de Tabasco. Esta autora
reportó valores altos de endogamia y una fuerte diferenciación (FST= 0.826)
entre las localidades, además de la existencia de dos grupos entre las
muestras: 1) la región de Veracruz: Puntilla Aldama y Papantla; y 2) la región
de Oaxaca: Oaxaca y Tabasco.
-
Schlüter et al. (2007), usando marcadores RAPD, analizaron la estructura
genética de Vanilla planifolia con 17 muestras de tres cultivares: “Variegata”,
“Mansa” y “Orjeja de Burro” de Florida, Veracruz, San Luis Potosí, Oaxaca,
Tabasco, y Costa Rica; seis muestras de individuos silvestres de Chiapas,
Oaxaca y Quintana Roo; y cuatro muestras en cultivo de supuesto origen
silvestre de Oaxaca y Costa Rica. Los autores reportaron una fuerte
estructuración al interior de las muestras, identificando dos grandes grupos
mediante un PCoA: 1) Costa Rica; y 2) México. El grupo México, a su vez se
dividió en dos subgrupos: Norte de la faja volcánica en México (plantas
cultivadas del norte de Veracruz); y Sur de la faja volcánica en México (en su
mayoría plantas silvestres del norte de Oaxaca); no se encontró una distinción
entre los cultivares estudiados (Mansa, Variegata y Oreja de Burro). Estos
resultados parecen indicar que la estructura encontrada puede estar
influenciada por un mayor número de clones incluidos entre las plantas
cultivadas, además de un número de muestras muy reducido, en especial de
las silvestres.
83
CAPÍTULO III
-
Ramos-Castella et al. (2016), usando marcadores ISSR, analizaron la
diferenciación genética de Vanilla planifolia en el sureste de México con 14
pozas génicas comerciales (variedades “Mansa” y “Variegata”) de Veracruz,
Oaxaca y Quinta Roo; y dos pozas génicas silvestres de Oaxaca y Quintana
Roo. Mediante un UPGMA, los autores reportaron tres grupos al interior de V.
planifolia: 1) “Variegata”, 2) Quintana Roo (silvestres), y 3) “Mansa”. De
acuerdo a lo señalado por estos autores, los ISSR fueron capaces de
diferenciar entre los cultivares analizados de V. planifolia.
Los trabajos de Ramos-Castella et al. (2016), Schlüter et al. (2007) y Cibrián (1999),
sugieren la existencia de dos grupos genéticos de Vanilla planifolia silvestre en México y
uno en Centroamérica: 1) Sur de México (Oaxaca, Chiapas y Tabasco), 2) Sureste de
México (Quintana Roo); y 3) Costa Rica. Sin embargo, es posible que estos grupos no
sean poblaciones reales de esta orquídea, en primer lugar, debido al tamaño limitado de
la muestra utilizada en los estudios antes citados y en segundo porque en el presente
trabajo se encontraron dos poblaciones (Norte: Yucatán-Quintana Roo y Sur: CampecheQuintana Roo) de V. planifolia en la zona núcleo de la Provincia Biótica Península de
Yucatán. Asimismo, la presencia de las dos poblaciones encontradas en el presente
trabajo sugiere que probablemente los tres grupos genéticos descritos entre México y
Costa Rica contengan más de una población; de haber más individuos silvestres. Por otro
lado, cabe señalar que al igual que en los estudios mencionados anteriormente, en el
presente se encontró una marcada diferenciación genética entre los individuos silvestres y
los cultivados.
Diversidad genética. En general, se observó un mayor porcentaje de variación genética
al interior de cada una de las poblaciones silvestres de Vanilla planifolia, indicando que
tiene bajos niveles de variación genética entre estas y una estructura poblacional muy
pequeña. Sin embargo, la diversidad genética promedio de estas poblaciones tuvo una
tendencia a ser mayor (HO= 0.295, %P= 89.29%; Cuadro 3.5) que la reportada en las
plantaciones de los diferentes cultivares (e. g. Ho= 0.0 – 0.12, en las plantaciones del
cultivar “Mansa” en Veracruz, Cibrián, 1999; I= 0.0, en las plantaciones del cultivar
“Mansa” en Veracruz y Quintana Roo, Ramos-Castella et.al, 2016). Dado que la
variabilidad genética en esta especie se ha descrito a través de distintos protocolos, no es
84
CAPÍTULO III
posible la comparación directa de los resultados, sin embargo, los estudios de diversidad
genética en Vanilla con los cuales podemos hacer a groso modo una comparación de los
niveles de variabilidad genética, son los mismos antes mencionados.
