Trabajo en extenso - Facultad de Ingeniería

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Propuesta de un nuevo diseño de biorreactor
para crecimiento de tejido cartilaginoso
Andrea C. Cura, Diego M. Campana y José Di Paolo
Grupo Biomecánica Computacional, Facultad de Ingeniería, Universidad Nacional de Entre Ríos
[email protected]
Resumen—
Una solución prometedora y a largo plazo para el problema
de la degradación del cartílago articular, es la implantación de
cartílago fabricado mediante ingeniería de tejido que pueda
reparar el defecto completamente. Para esto se usan
biorreactores que mantienen un ambiente biológicamente
activo para la proliferación celular, pudiendo programarse
para modular y preservar el crecimiento del cartílago,
especialmente cuando se aplican estímulos mecánicos como
esfuerzos de corte, perfusión y compresión. Debido a la
importancia de los biorreactores en la ingeniería de tejidos, el
objetivo del presente estudio es la propuesta de un nuevo
diseño de biorreactor que estimule la proliferación de tejido
cartilaginoso. Para ello, se investigó sobre los modelos de
biorreactores existentes y se seleccionaron ciertas
características de aquellos con mejores resultados
experimentales. Se estudiaron las variables físicas y químicas
que influyen en la proliferación celular. El diseño del
biorreactor propuesto se basa en un cilindro fijo con orificios
donde se fijan los constructos, rodeado de un cilindro exterior
concéntrico giratorio para inducir un flujo viscoso que accione
sobre los scaffolds (material de soporte para el conjunto
celular) con tensiones cortantes controladas. El fluido está
presurizado respecto al ambiente interior al cilindro fijo, para
promover su pasaje por perfusión a través de los scaffolds.
Además, se propone la forma de aumentar la superficie de
intercambio de oxígeno para poder incrementar la cantidad de
células en el cultivo, dado que el oxígeno generalmente es el
nutriente limitante del cultivo en un biorreactor. El diseño
propuesto permitiría la colocación de scaffolds sobre la
superficie del cilindro fijo sin restricción alguna, aumentando
la densidad de células por ml de medio de cultivo. Además,
proporcionaría esfuerzos cortantes tanto en la superficie como
en el interior del scaffold, estimulando la proliferación celular
y aumentando así el suministro de nutrientes y la remoción de
desechos.
Palabras clave— biorreactores, cartílago, esfuerzo de corte
y perfusión.
I. INTRODUCCIÓN
L
os cartílagos articulares se encuentran recubriendo las
extremidades de los huesos en contacto en las
articulaciones que soportan peso. Su misión es reducir
la fricción, soportando y distribuyendo cargas de modo de
aliviar cualquier presión que pueda dañar a los huesos. El
líquido sinovial que llena las cavidades entre los cartílagos
lubrica la articulación, reduciendo la fricción y el desgaste
[1], [2].
El tejido cartilaginoso está compuesto por condrocitos
rodeados por una matriz extracelular formada
mayoritariamente por proteoglicanos y colágeno tipo II.
Organizado en una estructura tridimensional compleja, el
cartílago está altamente adaptado a su ambiente mecánico
donde los proteoglicanos y las fibras colágenas interactúan
para proveer resistencia a las fuerzas de compresión y de
corte. Debido a su estructura sin vascularización, el
cartílago depende de los esfuerzos mecánicos, de los
esfuerzos inducidos por el fluido, de la perfusión del fluido
a través del cartílago y de la compresión durante el
movimiento de la articulación para el mantenimiento de la
función y estructura del tejido. La escasez de vasos
sanguíneos (que proveen oxígeno y nutrientes), contribuye a
la limitada capacidad del cartílago articular de regenerarse
in vivo [3].
El cartílago sano es el resultado de un balance entre los
procesos de síntesis y degradación. Los daños y
enfermedades que sufre el cartílago comienzan cuando la
vía catabólica sobrepasa la síntesis. Las enfermedades más
comúnmente conocidas son artritis, osteoartritis, artritis
reumatoide y artritis traumática. Los daños traumáticos
como las fracturas también pueden provocar degradación
del cartílago. Esto lleva a una necrosis en la región de la
herida, y la incapacidad del cartílago de repararse
convenientemente puede resultar en una funcionalidad
disminuida y eventualmente evolucionar a osteoartritis.
