Diversidad genética de los aislados colombianos de

Genética de poblaciones
Diversidad genética de los aislados colombianos
de Mycosphaerella fijiensis Morelet basada en
marcadores de microsatélites
I. Perea, E. Rodríguez Arango, E. Márquez y R. Arango
L
a Sigatoka negra o raya negra
de la hoja, causada por el hongo
Mycosphaerella fijiensis Morelet (Stover
1980), fue reconocida por primera vez en la
costa sudoriental de Viti Levu en Fiji en 1963
(Rhodes 1964). Posteriormente, la enfermedad
fue registrada en las islas del Pacífico, Asia,
África y finalmente, en América Latina en 1972
en La Lima, Honduras (Stover y Dickson,
1976). El hongo es haploide durante casi todo
su ciclo de vida y se reproduce tanto asexual
como sexualmente, vía conidias y ascósporas,
respectivamente.
Varios estudios han descrito la variabilidad
genética global de M. fijiensis (Carlier et al.
1994, 1996), basados principalmente en el
análisis de los aislados de los hongos de
diferentes continentes utilizando RFLP y
marcadores PCR-RFLP (Rivas et al. 2004).
La realización de estudios a escala local
podría ayudar a mejorar el manejo local de la
enfermedad y programas para el mejoramiento
de la resistencia a la Sigatoka negra.
En Colombia, la Sigatoka negra fue
observada por primera vez en 1981 (Mourichon
y Fullerton 1990) en la región productora de
banano de Urabá, de donde probablemente
se propagó al resto del país. Las principales
áreas productoras de banano en Colombia
están localizadas en Urabá y Magdalena,
donde los bananos se cultivan a alta densidad
en grandes plantaciones y son controlados
utilizando fungicidas químicos (Figura 1). Las
áreas de producción platanera se localizan
principalmente en Tolima y Arauca donde los
plátanos se cultivan en pequeñas y medianas
fincas, en asociación con café, cacao u otros,
con poco o ningún control químico.
En el presente estudio se utilizaron los
marcadores de microsatélites para realizar una
encuesta preliminar de la variabilidad genética
de 40 aislados de M. fijiensis de las principales
regiones locales bananeras y plataneras de
Colombia.
Materiales y métodos
240 Km
240 Km
Magdalena
Venezuela
Panamá
Urabá
Arauca
Tolíma
Ecuador
Se tomaron muestras de las hojas de banano
y plátano infectadas con M. fijiensis en cuatro
localidades en Colombia. De los 40 aislados
recolectados, 11 provenían de Urabá, 10 de
Tolima, 9 de Arauca, y 10 de Magdalena.
Los cultivares de los cuales se tomaron las
18
muestras incluían ‘Grand naine’ (AAA) en
Magdalena y Urabá, y ‘Dominico hartón’ (AAB)
en Tolima y Arauca. Cada aislado fue obtenido
de hojas de plantas diferentes recolectadas al
azar. Todos los aislados fueron cultivados a
partir de una sola ascóspora y mantenidos en
el PDA (agar de dextrosa de papa) en tubos de
ensayo a 28 ± 2°C e incubados en oscuridad
por 30 días.
De cada aislado se extrajo el ADN utilizando
un método basado en CTAB (Weising et al.
1991) con menores modificaciones descritas
en Romero et al. 1999.
El análisis de los microsatélites se realizó
utilizando siete pares de cebadores para los
loci Mf SSR 005, Mf SSR 025, Mf SSR 061,
Mf SSR 137, Mf SSR 203, Mf SSR 194 y Mf
SSR244 (Neu et al. 1999). El análisis PCR fue
realizado en un búfer con volumen de reacción
de 25 ml que contenía 2 mM de MgCl2, 0.2 mM
de dNTPs, 12.5 pmol de cada cebador, 0.625
unidades de polimerasa de ADN Taq DNA
(Promega, California), 1X de búfer de PCR
(50 mM de KCl , 10 mM de Tris HCl, pH 8.3),
Perú
Brasil
Figura 1. Principales regiones bananeras y plataneras de
Colombia.
Figure 1. Main banana and plantain growing regions in Colombia.
