Evaluación y Determinación de Actividades Biológicas de Muestras de Microalgas y Macroalgas para el Establecimiento de Valor Añadido y Potencial de Explotación Proyecto Algabiomac (MAC/3/C217) (www.algabiomac.com) Octubre de 2015, La Laguna, Tenerife, Islas Canarias, España Autores: Rafael Zárate Méndez (PhD) Raquel Ramírez Moreno (PhD) Ana Rodríguez López Ángel Ponce López ÍNDICE 1.-­‐ OBJETIVOS ........................................................................................................ 6 2.-­‐ INTRODUCCIÓN................................................................................................ 8 2.1.-­‐ Importancia de los Productos Naturales en el desarrollo de fármacos ...................... 9 2.2.-­‐ Descubrimiento de fármacos.................................................................................. 10 2.3.-­‐ Pasos iniciales en el desarrollo de fármacos. Búsqueda de bioactividades ............. 12 2.4.-­‐ Algas, alimentación y búsqueda de fármacos ......................................................... 15 3.-­‐ MATERIALES y MÉTODOS ............................................................................... 19 3.1.-­‐ Obtención de extractos ....................................................................................... 20 3.2.-­‐ Extracción supercrítica con CO2 ............................................................................ 21 3.2.1.-­‐ Pre-­‐tratamiento ......................................................................................................21 3.2.2.-­‐ Proceso de extracción ............................................................................................21 3.2.3.-­‐ Extracción con disolventes orgánicos: etanol y metanol .......................................23 3.3.-­‐ Bioensayos para evaluar la actividad antibiótica..................................................... 24 3.3.1.-­‐ Cultivo de bacterias................................................................................................26 3.3.2.-­‐ Preparación de los extractos a la concentración de trabajo..................................27 3.3.3.-­‐ Realización de bioensayos .....................................................................................27 3.3.4.-­‐ Elección de la población óptima de bacterias........................................................29 3.3.5.-­‐ Análisis de los datos del bioensayo........................................................................30 3.3.6.-­‐ Determinación de la CIM y CBM ............................................................................31 3.4.-­‐ Ensayos para evaluar la actividad fungicida frente a levaduras ............................ 33 3.4.1.-­‐ Cultivo de levaduras................................................................................................34 3.4.2.-­‐ Preparación de los extractos a la concentración de trabajo ...............................35 3.4.3.-­‐ Realización de bioensayos...................................................................................35 3.4.4.-­‐ Elección de la población óptima de levaduras........................................................37 3.4.5.-­‐ Análisis de los datos del bioensayo.........................................................................38 3.4.6.-­‐ Determinación de la CIM y CBM .............................................................................38 3.5.-­‐ Ensayo para evaluar la actividad fungicida frente a hongos superiores ................ 41 3.5.1.-­‐ Cultivo de hongos ...................................................................................................41 3.5.2.-­‐ Preparación de los extractos a la concentración de trabajo...................................42 3.5.3.-­‐ Preparación de las placas para el bioensayo ..........................................................42 3.5.4.-­‐ Realización de bioensayos ......................................................................................42 3.6.-­‐ Ensayo para evaluar la actividad antitumoral ...................................................... 44 3.6.1.-­‐ Crecimiento y recuento de células en el lector ADAM ...........................................44 3.6.2.-­‐ Preparación de los extractos a la concentración de trabajo...................................45 3.6.3.-­‐ Ensayo de MTT (Methyl Thiazolyl Tetrazolium) ......................................................46 3.6.4.-­‐ Análisis de los datos................................................................................................48 4.-­‐ RESULTADOS y DISCUSIÓN ............................................................................. 50 4.1.-­‐ Actividad antibiótica........................................................................................... 51 4.2.-­‐ Actividad fungicida frente a levaduras..................................................................... 61 4.3.-­‐ Actividad fungicida frente a hongos fitopatógenos .................................................. 68 4.4.-­‐ Actividad antitumoral ............................................................................................. 69 5.-­‐ REFERENCIAS.................................................................................................. 89 4 5 1.-­‐ OBJETIVOS 6 Este proyecto de investigación aplicada de acrónimo ALGABIOMAC, impulsado desde la FICIC y en conjunto con los otros socios participantes, constituye una clara apuesta por conocer y explorar la rica y extensa biodiversidad de la Región Macaronésica y determinar mediante la búsqueda de bioactividades su potencial y valor añadido. En el marco de este proyecto, el presente informe describe los siguientes objetivos: 1. La obtención de productos naturales a partir de microalgas y macroalgas de la Región Macaronésica. 2. La realización de diferentes bioensayos para conocer el potencial de estos extractos como antibióticos, fungicidas y/o antitumorales. 3. La evaluación y determinación de su valor añadido, su potencial como sustancia bioactiva, para su posible comercialización y creación de una industria biotecnológica capaz de explotar estos recursos marinos. 4. La puesta en valor del laboratorio de bioensayos de FICIC, para la determinación de actividades biológicas de productos naturales, obtenidos de la amplia biodiversidad marina y terrestre de la Región Macaronésica. 7 2.-­‐ INTRODUCCIÓN 8 2.1.-­‐ Importancia de los Productos Naturales en el desarrollo de fármacos Los Productos Natural son compuestos de bajo peso molecular, obtenidos de organismos terrestres o marinos que exhiben estructuras químicas diversas y en muchos casos complejas. Un número elevado de productos naturales son de difícil o imposible síntesis en laboratorio. Se conocen alrededor de 250.000-­‐300.000 productos naturales y cada año se consigue el aislamiento y la elucidación estructural de unos 4.000-­‐5.000 nuevos compuestos. Los productos naturales proveen relevantes actividades en el organismo productor, ofrecen también muchas aplicaciones e interesantes actividades para el hombre y otros seres vivos. Estas estructuras químicas, sintetizadas por los diferentes organismos y/o seres vivos, han sido biológicamente validadas a través de la evolución de dicho productor, interaccionando con muchas o todas las moléculas presentes en las células y biología de dicho organismo. Estos compuestos biológicamente validados a través de la evolución, presentan ventajas competitivas puesto que son moléculas que se han desarrollado y modificado a través de la evolución y validadas en un ambiente biológico, lo que les confiere más estabilidad y funciones en dicho ambiente. Así, los productos naturales están en íntima interconexión con múltiples moléculas tales como enzimas, proteínas, ARN, ADN que les confieren muchas propiedades estructurales y funcionales, presentando una clara especificidad bioquímica y altas afinidades en la unión a su receptor específico (Newman 2008; Dias et al. 2012). Los productos naturales han estado estrechamente relacionados con el hombre durante cientos de años ya que se han utilizado como medicamentos en la medicina tradicional de muchas culturas, además de sus usos como colorantes, nutrientes, venenos, aromas o fragancias (Newman et al., 2000; Newman y Cragg 2012). Cabe destacar que aproximadamente un 50-­‐60% de los medicamentos cotidianamente prescritos en la clínica son de origen natural o derivados sintéticos de éstos, y si nos referimos a los medicamentos antiparasitarios o antitumorales, este porcentaje se eleva a 75-­‐65%, respectivamente. Además, la Organización Mundial de la Salud estima que al alrededor del 80% de la población mundial confía en la medicina 9 tradicional para sus primeras atenciones (Newman et al., 2000; Newman y Cragg 2012). Se pueden citar ejemplos de productos naturales descritos por primera vez en el siglo XIX, que siguen usándose en la actualidad en medicina: la quinina, agente antimalárico; la morfina o codeína, usados como analgésicos; la digoxina, usada como agente antiarrítmico en insuficiencias cardíacas; o la atropina, que se emplea en oftalmología, anestesia y en el tratamiento de enfermedades cardíacas y gastrointestinales (Phillipson 2001). Los productos naturales y sus derivados se han reconocido durante muchos años como una fuente de agentes terapéuticos y de diversidad estructural. Sin embargo, además de su diversidad de estructuras químicas y su biodiversidad (presencia en multitud de organismos que los fabrican para mantener su fisiología e interacción con su medioambiente), el desarrollo de nuevas tecnologías ha revolucionado el cribado de productos naturales permitiendo cierto grado de automatización y rapidez para el descubrimiento de nuevos fármacos. La aplicación de estas tecnologías de cribado compensa claramente las limitaciones en el estudio de los productos naturales y ofrecen una oportunidad clara para reestablecer el interés y potencial de estos compuestos como la fuente principal de moléculas de partida para el desarrollo de medicamentos (Lalhou 2013). 2.2.-­‐ Descubrimiento de fármacos El desarrollo de nuevos medicamentos es un proceso complejo, de muy largo tiempo y en la mayoría de los casos muy costoso. El tiempo que va desde el descubrimiento de un nuevo fármaco, hasta su llegada a la clínica es de aproximadamente 12 años, con más de mil millones de dólares de inversiones en el contexto actual (Fig. 2.1). En esencia, el nuevo descubrimiento de fármacos implica la identificación de nuevas entidades químicas o extractos con pocos o múltiples metabolitos que ofrezcan algún tipo de bioactividad (antitumoral, antibiótica, antifúngica, antiinflamatoria, etc.). Estos compuestos pueden provenir de diferentes 10 orígenes, ya sea a través de síntesis química o semisíntesis partiendo de una producto inicial, o mediante el aislamiento de productos naturales como lo tratado en este proyecto. Figura 2.1.-­‐ Esquema que resume los pasos a seguir para el desarrollo de fármacos. Los humanos inicialmente encontraron estas sustancias activas a partir de fuentes naturales, plantas principalmente, pero también otros seres vivos como ciertos microorganismos, hongos, bacterias, algas, etc. Posteriormente, con el avance en la química se desarrolló la química médica que trata de la fabricación de moléculas con actividad medicinal, generalmente usando como moldes moléculas aisladas de fuentes naturales. Más recientemente, se desarrolló la química combinatorial (Kennedy et al. 2008), metodología que permite el diseño racional de compuestos que se dirigen para afectar a dianas moleculares específicas, con la posterior síntesis de miles de compuestos y la generación de grandes quimiotecas de productos, a partir de una 11 mezcla simple de ingredientes y pocas reacciones químicas, realizadas casi en el mismo recipiente (Nikolaou et al. 2000; Ji et al. 2009). Estas moléculas son posteriormente evaluadas para probar su actividad biológica mediante métodos de cribado automatizados, lo que ha permitido grandes avances en la generación de nuevas moléculas y su posterior evaluación. Sin embargo, y a pesar del éxito en esta metodología sintética y la generación de gran número de moléculas, éstas en la gran mayoría de los casos han fallado en su capacidad para mostrar la actividad biológica buscada. Al sintetizar moléculas nuevas mediante la química combinatorial, en contraposición a los productos naturales que se sintetizan por los diferentes organismos y que están moduladas a través de miles o millones de años de evolución biológica y la gran mayoría presentan bioactividad, a pesar del éxito que se esperaba, la química combinatorial ha demostrado ser menos eficaz en términos de tasa de éxito global y obtención de productos bioactivos con claro potencial, lo que frenó este tipo de abordaje en el desarrollo de nuevos medicamentos, y forzó el retorno a la búsqueda de estas sustancias a partir de fuentes y productos naturales como originariamente se desarrolló. Así, la popularidad de los productos naturales continuará, simplemente porque son una fuente incomparable de nuevos líderes de fármacos y una inspiración para la síntesis de moléculas no naturales lo que contribuirá otra vez a conseguir nuevos éxitos en el desarrollo de nuevos medicamentos empleando esta fuente de moléculas (Ji et al. 2009; Molinari 2009; Katiyar et al. 2012). 