-
Cibrián (1999), reporta que, a pesar de incluir pocos individuos silvestres, estos
fueron los más diversos. Cabe señalar, que las isoenzimas pueden subestimar
la diversidad clonal de las poblaciones de plantas (Silander, 1985), lo cual
puede deberse a que existe la posibilidad de que la actividad de las enzimas
estudiadas puede estar afectada por el ambiente celular. En Vanilla, las hojas
son sensibles a los cambios de pH (debido al metabolismo CAM), lo cual
podría afectar la expresión de las isoenzimas, dependiendo del momento del
día en que se colectó la hoja y de su longevidad (Cibrián, 1999). Por otra parte,
la variedad “Oreja de Burro” fue de los grupos con más heterocigotos. Los
resultados de este estudio sugieren que la polinización manual practicada en
las plantaciones aumenta los niveles de endogamia, pues no existe un
intercambio genético como el generado por el entrecurzamiento de diferentes
individuos, ya sea de individuos autoincompatibles o no.
-
Schlüter et al. (2007), reportan que tanto el grupo del norte de la faja volcánica
como el grupo del sur de esta, tienen valores del índice de diversidad de
Shannon muy elevados con marcadores RAPD. Sin embargo, no se indica el
número de marcadores (bandas) encontrados exclusivamente en Vanilla
planifolia. Es importante señalar que los marcadores dominantes como los
RAPD, no permiten distinguir el heterocigoto del homocigoto dominante,
además una banda del mismo tamaño en dos individuos no representa
necesariamente el mismo fragmento de ADN (co-migración) (Heinz, 2016), por
lo cual no son los marcadores más adecuados para examinar la variabilidad
genética, especialmente en aquellas especies que tienen tasas altas de
reproducción clonal y de autocompatibilidad como lo es V. planifolia.
-
Ramos-Castella et al. (2016), reportaron valores muy pequeños del índice de
diversidad de Shannon utilizando marcadores ISSR. Sin embargo, la utilización
de pozas génicas limita la determinación de la diversidad genética real, ya que
85
CAPÍTULO III
los individuos dentro de las pozas se enmascaran unos a otros. Además de
que el número de pozas génicas silvestres fue muy reducido.
Implicaciones para la conservación y uso sustentable de la especie. La importancia
de las poblaciones silvestres en el manejo, conservación y mejoramiento de sus parientes
cultivados radica en su acervo genético, el cual puede aportar a los cultivos
características de importancia agronómica (IUCN, 2010). Se ha visto a nivel mundial que
la diversidad genética al interior de las plantaciones de Vanilla planifolia es prácticamente
nula (Borbolla-Pérez et al., 2016; Ramos-Castella et al., 2016; Busungu, 2009; Lubinsky et
al., 2008; Bory et al., 2008; Sreedhar et al., 2007; Besse et al., 2004; Cibrián, 1999), lo
que es acorde con el modo vegetativo de propagación y la reciente introducción histórica
del cultivar “Mansa” en las regiones donde se cultiva (Soto-Arenas, 2009; Bory et al.,
2008; Lubinsky et al., 2008).
Con base en los estudios realizados sobre la diversidad genética de Vanilla
planifolia y a los resultados del presente estudio, podemos señalar que las poblaciones
silvestres de V. planifolia presentes en la PYM constituyen una de las fuentes primarias de
variabilidad genética más importantes para aumentar el acervo genético de las
plantaciones de vainilla, tanto a nivel nacional como internacional. Sin embargo, es
importante señalar que estas poblaciones silvestres de V. planifolia corren riesgo de
extinción a corto plazo, ya que gran parte de la vegetación primaria de la Península de
Yucatán ha sido transformada y sustituida por diferentes usos de la tierra, fuego y
huracanes (Zamora-Crescencio et al., 2011; Allen et al., 2003) y son pocos los sitios
donde existe vegetación madura, la cual muestra signos de perturbación humana (Rico–
Gray y García–Franco, 1992). Incluso, la PYM presenta casi en su totalidad vegetación
secundaria (Rico–Gray y García–Franco, 1991). Estos cambios han provocado
modificaciones en la estructura de la vegetación, composición florística (Carnevali et al.,
2003), diversidad, abundancia y frecuencia de las especies (Von–Gadow et al., 2004;
Sánchez–Aguilar y Rebollar–Domínguez, 1999; Ramírez–Marcial et al., 1998), siendo V.
planifolia una de las especies afectadas. Cabe señalar que, en la exploración botánica
realizada en el presente estudio, se pudo constatar la desaparición de individuos
registrados en años anteriores por Soto-Arenas (2009) en 17 localidades, debido al
establecimiento de cañaverales en su mayoría en el sur de Quintana Roo.