En el año 2005 aproximadamente 46,4 millones de
norteamericanos fueron diagnosticados con algún desorden
articular, el más común de los cuales fue osteoartritis
(National Center for Health Statistics 2007). Ésta
enfermedad se caracteriza por una lenta degradación del
cartílago articular en las articulaciones que soportan peso,
como por ejemplo la cadera y la rodilla. Los procesos
naturales de reparación son limitados por la naturaleza sin
vascularización del cartílago, lo que resulta en la formación
de fibrocartílago que posee funciones mecánicas más
pobres y carece de estabilidad a largo plazo [3].
Las opciones actuales de tratamientos incluyen drogas
antiinflamatorias, terapia de reemplazo hormonal,
regeneración de células mesenquimales, rellenos autólogos,
y reemplazo total de cadera o rodilla, cada uno con sus
ventajas y limitaciones [4].
Una solución prometedora y a largo plazo para la
degradación del cartílago articular, es la implantación de
cartílago fabricado mediante ingeniería de tejido que pueda
reparar el defecto completamente. El desafío es encontrar la
apropiada fuente de células, material de soporte para el
conjunto celular (scaffold), medio de cultivo, y condiciones
de almacenamiento para producir y mantener al cartílago
vivo y en condiciones de utilización. En ingeniería de
tejidos se utilizan células diferenciadas como los
condrocitos (para cartílago) o células madres multipotentes.
Los scaffolds poliméricos biodegradables y biocompatibles
definen la geometría del tejido y proveen el soporte inicial
para el establecimiento y crecimiento celular [5]. El
2
conjunto de scaffolds, condrocitos o células madres, medios
y condiciones de cultivo, conforman lo que se denomina un
biorreactor.
Un biorreactor es un recipiente o sistema que mantiene
un ambiente biológicamente activo para la proliferación
celular, es decir, el medioambiente apropiado para crear
tejidos en 3 dimensiones utilizando scaffolds adecuados. El
medioambiente del biorreactor puede programarse para
modular y preservar el crecimiento del cartílago,
especialmente cuando se aplican estímulos mecánicos como
esfuerzos de corte, perfusión y compresión. Debido a la
importancia de los biorreactores en la ingeniería de tejidos,
el objetivo del presente estudio es la propuesta de un nuevo
diseño de biorreactor que estimule la proliferación de tejido
cartilaginoso.
II. MATERIALES, DISEÑO Y CARACTERIZACIÓN DE LOS
BIORREACTORES EXISTENTES
Para lograr el nuevo diseño de biorreactor se realizó un
análisis de biorreactores existentes y se seleccionaron
ciertas características de aquellos dispositivos con mejores
resultados experimentales. Además se estudiaron las
variables físicas y químicas que influyen en la proliferación
celular.
La premisa de que los estímulos mecánicos y químicos
que modulan el comportamiento del condrocito in vivo,
también influyen en su comportamiento in vitro [6], [7] ha
llevado a numerosos estudios demostrando que los scaffolds
cultivados con células están influenciados por su medio
circundante, estimulando la condrogénesis y síntesis de
matriz [6]. Así, en los biorreactores, se efectúan cambios en
el medio de cultivo para afectar la cinética y propiedades
del crecimiento tisular en un régimen de flujo bien definido,
para dar con los caminos adecuados para la mecanotransducción y la óptima relación entre las causas mecánicas
y la cinética del crecimiento celular. Schultz et al. [7]
reporta que con algunas pocas excepciones, los
biorreactores que se usan para cultivar cartílago, tratan de
mimetizar la carga mecánica experimentada por el cartílago
in vivo que resulta del movimiento y las tensiones en las
articulaciones. También hay otros sistemas en los que se
aplican otras formas de estimulación a los cultivos
incluyendo: campos eléctricos, ultrasonido, o fuerzas
centrífugas.
crecimiento de cartílago, en general producían flujos
turbulentos o no uniformes que volvían errático el
crecimiento del tejido.
En el 2007, Bilgen y Barabino [10], concluyeron que el
esfuerzo de corte producido por el flujo experimentado por
los constructos de tejido dentro de un biorreactor de pared
ondulada eran significativamente menores que los
observados dentro de un tanque de agitación (ver Fig. 2).
Williams et al. [9] hicieron uso de modelos de DFC
(Dinámica de Fluidos Computacional) para calcular los
campos de flujo, los esfuerzos de corte y perfiles de
oxígeno alrededor de constructos no porosos que simulaban
el cartílago en desarrollo en un biorreactor concéntrico
cilíndrico. Ellos hallaron que su biorreactor proveía un
medioambiente hidrodinámico relativamente homogéneo,
con un transporte de oxígeno hacia el constructo uniforme.