2.3.-­‐ Pasos iniciales en el desarrollo de fármacos. Búsqueda de bioactividades Como se ha citado anteriormente y como se presenta en la Fig. 2.1, el desarrollo de fármacos es un proceso que conlleva abordar diferentes pasos. El primero consiste en diseñar o fijar la identificación del objetivo, que se refiere a la determinación del tipo de diana o patología para la que se busca diseñar un nuevo 12 fármaco (ej. antibiótico, fungicida, antitumoral, antiinflamatorio, antidiabético, etc.). Una vez establecido este objetivo, le sigue la selección del líder, entendiéndose como la búsqueda de un compuesto que muestre la actividad deseada, para lo cual se llevan a cabo estudios de bioactividad in vitro o in vivo realizándose bioensayos para determinar muestras positivas que muestren la actividad deseada a una concentración mínima lo suficientemente atractiva para continuar su estudio. En esta fase se suelen emplear bien extractos, o fracciones de estos o en otros casos compuestos aislados y purificados. En esta fase y cuando se alcanza un resultado positivo, el siguiente paso es identificar que compuesto es el causante de esta bioactividad. Así, pasamos al siguiente escalón en el esquema presentado, la fase de optimización del líder. Para ello y una vez elucidada su estructura se lleva a cabo química médica que persigue la síntesis e introducción de modificaciones en la estructura química del compuesto con el objetivo de aumentar o mejorar su bioactividad, así como otras propiedades farmacológicas y farmacocinéticas de dicho compuesto. Las siguientes fases son ya de la evaluación del producto optimizado, adentrándose en el desarrollo preclínico, que entre las metas a alcanzar se encuentran la determinación de los mecanismos de acción de esta molécula o compuesto en el organismo, la determinación de su toxicidad y dosis adecuada, así como conocer su farmacocinética y farmacodinámica, junto con la determinación de la absorción, distribución, metabolismo y excreción de la molécula en el entorno celular empleado como modelo, generalmente líneas celulares o roedores. A esto le sigue el desarrollo clínico, en sus diferentes fases I, II y III, en donde se evalúa la eficacia del producto en humanos, seleccionando individuos sanos o pacientes enfermos con la patología para la que se está desarrollando el fármaco, además de determinar la seguridad, ajuste de dosis, y disponibilidad. Finalmente, se llega a la fase de mercado que conlleva la comercialización y entrada en el mercado, ofreciendo un nuevo producto para su uso terapéutico y también para conseguir recuperar la inmensa inversión realizada en el desarrollo del nuevo fármaco o producto (Herrling 2005; Hughes et al. 2011). Los primeros pasos en el proceso de búsqueda y desarrollo de nuevos fármacos contemplan la realización de bioensayos para determinar el interés de una muestra por su capacidad para producir una determinada bioactividad (Figura 2.2). Los bioensayos o ensayos de bioactividad estiman la concentración y potencia de un 13 compuesto o extracto mediante la medida de su respuesta biológica en sistemas vivos, bien empleando células, tejidos, microorganismos, enzimas aisladas, etc. Figura 2.2.-­‐ Bioensayos como pasos para determinar el potencial de una muestra para su desarrollo como fármaco. Los bioensayos persiguen seleccionar un compuesto líder sobre el que seguir avanzando para desarrollarlo como fármaco o producto activo para sus distintas aplicaciones. Estos ensayos se pueden realizar bien con un compuesto puro, con un extracto que presenta múltiples componentes o una fracción de éste (Rahman et al. 2005; Liu 2011; Barreto y Simoes 2012). El bioensayo es un experimento que evalúa y determina la actividad de un extracto o compuesto contra una diana biológica. Existen multitud de tipos de bioensayos, citándose los siguientes: 1) una reacción química indicativa de un efecto en un sistema vivo (ej. antioxidante) 2) interferencia con un sistema subcelular ej. enzima, receptor, organela 3) inhibición de crecimiento de un microorganismo ej. bacteria, hongo 4) citotoxicidad o parada del crecimiento de células en cultivo (animal, cáncer, 5) toxicidad contra invertebrados vivos como modelo de organismo entero. etc.) 14 Existen multitud de bioensayos, dependiendo del interés de la investigación y recursos disponibles, se pueden realizar bioensayos tales como: a) antiparasitarios: por ejemplo con el empleo de nemátodos como sistema b) insecticida: empleando bien el propio insecto, o su larva. c) antibiótico: con el método tradicional de un antibiograma o con cultivo en d) antifúngico: enfrentamiento de dos hongos para conocer su capacidad e) citotoxicidad: método MTT, cultivo de líneas celulares de cáncer tratadas En este proyecto se ha abordado la primera fase de este proceso de desarrollo biológico. multipocillo siguiendo el método de microdilución. inhibitoria contra un hongo diana. con la muestra para conocer la capacidad antitumoral. de nueva sustancia bioactiva o fármaco, determinándose el tipo de diana a evaluar (objetivo), en nuestro caso la determinación de capacidad antibiótica, fungicida y antitumoral, realizadas con muestras obtenidas de micro-­‐ o macroalgas marinas de la región de la Macaronesia como se presenta en este informe. 2.4.-­‐ Algas, alimentación y búsqueda de fármacos Desde la antigüedad, los primeros usos que los humanos otorgaron a las algas fueron utilizarlas como parte de la dieta tradicional, principalmente para las comunidades costeras. Hoy en día continúan siendo muy populares y como ingredientes cotidianos en la dieta del Asia Oriental, especialmente en Japón, China y Corea. Recientemente, las algas tanto macroalgas como microalgas, en especial estas últimas, han despertado mayor interés por ser un alimento muy nutritivo, conteniendo multitud de elementos nutritivos con numerosos beneficios para la salud. Se conocen por ser alimentos con bajo contenido calórico y lipídico y con una elevada concentración de proteínas, en algunos casos llegando a contener un 70-­‐75% de su 15 peso, minerales (Mg, Ca, K, P, I), vitaminas, y carbohidratos indigeribles; y un importante contenido en fibra que oscila entre el 33-­‐75%. Además de su atractivo como nutrientes, de estas algas se extraen importantes productos que se explotan para múltiples aplicaciones, tales como agentes gelificantes, espesantes y estabilizantes, utilizados en variadas aplicaciones en la industria agroalimentaria, en artículos del hogar y productos biomédicos. A partir de estos se fabrican productos cotidianos tales como pasta dentífrica, cosméticos, champú, alimentos para animales, comidas para bebés, derivados lácteos, cremas, sopas de preparación instantánea, helados, etc. claros ejemplos de la presencia y utilidad de las algas marinas para los humanos (Holdt y Kraan 2011; Bishop y Zubek, 2012; Priyadarshani y Rath 2012; Mouritsen 2013). En las últimas dos décadas se ha desarrollado un gran movimiento científico centrado en la búsqueda de sustancias bioactivas procedentes de las algas marinas principalmente, pero también terrestres, como fuentes para el desarrollo de nuevos fármacos a partir de estas sustancias mostrando actividad biológica. Así, se ha conseguido la determinación de múltiples compuestos con atractivas actividades biológicas, algunos de los cuales han permitido desarrollar nuevos fármacos para la lucha contra diferentes patologías que afectan a humanos, y otras aplicaciones en alimentación (nutracéuticos) o cosmética, etc. (Skulberg 2000; Vegunopal 2009; Ahmed et al. 2014). Este abordaje está permitiendo evaluar este medio marino desde esta perspectiva y ha concretado el potencial que la biodiversidad marina ofrece para el desarrollo de nuevos medicamentos, la determinación de nuevas moléculas diana sobre las que realizar semisíntesis que permitirá generar una batería de compuestos similares que comparten elementos estructurales en sus moléculas para mejorar y optimizar sus propiedades para su uso terapéutico (Boopathy y Kathiresan 2010; Stirk et al. 2007; Simmons et al. 2005). En este contexto, y como se diseñó para este proyecto Algabiomac, la Actividad 1, titulada “Evaluación y determinación de actividades biológicas de muestras de microalgas y macroalgas para el establecimiento de valor añadido y potencial de explotación”, enmarcada bajo el Objetivo Específico 1 “Evaluación, determinación y extracción de sustancias bioactivas, tanto de microalgas como de 16 macroalgas de las regiones de la Macaronesia (y país tercer vecino) tras la cooperación en investigación y desarrollo tecnológico para el desarrollo de nuestras industrias”, se llevó a cabo el estudio de bioactividades con las muestras elaboradas. Con la participación de todos los socios del consorcio, estos resultados persiguían estudiar la viabilidad y desarrollo de industrias biotecnológicas que explotarán estos recursos marinos, estudiándose tanto las macroalgas procedentes de arribazones o asociadas a granjas marinas, como las microalgas seleccionadas y cultivadas. Las islas oceánicas, entre las que se encuentran las de la región macaronésica, constituyen reductos fascinantes para el estudio de la evolución de los organismos que viven en ellas. La región macaronésica, dentro de la Unión Europea, se compone de los archipiélagos: Islas Azores y Madeira y las Islas Canarias y un tercer territorio no incluido en la UE pero comprendido en el eje 3 de esta convocatoria, las islas de Cabo Verde. Esta región macaronésica es considerada como uno de los principales centros de concentración de biodiversidad y es uno de los 25 puntos calientes de biodiversidad a nivel mundial, especialmente por su alto contenido en especies y subespecies endémicas. Esta gran biodiversidad, y sobre todo la concentración de endemismos tanto terrestres como marinos en la región macaronésica, constituyen un potencial inigualable para el desarrollo de productos biológicos y terapéuticos con un amplio margen de aplicación en industrias tan potentes como la farmacéutica, alimentaria, biotecnológica. La determinación y caracterización de especies de microalgas atractivas por su potencial biotecnológico y para su explotación comercial, y también análogamente, la determinación y caracterización de especies de macroalgas igualmente atractivas por su potencial biotecnológico y para su explotación comerciales, son unas de las metas principales de este proyecto. Para poder determinar el interés y el potencial de las especies seleccionadas y establecer un valor añadido, es obligado evaluar la actividad biológica de las muestras extraídas y preparadas en este proyecto, mediante el desarrollo de diferentes bioensayos que nos permitan conocer diversas propiedades y determinar su valor añadido, estudiándose su capacidad anticancerígena, antibiótica y antifúngica como se ha llevado a cabo. Esta actividad 1 es pivotante, constituye un eje prioritario de Algabiomac, y se realiza con la participación de todos los socios, incluyendo las tareas de selección, 17 crecimiento (para el caso de las microalgas), recolección (para el caso de las macroalgas), tratamiento y manipulación (socio ITC); seguido de su extracción y obtención de muestras, empleando tecnologías novedosas de extracción supercrítica que utiliza CO2 como “disolvente” (socio AICA) y finalmente la evaluación de bioactividades y determinación de la capacidad antibiótica, fungicida y antitumoral de los extractos obtenidos (socio FICIC), tarea que ha ocupado todo el tiempo de realización del proyecto. En los próximos capítulos se describen con detalle, el desarrollo de todos los estudios de bioactividad llevados a cabo y los ensayos realizados, resaltándose los resultados más prometedores para la explotación de estos recursos marinos investigados en este proyecto y señalando el interés y potencial de algunos de los resultados obtenidos. 18 3.-­‐ MATERIALES y MÉTODOS 19 3.1.