86
CAPÍTULO III
Conforme se ha avanzado en la tecnología en materia de marcadores moleculares
y bioinformática para el estudio de genética de poblaciones, se ha podido comprobar que
V. planifolia silvestre alberga aún un nivel de variabilidad genética considerable, a pesar
de la desaparición de individuos, e incluso poblaciones, como consecuencia de la
destrucción de su hábitat y la extracción ilegal de estos para el establecimiento de
plantaciones. Bajo este contexto, aún estamos en un momento oportuno para establecer
estrategias de conservación y uso sustentable de esta especie tan importante. Por otra
parte, con base en nuestras observaciones en la PYM, se espera que haya más
poblaciones silvestres en otras regiones del sur de México (Oaxaca, Chiapas) y Centro
América aún por descubrir.
87
CAPÍTULO IIV
CAPÍTULO IV
DISCUSIÓN GENERAL.
4.1 ESTADO DE CONSERVACIÓN DE Vanilla planifolia SILVESTRE.
El progreso de la civilización humana a lo largo de los últimos dos siglos ha dado lugar a
un proceso de transformación de inmensas áreas naturales en paisajes antropogénicos,
alterando de esta manera la estructura, distribución y funcionamiento de la mayoría de los
ecosistemas naturales (Millennium Ecosystem Assessment, 2005; Saunders et al., 1991).
Las consecuencias inmediatas de este proceso incluyen la pérdida de hábitat, la
formación de parches de hábitat remanentes (de formas y tamaños variados), la reducción
del tamaño de las poblaciones silvestres y un aumento en el grado de aislamiento de las
mismas, sumergiéndolas en una matriz antropogénica (PNUMA, 2010; Fahrig, 2003;
McGarigal y Cushman, 2002). A estos fenómenos persistentes, actualmente se les
reconoce como las principales fuerzas impulsoras de la pérdida de la biodiversidad en los
ecosistemas terrestres de todo el planeta (Sala et al., 2000).
La Lista Roja de la UICN (versión 2016-3) contempla que 25,000 especies están
amenazadas de extinción, de las 85,000 especies evaluadas a nivel mundial. Además, se
ha determinado que la principal amenaza para el 85% de todas las especies descritas es
la pérdida y degradación del hábitat (IUCN, 2015). Cabe señalar que, el comercio ilícito y
las especies invasoras son también importantes factores de disminución poblacional
(CONABIO, 2009). En el caso particular de México, existe la Norma Oficial Mexicana
NOM-059-SEMARNAT-2010, la cual lista las especies y subespecies de flora y faunas
silvestres y acuáticas en peligro de extinción, amenazadas, raras y sujetas a protección
especial, estableciendo especificaciones para su protección. En esta Norma, se
encuentran enlistadas casi 2,800 especies de flora y fauna que habitan en territorio
nacional (SEMARNAT, 2016), las cuales se encuentran bajo alguna categoría de riesgo
debido a la actividad humana (Informe de actividades 2012-2014 CONABIO; NOM-059SEMARNAT-2010). Ante la falta de una revisión exhaustiva, la lista real podría ser mucho
mayor. No obstante, la inclusión de una especie en la lista no garantiza que se tomen las
medidas necesarias para su recuperación y conservación. Dicha Norma debería constituir
una plataforma de la cual partir para diseñar estrategias de manejo de recursos para su
88
CAPÍTULO IV
preservación. Sin embargo, el tráfico nacional e internacional de ejemplares de especies
protegidas indica que esta Norma no es respetada (Luna-Plascencia et al., 2011). El
Diario Oficial de la Federación, lista 985 especies de plantas en alguna categoría de
amenaza, de las cuales 187 son miembros de la familia Orchidaceae (NOM-059SEMARNAT-2010). Muchas de estas especies de orquídeas tienen poblaciones dentro de
áreas naturales protegidas (ANP) o reservas. Cuando la especie está dentro de una ANP
o dentro de una reserva de tamaño grande, generalmente implica la existencia de
poblaciones viables a largo plazo. Pero cuando la especie sólo se halla en reservas
pequeñas, su persistencia a largo plazo no está garantizada (Calderón-Saenz, 2006),
ahora menos si se encuentran fuera de las ANP y reservas.