InfoMusa - Vol. 14 N°2 Diciembre 2005
y 10-50 ng de patrón de ADN. Después de
la desnaturalización inicial se realizaron
amplificaciones en un thermocycler (MJ
Research PT-200, Mass.) programado para 2
min. a 94°C; 30 ciclos de 30 segundos a 94°C,
45 segundos a 55°C y 45 segundos a 72°C;
con una extensión final de 7 min. a 72°C.
Para determinar el tamaño de los alelos,
un volumen de 2 ml del producto de PCR,
combinado con 3 ml de formamido de búfer
de carga (loading buffer) (80% (w/v), 10 mM
de EDTA pH (8.0), 1 mg/ml de bromofenol
azul y 1mg/ml de xileno cianol FF), fue
desnaturalizado a 98°C por 5 min. Esta
mezcla fue cargada en el gel desnaturalizador
de poliarilamida al 6%, que contenía 7 mol/L
de urea. La electroforesis fue llevada a cabo
con el búfer 1X TBE en un sistema Sequi-Gen
®
(Bio-Rad). Los tamaños de alelos fueron
estimados utilizando una escalera de ADN de
10bp (Gibco BRL).
Los datos se consideraron como haploides,
ya que el ADN fue aislado del cultivo de una
sola ascóspora. Para cada locus se calculó
la cantidad de alelos. La diversidad génica
fue estimada utilizando el índice de Nei
(h) (Nei 1978) y la diversidad genotípica,
utilizando la estadística G de Stoddart y
Taylor, considerando cada genotipo como
un haplotipo con loci múltiples (Hayden et
al. 2003). Para comparar las muestras de
diferentes tamaños, el valor de G fue dividido
por el tamaño de la muestra. Los cálculos de
la diversidad génica se realizaron utilizando
el programa de computadora GDA (Lewis y
Zaykin 2001).
La diferenciación genética se estimó
utilizando las estadísticas Fst de Wright como
se describe en Weir y Cockerham (1984),
utilizando el programa de computadora
Arlequín (Schneider et al. 2000). El significado
de los valores Fst fue examinado con el
método descrito en Excoffier et al. (1992)
utilizando 3024 permutaciones.
Resultados y discusión
La diversidad génica estimada en la muestra
de Arauca (0.42) fue más alta que los valores
obtenidos para Urabá (0.33) y Magdalena
(0.36), aunque en ausencia de la prueba
apropiada es imposible distinguir las muestras
(Tabla 1). Utilizando nueve marcadores de
microsatélites, incluyendo siete utilizados
en nuestro estudio, Molina y Kahl (2004)
obtuvieron una diversidad génica de 0.13 para
la región de Magdalena. La diferencia podría
deberse a diferencias en el muestreo o al
hecho de que los últimos autores utilizan más
marcadores.
La diversidad global génica (h) de nuestras
muestras fue 0.46 (Tabla 1), un valor similar al
0.40 registrado por Neu et al. (1999) para las
poblaciones de M. fijiensis en México y al 0.42
registrado por Molina y Kahl (2004) para un
conjunto de aislados de Costa Rica, Colombia
y Venezuela.
Los productos de PCR revelaron dos alelos
en cada locus, exceptuando Mf SSR 194 y
Mf SSR 244, los cuales tenían tres alelos
por locus. En promedio, la población tenía
2.03 alelos por locus (Tabla 2). Este valor
es aparentemente más bajo que los valores
registrados para México (2.6) y Nigeria
(2.7) utilizando los mismos marcadores de
microsatélites (Neu et al. 1999), pero no es
posible decir si las diferencias son significativas
estadísticamente.
Entre los 40 aislados estudiados se
descubrió un total de 36 distintos haplotipos de
loci múltiples. Los valores G calculados para
cada localidad muestreada mostraron altos
niveles de diversidad genotípica (Tabla 2).
La diversidad genotípica se encuentra cerca
del máximo teórico, ya que la mayoría de los
haplotipos fueron observados solo una vez.
Esto es muy similar a lo que fue descrito por
Carlier et al. (1996) quienes observaron que
cada aislado de M. fijiensis correspondía a un
solo haplotipo de loci múltiple, en 19 loci de
RFLP evaluados.