-­‐ Obtención de extractos Para la obtención de productos naturales marinos se seleccionaron un total de 14 especies, 4 macroalgas y 10 microalgas (Tabla 3.1). Este material se ha recolectado en diferentes localizaciones y también obtenido mediante cultivos de diferentes especies de la región Macaronésica, mayormente del Archipiélago Canario, por el socio ITC. Especie Lobophora variegata Cystoseira abies-­‐marina Grateulopia turuturu Dictyota sp. Arthrospira sp. (cianobacteria) Isochrysis galbana Tetraselmis striata Lyngbya majuscula Navicula salinicola Dunaniella tertiolecta Dunaniella salina var. Janubiensis Dunaniella salina 421 R8 ITC C22/07/14 AIFA Porphyridium sp. Haematococcus pluvialis Tipo de alga macroalga macroalga macroalga macroalga microalga (cianobacteria) microalga microalga microalga (cianobacteria) microalga (diatomeas) microalga microalga microalga microalga microalga Tabla 3.1.-­‐ Especies de algas estudiadas en el proyecto Algabiomac Los productos naturales o extractos de algas generan una combinación de varios tipos de compuestos químicos con diferente polaridad y con posible actividad biológica. En este proyecto hemos empleado distintos métodos de extracción, tales como extracción supercrítica con CO2, desarrollada por el socio de Madeira (AICA) en sus instalaciones, y la extracción con disolventes orgánicos llevada a cabo en el laboratorio de FICIC (La Laguna, Tenerife). Los diferentes extractos crudos obtenidos fueron ensayados, como una primera aproximación, para determinar su potencial como productos bioactivos y su posible 20 explotación futura; investigándose tres bioactividades diferentes: antibiótica, fungicida y antitumoral. 3.2.-­‐ Extracción supercrítica con CO2 3.2.1.-­‐ Pre-­‐tratamiento Puesto que la pared celular es la principal barrera para el proceso de extracción, las muestras de microalgas (Navicula salinicola y Tetraselmis striata) se homogenizaron antes del proceso de extracción supercrítica con CO2. En un matraz de vidrio se añadieron 40 gramos de microalga, 20 gramos de microesferas de vidrio y aproximadamente 50 mL de acetona. Con el fin de romper las paredes celulares, esta mezcla se agitó con vortex. Luego se transfirió a otro recipiente y el disolvente se dejó evaporar. Esta operación se repitió hasta que se alcanzó la cantidad total de biomasa requerida para la extracción con CO2 supercrítico. 3.2.2.-­‐ Proceso de extracción La extracción supercrítica con CO2 suscita un gran interés, porque es una extracción más segura que la que se realiza con disolventes orgánicos y más respetable con el medio ambiente por no emplear disolventes orgánicos. Además, este proceso requiere un tiempo más corto y unas condiciones de funcionamiento moderadas. Las muestras de microalgas se sometieron a extracción supercrítica con CO2, en un aparato de flujo comercial modificado (Figura 3.1). Partiendo de aproximadamente 600 g de biomasa de cada una de las especies. El CO2 líquido con una pureza del 99,995% fue suministrado por Air Liquide (Portugal) fluye desde el cilindro, comprimiéndose a la presión deseada en el recipiente de extracción, que se calienta hasta una temperatura predeterminada para realizar la extracción. Con el fin de obtener extractos de diferente composición, se crearon unas determinadas condiciones de presión y temperatura en el primer y segundo separador/colector 21 (Figura 3.1 "separator"). Los extractos se recolectaron después de que una cantidad específica de CO2 hubiera pasado a través de la masa de microalgas y algunos otros detalles de extracción como se citan en la Tabla 3.2, resultando en los extractos crudos para su evaluación de bioactividades. Figura 3.1.-­‐ Esquema del sistema de extracción supercrítica con CO2 Especie Condiciones de la extracción Isochrysis galbana CO2 (30.0 g min-­‐1) + etanol, 350 bares, 40⁰C, 2.5 h Dunaliella salina CO2 (70.0 g min-­‐1), 350 bares, 40⁰C, 5 h Dunaliella tertiolecta CO2 (30.0 g min-­‐1), 300 – 500 bares, 40⁰C, 5.5 h Navicula salinicola CO2 (30.0 g min-­‐1) + etanol, 300 bares, 40⁰C, 3 h Tetraselmis striata CO2 (60.0 g min-­‐1) + etanol, 400 – 600 bares, 40⁰C, 3 h Tabla 3.2.-­‐ Condiciones de extracción para cada microalga (tasa de flujo de CO2, presión, temperatura y tiempo de extracción). 22 3.2.3.-­‐ Extracción con disolventes orgánicos: etanol y metanol La biomasa de algunas algas también se extrajo empleando independientemente dos disolventes orgánicos, etanol y metanol. Una vez descongeladas las diferentes biomasas de micro y macroalgas se limpiaron con agua dulce, se les retiró epífitos, restos de arena y partes necrosadas, se volvieron a enjuagar con agua Milli-­‐Q (Merck Millipore©) y se secó con papel de filtro absorbente ejerciendo una ligera presión para retirar la mayor cantidad de agua. Para cada extracción se partió de 25 gramos de material parcialmente seco, éste se troceó manualmente y luego se introdujo en una batidora de vaso HR2094 (Philips©) con 100 mL del disolvente orgánico, bien etanol 96% extra puro (Sharlau©) o metanol 100% (PanReac AppliChem©) según la extracción fuera etanólica o metanólica, respectivamente. El homogeneizado se pasó a un matraz Erlenmeyer (500 mL) junto con los restos de material triturado, que se recuperaron de la batidora añadiendo 100 mL más del disolvente orgánico correspondiente. El homogeneizado contenido en el matraz Erlenmeyer, sellado con una doble capa de papel de aluminio y con un volumen final de 250-­‐300 mL de disolvente, se mantuvo en agitación continua empleando una barra magnética durante 24h a temperatura ambiente. Posteriormente, el extracto final se filtró a través de papel de filtro Whatman del número 1 utilizando un matraz kitasato mediante vacío. Inmediatamente el extracto se concentró en un evaporador rotatorio (rotavapor) a presión reducida y una temperatura constante de 40-­‐45⁰C. Finalmente, el extracto resultante se sacó del matraz redondo, se pesó y se transfirió en viales de vidrio de unos 10-­‐20 mL de capacidad cerrados con tapa hermética que se almacenaron a 4⁰C hasta su uso. En aquellos casos en los que era muy difícil recuperar el extracto del matraz redondo, se usó un volumen mínimo variable de acetato de etilo para resuspender y extraer el extracto final. Este volumen conteniendo el extracto concentrado se transfirió a un matraz Erlenmeyer de 100 mL que se incubó a 37⁰C hasta que lentamente se evaporó el acetato de etilo consiguiéndose el extracto seco final (protocolo adaptado de Kandhasamy y Arunachalam, 2008). 23 Se obtuvieron un total de 98 extractos crudos, a partir de las 14 especies distintas de algas usadas y siguiendo los métodos de extracción descritos, extracción supercrítica con CO2, extracción con etanol y/o extracción con metanol. Para la preparación de disoluciones madre de trabajo de cada extracto, se tomó una cantidad precisa de éste pesándose en una balanza de precisión. Bajo condiciones de esterilidad en una campana de flujo invertido, todos los extractos fueron disueltos en dimetilsulfóxido (DMSO) estéril empleado como vehículo, excepto los extractos F13.2, F74-­‐F79 rico en β-­‐carotenos, F60, F80-­‐F84 ricos en fucoxantina, con reducida solubilidad en DMSO. En estos caso se utilizó como vehículo una mezcla, también estéril, de Kolliphor RH40 (Sigma-­‐Aldrich©): DMSO en la proporción 15:85 (v/v). Los extractos se dispusieron en tubos Eppendorf de 1,5 o 2 mL, a una concentración final de 40 mg/mL (mg de extracto seco/mL de vehículo). Finalmente, se sometieron a agitación en vortex y/o sonicación cuando se precisaba para su completa disolución a temperatura ambiente, y se conservaron a 4⁰C hasta su uso. 3.3.-­‐ Bioensayos para evaluar la actividad antibiótica La actividad antibiótica de todos los extractos se determinó usando como modelo de estudio cuatro especies de bacterias, cuyas características y patogénesis, se describen a continuación. (FDA, 2012). Escherichia coli (E. coli): forma parte de la flora bacteriana presente en el intestino animal, ayudando a la absorción de nutrientes, y necesaria para el proceso digestivo. Pertenecen a la familia Enterobacteriaceae formada por bacilos Gram negativos, anaerobios facultativos, móviles con flagelos perítricos y que no desarrollan esporas. Aunque la mayoría de las cepas no causan problemas, algunas pueden producir infecciones intestinales y extra-­‐intestinales generalmente graves, tales como infecciones del aparato excretor, vías urinarias, meningitis, peritonitis, mastitis, septicemia y neumonía. Es una especia extensamente estudiada y su uso es muy frecuente en la investigación básica así como en la aplicada. 24 Salmonella enterica: está ampliamente distribuida en la naturaleza, puede colonizar el tracto intestinal de los vertebrados, incluyendo el ganado, la fauna silvestre, los animales domésticos y los seres humanos. También puede vivir en otros ambientes, como en el sedimento o en el agua de estanques. Al igual que E. coli, pertenece al grupo de las enterobacterias, bacilos Gram negativos, anaerobios facultativos, móviles con flagelos perítricos y que no desarrollan esporas. Es un agente productor de zoonosis de distribución universal. Se transmite a través de la vía fecal-­‐oral, por vía sexual y por contacto directo o bien contaminación cruzada con agua, alimentos contaminados, etc. Dependiendo del serotipo, puede causar la salmonelosis y la fiebre entérica (tifoidea y paratifoideas). Bacillus subtilis: no se considera una especie patógena para el hombre; sin embargo, puede contaminar los alimentos, pero raramente causa intoxicación alimenticia. Es un bacilo aerobio, Gram positivo y ubicuo. Tiene la habilidad de formar una resistente endospora protectora, que le permite tolerar condiciones ambientales extremas. Algunas variedades de B. subtilis se usan en biotecnología y se comercializan, por ejemplo, como agente de control biológico por su actividad fungicida natural, o como fuente de bajo coste en la producción de bioplásticos, como los polihidroxialcanoatos (PHA). Éste es un organismo modelo de laboratorio, siendo a menudo el equivalente Gram positivo de E coli. Staphylococcus aureus: es un reconocido patógeno humano, ampliamente distribuido por todo el mundo. Habita en las mucosas y en la piel, formando parte de la microbiota normal humana. Son pequeñas bacterias esféricas (cocos), Gram positivas, anaerobias facultativas, inmóviles y no esporuladas. S. aureus es el agente etiológico de un amplio espectro de infecciones, que van desde cutáneas y mucosas, relativamente benignas, hasta otras que comprometen la vida 25 como meningitis, sepsis, endocarditis, neumonía, etc. El aparato gastrointestinal también se puede ver afectado, ya sea por la presencia física de la bacteria o por la ingesta de la enterotoxina estafilocócica. Además, es el principal causante de las infecciones nosocomiales, siendo el principal grupo de riesgo los pacientes hospitalizados o inmunodeprimidos. 3.3.1.-­‐ Cultivo de bacterias Las diferentes cepas bacterianas se crecieron en un matraz Erlenmeyer (125 mL) esterilizado con 18 mL de medio nutritivo TSB (Tryptic Soy Broth) estéril (Scharlab, Barcelona), al que se le añadieron 20-­‐40 µL de un cultivo anterior, o una porción del tamaño de una lenteja del stock del microorganismo conservado en un stock de glicerol al 25% a -­‐20⁰C. Las bacterias se incubaron durante 24h a 37⁰C con agitación orbital de 250 rpm en oscuridad. Tras esta incubación, se midió la absorbancia a 600 nm, tomando asépticamente 1 mL del cultivo, y como blanco 1 mL de medio TSB (este valor de absorbancia es orientativo, debe estar dentro de un rango, que fue establecido en la optimización del protocolo, para saber que el crecimiento ha ido bien y se puede continuar con el ensayo empleando dicho cultivo). A partir del cultivo inicial o pre-­‐inóculo se prepararon diluciones seriadas desde la 10-­‐2 a la 10-­‐5, tal y como se muestra en la Figura 3.2. Figura 3.2.-­‐ Esquema de la preparación de diluciones seriadas a partir del cultivo de bacterias. 26 3.3.2.-­‐ Preparación de los extractos a la concentración de trabajo Cada extracto se ensayó a una concentración final de 50 µg/mL y 100 µg/mL. Para ello se usaron concentraciones de trabajo 2X, de 100 µg/mL y 200 µg/mL, respectivamente. Estas concentraciones de trabajo se prepararon con medio TSB, en tubos Eppendorf de 2 mL y en fresco, es decir en el momento que se realizó el ensayo, a partir del stock de 40 mg/mL conservado a 4⁰C. Se trabajó siempre bajo condiciones asépticas en una campana de flujo invertido. 3.3.3.