2. Estudio celular, bacterias, virus, viroides y priones

Métodos de estudio celular
BIOLOGIA CELULAR Y
MOLECULAR
TM. MsC. Willi Quino Sifuentes
CLASIFICACIÓN
I)
Técnicas para el estudio fisicoquímico: sirven para conocer la
composición y relacionar esta composición con las estructuras
celulares. Estos métodos son:
a) Centrifugación
b) Cromatografía
c) Electroforesis
d) Cultivos "in vitro“
Hay un problema:
•
Los componentes de un ser vivo se encuentran formando mezclas muy complejas.
II) Técnicas para el estudio morfológico de la célula. Nos
permiten conocer cómo es su forma, su tamaño y su
estructura. Son, fundamentalmente:
a) Microscopía óptica
b) Microscopía electrónica:
1) Microscopio electrónico de Trasmisión (MET)
2) Microscopio electrónico de barrido (MEB)
A) CENTRIFUGACIÓN
Consiste en la separación de los componentes de una mezcla en función de las diferencias
entre las velocidades que presentan al someterlos a elevadas rpm.
Esta técnica requiere los siguientes pasos:
1) FRACCIONAMIENTO U HOMOGENEIZACIÓN:
Obtendremos así una "papilla" que estará compuesta de restos de
membranas, orgánulos celulares, núcleos, moléculas libres y agua
2) CENTRIFUGACIÓN:
B) CROMATOGRAFÍA
Se fundamenta en la separación de los componentes de una mezcla por sus diferencias de
absorción. Éstas diferencias van a ser debidas a las fuerzas de Van der Wals que se establecen
entre los componentes de la mezcla y una sustancia que actúa de fase estacionaria. Según la
naturaleza de la fase estacionaria, tendremos los siguientes tipos de cromatografía:
1) CROMATOGRAFÍA SOBRE PAPEL:
2) CROMATOGRAFÍA DE GASES
El aparato consiste en un serpentín largo y delgado (fase estacionaria). La mezcla a separar se vaporiza y
atraviesa el serpentín transportada por un gas. La fase estacionaria retiene más o menos los diferentes
componentes de la mezcla. Éstos se detectan cuando al atravesar una llama entran en combustión, lo que
aumenta la conductividad eléctrica del detector.
C) ELECTROFORESIS
Naturalmente este método se empleará con sustancias que presenten cargas
eléctricas (proteínas y ácidos nucléicos)
D) CULTIVOS IN VITRO
•
•
Estos métodos nos van a permitir mantener líneas celulares en el exterior de un organismo
en condiciones favorables a su multiplicación. La gran ventaja va a ser la facilidad para el
tratamiento del material biológico y su estandarización.
Las células extraídas deben mantenerse para su cultivo en un medio con las condiciones
físicas y químicas adecuadas y suministrarles aquellas sustancias que ellas no son capaces de
sintetizar. En la actualidad se venden medios de cultivo concretos para cada tipo celular y que
permiten mantener los cultivos durante largos períodos de tiempo.
II) MÉTODOS MORFOLÓGICOS
•
•
Los métodos morfológicos nos van a permitir la observación directa de la estructura celular.
El ojo humano puede distinguir a 25 cm dos objetos separados entre sí 0,2 mm. Éste es el
poder separador o poder de resolución del ojo. Las células de mamífero suelen tener unos
0,01 mm, por lo que no es posible verlas a simple vista y mucho menos observar en ellas
detalles estructurales. El microscopio va a permitir su observación al aumentar el poder de
resolución del ojo
CLASES DE MICROSCOPIOS
A) MICROSCOPIO ÓPTICO O FOTÓNICO
1) FUNDAMENTO:
Funciona de la siguiente manera: Una fuente luminosa
envía rayos de luz a una primera lente, llamada
condensador, que concentra los rayos de luz sobre el
objeto a observar. Estos rayos atraviesan el objeto y una
lente denominada objetivo da una imagen aumentada de
éste. Una segunda lente, el ocular, vuelve a aumentar la
imagen dada por el objetivo. Esta última imagen es la
que será recibida por el observador.
2) PREPARACIÓN DEL MATERIAL: En el microscopio óptico la luz atraviesa el objeto a observar. Si
éste es muy grueso, la luz no lo atravesará y el objeto aparecerá demasiado oscuro; además se
superpondrán los diferentes planos dando una imagen borrosa. Si el objeto es demasiado
delgado o muy transparente, no se observarán sus estructuras. En cualquier caso, deberemos
realizar una preparación.
En general, una preparación requiere las siguientes etapas
a- CORTE. Los objetos demasiado gruesos son cortados mediante aparatos denominados
micrótomos. Éstos permiten realizar cortes de apenas unas micras de grosor, corrientemente
entre 3 μ y 20 μ.
b- FIJACIÓN. Su fin es matar a las células con la menor alteración de las estructuras posible, para
evitar las modificaciones que pudiesen producirse posteriormente por el metabolismo celular o
por la descomposición.
c- DESHIDRATACIÓN. La extracción del agua del interior de las células permitirá también una
mejor conservación y la penetración de los colorantes.
d- TINCIÓN. Es la coloración de las células o de partes de éstas para que resalten y posibilitar así
su observación. Algunos colorantes son selectivos pues tiñen partes concretas de la célula.