Vanilla planifolia es una de las orquídeas mexicanas enlistadas en la NOM-059SEMARNAT-2010. Esta planta es ampliamente cultivada debido a su importancia
económica a nivel mundial y su forma silvestre se encuentra clasificada en la categoría de
Protección Especial (Pr). A pesar de estas características importantes, no se habían
realizado estudios de esta especie en su hábitat natural desde el 2009 (i.e. Soto-Arenas,
2009), por lo que los resultados del presente estudio representan un aporte importante
para esta especie.
En este trabajo, la mayoría de las áreas de distribución de las poblaciones
silvestres de Vanilla planifolia presentes en la PYM se encontraron en franjas remanentes
de vegetación primaria de selva alta perennifolia y selva mediana subperennifolia en el
oeste y sur de la PYM. Esta especie se desarrolla de manera natural en zonas con suelos
húmedos y ricos en materia orgánica, bajo el dosel de árboles con fuste entre 15 y 150 cm
de diámetro. No se encontró preferencia por algún hospedero, pudiéndose verla crecer
encima de rocas, de miembros de las familias: Arecaceae, Sapotaceae, Burseraceae,
Anacardiaceae, Annonaceae, Fabaceae, etc. Los sitios de colecta de V. planifolia
encontrados en el norte de la PYM, los cuales aparentemente se encuentran aislados del
resto de los otros puntos de colecta, se encuentran inmersos en una matriz remanente
con elementos de vegetación primaria de selva mediana subcaducifolia, asociados a
cuerpos de agua permanentes como lo son los cenotes y las rejolladas.
En varias de sus publicaciones, Soto-Arenas (2009; 2006; 1999) refirió a Vanilla
planifolia como en peligro de extinción en su hábitat natural, debido al escaso número de
89
CAPÍTULO IIV
individuos encontrados en sus exploraciones botánicas en el Centro, Sur y Sureste de
México. Por medio de la exploración botánica realizada en el presente estudio en todo el
territorio de la Península de Yucatán, se pudo constatar la desaparición de 14 individuos
registrados en diferentes colecciones botánicas (Herbario CICY; Herbario AMO, SotoArenas, 2009). Lo anterior, podría ser consecuencia de la fragmentación y destrucción del
hábitat, así como de la extracción ilícita de algunos ejemplares (comunicación personal
del Sr. Escárcega, productor de vainilla en Chetumal, Quintana Roo, y habitantes del
poblado San José de la Montaña, Quintana Roo), ya que al acudir a los sitios
georreferenciados se encontraron grandes extensiones de cañaverales, cultivos de
calabazas, soya, potreros, etc., principalmente en el sur de Quintana Roo. En contraparte,
se realizó el registro de individuos nuevos (varios de ellos solitarios) en diferentes sitios de
la PYM.
Entre 1999 hasta 2009, Cibrián y Soto-Arenas reportaron entre 13 y 16 localidades
de México con individuos silvestres, la mayoría de ellos solitarios y 8 localidades con
individuos de los que se desconoce su origen (silvestre o escapado de cultivo). Estos
registros, junto con los nuevos registros generados en el presente estudio, reflejan una
distribución a manera de “U” abierta en el territorio mexicano, extendiéndose hacia el sur
de la PYM por Centro América (Schlüter et al., 2007) y formando una “Y” zigzagueante
abierta (Figura 4.1). Con base en el total de registros de observaciones de V. planifolia
existentes hasta ahora, se puede determinar la distribución natural de esta especie en tres
de las 14 Provincias Biogeográficas de México propuestas por Morrone (2005): Península
de Yucatán, Golfo de México y Chiapas.
Los individuos silvestres de Vanilla planifolia reportados en estudios anteriores
(Ramos-Castella et al., 2016; Soto-Arenas, 2009; Schlüter et al., 2007; Cibrián, 1999),
suman en total 41 individuos. Es importate mencionar que varios de estos autores
trabajaron en colaboración, lo que pudo haber generado un sesgo en la información del
número de registros de V. planifolia, ya que algunos pudieron haber trabajado sobre el
mismo material de herbario o las mismas colectas de material botánico. Considerando
esto, se desconoce con certeza que efectivamente sean individuos diferentes los
analizados en estos estudios. Suponiendo que sean diferentes, que el muestreo haya sido
extensivo y que todos los individuos registrados hace diez años aún vivan (situación poco
90
CAPÍTULO IV
probable), la suma de estos registros junto con los nuevos registros generados por la
exploración botánica del presente trabajo da un número aproximado de solamente 241
individuos silvestres observados en su hábitat natural.