-­‐ Realización de bioensayos Los bioensayos para determinar si los extractos obtenidos de las algas tenían actividad antibiótica se realizaron en placas plástica de 96 pocillos (VWR International). Cada pocillo se cargó con 100 µL del cultivo de bacterias individualmente a dos diluciones 10-­‐4 y 10-­‐5, más 100 µL del extracto a la concentración de trabajo correspondiente (volumen final en cada pocillo 200 µL). En cada placa multipocillo se incluyó un control negativo (100 µL del cultivo + 100 µL de medio TSB con la misma concentración de vehículo usada para disolver los extractos), un control positivo (100 µL del cultivo + 100 µL de 25 unidades de la mezcla de antibióticos estreptomicina/tetraciclina (Sigma-­‐Aldrich) y un “blanco” (200 µL de medio TSB con la misma concentración de vehículo) como control de contaminación. Basándonos en la optimización inicial del protocolo, los ensayos se realizaron por triplicado y simultáneamente con dos diluciones del cultivo bacteriano, 10-­‐4 y 10-­‐5 (Figuras 3.3-­‐A-­‐B). Posteriormente, tras el cultivo en medio sólido y el recuento de colonias, se determinó cuál de las dos diluciones era la que contenía una población óptima de bacterias para el ensayo, teniendo en cuenta que la población de bacterias en la dilución realizada debe estar comprendida entre 1-­‐6 por 105 UFC/mL. Las placas multipocillos se incubaron durante 24h a 37⁰C con agitación orbital suave (150-­‐160 rpm) y oscuridad. Para mantener una humedad adecuada en el incubador, las placas multipocillo se colocaron en una bandeja sobre papel de filtro 27 humedecido con agua Milli-­‐Q (Merck Millipore), evitando así que se evaporase el volumen de incubación dentro de los pocillos. Tras la incubación se midió la absorbancia de cada pocillo a 600nm empleando un espectrofotómetro (Thermo Fisher Scientific) (Figura 3.4). Figura 3.3.-­‐ A: Cada ensayo se repitió simultáneamente para las diluciones de trabajo 10-­‐4 y 10-­‐5, en placas de 96 pocillos. B: Ejemplo de la distribución de los controles y extractos ensayados en la placa multipocillos. Ésta se completa con varios extractos. Todos los ensayos se realizaron por triplicado y a dos concentraciones finales de 50 µg/mL y 100 µg/mL. Figura 3.4.-­‐ Lectura de la absorbancia. La placa multipocillos se introdujo sin tapa en el espectrofotómetro para medir la absorbancia de cada pocillo a 600nm. Para conocer cuál era la dilución adecuada de bacterias, el mismo día que se hizo el ensayo, y a partir de las mismas diluciones iniciales de trabajo, se prepararon nuevas diluciones secundarias en tubos Eppendorf de 1.5mL (10-­‐2, 10-­‐3 y 10-­‐4). Un volumen de 100 µL de cada una de ellas se inoculó en placas de Petri de 90mm de diámetro con medio sólido TSA (Tryptone Soya Agar) (Sigma-­‐Aldrich). Con una varilla 28 acodada estéril se extendió el volumen sobre la superficie del medio de cultivo y se incubó la placa durante 24h a 37⁰C en oscuridad (Figura 3.5). -­‐4
-­‐5
de trabajo 10 -­‐10 se prepararon las Figura 3.5.-­‐ A partir de -­‐2 las -­‐3diluciones -­‐4
diluciones secundarias 10 , 10 y 10 que luego se inocularon en placas de Petri de 90mm de diámetro con medio TSA. Tras el tiempo de incubación, se llevó a cabo el contaje de colonias. 3.3.4.-­‐ Elección de la población óptima de bacterias Tras las 24h de incubación, se llevó a cabo el recuento de colonias crecidas en las placas de Petri. La concentración de bacterias para cada dilución se calculó usando la fórmula: Concentración (UFC/mL)= (nº colonias x factor de dilución en positivo x 1000)/100 (UFC: Unidad formadora de colonias). La concentración de bacterias de cada dilución de trabajo inicial (10-­‐4 y 10-­‐5) resultó del cálculo de la media de los valores obtenidos para cada dilución secundaria (10-­‐2, 10-­‐3 y 10-­‐4). La concentración de bacterias debe estar entre 1 y 6 por 105 UFC/mL. Una vez conocido el número adecuado de colonias de la dilución del ensayo a elegir (10-­‐4 y 10-­‐5), se tomaron los valores de absorbancia de la placa multipocillos con 29 aquella concentración óptima de bacterias y se ignoraron los resultados de la placa correspondiente a la otra dilución para así hacer los cálculos y determinar el efecto de los extractos sobre el crecimiento de estos microorganismos (Figura 3.6). Figura 3.6.-­‐ Ejemplo de tabla de datos generada tras la lectura de absorbancia a 600 nm de la placa multipocillo para una dilución de ensayo de bacterias. 3.3.5.-­‐ Análisis de los datos del bioensayo Una vez seleccionado el archivo con los resultados de la lectura de la absorbancia de la placa multipocillos correspondiente a la dilución inicial con una población óptima de bacterias, se analizaron los datos del experimento. En primer lugar se calculó la media de los ensayos realizados por triplicado, tanto para los extractos como para los controles positivo, negativo y blanco. A todos los valores medios se les restó el valor medio del blanco, obteniendo así el valor normalizado. El porcentaje de supervivencia de la población bacteriana tras el tratamiento con los extractos, se calculó usando los valores normalizados y la siguiente fórmula: Supervivencia (%)= (valor normalizado del extracto*100/valor normalizado del control negativo. El porcentaje de inhibición se determinó con la fórmula: Inhibición (%)= 100-­‐supervivencia (%). 30 3.3.6.-­‐ Determinación de la CIM y CBM Después de analizar los datos del ensayo inicial, se determinó la concentración inhibitoria mínima (CIM) y la concentración bactericida mínima (CBM) para aquellos extractos atractivos, es decir aquellos capaces de inhibir el crecimiento bacteriano en un porcentaje ≤ 50% a la dosis de 50 µg/mL. Para ello se utilizó el mismo protocolo de dilución en medio de cultivo, usado para los ensayos y detallado anteriormente, pero en este caso a las cepas bacterianas sensibles se les aplicó el tratamiento con diferentes dosis del extracto bioactivo (50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,06 µg/mL) y por triplicado, como se muestra en la Figura 3.7. Figura 3.7.-­‐ Ejemplo de la placa multipocillos usada para el calcular CIM y CBM de un extracto con bioactividad. El extracto natural se ensaya a distintas concentraciones y se incluyen también los controles (C-­‐:negativo, Blanco y C+: positivo) Antes y después de la incubación, se midió la absorbancia a 600 nm para determinar si ésta había aumentado (hubo crecimiento) o se había mantenido (hubo inhibición). Los pocillos que presentaban un cambio en la turbidez o un valor menor o igual de absorbancia con respecto al control negativo se seleccionaron para determinar la CIM y la CBM. En un tubo Eppendorf de 1,5 mL se mezcló el contenido de los pocillos correspondientes al ensayo por triplicado de cada extracto. A partir de este volumen (600 µL) se hicieron diluciones seriadas (10-­‐1, 10-­‐2, 10-­‐3 y 10-­‐4) y de cada dilución se inoculó un volumen de 100 µL en placas de Petri de 90 mm de diámetro con medio TSA (Sigma-­‐Aldrich). Con una varilla acodada estéril se extendió el volumen sobre la superficie del medio nutritivo y se incubó la placa durante 24h a 37⁰C en oscuridad (Figura 3.8). 31 Tras el tiempo de incubación se contaron las colonias para calcular la CIM y CBM. La CIM fue aquella concentración de extracto que fue capaz de inhibir el crecimiento bacteriano, es decir aquella que nos dio tras el tratamiento una concentración igual a la de partida. La CBM en cambio, fue aquella capaz de matar el 99,9% de la población de bacterias (Figura 3.9). Para el cálculo de la CIM y CBM se utilizó la siguiente fórmula: Concentración (UFC/mL)= nº de colonias x factor de dilución en positivo x 10. Figura 3.8.-­‐ Esquema del protocolo para el recuento de colonias a partir del ensayo con distintas dosis del extracto natural, que permite calcular la CIM y CBM. 32 Figura 3.9.-­‐ Esquema del ensayo para el cálculo de la CIM y la CBM. 3.4.-­‐ Ensayos para evaluar la actividad fungicida frente a levaduras La actividad fungicida de los extractos del proyecto Algabiomac se determinó usando como modelo de estudio dos especies de levaduras, que se describen a continuación: Candida albicans: es un hongo diploide asexual, saprófito de la familia de los Saccharomycetaceae. Normalmente se encuentra en la cavidad oral, en el tracto gastrointestinal y en la vagina. Se le considera el agente causal de la candidiasis que se presenta como una afección vaginal (vaginitis), de la cavidad oral (muguet), del intestino o de la piel. En pacientes inmunodeprimidos es capaz de provocar candidemia que cursa con trastornos intestinales, insomnio, pérdida de la memoria, dolores de cabeza y/o depresión. Saccharomyces cerevisiae: es un hongo unicelular, utilizado industrialmente en la fabricación de pan, cerveza y vino. Es un modelo simple de la célula eucariota, ampliamente usado en la investigación básica y aplicada. Además se conoce la secuencia completa de su genoma, permitiendo la manipulación genética de 33 sus aproximadamente 6.600 genes, para estudiar diferentes aspectos moleculares como la expresión génica, el transcriptoma, la localización de proteínas, la organización funcional del genoma y el proteoma, etc. Esta levadura no se considera un patógeno común. Sin embargo, actúa como patógeno oportunista en las septicemias de pacientes inmunodeprimidos y como agente causal del síndrome Auto-­‐
brewery o síndrome de fermentación Intestinal (Cordell y McCarthy 2013). 3.4.1.-­‐ Cultivo de levaduras Las dos especies de levaduras se crecieron en un matraz Erlenmeyer esterilizado con 18 mL de medio nutritivo estéril YPD (Yeast extract Peptone Dextrose) (Sigma-­‐Aldrich©), al que se le añadieron 20-­‐40 µL de un cultivo anterior, o una porción del tamaño de una lenteja del stock del microorganismo en 25% glicerol conservado a -­‐
20⁰C. Las levaduras se incubaron durante 48h a 30⁰C, con agitación orbital de 250 rpm y en oscuridad. Tras esta incubación se midió la absorbancia a 600 nm, tomando asépticamente 1 mL del cultivo, y como blanco 1 mL de medio YPD. Este valor de absorbancia es orientativo, debe estar dentro de un rango, que fue establecido en la optimización del protocolo, para saber que el crecimiento ha ido bien y se puede continuar con el ensayo. A partir del cultivo inicial se prepararon diluciones seriadas de la 10-­‐1 a la 10-­‐3, tal y como se muestra en la Figura 3.10. Figura 3.10-­‐. Esquema de la preparación de diluciones seriadas a partir del cultivo de levaduras. 34 3.4.2.-­‐ Preparación de los extractos a la concentración de trabajo Cada extracto se ensayó a una concentración final de 50 µg/mL y 100 µg/mL. Para ello se usaron concentraciones de trabajo 2X, de 100 µg/mL y 200 µg/mL, respectivamente. Estas concentraciones de trabajo se prepararon con medio YPD, en tubos Eppendorf de 2 mL y en fresco, es decir el mismo día que se realizó el ensayo, a partir del stock de 40 mg/mL de cada extracto conservados a 4⁰C. Se trabajó siempre en condiciones de esterilidad bajo campana de flujo invertido. Los extractos a las concentraciones de trabajo se conservaron a temperatura ambiente hasta su uso el mismo día de su preparación. 3.4.3.-­‐ Realización de bioensayos Los bioensayos para determinar si los extractos tenían actividad fungicida frente a estas dos levaduras se realizaron en placas de 96 pocillos (VWR International). Cada pocillo se cargó con 100 µL del cultivo de levaduras a la dilución adecuada y 100 µL del extracto a la concentración de trabajo correspondiente (volumen final 200 µL). En cada placa multipocillo se incluyó un control negativo (100 µL del cultivo + 100 µL del medio YPD con la misma concentración de vehículo usada para disolver los extractos); un control positivo (100 µL del cultivo + 100 µL del medio YPD conteniendo 25 mM CuSO4 y la misma concentración de vehículo usada para disolver los extractos) y un blanco (200 µL de medio YPD con la misma concentración de vehículo) como control de contaminación. Basándonos en la optimización inicial del protocolo, los ensayos se realizaron por triplicado y simultáneamente con dos diluciones del cultivo de levaduras, 10-­‐2 y 10-­‐3. Posteriormente tras el cultivo en medio sólido y el recuento de colonias se determinó cuál de las dos diluciones era la que contenía una concentración adecuada de levaduras que se tomó para el estudio de los datos obtenidos (Figuras 3.11A-­‐B). Las placas multipocillos se incubaron durante 48h a 30⁰C con agitación orbital suave (150 rpm) y oscuridad. Para mantener una humedad adecuada en el incubador, las placas multipocillo se colocaron en una bandeja sobre papel de filtro humedecido 35 con agua Milli-­‐Q (Merck Millipore), evitando así que se evaporase el volumen de los pocillos. Tras la incubación se midió la absorbancia a 600 nm en un espectrofotómetro (Thermo Fisher Scientific) (Figura 3.12). Figura 3.11.-­‐ A: Cada ensayo se repitió simultáneamente para las diluciones de trabajo, 10-­‐2 y 10-­‐3 en placas de 96 pocillos. B: Ejemplo de la distribución de los controles y extractos ensayados en la placa multipocillos. Ésta se completa con varios extractos. Todos los ensayos se realizaron por triplicado y a las concentraciones finales de 50 µg/mL y 100 µg/mL. Figura 3.12.