Algunos de los aislados similares provenían
de localidades distantes, por ejemplo, el
aislado 990920 de Tolima tenía el mismo
haplotipo que el aislado 981111 de Arauca.
La colección de aislados con haplotipos
similares puede representar el resultado de
Tabla 1. Estimados de la diversidad génica de Nei en siete loci de los aislados de Mycosphaerella
fijiensis provenientes de cuatro poblaciones en Colombia.
Locus
MfSSR 005
MfSSR 025
MfSSR 061
MfSSR 137
MfSSR 194
MfSSR 244
MfSSR 203
Media
Desviación estándar
Arauca
0.34
0.34
0.34
0.49
0.56
0.44
0.44
0.42
0.08
Magdalena
0.18
0.32
0.18
0.42
0.48
0.58
0.42
0.36
0.15
InfoMusa - Vol. 14 N°2 Diciembre 2005
Tolima
0.32
0.50
0.50
0.48
0.42
0.18
0.42
0.40
0.11
Urabá
0.49
0.29
0.46
0.29
0.00
0.39
0.39
0.33
0.16
Total
0.39
0.39
0.42
0.45
0.62
0.48
0.48
0.46
0.07
19
Tabla 2. Resultados de los análisis de cuatro poblaciones de Mycosphaerella fijiensis en Colombia
utilizando siete marcadores de microsatélites.
Número de aislados
Número de genotipos
Número de alelos/locus
Diversidad génica (h)
Diversidad genotípica (G)
Tamaño de G/muestra
Arauca
9
9
2.1
0.42
9
1
Magdalena
10
10
2.0
0.36
9.36
0.85
Tolima
10
10
2.0
0.40
10
1
Urabá
11
9
1.8
0.33
10
1
Total
40
36
2.03
0.46
38.1
0.95
Tabla 3. Niveles de diferenciación genética (Fst) entre las cuatro poblaciones de Mycosphaerella
fijiensis en Colombia.
Tolima
Urabá
Arauca
Magdalena
Tolima
0.00000
0.20158*
0.07566
0.10979*
Urabá
Arauca
0.00000
0.13086*
0.26992*
0.00000
0.03130
Magdalena
0.00000
* Denota un valor p igual o menor que 0.05 (Excoffier et al. 1992).
un muestreo independiente de la combinación
más frecuente de alelos.
El estimado global de Fst fue 0.145. Tal
como se ve en la tabla 3, los valores de Fst
variaron de 0.07566 hasta 0.26992 indicando
algún grado de diferenciación, aunque los
niveles logrados no fueron tan altos como los
niveles obtenidos por Rivas et al. (2004) entre
las poblaciones de varios países de América
Latina, que variaron entre 0.03 y 0.58. Esto no
es sorprendente, ya que nuestros datos fueron
recolectados solo en un país.
Aunque la cantidad de aislados en nuestro
estudio es pequeña, se debe realizar más
estudios, ya que nuestros datos ofrecen un
primer estimado de la variabilidad genética de
M. fijiensis en algunas regiones de Colombia.
Agradecimiento
I. Perea y E. Rodríguez
Arango trabajan en la
Unidad de Biotecnología
Vegetal, Corporación para
Investigaciones Biológicas,
Cra. 72 A No. 78B- 141
Medellín, Colombia.
E. Márquez trabaja en la
Escuela de Biociencias,
Facultad de Ciencias,
Universidad Nacional sede
Medellín, Calle 64 Cra. 65
Autopista Norte, Medellín,
Colombia, y Rafael Arango
trabaja en ambas instituciones.
Autor para correspondencia:
[email protected]
Este trabajo fue apoyado en parte por el
Instituto Colombiano para el Desarrollo de
la Ciencia y la Tecnología “Francisco José
de Caldas” (Colciencias), subvención de
Colombia No. 2213-05-157-97, la Corporación
para Investigaciones Biológicas, CIB y el
Programa de Postrado en Biotecnología de
la Universidad Nacional de Colombia, sede
Medellín. Agradecemos al Dr. Dieter Kammer
y al Dr. Gunter Kahl por suministrar cebadores
de microsatélites asi como a la Dra. Alba
Estella Riveros, Sra. Alegría Saldarriaga y Sr.