Posteriormente, Farooque [11], desarrolló un trabajo
experimental basado en dos modelos de biorreactores con
cilíndricos concéntricos. Uno de los modelos (CC,
concentric cylinder) solo provee un flujo que genera
tensiones de corte sobre la superficie de los constructos. En
estudios previos y utilizando un biorreactor similar a este,
se observó que la carga hidrodinámica, la baja tensión de
oxígeno y los factores de crecimiento contribuyen a la
condrogénesis [6], [12]. El otro modelo (ver Fig. 3), además
de los esfuerzos de corte sobre la superficie, proporciona un
flujo de perfusión a través del volumen de los scaffolds
(modelo PCC, perfusión concentric cylinder). Los
resultados experimentales mostraron que, ambos modelos
favorecen el crecimiento de tejido de cartílago, con la
diferencia de que en el PCC hay un crecimiento de células
que casi duplica la tasa de crecimiento del modelo CC, y el
contenido de glicosamino-glicanos y colágeno en el
constructo es significativamente menor en el modelo PCC.
En el estudio de Farooque, mediante la utilización de DFC,
se realizó un modelo 2D del flujo en la zona anular (entre
los cilindros) del biorreactor PCC, incluyendo los scaffolds.
Mediante este modelo se encontró que los perfiles de
velocidades sobre la superficie del constructo no eran
homogéneos y se observó recirculación de flujo en los
bordes del mismo.
a)
Fig. 1: Las imágenes en la segunda columna magnifican el perfil del
fluido. A) Tanque de agitación; B) De pared rotatoria. Tomado de [11].
Entre los primeros modelos de biorreactores (ver Fig. 1)
se encuentran los de tanque de agitación [8]; y los de pared
rotatoria. A pesar que estos biorreactores indujeron el
b)
c)
Fig. 2: Esfuerzo de corte para: a) Tanque de agitación (SF, Spinner Flask),
b) y c) Biorreactor de pared ondulada (WWB, Wavy-Walled Bioreactor)
con los scaffolds en ubicación central y lobular respectivamente. Tomado
de [10].
3
Fig. 5: Vista frontal del biorreactor propuesto
Fig. 3: Biorreactor PCC presentado por Farooque. Tomado de [11].
Cinbiz et al. [13] simularon un biorreactor de perfusión
de paredes rotatorias RWPV (rotating wall perfusion
vessel), el cual consiste en dos cilindros concéntricos. El
medio de cultivo y los constructos se encuentran entre los
cilindros, los cuales rotan a la misma velocidad angular para
lograr condiciones microgravitatorias y la rotación de
cuerpo rígido de los constructos de tejido y el medio de
cultivo, sincrónicamente con el recipiente. Las fuerzas que
actúan en los constructos están balanceadas, y éstos se
mantienen en una posición relativamente estable dentro del
recipiente durante el periodo de cultivo (ver Fig. 4). Los
patrones de flujo laminar dinámico en el RPWV proveen
grandes tasas de transferencia de masa con bajos valores de
esfuerzos de corte. Por lo tanto, el medioambiente
hidrodinámico de los biorreactores giratorios mantiene la
formación de constructos de cartílago de gran tamaño,
superiores bioquímica y mecánicamente al compararlos con
otros sistemas de cultivo [13].
Fig. 4: Esquema de la posición de los scaffolds dentro del biorreactor de
perfusión de paredes rotatorias. Tomado de [13].
III. RESULTADOS
Basados en los estudios mencionados en la sección
anterior, y principalmente en el diseño presentado por
Farooque [11], se propone una posible configuración de un
nuevo diseño de biorreactor (ver Fig. 5). Éste está
constituido por un cilindro fijo con orificios donde se fijan
los constructos, rodeado de un cilindro exterior concéntrico
giratorio que impulsa el flujo del fluido de cultivo en el
espacio anular entre ambos cilindros. El fluido esta
presurizado respecto al ambiente interior al cilindro fijo
para promover la perfusión a través de los constructos.
Además, cuenta en su extremo inferior con una región de
configuración cono-plato para minimizar los efectos en la
extremidad. El ángulo del cono se elige de forma de
asegurar que durante la rotación constante de la pared
externa, el esfuerzo de corte promedio en esta región sea
igual al presente en la región concéntrica cilíndrica en la
superficie del constructo.