-­‐ Lectura de la absorbancia. La placa multipocillos sin tapa, se introdujo en el espectrofotómetro para medir la absorbancia a 600 nm. Para conocer cuál era la dilución óptima de levaduras, el mismo día que se comenzó el ensayo, y a partir de las mismas diluciones iniciales de trabajo, se prepararon nuevas diluciones secundarias en tubos Eppendorf de 1,5 mL (10-­‐2, 10-­‐3 y 10-­‐4). Un volumen de 100 µL de cada una de ellas se inoculó en placas de Petri de 90 36 mm de diámetro con medio sólido, YPD-­‐agar (Sigma-­‐Aldrich). Con la ayuda de una varilla acodada estéril se extendió el volumen sobre la superficie del medio de cultivo y se incubó la placa durante 48h a 30⁰C en oscuridad hasta el conteo de colonias (Figura 3.13). Figura 3.13-­‐. A partir de las diluciones de trabajo 10-­‐2 y 10-­‐3 se prepararon las diluciones secundarias 10-­‐2, 10-­‐3 y 10-­‐4 que luego se inocularon (100 mL) en placas de Petri de 90mm de diámetro con medio YPD-­‐agar. Tras el tiempo de incubación se llevó a cabo el contaje de colonias. 3.4.4.-­‐ Elección de la población óptima de levaduras Tras la incubación, se llevó a cabo el recuento de colonias crecidas en las placas de Petri. La concentración de levaduras para cada dilución se calculó usando la fórmula: Concentración (UFC/mL= (nº de colonias x factor de dilución en positivo x 1000)/100. Como ejemplo la dilución 10-­‐2 en positivo sería 100. La concentración de levaduras de cada dilución de trabajo inicial (10-­‐2 y 10-­‐3) resultó de la media de los valores obtenidos para cada dilución secundaria (10-­‐2, 10-­‐3 y 10-­‐4). El número de colonias debe estar entre 1 y 6 por 105 UFC/mL. Para evaluar los datos del ensayo, se usaron los valores de absorbancia de la placa multipocillos con 37 una concentración óptima de levaduras y se ignoraron los resultados de la placa correspondiente a la otra dilución. 3.4.5.-­‐ Análisis de los datos del bioensayo Una vez seleccionado el archivo de datos con los resultados de absorbancia, de la placa multipocillos correspondiente a la dilución inicial con una población óptima de levaduras, se trataron los datos del experimento. En primer lugar se calculó la media de los ensayos realizados por triplicado, tanto para los extractos como para los controles positivo, negativo y blanco. A todos los valores medios se les restó el valor medio del blanco, obteniendo así el valor normalizado. El porcentaje de supervivencia de la población de levaduras, tras el tratamiento con los extractos, se calculó usando los valores normalizados y la siguiente fórmula: Supervivencia (%)= (valor normalizado del extracto*100/valor normalizado del control negativo. El porcentaje de inhibición se determinó con la fórmula: Inhibición (%)= 100-­‐supervivencia (%). 3.4.6.-­‐ Determinación de la CIM y CBM Después de analizar los datos del ensayo inicial, se determinó la concentración inhibitoria mínima (CIM) y la concentración bactericida mínima (CBM) para aquellos extractos atractivos, es decir aquellos capaces de inhibir el crecimiento de las levaduras en un porcentaje menor o igual a 50% a la dosis de 50 µg/mL. Para ello se utilizó el mismo protocolo de dilución en medio de cultivo, usado para el ensayo y detallado anteriormente, pero en este caso a las cepas de levaduras sensibles se les aplicó el tratamiento con diferentes dosis del extracto natural bioactivo (50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,06 µg/mL), por triplicado, como se muestra en la Figura 3.14. 38 Figura 3.14-­‐. Ejemplo de la placa multipocillos usada para calcular CIM y CBM de un extracto con bioactividad. El extracto se ensaya a distintas concentraciones y se incluyen también los controles (C-­‐:negativo y Blanco) Antes y después de la incubación, se midió la absorbancia a 600 nm para determinar si ésta había aumentado (hubo crecimiento) o se había mantenido (hubo inhibición). Los pocillos que presentaban un cambio en la turbidez o un valor igual o menor de absorbancia con respecto al control negativo se seleccionaron para determinar la CIM y la CBM. En un tubo Eppendorf de 1,5 mL se mezcló el contenido de los pocillos correspondientes al ensayo por triplicado de cada extracto. A partir de este volumen (600 µL) se hicieron diluciones seriadas (10-­‐1, 10-­‐2, 10-­‐3 y 10-­‐4) y de cada dilución se inoculó un volumen de 100 µL en placas de Petri de 90 mm de diámetro con medio sólido, YPD-­‐agar. Con la ayuda de una varilla acodada estéril se extendió el volumen sobre la superficie del medio nutritivo y se incubó la placa durante 48h a 30⁰C en oscuridad (Figura 3.15). Tras el tiempo de incubación se contaron las colonias para calcular la CIM y CBM. La CIM fue aquella concentración de extracto que fue capaz de inhibir el crecimiento de las levaduras, es decir aquella que nos dio tras el tratamiento una concentración igual a la de partida. La CBM en cambio, fue aquella capaz de matar el 99,9% de la población d levaduras (Figura 3.16). Para el cálculo de la CIM y CBM se utilizó la siguiente fórmula: Concentración (UFC/mL)= nº de colonias x factor de dilución en positivo x 10. 39 Figura 3.15.-­‐ Esquema del protocolo para el recuento de colonias a partir del ensayo con distintas dosis del extracto natural, que permite calcular la CIM y CBM. Figura 3.16.-­‐ Esquema del ensayo para el cálculo de la CIM y la CBM. 40 3.5.-­‐ Ensayo para evaluar la actividad fungicida frente a hongos superiores La actividad fungicida de los extractos del proyecto Algabiomac para hongos superiores se determinó usando una batería de hongos fitopatógenos, responsables de enfermedades que afectan a distintas partes de la planta, podredumbre de los frutos, de la raíz, manchas en las hojas, y también afectan a productos almacenados. Esto provoca en alta frecuencia la pérdida de las cosechas, lo que se traduce en grandes pérdidas económicas para el agricultor (Figura 3.17). Figura 3.17.-­‐ Hongos fitopatógenos usados en el ensayo para evaluar la actividad fungicida de los extractos del proyecto Algabiomac frente a hongos superiores. 3.5.1.-­‐ Cultivo de hongos Los hongos superiores se crecieron en placas de Petri de 90 mm de diámetro con medio nutritivo PDA (Potato Dextrose Agar) (Scharlab©) estéril, a 26⁰C y en oscuridad, hasta que toda la superficie de la placa fue colonizada por el hongo. La manipulación del los hongos se realizó bajo campana de flujo invertido en condiciones de esterilidad, aproximadamente 4-­‐6 días antes del inicio de los bioensayos, pues la velocidad de crecimiento de cada especie es variable. Esto nos permitió obtener el número necesario de discos de hongo/agar para los bioensayos. A pesar de la variabilidad en la velocidad de crecimiento, se determinó que los tiempos de recogida de datos durante el ensayo fuesen cada 2 y 4 días tras comienzo del experimento y hasta que el crecimiento del hongo ocupara toda la superficie de agar, aproximadamente 8-­‐10 días. 41 3.5.2.-­‐ Preparación de los extractos a la concentración de trabajo Cada extracto se ensayó a una concentración final de 100 µg/mL. Esta concentración de trabajo se preparó con medio PDB (Potato Dextrose Broth) (Scharlab), en tubos Eppendorf de 2mL y en fresco, es decir el mismo día que se realizó el ensayo, a partir del stock de 40 mg/mL conservado a 4⁰C. Se trabajó siempre en condiciones de esterilidad bajo la campana de flujo invertido. Los extractos a la concentración de trabajo se conservaron a temperatura ambiente hasta su uso. 3.5.3.-­‐ Preparación de las placas para el bioensayo Los bioensayos se realizaron en placas de Petri de 50 mm de diámetro con 10 mL de medio PDA estéril. Antes de añadirle el extracto a ensayar y para permitir una total absorción del mismo, las placas conteniendo el medio nutritivo se dejaron con la tapa entreabierta durante unos 30 minutos bajo la campana de flujo invertido y con la luz ultravioleta encendida. Tras ello, cada placa se le añadió asépticamente 500 µL del extracto a un concentración de 100 µg/mL. Con la ayuda de una varilla acodada estéril se extendió el volumen sobre la superficie del medio nutritivo y se mantuvieron las placas de Petri abiertas unos 10 minutos en la campana para favorecer su absorción. En cada experimento se incluyó una placa control con 500 µL de medio PDB con la misma concentración de vehículo presente en los extractos y también se crecieron discos de hongos en el medio PDA como controles. 3.5.4.-­‐ Realización de bioensayos A partir del cultivo inicial de hongos se sacaron discos de hongo/agar con la parte trasera de una punta de pipeta de 200 µL estéril (8mm de Ø) (Figuras 3.18A-­‐B). Estos discos se colocaron en el centro de las placas de Petri de 50 mm de diámetro, preparadas con anterioridad (Figura 3.18.B). Las placas se colocaron en posición inversa, en una estufa-­‐incubador a 26⁰C y en oscuridad, durante los días que duró el experimento. 42 Para calcular cómo el extracto inhibe el crecimiento del hongo, se midió el diámetro o área de crecimiento cada 2 o 4 días. El área de crecimiento se calculó haciendo la media de las medidas de dos planos perpendiculares tomando el diámetro más corto y el diámetro más largo. Esta media se comparó con la media obtenida para el hongo control creciendo en PDA sin extracto, para así cuantificar exactamente la capacidad fungicida del extracto (Figura 3.19). Figura 3.18.-­‐ A) Placa de Petri de 90mm de diámetro a la que se le han sacado discos de hongo/agar con una punta de pipeta de 200µL estéril. B) Placas de Petri de 50mm de diámetro con medio PDA y el extracto F3 (izquierda) o el control (derecha), sobre las cuales se situaron los discos hongo/agar en posición central. Figura 3.19-­‐ . Medidas A y B tomadas para el cálculo del diámetro de crecimiento del hongo tratado vs. control. 43 3.6.-­‐ Ensayo para evaluar la actividad antitumoral Como modelo para determinar la actividad antitumoral de los extractos del proyecto Algabiomac se han elegido cuatro líneas celulares tumorales humanas, de los cuatro tipos de cáncer que presentan una mayor incidencia según los últimas estadísticas publicadas por el National Cancer Institute (USA) (Howlader et al. 2005).
Estas fueron adquiridas directamente de la compañía ATCC (American Type Culture Collection). Todas ellas se aislaron de pacientes caucásicos y tienen en común su morfología epitelial, su inmortalidad y su crecimiento adherente al sustrato. La línea celular T47D se obtuvo a partir de un carcinoma ductal de mama, de una señora de 54 años. Este tipo de tumor sobreexpresa el receptor de estrógenos y progesterona, y el factor de crecimiento epidérmico humano tipo 2 (HER2/neu), siendo el cáncer de mama más frecuente. La línea celular DU145 fue aislada a partir de un carcinoma de próstata de un varón de 69 años. Por otro lado, la línea celular NCI-­‐H1299 se obtuvo de un carcinoma de pulmón no microcítico, denominado también NSCLC (non-­‐small cell lung carcinoma), de un varón de 43 años de edad. Por último, la línea celular HT29 fue obtenida de un adenocarcinoma colorrectal de una paciente de 44 años de edad. Para el ensayo también se usó la línea celular Vero, células epiteliales de riñón del llamado mono verde africano (Cercopithecus aethiops). Estas son células normales, pero con capacidad de dividirse de forma continua sin convertirse en senescentes y con crecimiento adherente al sustrato. La línea celular Vero se usa frecuentemente en este tipo de ensayos como línea celular no tumoral (control). 3.6.1.-­‐ Crecimiento y recuento de células en el lector ADAM Las células tumorales elegidas se crecieron en botellas de cultivo (flash) de 75 cm2, con el medio nutritivo correspondiente: T47D y NCI-­‐H1299 con medio RPMI, DU145 con medio DMEN y HT29 con medio McCoy´s (Gibco®, Thermo Fisher Scientific Inc.). Se incubaron a 37⁰C, 95% de humedad y 5% CO2, durante 24-­‐72h, dependiendo del tiempo de división de la línea celular. Una vez confluentes, se les retiró el medio 44 de cultivo y se lavaron con 2 mL de solución PBS (Phosphate Buffer Saline) 10X (Sigma-­‐
