6. DISCUSIÓN
A partir de los modelos obtenidos, podemos hacer un análisis de las propiedades de los
74 análogos a la isoniazida que fueron utilizados para este estudio, y del mismo estudio
en sí.
Es indudable que no fue encontrada ninguna relación lineal para alguno de los
descriptores calculados con respecto al MIC de los compuestos, por lo que dichos
parámetros no pueden ser tomados como un modelo válido para predicción de
propiedades. No obstante, el modelo 2D no computarizado nos da una idea de que el
Peso Molecular combinado con la distribución espacial bidimensional marca una
diferencia general en el comportamiento del MIC de las moléculas.
Es importante recalcar que aunque la dispersión gráfica del Peso Molecular no
presenta una linealidad satisfactoria, si concuerda con el modelo 2D no computarizado
con el hecho de que por arriba de los 300 g/mol la magnitud del MIC aumenta
considerablemente, hasta en un orden de 50 a 100 veces. Los compuestos aislados a
este comportamiento que presentan un muy bajo MIC con un alto peso molecular, son
moléculas altamente hidrofílicas. Su lejanía con la linealidad antes mencionada, es
explicada en las líneas posteriores.
La dispersión gráfica del coeficiente de partición (LogP), aunque no nos da una
relación lineal, si nos brinda un dato relevante: 72 de los 74 compuestos análogos a INH
son altamente hidrofóbicos, presentando un LogP entre 1 y 4. Esto es más del 97% de
las moléculas en estudio, marcando así claramente un comportamiento general para
posteriores conclusiones.
59
Otro punto a considerar es el modelo QSAR que se llevó a cabo con una
selección de 23 descriptores, los cuáles fueron luego reducidos a 12 para mejorar la
precisión del modelo al eliminar parámetros con poca o nula importancia relativa. Se
obtuvo un modelo lineal que fue puesto a prueba con 16 moléculas de estructura y MIC
similares, a fin de poder medir de forma comparable la variación de la actividad
resultante. El resultado no fue satisfactorio, ya que los MICs obtenidos de la predicción
estaban muy alejados de los medidos experimentalmente, siendo muchos de ellos
negativos. Esto nos muestra que el modelo lineal obtenido por el estudio QSAR no nos
sirve para predicción de la actividad en otras moléculas; sin embargo, lo rescatable del
modelo recae en el resultado arrojado sobre el coeficiente de partición (LogP) como el
descriptor con mayor importancia relativa, dato que nos confirma la importancia de la
lipofilicidad de las moléculas, que será discutido más adelante.
Una información relevante de este trabajo nos la brinda el modelo 3D. Para este
estudio, se decidió usar la posición de la isoniazida dentro del sitio activo de la enzima
KatG en la región δ-meso del grupo hemo, tal como lo reportan Bertrand et al 2004, y
no en el lazo de superficie contenido entre los aminoácidos Leu283 y Ala312 como
había sido postulado anteriormente (Carpena et al 2003).
Basándonos en esta
información, y apoyándonos en lo reportado por Todorovic et al 1999, sobre la distancia
medida entre el átomo de N de amida de la INH y el átomo de Fe del grupo hemo de 3.8
± 0.8 Å, pudimos encontrar resultados muy interesantes al realizar la superposición de
los 74 análogos dentro del sitio activo.
60
El resultado más importante de este estudio tridimensional es el hecho de que
más del 90 % de las análogos a la INH no caben en el sitio activo si las superponemos
con su estructura base de INH en la posición establecida anteriormente, ya que existe un
traslape entre los átomos pertenecientes a los compuestos análogos en el extremo
contrario a la INH y el entorno enzimático del sitio activo.