Alberto Martínez por su ayuda en el muestreo
y aislamiento de Mycosphaerella spp.; también
agradecemos al Dr. Nicolás Jaramillo,
Dr. Mario Lobo, Dra. Ángela Restrepo y
Dra. Helga VonPlaten, por revisar y mejorar el
manuscrito.
Referencias
Carlier J., M.H. Lebrun, M.F. Zapater, C. Dubois &
X.Mourichon. 1996. Genetic structure of the global
population of banana black leaf streak fungus
Mycosphaerella fijiensis. Molecular Ecology 5:499510.
20
Carlier J., X. Mourichom, D. Gonzales de León, M.F.
Zapater & M.H. Lebrun. 1994. DNA restriction
fragment length polymorphisms in Mycosphaerella
species that cause banana leaf spot diseases.
Phytopatology 84:751-756
Excoffier L., P. Smouse & J. Quatro. 1992. Analysis of
molecular variance inferred from metric distances
among DNA haplotypes: Application to human
mitochondrial DNA restriction data. Genetics 131:
479-491.
Hayden H.L., J. Carlier & E.A.B. Aitken. 2003 Genetic
structure of Mycosphaerella fijiensis populations from
Australia, Papua New Guinea and the Pacific Islands.
Plant Pathology 52:703-712
Lewis P. & D. Zaykin. 2001. Genetic Data Analysis (
GDA) User’s manual.
Molina C.M. & G. Kahl. 2004. Genomics of two
banana pathogens: genetic diversity, diagnostics,
and phylogeny of Mycosphaerella fijiensis and M.
musicola. Pp. 127-146 in Banana Improvement
Cellular, Molecular Biology, and Induced Mutations
(S. Mohan Jain and R. Swennen, eds). Science
Publishers Inc., Enfield, USA.
Mourichon X. & R.A. Fullerton. 1990. Geographical
distribution of the two species, Mycosphaerella
musicola
Leach
(Cercosporamusae)
and
Mycosphaerella fijiensis (Cercospora fijiensis),
respectively agents of Sigatoka disease and black
leaf streak disease in bananas and plantains. Fruits
45(3):213-218
Nei M. 1978. Estimation of average heterozygozity and
genetic distance from small number of individuals.
Genetics 89:583-590
Neu C., D. Kaemmer, G. Kahl, D. Fisher & K. Weising.
1999. Polymorphic microsatellite markers for the
banana pathogen Mycosphaerella fijiensis. Molecular
Ecology 8:523-525
Rivas G.G., M.F. Zapater, C. Abadie & J. Carlier. 2004.
Founder effects and stochastic dispersal at the
continental scale of the fungal pathogen of bananas
Mycosphaerella fijiensis. Molecular Ecology 13:
471-482.
Rhodes P.L. 1964. A new banana disease in Fiji.
Commonwealth Phytopathology News 10:38-41
Romero M., T. Diaz, D. Castañeda & R. Arango.
1999. Diagnostico para PCR del complejo Sigatoka
en Colombia. Revista Facultad de Agronomía.
52:425-434
InfoMusa - Vol. 14 N°2 Diciembre 2005
Schneider S., D. Roessli & L. Excoffier. 2000. Arlequin
Stover R.H. & J. Dickson. 1976. Banana leaf spot caused
ver 2000: A software for population genetics data
by Mycosphaerella musicola and Mycosphaerella
analysis.
Laboratory,
fijiensis var difformis: a comparison of the first central
Stover R. 1980. Sigatoka leaf spot of banana and
Weir B. & C. Cockerham. 1984. Estimation of F-statistic for the
Genetics
and
Biometry
University of Geneva, Switzerland.
plantains. Plant Disease 64:750-755
American epidemics. FAO Plant Prot. Bull. 24:36-42.
analysis of population structure. Evolution 38:1358-1370.
Estimación del tamaño del sistema radical utilizando
muestras testigo
H. H. Mukasa, D. Ocan, P. R. Rubaihayo y G. Blomme
L
a excavación del sistema radical de una
planta de banano que crece en el campo
es un proceso destructivo y consumidor de
tiempo. Por ejemplo, se necesitan seis hombreshora para excavar y evaluar el sistema radical de
una planta de banano maduro (Blomme 2000).