Aldrich), para eliminar los restos de medio de cultivo. Para la tripsinización se añadieron 2 mL de 0,25% Tripsina-­‐1% EDTA (Sigma-­‐Aldrich) y se incubaron a 37⁰C, 95% de humedad y 5% CO2, durante 4 minutos. Tras este periodo de incubación, se añadieron 8 mL de medio de cultivo fresco, se homogeneizó con una pipeta serológica y se pasó el volumen a un tubo Falcon de 15 mL. Después de centrifugar a 900 rpm durante 4 minutos, se retiró el sobrenadante y el pellet se resuspendió en 10 mL de medio de cultivo fresco. Para conocer la concentración de células viables disponibles para el ensayo se usó el contador ADAM (NanoEnTek Inc.). El chip ADAM se preparó siguiendo las instrucciones del fabricante. Se tomaron dos tubos Eppendorf de 1,5 mL estériles que se rotularon con las siglas N y T. En el tubo N se preparó la mezcla N con 12 µL de cultivo celular y 12 µL de la solución N del Kit ADAM, y en el tubo T la mezcla T con 12 µL de cultivo celular y 12 µL de la solución T del Kit. Luego se cargó el chip, similar a un portaobjetos, con 12 µL de cada una de las soluciones, en su correspondiente ranura, y se introdujo en el contador de células. El lector nos proporcionó los valores: N = Número de células no viables (células/mL) T = Número de células totales (células/mL) T-­‐N = Concentración de células en el cultivo (células/mL) 3.6.2.-­‐ Preparación de los extractos a la concentración de trabajo Cada extracto se ensayó a una concentración final de 20, 50 y 100 µg/mL. Para ello se prepararon concentraciones de trabajo 2X, de 40, 100 y 200 µg/mL, respectivamente a partir del stock de 40 mg/mL conservado a 4⁰C. Estas concentraciones de trabajo se prepararon con el medio correspondiente según la línea celular, en tubos Eppendorf de 2 mL y en fresco, el mismo día que se realizó el ensayo. Se trabajó en condiciones de esterilidad bajo campana de flujo invertido. Los extractos a las concentraciones de trabajo se conservaron a temperatura ambiente hasta su uso. 45 3.6.3.-­‐ Ensayo de MTT (Methyl Thiazolyl Tetrazolium) La determinación de la actividad antitumoral de los extractos se llevó a cabo mediante el ensayo MTT (Mosmann 1983). Este es un ensayo in vitro, colorimétrico, que mide la actividad metabólica de las células en fase de proliferación activa, capaces de metabolizar el MTT (de color amarilloso) en sales de formazan (de color violáceo), que se pueden observar al microscopio óptico (Figura 3.20). Así, el ensayo MTT determina la capacidad de los diferentes extractos de inhibir la proliferación celular. Imagen de las sales de formazan (microscopio óptico) Figura 3.20.-­‐ Reacción química donde la enzima reductasa mitocondrial transforma el MTT en sales de formazan. El MTT tiene un color amarilloso mientras que las sales de formazan son de color violáceo. Los cristales de formazan (de color violáceo) son insolubles en agua pero pueden solubilizarse en disolventes orgánicos como el DMSO (Dimetilsulfóxido). La intensidad de color violeta será directamente proporcional al número de células viables (metabólicamente activas) que hay en el pocillo de cultivo después del tratamiento con el extracto, y esto se puede medir en un espectrofotómetro. Para realizar el ensayo se sembraron 100 μL de células, con el medio nutritivo correspondiente, en una placa de 96 pocillos (5.000 o 10.000 células/pocillo 46 dependiendo de la línea celular). No se añadieron células a los pocillos elegidos como blanco, solo 100 μL del medio de cultivo correspondiente. Las células, en 100 μL de medio nutritivo, se dejaron proliferar durante 24h en el incubador, a 37⁰C, 5% de CO2 y 95% de humedad. Al día siguiente, sin retirar el medio, se les añadió el tratamiento en un volumen de 100 μL, a las concentraciones ensayadas 20, 50 y 100 µg/mL (volumen final del pocillo: 200 μL). Los ensayos se realizaron por triplicado, tanto para los extractos como para los controles. Se usó la doxorrubicina al 20% como control positivo, y a los pocillos elegidos como control negativo (células sin tratamiento) se les añadió 100 μL más del medio correspondiente con la misma cantidad de vehículo (compuesto usado para disolver los extractos), es decir DMSO o Kolliphor-­‐DMSO, que tenían los pocillos con tratamiento. Para evitar toxicidad no se superó la concentración de 0,1% de estos vehículos. Transcurridas 48h de incubación a 37⁰C, 5% de CO2 y 95% de humedad se observó la morfología de las células al microscopio óptico y se evaluó si existían diferencias entre el grupo control y aquellos pocillos con tratamiento. Tras esta valoración se añadieron 10 μL de MTT 10X a cada pocillo, solución atemperada previamente en el incubador y preparada en fresco (concentración final: 0,3 mg/mL), que se incubó a 37⁰C, 5% de CO2 y 95% de humedad durante 1,5-­‐2 horas. La reacción se controló para evitar una alta precipitación de las sales de formazan que dificulta la lectura posterior. Una vez pasado el tiempo de incubación se aspiró el medio, con extremo cuidado de no arrastrar las células adheridas al fondo del pocillo. Seguidamente, se añadieron 200 μL de DMSO a cada pocillo, para lisar las células y solubilizar las sales de formazan. Se incubó de nuevo la placa multipocillos en oscuridad durante 20 min a 37⁰C, 5% de CO2 y 95% de humedad para facilitar la completa solubilización del formazan. Con la ayuda de una punta de pipeta cerrada y doblada (para evitar capilaridad) se homogeneizó el color formado en cada pocillo. Finalmente, se realizó la lectura de la absorbancia a 595 nm empleando un espectrofotómetro Skan como se citó más arriba. La actividad antitumoral se visualiza en la placa multipocillo atendiendo a la intensidad del color violeta formado en cada pocillo. Cuanto más débil o inexistente es 47 el color violeta, mayor actividad antitumoral muestra el extracto analizado. Por el contrario, a mayor intensidad del color violeta, menor o nula es la actividad antitumoral registrada, pues se registra la actividad de la respiración celular como se citó más arriba (Figura 3.21). Figura 3.21.-­‐ Resultado visual de la tinción con MTT de células tumorales ensayadas con diferentes extractos. Nula o débil coloración violeta indica capacidad antitumoral, por el contrario la intensidad del color violeta indica que no existe efecto sobre las células. 3.6.4.-­‐ Análisis de los datos Como ya se ha mencionado anteriormente, cada uno de los ensayos se realizó por triplicado. Para el análisis de los resultados se calculó en primer lugar la media de los valores de absorbancia de los pocillos del blanco. En segundo lugar se restó este valor, a los valores de absorbancia correspondientes a las células tratadas y a los controles positivo y negativo (células no tratadas). Para calcular el porcentaje de supervivencia o viabilidad celular se aplicó la siguiente fórmula: Supervivencia (%) = [(Abs. células tratadas – blanco) x 100] / media (abs. células no tratadas-­‐blanco). Por último, se calculó la media de los porcentajes de supervivencia de los tres ensayos y su correspondiente desviación estándar. 48 Una vez conocida la actividad como antitumorales de los extractos a las concentraciones iniciales estudiadas, se calculó la IC50 para aquellos que eran capaces de disminuir la supervivencia en un valor igual o menor a 50%, a la concentración de 50 µg/mL. Para ello se ensayó el extracto al menos a cinco concentraciones decrecientes, en este caso 50, 25, 12,5, 6,25 y 3,125 µg/mL. Aquella concentración de extracto que causa un 50% de inhibición de la supervivencia se obtuvo mediante un análisis de regresión, usando el programa Graphpad Prism (GraphPad Software, Inc), para así determinar la IC50. Igualmente y para aquellos extractos y líneas celulares que mostraron capacidad citotóxica e inhibición del crecimiento, se estudio también su IC50 con la línea no tumoral Vero siguiendo la misma metodología. Esto permite determinar también el grado de especificidad del extracto para eliminar la línea celular tumoral y no afectar, o afectar en menor medida, a la línea celular normal (no tumoral) de Vero. 49 4.-­‐ RESULTADOS y DISCUSIÓN 50 A partir de las catorce especies de macroalgas y microalgas recolectadas y objeto de estudio, se obtuvieron un total de 98 extractos siguiendo los métodos de extracción descritos anteriormente en la sección de Materiales y Métodos: extracción supercrítica con CO2, extracción con etanol y extracción con metanol. En este apartado se detallan los resultados obtenidos en los diferentes bioensayos evaluados para la determinación de tres bioactividades: antibiótico, antifúngico y/o antitumoral, de los distintos extractos estudiados, así como las posibilidades de explotación futura. 4.1.-­‐ Actividad antibiótica Los extractos de algas, independientemente del método de extracción seguido, se ensayaron a dos concentraciones, 50 y 100 µg/mL empleándose las cuatro especies bacterianas descritas anteriormente, dos Gram positivas (B. subtilis y S. aureus) y dos Gram negativas (E. coli y S. enterica), siguiendo el ensayo de microdilución en placas multipocillos. Comenzando por las bacterias Gram positivas, los extractos, F19.2, F31, F43, F44, F62, F63, F64, F65, F66 y F67 mostraron una significativa actividad antibiótica para Bacillus subtilis. Estos fueron capaces de inhibir el crecimiento bacteriano en un porcentaje menor al 50% a la concentración de 50 µg/mL (Fig. 4.1). Figura 4.1.-­‐ Bioensayo de microdilución de distintos extractos con atractiva actividad antibiótica frente a Bacillus subtilis. 51 Por otro lado, los extractos F6.2, F18.2, F19.1, F30, F31, F33, F37, F44, F50 y F59 mostraron una actividad antibiótica moderada de acuerdo a la inhibición del crecimiento de esta bacteria en un porcentaje menor o igual al 50% a la concentración de 100 µg/mL (Fig. 4.2). Figura 4.2.-­‐ Resultados de viabilidad celular de bioensayos de microdilución de distintos extractos con actividad antibiótica moderada frente a Bacillus subtilis. El resto de los extractos ensayados no mostraron una inhibición destacable, registrándose para un elevado número de muestras una supervivencia próxima al 100% y en algunos casos incluso estimularon el crecimiento de esta bacteria (Fig. 4.3 A-­‐D). A 52 B C D Figuras 4.3A-­‐D.-­‐ Resultados de viabilidad celular de bioensayos de microdilución de distintos extractos con actividad antibiótica débil o sin actividad frente a Bacillus subtilis 53 Teniendo en cuenta la inhibición del crecimiento de B. subtilis obtenido con las muestras indicadas, se realizaron nuevos ensayos evaluando la capacidad de inhibición del crecimiento a diferentes concentraciones, más bajas que las anteriormente mostradas, para conseguir la determinación de la CIM (concentración inhibitoria mínima) frente a esta bacteria. La concentración inhibitoria mínima de los extractos anteriormente citados con actividad efectiva o moderada, se observó para la mitad de estas muestras entre 25 y 50 µg/mL (Tabla 4.1). Tabla 4.1. Concentración inhibitoria mínima aproximada de los extractos frente a Bacillus subtilis En cuanto a los ensayos empleando Staphylococcus aureus, solo los extractos F18.2, F19.2, F30, F43 y F81 mostraron una actividad antibiótica destacable, siendo capaces de inhibir el crecimiento de esta especie bacteriana en un porcentaje mayor al 50% a la concentración de 100 µg/mL, pero no a 50 µg/mL (Fig. 4.4). 54 Figura 4.4.-­‐ Resultados de viabilidad celular de bioensayos de microdilución de distintos extractos con actividad antibiótica destacable frente a Staphylococcus aureus. Para el resto de muestras ensayadas frente a esta bacteria, no se observó inhibición del crecimiento como se muestra en las Figuras 4.4A-­‐E). A 55 B C D 56 E Figuras 4.4A-­‐E.-­‐ Resultados de viabilidad celular de bioensayos de microdilución de distintos extractos sin actividad antibiótica frente a Staphylococcus aureus En cuanto a los resultados obtenidos con las bacterias Gram negativas, E. coli y S. enterica, también ensayadas a 50 y 100 µg/mL, no hubo inhibición del crecimiento de estas bacterias a las concentraciones ensayadas siguiendo el método de microdilución en placas multipocillos como se muestra en las siguientes Figuras 4.5A-­‐
E). A 57 B C D 58 E Figuras 4.5A-­‐E.-­‐ Resultados de viabilidad celular de bioensayos de microdilución de distintos extractos sin actividad antibiótica frente a Escherichia coli. Análogamente a lo descrito para E. coli, tampoco se consiguió inhibición del crecimiento de S. enterica evaluada de la misma forma (Figuras 4.6A-­‐E). A 59 B C D 60 E Figuras 4.6A-­‐E.-­‐ Resultados de viabilidad celular de bioensayos de microdilución de distintos extractos sin actividad antibiótica frente a Salmonella enterica. En resumen y como aparece en las figuras 4.2 y 4.4, para esta bioactividad evaluada, la especie Bacillus subtilis fue la más sensible al tratamiento, seguida de S. aureus, ambas especies Gram positivas, indicando una mayor sensibilidad de estas bacterias Gram positivas a algunos de los extractos ensayados (F6.2, F18.2, F19.1, F30, F33, F50, F59 para B. subtilis; F18.2, F19.2, F30, F43, F81 para S. aureus). Por el contrario, las otras dos especies empleadas para la realización de los bioensayos, S. enterica y E. coli, pertenecientes al grupo de las bacterias Gram negativas, no mostraron sensibilidad a ninguno de los extractos ensayados (Figs. 4.5-­‐