M. tuberculosis presenta en su pared celular pequeños poros llenos de agua por
medio de los cuáles moléculas pequeñas hidrofílicas entran a la célula por medio de
penetración pasiva (Scior et al 2000). Dichos poros, llamados “porinas”, son proteínas
transmembranales que se asocian entre sí para formar pequeños agujeros de un nm de
diámetro aproximadamente (Brock, 1999). La isoniazida es una de las moléculas que
utilizan este medio para ingresar a la bacteria debido a su tamaño (aproxiamadamente
entre 7 y 8 Å en su longitud más larga, desde el N de piridina hasta el protón unido al N
de amina) y a su coeficiente de partición (LogPexp = -0.7) (Hansch et al 1995). En
cambio, moléculas de mayor tamaño lipofílicas tienen que utilizar la difusión a través de
los lípidos de la pared celular, como los ácidos micólicos. Debido a que los modelos
anteriores nos dicen que el 97% de los compuestos en estudio son altamente
liposolubles y que dicho coeficiente de partición es el descriptor de más peso para el
comportamiento relativo con respecto al MIC, nos hace proponer que quizás nuestras
moléculas en cuestión no entran como tales al sitio activo de la KatG, sino que son antes
sometidas a una reacción dentro del citoplasma del M. tuberculosis en la cuál la
estructura base de INH es separada del resto de la molécula. En el caso de las 63
hidrazonas que forman parte de los 74 análogos, formarían parte de esta posible
reacción de hidrólisis:
61
R
O
+ H2 O
C
H2N
R
N
+
H2N-NH2
C
R
R
Cetona
Hidrazona
Mecanismo:
H
N
C
R
N
R
N
H
N
δ+
R
N
O
O
H
H
H
R
N
N
H
N
O
NH
O
O
NH
R
C
O
N
O
C
R
N
H
H
R
H
R
C
H
N
R
O
O
R
H2 N
C
N
cetona
isoniazida
62
O
H
El resultado son dos moléculas: la isoniazida y el resto de la molécula original en forma
cetónica.
En el mecanismo de reacción, el átomo de Oxígeno del agua ataca con uno de
sus pares electrónicos libres al Carbono unido al Nitrógeno de amina. Dicho Carbono
presenta una carga parcial positiva, la cuál es afectada por el resto de la molécula; sin
embargo, hemos visto que dicha carga no es un parámetro que se relacione directamente
con el MIC. A pesar de ello, se pudo llegar a la conclusión anterior gracias al trabajo
realizado por el Dr. Thomas Scior y por Julián A. Yunes Rojas, quienes, a través de una
comunicación privada durante el desarrollo de esta tesis, aportaron la información
necesaria para soportar dicha hipótesis (Scior et al 2004).
Los otros 11 compuestos que no presentan la estructura de hidrazona
posiblemente podrían participar en una reacción de hidrólisis por medio de otro
mecanismo químico o inclusive haciendo uso de las hidrolasas que radican dentro del
M. tuberculosis; no obstante, dichos mecanismos no pertenecen a los objetivos de este
estudio, por lo que no se profundizará en el tema.
Los mecanismos antes descritos podrían ser comprobados realizando pruebas in
Vitro, utilizando los mismos compuestos de este trabajo, previamente aislados e
hidrolizados, en cepas de M. tuberculosis. De esta forma, si la medición del MIC se
lleva a cabo bajo las mismas condiciones en las cuales se midieron los MICs usados en
los modelos anteriores, podríamos corroborar la hipótesis de la hidrólisis si aquellos
fuesen iguales.
Como resultado de lo anterior, podemos proponer que los análogos a la INH
estudiados en esta tesis penetran por difusión pasiva la pared celular de la bacteria para
63
luego ser hidrozilados y liberar la molécula de INH, la cual entrará al sitio activo de
KatG y llevará a cabo su proceso de activación (Figura 14).
Análogo
Análogo
Hidrólisis
INHlibre
Figura 14: Modelo simple de la entrada de los análogos a INH al
Mycobacterium TB y su hidrólisis para liberar INH dentro de la célula.
Si analizamos el modelo simple de la Figura 14, podemos darnos cuenta que el
primer paso importante es la entrada de los análogos a la bacteria a través de la pared
celular, y su cinética estará determinada por factores fisicoquímicos de las moléculas,
como su lipofilicidad (LogP), tamaño, carga, etc. Una vez dentro de la célula, la
liberación de INH dependerá de la tasa de hidrólisis del compuesto, que estará
determinada por la estabilidad de la molécula, el impedimento estérico, la carga parcial
del carbono que reacciona con el agua, etc. Todos estos parámetros mencionados son
objeto de estudio para un futuro modelo QSAR, ya que al influir directamente en la
concentración libre final de INH, es muy probable que tengan una relación lineal con el
MIC.
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