Figura 4.1. Distribución de Vanilla planifolia en México y Provincias biogeográficas de
México (Morrone, 2005). Puntos azules: registros de Soto-Arenas (2009; 1999) y Cibriáan
(1999); puntos verdes registros de Villanueva-Viramontes et al., 2017. Mapa tomado de
Morrone, 2005: 1, California; 2, Baja California; 3, Sonora; 4, Altiplano Mexicano; 5,
Tamaulipas; 6, Península de Yucatán; 7, Sierra Madre Occidental; 8, Sierra Madre
Oriental; 9, Eje Volcánico Transmexicano; 10, Cuenca del Balsas; 11, Sierra Madre del
Sur; 12, Costa Pacífica Mexicana; 13, Golfo de México; 14, Chiapas.
Con base en el argumento de Calderón-Sáenz (2006), quien señala que “… de
encontrarse las poblaciones dentro de reservas de tamaño grande, la viabilidad a largo
plazo de las poblaciones tiene mayor probabilidad de ocurrir…”, se realizó la sobre
posición de los registros en los polígonos de las ANPs (Figura 4.2) del Sistema de
Información, Monitoreo y Evaluación para la Conservación (SIMEC). En el SIMEC
únicamente se cuenta con registros de Vanilla planifolia en la Reserva de la Biósfera Los
Tuxtlas
y
en
la
Reserva
de
la
Biósfera
Selva
El
Ocote
91
CAPÍTULO IIV
(https://simec.conanp.gob.mx/especies.php), sin embargo, se desconoce el número de
individuos presentes en ambas Reservas. De los registros de Soto-Arenas (2009; 1999) y
Cibrián (1999), solamente se encuentran dos sitios dentro de ANPs: en el Parque
Nacional Palenque al noreste del estado de Chiapas y en la Reserva de la Biosfera
Montes Azules al este del estado del mismo estado. De acuerdo con el trabajo de tesis de
Cibrián, cada uno de estos sitios mantiene un individuo solitario.
Con relación al presente trabajo, únicamente seis sitios registrados en la
exploración botánica (18 individuos) se encontraron dentro de ANPs (la mayoría en los
límites de éstas):
-
ROJO-K2: el sitio 10 en el Centro de la PYM en el Área de Protección de Flora y
Fauna Bala’an K’aax con un individuo.
-
VERDE-K2: cuatro sitios en el Sur de la PYM en la Reserva de la Biosfera de
Calakmul (14, 15, 18 y 23), con tres, dos, cuatro y tres individuos respectivamente, y
un sitio en el Sur de la PYM en el Área de Protección de Flora y Fauna Cañon del
Usumacinta (25-S) con cuatro individuos.
Es importante resaltar que la población VERDE-K2 tiene mayor diversidad (HO= 0.419), y
que probablemente esté relacionada con un mayor número de sitios dentro de ANPs:
sitios 14, 15, 18 y 25 pertenecen a la subpoblación Rojo-K5 (con individuos de las
familias: púrpura-K11, amarillo-K11, azul-K11, ocre-K11, siena-K11, rojo-K11 y turquesaK11) y el sitio 23 pertenece a la subpoblación Fucsia-K5 (con individuos de la familia
aguamarina-K11). Sin embargo, se señala que el sitio 10 dentro de ANP, no representa
una fracción significativa de la diversidad de la población ROJO-K2. Este sitio pertenece
únicamente a la subpoblación Verde-K5 (un individuo de la familia turquesa-K11). Con
base en lo anterior, observamos que únicamente están representadas dentro de ANPs
tres de las cinco subpoblaciones con ocho familias representadas por un par de
individuos, de las diez subfamilias encontradas en la PYM.