4.6). 4.2.-­‐ Actividad fungicida frente a levaduras Los extractos de algas se ensayaron también con los dos modelos de levaduras, Saccharomyces cerevisiae y Candida albicans, descritas con anterioridad para determinar su capacidad antifúngica. Se practicaron ensayos de microdilución a dos concentraciones diferentes (50 y 100 µg/mL) siguiendo un protocolo similar al descrito para evaluar la actividad antibiótica pero con ligeras modificaciones como se describieron en el apartado de Materiales y Métodos. 61 Los ensayos llevados a cabo contra S. cerevisiae no mostraron actividad destacable, observándose que para algunos de los extractos la poca inhibición del crecimiento de esta levadura fue tan solo del 5-­‐10% en el mejor de los casos (F1, F5, F7, F17.1, F26, F32.1, F60, F61) (Fig. 4.7). Figura 4.7.-­‐ Resultados de viabilidad celular de bioensayos de microdilución de distintos extractos con leve actividad antifúngica frente a Saccharomyces cerevisiae. Para el resto de muestras, la inhibición del crecimiento fue prácticamente inexistente (Figs. 4.8A-­‐D) lo que indica que ninguno de estos extractos presentó capacidad para inhibir el crecimiento de esta levadura y por tanto no presentaron capacidad antifúngica (Tabla 5). 62 A B 63 C
D
Figuras 4.8A-­‐D.-­‐ Resultados de viabilidad celular de bioensayos de microdilución de distintos extractos sin actividad antifúngica frente a Saccharomyces cerevisiae. En el caso de C. albicans, los ensayos de bioactividad mostraron que para cuatro de los extractos estudiados se registró una actividad fungicida significativa para las muestras F62, F63, F66 y F67, que fueron capaces de inhibir el crecimiento en un porcentaje superior al 95% a las dos concentraciones evaluadas (Fig. 4.9). 64 Figura 4.9.-­‐ Resultados de viabilidad celular de bioensayos de microdilución de distintos extractos con efectiva actividad antifúngica frente a Candida albicans. Por otro lado, 14 de los extractos estudiados exhibieron una actividad fungicida débil, inhibiendo el crecimiento de C. albicans en un porcentaje menor o igual al 5-­‐10% a las concentraciones ensayadas (Fig. 4.10). Figura 4.10.-­‐ Resultados de viabilidad celular de bioensayos de microdilución de distintos extractos con leve actividad antifúngica frente a Candida albicans. Finalmente, la gran mayoría de las muestras ensayadas no mostraron ningún efecto inhibitorio en el crecimiento de C. albicans (Figuras 4.11A-­‐D). 65 A B C 66 D Figuras 4.11A-­‐D.-­‐ Resultados de viabilidad celular de bioensayos de microdilución de distintos extractos sin actividad antifúngica frente a Candida albicans. La Tabla 4.3 muestra la concentración mínima inhibitoria (CMI) aproximada de los extractos con actividad fungicida frente a levaduras. Algunos de los extractos que mostraron actividad antibiótica también presentaron actividad fungicida frente a levaduras, si bien la CMI para la mayoría de ellos se elevó pasando de 25-­‐50 µg/mL en B. subtilis a 51-­‐100 µg/mL en C. albicans, es el caso de los extractos F62, F63 y F66. El extracto F67 presentó aproximadamente la misma CIM frente a B. subtilis que frente a C. albicans (Tabla 4.1 y Tabla 4.2). Tabla 4.2.-­‐ Concentración inhibitoria mínima aproximada de los extractos frente a Candida albicans 67 4.3.-­‐ Actividad fungicida frente a hongos fitopatógenos Los extractos de algas se ensayaron también contra una batería de 9 hongos superiores fitopatógenos a una concentración de 100 µg/mL (ver 3.5.1 a 3.5.4). Este ensayo se practicó en placas de Petri de 5 centímetros de diámetro sobre medio PDA solidificado con agar, al cual se le añadieron 0,5 mL de cada extracto a la concentración indicada. Una vez inoculados cada hongo de forma individualizada para cada extracto, se cultivaron en la oscuridad a 25°C. Para conocer el efecto inhibidor de cada extracto, se registró el diámetro de crecimiento de cada hongo frente a su correspondiente control cada 48 h y se compararon los resultados para determinar su capacidad antifúngica frente a estos hongos. Como se presenta en la Tabla 4.3, ninguno de los extractos evaluados mostró una actividad significativa, ni siquiera moderada frente a los 9 hongos diferentes ensayados (solo se muestra un grupo de datos como ejemplo), determinándose que las muestras ensayadas no mostraron capacidad fungicida frente a esta batería de hongos fitopatógenos que afectan a muchas especies de interés agrícola y provocan grandes pérdidas. 68 Diámetro de Crecimiento (cm) Muestra Contro
l F1 F2.2 F3.2 F12.1 F12.2 F13.2 F28.2 F30 F31 F44 F45 F65 F67 A. fumigatus B. cinerea C. beticola F. solani G. candidum R. solani S. sclerotiorum T. viride V. dahliae 5,0 5,0 4,5 4,9 4,7 5,0 5,0 5,0 4,7 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 4,25 4,0 4,0 4,5 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 4,8 4,8 4,7 4,65 4,7 5,0 5,0 5,0 4,6 4,8 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 4,9 4,9 5,0 4,9 4,8 4,8 4,7 4,7 4,7 4,7 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 4,7 3,35 4,6 4,1 3,75 -­‐ -­‐ -­‐ -­‐ -­‐ -­‐ -­‐ -­‐ Tabla 4.3.-­‐ Resumen de algunos datos de los ensayos de la actividad fungicida frente a los distintos hongos que afectan a plantas con interés agrícola u ornamental A. fumigatus=Aspergillus fumigatus, B. cinerea=Botrytis cinerea, C. beticola=Cercospora beticola, F. solani=Fusarium solani, G. candidum=Geotrichum candidum, R. solani=Rhizoctonia solani, S. sclerotiorum=Sclerotinia sclerotiorum, T. viride=Trichoderma viride, V. dahliae=Verticilium dahliae 4.4.-­‐ Actividad antitumoral La actividad antitumoral se evaluó utilizando 4 líneas celulares de cáncer humano estudiándose individualmente para cada una de ellas la capacidad antitumoral de los distintos extractos. Estas cuatro líneas celulares se seleccionaron por representar los tipos de cáncer más frecuentes (mama=T47D; próstata=DU-­‐145; colon=NCI H1299; pulmón=HT-­‐29). Asimismo, como línea celular control se empleó la línea no tumoral denominada Vero, derivada de células renales de mono. Los extractos se ensayaron a diferentes concentraciones, inicialmente a 50 y 100 µg/mL y más adelante a 20 µg/mL, pues esta última concentración es más determinante y ofrece un umbral más definitorio para determinar una atractiva 69 capacidad antitumoral para un determinado extracto de acuerdo a las directrices del National Cancer Institute de los Estados Unidos que establece esta concentración como umbral a partir del cual considerar a un extracto que haya mostrado bioactividad como candidato atractivo (Suffness y Pezzuto 1990; Shoemaker 2006; Vijayarathna y Sasidharan 2012; Srisawat 2013). Adicionalmente, para aquellas muestras que mostraron efecto citotóxico con una atractiva inhibición del crecimiento celular (>50%) equivalente a un porcentaje de supervivencia menor al 50%, para alguna de las líneas celulares estudiadas, se realizaron ensayos adicionales disminuyendo la concentración del extracto para poder determinar la IC50 (Concentración inhibitoria 50, aquella concentración que elimina el 50% de la población celular), y también conocer el comportamiento de dicha muestra contra la línea control no-­‐tumoral Vero e igualmente determinar la IC50 para esta línea, como se describe más adelante. La línea celular T47D (cáncer de mama) mostró clara sensibilidad al tratamiento con los diferentes extractos. Un total de 18 extractos inhibían el crecimiento de esta línea celular a diferentes concentraciones evaluadas. Destacan cinco de ellos, F14.2, F17.2, F22.2, F23.2 y F41 que mostraron una viabilidad celular por debajo del 20-­‐30% (Figura 4.12). Figura 4.12.-­‐ Resultados de viabilidad celular de bioensayos siguiendo el método MTT de distintos extractos con mayor actividad antitumoral frente a la línea celular T47D de cáncer de mama. 70 Por otro lado, otro grupo de extractos mostraron una leve actividad antiproliferativa frente a esta línea de cáncer de mama, alcanzando en el mejor de los casos valores de viabilidad celular de 52-­‐55% para algunos de los extractos de este grupo como se muestra en las Figuras 4.13A-­‐B. A B Figuras 4.13A-­‐B.-­‐ Resultados de viabilidad celular de bioensayos siguiendo el método MTT de distintos extractos mostrando una leve actividad antitumoral frente a la línea celular T47D de cáncer de mama. 71 Finalmente, el resto de los extractos evaluados mostraron una muy baja o ninguna capacidad antiproliferativa sobre esta línea celular (Figuras 4.14A-­‐B). A B Figuras 4.14A-­‐B.-­‐ Resultados de viabilidad celular de bioensayos siguiendo el método MTT de distintos extractos mostrando una nula o escasa actividad antitumoral frente a la línea celular T47D de cáncer de mama. Para aquellos extractos que destacaron en su capacidad antitumoral frente a la línea celular T47D de cáncer de mama (F6, F8.2, F14.2, F17,1, F22.2, F23.2, F69, F70, F81) (Figura 4.12) se llevó a cabo la determinación de la IC50, para conocer la concentración mínima que fuera capaz de disminuir el crecimiento de esta línea celular 72 en un 50%. Asimismo, también se realizó un ensayo MTT con estos atractivos extractos contra la línea control no tumoral Vero, para conocer y determinar su especificidad frente a la línea tumoral de cáncer de mama en comparación con los resultados alcanzados frente a la línea celular Vero (Tabla 4.4). Los mejores valores de IC50 de 7,6; 8,0; 10,8; 13,1 y 13,7 mg/mL se obtuvieron con las muestras F81, F70, F69, F17.2 y F14.2, respectivamente seguido de F23.2 (IC50 23.4 mg/mL) y algo más alejado F22.2 (IC50 31,6 mg/mL), y finalmente F6 y F8.2 con una IC50 mayor de 50 mg/mL. Atractivamente, cuando se determinó el valor de viabilidad celular y la IC50 de estos extractos frente a la línea celular Vero, se encontró que la concentración IC50 requerida para eliminar esta línea celular fue 2-­‐5 veces superior dependiendo de la muestra, lo que indica un grado de selección y especificidad atractivos para atacar células tumorales, apenas afectando las células normales (Vero) (Tabla 4.4). Muestra F6 F8.2 F14.2 F17.2 F22.2 F23.2 F39 F60 F62 F63 F67 F69 F70 F71 F72 F73 F74 F81 IC50 (mg/mL) Colon NCI H1299 -­‐ -­‐ 26,3 23,6 17,7 20,6 -­‐ 28,8 25,8 26,3 33,9 10,1 6,6 11,0 12,0 8,9 10,3 7,5 Próstata DU-­‐145 . . 49,9 > 50,0 14,4 18,2 -­‐ -­‐ -­‐ -­‐ -­‐ 17,8 10,5 20,0 >20,0 14,8 20,0 8,3 Mama T47D > 50 > 50 13,7 13,1 31,6 23,4 -­‐ -­‐ -­‐ -­‐ -­‐ 10,8 8,0 -­‐ -­‐ -­‐ -­‐ 7,6 Pulmón HT29 -­‐ -­‐ 45,6 47,5 12,0 19,0 41,2 -­‐ -­‐ -­‐ -­‐ 15,3 11,5 -­‐ -­‐ -­‐ -­‐ 12,5 Vero > 100 > 90 > 50 > 50 > 50 40,2 -­‐ > 50-­‐ > 50-­‐ > 50-­‐ > 50-­‐ > 20 14,45 > 20 > 20 > 20 > 20 12,89 Tabla 4.4.-­‐ Valores de IC50 (mg/mL) de los extractos más destacados frente a las líneas tumorales estudiadas, así como frente a la línea celular Vero no tumoral empleada para determinar la especificidad de las muestras para afectar la línea tumoral y no sobre la línea celular no tumoral. 73 Para la línea celular HT29 (cáncer de pulmón) se encontraron un total de 8 extractos con atractiva actividad antitumoral (Fig. 4.15). Siete de éstos destacaron (F14,2, F17,2 F22.2, F23.2, F69, F70, F81) mostrando una reducción de la viabilidad celular hasta del 85-­‐90% mostrando una clara inhibición del crecimiento de esta línea celular (Fig. 4.15). Figura 4.15.-­‐ Resultados de viabilidad celular de bioensayos siguiendo el método MTT de distintos extractos mostrando una clara actividad antitumoral frente a la línea celular HT29 de cáncer de pulmón. También se observó una ligera actividad antiproliferativa sobre esta línea celular para 38 de los extractos evaluados, donde la viabilidad celular más destacada, aunque no muy interesante, fue de aproximadamente el 55-­‐58%, para las muestras F8.1 y F29.2 respectivamente (Figuras 4.16A-­‐B). 74 A B Figuras 4.16A-­‐B.-­‐ Resultados de viabilidad celular de bioensayos siguiendo el método MTT de distintos extractos mostrando una leve actividad antitumoral frente a la línea celular HT29 de cáncer de pulmón. Para el resto de los extractos evaluados, la actividad antitumoral frente a esta línea celular fue inexistente o muy débil (Figuras 4.17A-­‐C). 75 A B 76 C Figuras 4.17A-­‐C.-­‐ Resultados de viabilidad celular de bioensayos siguiendo el método MTT de distintos extractos no mostrando actividad antitumoral frente a la línea celular HT29 de cáncer de pulmón. Para aquellos extractos que destacaron en su capacidad antitumoral frente a la línea celular HT29 de cáncer de pulmón (F14.2, F17.2, F22.2, F23.2, F39, F69, F70 Y F81) (Figura 4.15) se llevó a cabo la determinación de la IC50, para conocer la concentración mínima que fuera capaz de disminuir el crecimiento de esta línea celular en un 50%. Asimismo, también se realizó un ensayo MTT y determinación de la IC50 con estos atractivos extractos contra la línea control no tumoral Vero, para conocer y determinar su especificidad frente a la línea tumoral de cáncer de pulmón en comparación con la línea celular Vero (Tabla 4.4). Los valores de IC50 más sobresalientes de 12,0; 19,0, 15,3, 11,5 y 12,5 mg/mL se obtuvieron con las muestras F22.2, F23.2, F69, F70, F81 seguido de F39 (IC50 41,2 mg/mL) y algo más alejados F14.2 (IC50 45,6 mg/mL) y F17.2 (IC50 47.5 mg/mL) (Tabla 4.4). Atractivamente, cuando se determinó el valor de viabilidad celular y la IC50 de estos extractos frente a la línea celular no tumoral Vero, se encontró que la concentración IC50 requerida para eliminar esta línea celular fue 1-­‐2 o más veces superior, lo que indica un grado de selección y especificidad atractivos para atacar las 77 células tumorales de pulmón afectando apenas a las células normales (Vero) (Tabla 4.4). En referencia a la línea celular NCI H1299 (cáncer de colon), 15 extractos mostraron una clara actividad antitumoral (F14.2, F17.2, F22.2, F23.2, F60, F62, F63, F67, F69, F70, F71, F72, F73, F74, F81) (Figura 4.18). Figura 4.18.-­‐ Resultados de viabilidad celular de bioensayos siguiendo el método MTT de distintos extractos mostrando clara actividad antitumoral frente a la línea celular NCI H1299 de cáncer de colon. Otro grupo de 28 muestras exhibieron una débil capacidad para inhibir el crecimiento de estas células de cáncer de colon (Figuras 4.19A-­‐B). 78 A B Figuras 4.19A-­‐B.-­‐ Resultados de viabilidad celular de bioensayos siguiendo el método MTT de distintos extractos mostrando una leve actividad antitumoral frente a la línea celular NCI H1299 de cáncer de colon (F61 no pudo evaluarse por contaminación del extracto con bacterias motiles). El resto de extractos ensayados contra esta línea celular no mostraron actividad antiproliferativa, exhibiendo valores de viabilidad celular en la mayoría de los casos del 100% y los mejores resultados inhibiendo ligeramente el crecimiento celular con 76-­‐