La estimación del tamaño del sistema radical
de una mata tomando muestras de las raíces
podría ser mucho más rápida. Para la fresa
(Fragana xananassa Duch.), Fort y Shaw (1998)
demostraron una correspondencia sustancial en
la variabilidad de las muestras testigo del suelo y
la masa radical de toda la planta, indicando que
los cambios en el crecimiento del sistema radical
podrían ser estimados eficazmente a partir de
las muestras testigo del suelo. Las muestras
testigo del suelo requieren no más del 10% del
tiempo empleado para recolectar y procesar
el sistema radical de la planta entera. Blomme
(2000) evaluó plantas de banano cultivadas en
el campo en la estación de pluviometría alta
del Instituto Internacional de Agricultura Tropical
en Nigeria y reportó que las características del
sistema radical de la mata podrían ser evaluadas
adecuadamente a partir de las muestras testigo.
En adición, la obtención de las raíces de las
muestras testigo del suelo requirió sólo una
fracción del tiempo (por ejemplo, el 5% para
dos muestras testigo del suelo) necesitado para
excavar y evaluar el sistema radical completo de
una planta madura.
El objetivo de este estudio consistió en evaluar
si el enfoque de muestras testigo proveería
suficiente información para estimar el tamaño del
sistema radical de la mata en un amplio rango
de genotipos de bananos de Africa Oriental, que
crecen en las fincas.
Materiales y métodos
Este estudio fue realizado en las fincas en los
distritos de Masaka y Bushenyi en el sudoeste
de Uganda, dos áreas productoras de banano
importantes. El sitio Masaka-Lwengo se clasifica
bajo el sistema banano-café, mientras que el sitio
Bushenyi, bajo el sistema de montaña (INIBAP
2003). La altitud en el sitio Masaka-Lwengo varía
entre 1080-1330 metros, con una precipitación
anual promedio de 1200 mm y suelos clasificados
como Luvisoles (FAO 1998). La altitud en el sitio
Bushenyi varía entre 1600-1800 metros con una
precipitación anual promedio de 1588 mm y
suelos clasificados como Acrisoles (FAO 1998).
En cada sitio se evaluaron ocho genotipos
de Musa: los genotipos de banano de altiplanos
de Africa Oriental (AAA-EAHB) ‘Mpologoma’,
‘Lwadungu’, ‘Nakitembe’, ‘Mbwazirume’ y
‘Kibuzi’, el banano de postre ‘Sukali Ndizi’ (AAB),
el plátano ‘Gonja’ (AAB) y el banano cervecero
‘Kayinja’ (ABB). En cada sitio fueron evaluadas
veinte plantas por genotipo con dos a cinco matas
por finca. Las matas seleccionadas estaban en la
cuarta etapa de desarrollo y consistían de una
planta madre lista para cosechar con dos o tres
retoños. La selección de los genotipos AAAEAHB se basó en las series de clones con el
fin de incluir un genotipo representativo de cada
serie de cuatro clones (Karamura y Pickersgill
1999).
El sistema radical fue evaluado utilizando el
método de muestra testigo (Blomme 2000). Se
tomaron tres muestras testigo del suelo en cada
mata: de la posición contigua al retoño más alto
y a 90° y 180° según las manecillas del reloj
desde el retoño más alto. Los testigos tenían un
diámetro de 25 cm y una altura de 80 cm. Los
testigos fueron marcados utilizando un anillo de
metal y se removieron con un pequeño azadón.
Las muestras fueron lavadas para descartar
las partículas de suelo y para cada muestra
testigo se recolectaron los datos del peso seco
y el largo de la raíz adventicia (Tennant 1975).
Posteriormente, las plantas fueron enteramente
excavadas y algunas de las características
fueron medidas en la planta completa.
El análisis estadístico se realizó utilizando el
paquete estadístico Genstat (Genstat 1999). Se
ejecutó una prueba ANOVA para determinar los
efectos de la localización de la planta y de la
InfoMusa - Vol. 14 N°2 Diciembre 2005
21
Sistema radical