Por otra parte, también es importante señalar que se encuentra fuera de ANPs
(Figura 4.2) el sitio 4 al Norte de la PYM, el cual tiene la mayor densidad de individuos
(superior a la reportada en la literatura) en un área de aproximadamente 300 m2, en
92
CAPÍTULO IV
donde se ha observado floración y producción de frutos de manera natural por los
polinizadores locales. Este sitio pertenece a la población ROJO-K2 (subpoblación AzulK5: con individuos de las familias fucsia-K11, turquesa-K11, siena-K11), y está en peligro
de extinción local por la modificación y destrucción de su hábitat desde el año 2013
(observación personal), ya que el ejido donde se encuentra ha abierto carretera a escasos
10 metros del inicio de esta población de V. planifolia. Aunque los habitantes de este ejido
tienen la intención de hacer un manejo de la especie para la producción de vainilla, no se
asegura el éxito del proyecto por falta de capacitación. Además, la aplicación de
fungicidas y plaguicidas para el control de la producción de vainilla, pueden afectar tanto a
las micorrizas necesarias para la germinación de las semillas (Menchaca et al., 2011;
Soto-Arenas, 2006), como a los polinizadores locales (Coro, 2009). Por otra parte, la
modificación en el microclima donde se desarrolla la especie puede verse afectado por la
apertura de claros en el dosel por el establecimiento de la carretera, así como en la
interrupción en el flujo del agua de temporal, ya que por encontrarse en una rejollada
depende de las escurrentías. De la misma manera, el resto de los sitios que albergan
individuos de todas las subpoblaciones y familias, están en peligro de extinción local, ya
que se encuentran fuera de las ANPs y próximos a cañaverales, zonas de cultivo donde
se clarea (limpia) el “monte” y carreteras. Estos sitios representan el 79.77% de la
diversidad genética de las poblaciones silvestres de V. planifolia presentes en la zona
núcleo de la Provincia biótica Península de Yucatán (Cortés-Ramírez et al., 2011).
Con base en todo lo expuesto anteriormente, podemos recalcar la necesidad de
mover a Vanilla planifolia a la categoría de “en Peligro de extinción” en la NOM-059SEMARNAT-2010, considerando los factores reales y potenciales que producen la
disminución de los tamaños poblacionales, del número de poblaciones viables y de las
áreas de distribución, así como también el deterioro genético, los factores que causan el
deterioro y la modificación del hábitat, los antecedentes del estado de la especie y en este
caso, de las poblaciones y sus hábitat, y los efectos nulos de las medidas de protección
que han sido aplicadas.
93
CAPÍTULO IIV
Figura 4.2. Distribución de Vanilla planifolia silvestre en México y Áreas Naturales
Protegidas-SIMEC. Círculos azules: registros de Soto-Arenas (2009; 1999) y Cibrián
(1999); círculos verdes: población VERDE-K2 y círculos rojos: población ROJO-K2
(exploración botánica del presente estudio).
Por otra parte, la NOM-059-SEMARNAT-2010, considera:
-
la rareza (Vanilla planifolia es considerada una especie rara, cuyas poblaciones
son biológicamente viables, aunque escasas de manera natural, y restringidas
a hábitat muy específicos);
-
la singularidad o relevancia taxonómica, ecológica;
-
el endemismo o el aislamiento genético, como atributos intrínsecos de la
especie.
Además de subir de categoría a Vanilla planifolia y de hacer valer la Norma, es necesario
el apoyo y la capacitación para el manejo y conservación de esta especie en las
comunidades humanas, la integración de fragmentos de individuos clave en los bancos de
germoplasma y jardines botánicos como el Jardín Botánico Regional Roger Orellana
94
CAPÍTULO IV
(JBR-RO) para su conservación, y la integración de V. planifolia en las estrategias de
propagación para la conservación.
4.2 CONCLUSIONES.
Por más de 20 años y hasta el 2009, Soto Arenas, experto botánico de orquídeas y
vainillas, exploró el sur de México buscando especímenes silvestres de Vanilla planifolia.
Él encontró menos de treinta especímenes silvestres (Bory et al., 2008; Ecott 2004),
debido a que fue pionero en el estudio de esta orquídea y no se contaba con información
suficiente de su biología. Gracias al detalle de los registros y de la información que logró
recopilar Soto-Arenas, en el presente trabajo fue posible localizar un mayor número de
individuos y con ello determinar por primera vez poblaciones naturales de tan importante
orquídea, las cuales representan una fuente importante de diversidad genética. También,
esto ayudo para aportar conocimiento sobre el estado de conservación genética de las
poblaciones silvestres de V. planifolia, y que consideramos está “en peligro de extinción”,
como bien suponía Soto-Arenas (2009; 2006). Tal estado de conservación parece estar
relacionado a la destrucción del hábitat de V. planifolia, al número bajo de individuos y a la
hiperdispersión de los mismos, lo cual limita el entrecruzamiento con mayor frecuencia
entre éstos.