85% de viabilidad celular (Figuras 4.20A-­‐C). 79 A B C Figuras 4.20A-­‐C.-­‐ Resultados de viabilidad celular de bioensayos siguiendo el método MTT de distintos extractos no mostrando actividad antitumoral frente a la línea celular HCI H1299 de cáncer de colon. 80 Para aquellos extractos que destacaron en su capacidad antitumoral frente a la línea celular NCI-­‐H1299 de cáncer de colon (F14.2, F17.2, F22.2, F23.2, F60, F62, F63, F67, F69, F70, F71, F72, F73, F74, F81) (Figura 4.18) se llevó a cabo la determinación de la IC50, para conocer la concentración mínima que fuera capaz de disminuir el crecimiento de esta línea celular en un 50%. Asimismo, también se realizó un ensayo MTT con estos atractivos extractos contra la línea control no tumoral Vero, para conocer y determinar su especificidad frente a la línea tumoral de cáncer de colon en comparación con los resultados alcanzados frente a la línea celular Vero (Tabla 4.4). Como se muestra en la Tabla 4.4, los mejores valores de IC50 de 6,6; 7,5; 8,9; 10,1; 10,3; 11,0; 12,0 y 17,7 mg/mL se obtuvieron con las muestras F70, F81, F73, F69, F74, F71, F72 y F22.2, respectivamente, seguidos de F23.2 (IC50 20,6 mg/mL) y algo más alejados F17.2, F62, F14.2, F63, F60 y F67 (IC50 23,6; 25,8; 26,3; 26,3; 28,8 y 33,9 respectivamente). Atractivamente, cuando se determinó el valor de viabilidad celular y la IC50 de estos extractos frente a la línea celular control Vero, se encontró que la concentración IC50 requerida para eliminar esta línea celular fue 2 o más veces superior, lo que indica un grado de selección y especificidad atractivos para atacar las células tumorales de colon y apenas afectando a las células normales (Vero) (Tabla 4.4). Análogamente, se ensayaron todos los extractos en la línea celular DU145 (cáncer de próstata) que fue la menos sensible. Doce extractos inhibieron su crecimiento de forma clara, destacando los extractos F14.2, F17.2, F22.2, F23.2, F69, F70, F71, F72, F73, F74, F81 que mostraron una viabilidad celular de alrededor de tan solo el 5-­‐12% (Figura 4.21). 81 Figura 4.21.-­‐ Resultados de viabilidad celular de bioensayos siguiendo el método MTT de distintos extractos exhibiendo una clara actividad antitumoral frente a la línea celular DU-­‐145 de cáncer de próstata. Al igual que lo obtenido y descrito con las otras líneas celulares estudiadas, otros extractos mostraron una ligera actividad antitumoral frente a DU-­‐145, con valores de viabilidad celular en el mejor de los casos de 52-­‐55% para la concentración de 100 mg/mL como se muestra en las siguientes gráficas (Figuras 4.22A-­‐B). A 82 B Figuras 4.22A-­‐B.-­‐ Resultados de viabilidad celular de bioensayos siguiendo el método MTT de distintos extractos exhibiendo una débil actividad antitumoral frente a la línea celular DU-­‐145 de cáncer de próstata. Finalmente, otros 35 extractos no mostraron actividad antiproliferativa frente a esta línea celular de cáncer de próstata, con valores de viabilidad celular en el mejor de los casos de 85-­‐94% y para el resto de muestras sin ninguna actividad mostrando el 100% de viabilidad celular (Figuras 4.23A-­‐B). A 83 B Figuras 4.23A-­‐B.-­‐ Resultados de viabilidad celular de bioensayos siguiendo el método MTT de distintos extractos sin actividad antitumoral frente a la línea celular DU-­‐145 de cáncer de próstata (F61 no pudo evaluarse por contaminación del extracto con bacterias motiles). Para los doce extractos que destacaron en su capacidad antiproliferativa frente a esta línea celular DU-­‐145 de cáncer de próstata (F14.2, F17.2, F22.2, F23.2, F69, F70, F71, F72, F73, F74, F81) (Figura 4.21) se llevó a cabo la determinación de la IC50, para conocer la concentración mínima capaz de disminuir el crecimiento de esta línea celular en un 50%. Asimismo, también se realizó un ensayo MTT con estos atractivos extractos contra la línea control no tumoral Vero, para conocer y determinar su especificidad frente a la línea tumoral de cáncer de próstata en comparación con los resultados alcanzados frente a la línea celular Vero no tumoral. Como se muestra en la Tabla 4.4, los mejores valores de IC50 de 8,3; 10,5; 14,4; 14,8;: 17,8 y 18,2 mg/mL se obtuvieron con las muestras F81, F70, F22.2, F73, F69 y F72 F23.2, respectivamente, seguidos de F71, F74, F72 (IC50 20 mg/mL) y algo más alejados F14.2 y F17.2 (IC50 49,9 y >50 respectivamente). Atractivamente, cuando se determinó el valor de viabilidad celular y la IC50 de estos extractos frente a la línea celular Vero, se encontró que la concentración IC50 requerida para eliminar esta línea celular fue mayor que 20, indicando un grado de selección y especificidad atractivos para atacar las células tumorales de próstata y apenas afectando a las células normales (Vero) (Tabla 4.4). 84 Realizando una comparación global de los resultados obtenidos en las diferentes líneas celulares, destaca la actividad antitumoral de los extractos F14.2, F17.2, F22.2, F23.2, F69, F70 y F81 pues fueron capaces de inhibir el crecimiento de todas las líneas celulares tumorales estudiadas. Como ya se ha mencionado, estos extractos requirieron una concentración de la muestra 2-­‐3 veces superior para mostrar citotoxicidad e inhibición del crecimiento de las células no tumorales Vero. También los extractos F71, F72, F73 y F74 presentaron actividad citotóxica frente a dos líneas celulares tumorales estudiadas (colon=NCI-­‐H1299 y próstata=DU145 ) y finalmente las muestras F60, F62, F63 y F67 mostraron actividad antiproliferativa frente a la línea celular de colon (NCI-­‐H1299). Estos resultados son atractivos y alentadores para continuar con la investigación y posible obtención de fármacos antitumorales eficaces a partir de micro o macroalgas una vez se acometa la identificación estructural de todos los metabolitos presentes en estos extractos, así como el estudio individualizado de cada uno de los compuestos aislados de cada muestra y su capacidad individual para inhibir el crecimiento de estas líneas celulares tumorales. Según el Instituto Nacional del Cáncer Americano los extractos capaces de inhibir la proliferación en un 50% (IC50) a una dosis menor o igual a 20 µg/mL se consideran extractos con alta actividad antitumoral. Con una actividad moderada están los que presentan una IC50 entre 21-­‐ 200 µg/mL, con actividad débil los que tienen una IC50 entre 201-­‐ 500 µg/mL y son inactivos los que muestran una IC50 > 500 µg/mL. Teniendo en cuenta esta clasificación, hemos encontrado un total de 11 extractos con una actividad antitumoral alta, y otros 8 exhibiendo una actividad antitumoral moderada (Tabla 4.4). A modo de resumen y considerando todos los ensayos realizados para determinar la capacidad antibiótica, antifúngica y/o antitumoral, la Tabla 4.5 muestra la especificidad encontrada de los extractos ensayados en los diferentes modelos biológicos utilizados (antibiótico, antifúngico, antitumoral). 85 Los extractos F6.2, F18.2, F19.1, F19.2, F30, F31, F33, F37, F43, F44, F50, F59 mostraron solo actividad antibiótica moderada o algo destacable. F65 presentó actividad antibiótica y fungicida frente a levaduras. Con respecto a la capacidad de las muestras para inhibir el crecimiento de hongos superiores, no se obtuvo ningún resultado de inhibición frente a estos organismos. Las muestras F8.2, F12.2, F14.2, F17.2, F22.2, F23.2, F39, F41, F69, F70, F71, F72, F73, F74 y F81 solo mostraron actividad antitumoral. Por otro lado, en pocos casos y solo para los extractos F62, F63, F66 y F67 estos presentaron conjuntamente actividad antibiótica, fungicida y antitumoral. Tabla 4.5.-­‐ Resumen de los extractos destacables que mostraron bioactividad (antibiótica, antifúngica y antitumoral) en esta investigación. 86 Los resultados presentados en este informe destacan los obtenidos para la actividad antitumoral con atractivos datos y nos permiten afirmar que el proyecto ha conseguido valorizar estos recursos marinos que por lo que conocemos no se habían estudiado adecuadamente desde esta perspectiva. Las bioactividades realizadas se seleccionaron para buscar una utilidad a estas especies de algas, con la biomasa conseguida y extraída según se ha descrito en este documento con la participación de los tres socios tecnológicos principales del proyecto. Los datos obtenidos como antibióticos fueron poco interesantes pues solo 8 extractos, a la concentración de 50 µg/mL, mostraron capacidad para inhibir en más de un 50% el crecimiento de la bacteria B. subtilis y otros 7 a una concentración de 100 µg/mL; asimismo, otros 5 extractos mostraron actividad frente a S. aureus, pero solo a la concentración de 100 µg/mL, no consiguiéndose similares resultados para las otras dos bacterias patógenas humanas estudiadas (E. coli y S. enterica). Por otro lado y de forma destacable, 18 muestras presentaron atractiva actividad citotóxica frente a la mayoría de las cuatro líneas celulares tumorales empleadas con concentraciones de IC50 desde 6,6 hasta 49,9 µg/mL. Cabe destacar que para estas muestras las concentraciones requeridas para inhibir el crecimiento de células no tumorales (control) fueron de 2-­‐3 veces superioriores, lo que indica una mayor selectividad y especificidad para atacar las células tumorales, apenas afectando a las células normales (Vero). Como se mencionaba en la introducción de este documento, el desarrollo de fármacos tiene distintas etapas (Fig. 2.1), la primera consiste en diseñar o fijar la identificación del objetivo, que se refiere a la determinación del tipo de diana o patología para la que se busca diseñar un nuevo fármaco (en nuestro estudio antibiótico, fungicida y/o, antitumoral). Tras esta etapa le sigue la selección del líder, entendiéndose como la búsqueda de un compuesto que muestre la actividad deseada, para lo cual se llevan a cabo estudios de bioactividad in vitro o in vivo realizándose bioensayos para determinar las muestras (compuesto, extracto, mezcla) que presenten la actividad deseada a una concentración mínima lo suficientemente atractiva para continuar su estudio. En esta investigación se ha alcanzado dicha meta, particularmente los resultados obtenidos por su capacidad antiproliferativa de células de cáncer que 87 parecen apuntar en la dirección correcta. Al tratarse de extractos, las siguientes etapas que habría que desarrollar consisten en aislar los componentes del extracto, para con cada uno de ellos estudiar su capacidad antitumoral y así conocer el/los compuesto(s), causantes de dicha actividad, para luego realizar la optimización del líder (química medicinal) y avanzar con las siguientes etapas del desarrollo de un fármaco o producto activo. Se han conseguido atractivos resultados que permiten continuar con nuevas investigaciones y avanzar en esta línea para poder establecer una posible explotación comercial de estos resultados. Esfuerzos que requieren más financiación y más estudios, pero que demuestran el potencial de nuestra biodiversidad, las diferentes aplicaciones industriales/comerciales que esta nos ofrece, resultados que permiten estimular la creación de empresas de base tecnológica. 88 5.-­‐ REFERENCIAS 89 Ahmed F, Fanning K, Netzel M, Turner W, Li Y, Schenk PM (2014). 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Evaluación y Determinación de Actividades Biológicas