Existen dos clases de colorantes:
1) Los colorantes vitales. Que tiñen las estructuras celulares pero sin matar a las
células (por ejemplo: el verde jano, el rojo neutro, el azul tripán, el azul de metileno).
2) Los colorantes no vitales. Que matan a las células (eosina, hematoxilina).
e- MONTAJE. Una vez realizadas las anteriores operaciones el material se coloca entre
un porta-objetos y un cubre-objetos. Para un montaje no definitivo, se coloca entre
"porta" y "cubre" una gota de glicerina. Este tipo de preparaciones tiene una duración
limitada y sólo sirven para la observación momentánea o a lo sumo de unos días. Si se
desea una mayor duración debe realizarse el montaje en gelatina-glicerina .
B1) EL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE TRANSMISIÓN (MET)
FUNDAMENTO:
El microscopio electrónico fue puesto
a punto en 1931 a partir de los
trabajos teóricos de De Broglie.
Los electrones pueden comportarse
como ondas o como partículas. Como
ondas pueden llegar a tener una
longitud 100.000 veces menor que la
luz visible. Al ser partículas negativas
pueden ser desviadas por campos
eléctricos que actúan como lentes.
Los
microscopios
electrónicos
permiten aumentos útiles que van de
2000 a 100.000 pudiendo llegar hasta
600.000.
Los
microscopios
electrónicos son aparatos de hasta 2
m de alto y llegan a pesar 500 kg.
B2) MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE BARRIDO (MEB)
Este tipo de microscopio permite
obtener imágenes tridimensionales
del objeto a estudiar.
Primero se efectúa un sombreado
metálico de la superficie de la
muestra, y la réplica obtenida es
barrida por un haz de electrones.
Los electrones secundarios que se
forman son captados y convertidos
en imágenes sobre una pantalla de
televisión.
Estos microscopio son muy útiles
para revelar estructuras anatómicas
submicroscópicas, sin embargo su
aumento no suele pasar de 20.000
Ernst Ruska
Tinción de células para
la observación microscópica
Extensión de una fina capa
de células sobre el porta
Adición del colorante
lavado y secado
Secado al aire
Fijación por flameado del porta
Se coloca una gota de aceite
de inmersión sobre el porta y
se observa con el objetivo de
100X
Tinción de Gram
Tinción del frotis
Paso 1
Paso 2
Previamente fijado al calor,
con cristal violeta
Durante 1 minuto.
Todas las células se tiñen
de color azul-violeta.
Añadir Lugol,
dejar actuar 2 minutos
Todas las células siguen
de color azul-violeta.
Gram +
Decolorar con alcohol
Paso 3
Las células Gram +
siguen de color azul-violeta.
Las Gram negativas
se decoloran.
Tinción de contraste
Con safranina 2 minutos.
Las células G+
se ven azul-violeta.
Paso 4
Las G- rosas o rojas.
Gram -
FORMA DE LAS BACTERIAS
cocos
bacilos
espirilos
L. Monocytogenes
V. cholerae
Helycobacter pylori
Campylobacter sp.
FLORA NORMAL VAGINAL
lactobacilos
célula epitelial
Streptococcus
Cocos gram positivos
Bacilos Gram negativos
TINCIÓN DE GRAM: APLICACIONES
•
•
•
•
•
•
LCR y otros fluidos estériles
Esputo
Exudado uretral
Exudado vaginal
Exudados inflamatorios
Orina
33
Microbiología Clínica: Tema 1
INFORMACIÓN QUE APORTA UNA TINCIÓN DE GRAM EN
MUESTRAS CLÍNICAS (EXUDADOS INFLAMATORIOS Y FLUIDOS
ESTÉRILES)
• Permite evaluar la calidad de la muestra. Presencia
de:
– Células inflamatorias → muestra adecuada
– Células epiteliales → posible contaminación
• Permite visualizar la morfología, su disposición y
localización intra o extracelular de las bacerias
• Permite diferencias bacterias Gram + y Gram –
• Permite detectar la presencia de flora contaminante
• Permite cuantificar el número de bacterias
34
Microbiología Clínica: Tema 1
Coloración de Ziehl- Neelsen
Bacterias, virus, viroides, y priones
BIOLOGIA CELULAR Y
MOLECULAR
TM. MsC. Willi Quino Sifuentes
BACTERIA (HISTORIA)



Anton van Leeuwenhoek (1683) observó la
bacteria por primera vez.
Ehrenberg (1828) propuso el nombre de
bacteria derivado del griego “BAKTER”
bastón .
Louis Pasteur (1822-1895) y Robert Koch
(1843-1910) describieron el papel de la
bacteria como causa de enfermedades.