En este trabajo, el uso de marcadores ISSR permitió discriminar entre individuos
silvestres de Vanilla planifolia y los pertenecientes a otras especies de Vanilla presentes
en la MYP, y de esta manera ayudó a asegurar una correcta determinación molecularde la
especie. Además, mediante el uso de marcadores microsatélites, fue posible la
determinación de dos poblaciones al interior de la PYM (Norte y Sur), así como observar
una subestructura compleja al interior de las mismas.
Las conclusiones respecto a las hipótesis planteadas al inicio de esta investigación son
las siguientes:
1.
La distribución geográfica discontinua y el distanciamiento espacial entre
las poblaciones silvestres de Vanilla planifolia presentes en la MYP generan
niveles altos de estructura genética, aspecto que también se ve favorecido por
bajos niveles de flujo genético y procesos de aislamiento por distancia, resultó
95
CAPÍTULO IIV
verdadera. Se observó una estructura compleja al interior de las dos poblaciones
encontradas en la PYM, pudiéndose rastrear 10 grupos genéticos íntimos
(familias). A través de la exploración botánica realizada en la presente tesis, se
confirmó que V. planifolia mantiene una hiperdispersión (Soto-Arenas, 2009) de los
individuos en las poblaciones encontradas, lo que promueve la subestructuración
al interior de las poblaciones. Los patrones de distribución geográfica encontrados
en V. planifolia pudieran ser explicados por los corredores biológicos de los
posibles consumidores ocasionales de los frutos de esta especie (monos araña,
saraguatos, murciélagos, aves, los cuales se observaron en varios sitios del sur de
la PYM).
2.
Considerando el buen estado de conservación de ciertas zonas de la MYP
en donde se desarrolla Vanilla planifolia, sus poblaciones silvestres presentaron
niveles de diversidad genética con una tendencia a ser más altos comparados con
los observados en los cultivares analizados reportados en estudios previos, fue
verdadera. Es necesario resaltar el papel clave de las ANPs en la conservación de
los recursos genéticos, como en el caso de V. planifolia, la cual presentó mayores
niveles de diversidad genética en la población Sur, varios de sus individuos se
encontraron en dos ANPs en la PYM. A pesar de que la mayoría de los sitios
donde se encontró a V. planifolia están fuera de las ANPs, cada una de las
poblaciones encontradas en la PYM tienden a tener mayor diversidad genética que
los cultivares reportados en estudios previos (Borbolla-Pérez et al., 2016; RamosCastella et al., 2016; Busungu, 2009; Lubinsky et al., 2008; Bory et al., 2008;
Sreedhar et al., 2007; Besse et al., 2004; Cibrián, 1999).
Es importante resaltar que Vanilla planifolia está seriamente amenazada en la
naturaleza, por lo que mantener en secreto las localidades precisas de los pocos
individuos silvestres conocidos es de vital importancia para la conservación de este
importante recurso fitogenético.
96
CAPÍTULO IV
4.3 PERSPECTIVAS.
Es necesario continuar con el estudio de la biología de Vanilla planifolia, es decir, su
fenología, los polinizadores, los dispersores; así como continuar con el estudio de su
distribución. Todo esto con el fin de seguir conociendo el estado de conservación de esta
especie en México. Por otra parte, durante la exploración botánica y mediante el análisis
para la discriminación de V. planifolia (Villanueva-Viramontes et al., 2017), se observó que
no solamente V. planifolia se encuentra en peligro de extinción en la PYM, sino también
otras cuatro especies más (V. odorata, V. insignis y V. inodora), las cuales se encontraron
en menor cantidad, no así V. sp., nov. aff. V. phaeantha, la cual se encontró en mayor
número que V. planifolia. Cabe mencionar, que durante la exploración botánica se
encontró un solo individuo de V. inodora, el cual no fue posible preservar, ni tampoco
pudo llevarse a cabo la extracción de su ADN. Con base en lo anterior, se propone
continuar con el estudio de la diversidad y estructura genética del resto de las especies
silvestres de vainilla presentes en la PYM y el resto de México, para su evaluación e
inclusión en la NOM-059-SEMARNAT-2010.
97
CAPÍTULO IIV
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