Por otra parte, una bomba extrae el fluido del cilindro
interior y lo vuelca hacia el espacio anular. Además, el
diseño propuesto cuenta con un tanque de burbujeo por el
que circularía el medio de cultivo, para aumentar de esta
manera la transferencia de oxígeno al medio, asegurando la
satisfacción de los requerimientos metabólicos celulares.
IV. DISCUSIÓN
Para optimizar la producción de cartílago para
implantación e identificar los factores que estimulan el
crecimiento del constructo, es necesario desarrollar
protocolos que expongan a los constructos a condiciones
uniformes en tiempo y espacio. Por ello, para el presente
estudio se eligió un biorreactor concéntrico cilíndrico que
opera en un régimen de bajo esfuerzo de corte para
minimizar el daño celular, posee un gran área de
crecimiento para aumentar la producción de constructos por
unidad de volumen, y es de geometría sencilla permitiendo
el cálculo del transporte de nutrientes y de la carga
hidrodinámica en los constructos. Este diseño provee un
medioambiente cuantificable, uniforme e hidrodinámico,
que promueve la adhesión celular y crecimiento de matriz
bajo condiciones bien definidas y controlables [6]. La
rotación del cilindro exterior (en contraposición a la
rotación del cilindro interior) asegura el mantenimiento de
un flujo estable aún a velocidades de rotación mayores a las
necesarias para inducir el esfuerzo de corte en el cultivo
celular [14]. La relación entre el radio del cilindro interno
(Ri) y externo (Re) cercana a la unidad (Ri/Re= 0.91),
asegura un flujo estable y un esfuerzo de corte constante a
través del espacio anular. Además, se incluye la perfusión
del fluido a través del constructo ya que mediante la
perfusión se proporciona un adecuado suministro de
nutrientes, remoción de desechos y un intercambio gaseoso
suficiente, promoviendo así el crecimiento y la proliferación
celular en el scaffold [15].
4
Al comparar el nuevo diseño de biorreactor con el PCC
reportado en la literatura, se observa que el PCC, dada su
configuración, presenta una cavidad abierta próxima a los
constructos que indica una limitación debido a que produce
un flujo multidireccional y esfuerzos de corte heterogéneos
en la superficie de los constructos. Esto, no ocurriría en el
nuevo diseño propuesto ya que la perfusión se realiza a
través de un gradiente de presión, y no utilizando tubos por
los cuales perfunda el fluido. Además, dado el diseño
propuesto, se visualiza una disminución del espacio muerto
en relación al PCC, aumentando así la densidad del cultivo.
El oxígeno es escasamente soluble en medios acuosos, y
una de las preocupaciones relativa a los cultivos de tejido
de alta densidad es la depleción del oxígeno y la formación
de regiones metabólicamente inactivas o necróticas dentro
del constructo. El oxígeno es el nutriente limitante en un
cultivo celular ya que la concentración de otros nutrientes y
factores de crecimiento puede aumentarse mediante un más
frecuente cambio del medio de cultivo para lograr abastecer
la mayor demanda metabólica que ocurre por la adición de
constructos en un biorreactor [16]. Por ello, el diseño
propuesto posee un tanque de burbujeo para aumentar la
transferencia de oxígeno, y disponer de la cantidad
adecuada del gas en el cultivo celular, posibilitando la
colocación de scaffolds sobre la superficie del cilindro fijo
sin restricción alguna en relación a la disponibilidad de
oxígeno.
[5]
[6]
[7]
[8]
[9]
[10]
[11]
[12]
[13]
[14]
V. CONCLUSIONES
La carga hidrodinámica de los tejidos en los
biorreactores es importante para regular el crecimiento y la
maduración de los tejidos.
Un diseño como el propuesto, permitiría la colocación de
scaffolds sobre la superficie del cilindro fijo sin restricción
alguna, disminuiría el espacio muerto, reduciendo la
cantidad de medio de cultivo utilizado, y aumentando así la
densidad de células por ml de medio de cultivo.
VI. TRABAJOS FUTUROS
Sería de invalorable utilidad el uso de DFC para la
caracterización del flujo permitiendo predecir y
posiblemente optimizar el diseño propuesto. A través del
uso de paquetes de software para la simulación de la
operación del nuevo biorreactor, se obtendrán los resultados
en el contexto de la geometría y dimensiones del dispositivo
a analizar, que optimicen el flujo de cultivo, y el impacto de
éste sobre el crecimiento celular.
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[2]
[3]
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