MORFOLOGIA DE LAS BACTERIAS
Salmonella enteritidis
MEMBRANA CITOPLASMÁTICA
GRAM POSITIVA
GRAM NEGATIVA
DIFERENCIAS
• GRAM POSITIVA
• GRAM NEGATIVA
Es mas ancha.
10% de la estructura es
peptidoglicano.
El 90% esta constituida por
peptidoglicano.
Capa adicional de Lipopolisacáridos
10% acido teicoico.
PORINAS
ZONA PERIPLASMATICA
Locomoción
polar
lofotricos
anfitricos
peritricos
FIMBRIAS
• Son estructuras opcionales producidas por
algunos microorganismos.
• NO PARTICIPAN EN LA MOTILIDAD.
• Son más cortos que los flagelos y más
numerosos.
• Son de naturaleza proteica.
• Son estructuras que participan en la fijación
de los microorganismos a los tejidos del
huésped.
PILI/PELOS
• Son estructuralmente similares a las fimbrias.
• Son más largos y solo existe uno o unos pocos
sobre la superficie.
• También participan en el mecanismo de
patogénesis.
• Participan en el proceso de conjugación.
CAPA “S”
• PARACRISTALINA.
• Capa superficial formada por una
disposición bidimensional de proteínas.
• Protege a la bacteria de mecanismos de
defensa del hospedador.
Endosporas
• Endospora
– Estrucutra de supervivenvia.
– Resistente a:
•
•
•
•
•
•
Calor
Disecación
Radiación
Ácidos
Desinfectantes
Químicos fuertes
– Presente en bacterias del suelo
– Su descubrimiento ayudó al desarollo de métodos y
técnicas adecuadas de esterilización
Factores que afectan el crecimiento
– Oxígeno
• Aeróbico
• Anaeróbico
– pH
• Acidofílicos (+)
• Alcalófilos (-)
– Temperatura
• Psicrofilos (10-15°C)
• Psicrotolerante (15-30°C)
• Termófilo (45-80°C)
• Mesófilo (30-40°C)
• Hipertermófilo (80°C o mas)
DIVISIÓN CELULAR
Virus
Características
• Elementos genéticos
• Los virus, para poder multiplicarse deben obligadamente entrar en una
célula.
• Los virus, aprovechan la maquinaria metabólica de la célula huésped.
• Los virus integran su material genético en el de la célula huésped,
adquiriendo todas las características y propiedades, como por ejemplo el
carácter de heredabilidad.
• Los virus adquieren un carácter patógeno debido a que durante su
replicación al interior de la célula huésped, se produce la destrucción de
esta.
Virus
• Partícula viral completa formada por
moléculas de ADN o ARN y rodeada por
una cubierta de proteínas simple o
compleja formada por carbohidratos,
lípidos y proteínas.
Fase extracelular
• Los virus son incapaces de reproducirse y no
realizan funciones enzimáticas.
Fase intracelular
• Son considerados como ácidos nucleicos que
se replican e inducen el metabolismo de la
célula huésped para sintetizar todos los
componentes del virión.
Clasificación de los virus en
función de sus genomas
Clasificación de los virus en
función de sus huéspedes
Virus
de
Bacterias
Virus
de
Plantas
Virus
de
Animales
Virus Bacterianos,
Bacteriófagos
Cáncer
Virus
Genoma
Leucemia de
Células T
Leucemia Humana
RNA
Linfoma de Burkitt
Epstein-Barr
DNA
Carcinoma
Nasofaringeo
Epstein-Barr
DNA
Carcinoma
hepatocelular
Hepatitis B
DNA
Cáncer cervical y de
piel
Papiloma
DNA
Son agentes patógenos formados por una proteína ( proteína del prión o PPr ).
Producen entre otras, la enfermedad de las "vacas locas" o encefalopatía
bovina espongiforme. Esta proteína se acumula en el cerebro de animales
enfermos , dando lugar a la estructura esponjosa de la corteza cerebral que da
nombre a la enfermedad.
Los priones, o las enfermedades producidas por priones, tienen un
comportamiento sorprendente, por un lado se transmiten verticalmente ,
como cualquier enfermedad hereditaria típica, mientras que por otro lado se
comportan de manera infectiva, transmitiéndose horizontalmente, mediante
contagios que pueden darse entre individuos de distintas especies.
La proteína del prión (PrP) normal, tiene una secuencia de aminoácidos,
(estructura primaria) idéntica a la proteína del prión patógena. La diferencia
entre las dos recae en la estructuras secundaria y terciaria.
Puede ocurrir que la proteína patógena infecte individuos que producen proteína normal (a), como ha ocurrido
por ejemplo al consumir las vacas piensos elaborados a partir de ovejas enfermas. En este caso la
proteína patógena origina un cambio conformacional de la proteína normal (b), transformando las hélices
alfa de su estructura proteíca en láminas beta. Las nuevas proteínas patógenas inducen el cambio en otras
normales, lo cual produce un efecto de "cascada".