Mayor rendimiento y
pureza a partir de la
mínima
concentración celular
IGEN Biotech
gDNA LC KIT®
gDNA LC Kit ®
Extracción de ADN de muestras de baja celularidad
resuspensión. El mayor gasto de tiempo se produce durante la lisis (30 minutos),
para un total de 3 horas de duración del proceso.
gDNA LC Kit. IGEN Biotech
Estas 6 soluciones son totalmente graduables en función del número de
extracciones que se deseen para el producto dirigido al consumidor final. También
‰ Gran rendimiento desde mínima cantidad de células
‰ Proceso
rápido, sencillo
temperatura ambiente
y
limpio.
Almacenamiento
a
‰ Alto rendimiento y calidad de ADN obtenido
‰ Producto patrocinado y financiado por CDTI.
La extracción de ADN de muestras de baja celularidad, como líquido amniótico,
existe la posibilidad de realizar el proceso sin pipetas, mediante un innovador
sistema de goteo de las soluciones.
El kit se basa una extracción en fase orgánica (fenol/cloroformo), pero
optimizando enormemente su rendimiento debido a la limpieza, diferenciación y
eficiencia de la separación de fases.
vellosidad coriónicas o muestras dañadas, es un campo de gran dificultad debido,
sobre todo a los pobres rendimientos de DNA obtenido o el tiempo necesario para
la obtención del ADN necesario para su posterior aplicación. Esto sucede con
muestras forenses (manchas de sangre o semen), diagnóstico prenatal (líquido
amniótico, vellosidad coriónica), etc.
El procedimiento habitual tras la obtención de las muestras consiste en la
expansión celular mediante largos cultivos in vitro con el fin de obtener la cantidad
de células suficiente para su posterior análisis mediante técnicas citogenéticas o
moleculares, llegando a atrasar el diagnóstico a días e incluso semanas, siendo
clave en este tipo de diagnósticos el tiempo y la eficacia.
Figura
1.
generales
en
la
extracción de ADN
mediante
Cómo funciona
Fases
el
(fase orgánica).
El Kit de Extracción de ADN Genómico especializado en muestras de baja
celularidad proporciona un método de extracción sencillo y rápido basado en 5
fases durante las cuales actuarán las 6 soluciones por las que está formado el
producto. Estas soluciones son: lisis, aislamiento, precipitación, lavado, secado y
Gustavo Fernández Balbuena 11 - 28002. Madrid - ESPAÑA - Tel. +34 91 510 29 99 - Fax. +34 91 519 13 26 – igen@igenbiotech.com -
kit
gDNA LC Kit ®
Alto rendimiento pese a la baja celularidad
Alta calidad de ADN obtenido
Los kits de extracción de ADN genómicos existentes en el mercado suelen centrar
La optimización de la separación en fase orgánica proporciona un ADN libre de
su acción en sangre completa, plasma suero, tejido animal o vegetal, etc., el Kit
impurezas, sobre todo de ARN sin perder calidad en el ADN respecto a otros tipos
de IGEN Biotech es capaz de extraer ADN desde aproximadamente 50.000 células,
de métodos, por ejemplo los basados en columnas de sílice que suelen obtener
lo que le aporta un valor solo capaz de ser igualado por caros sistemas
ADN contaminado con restos de nucleótidos. También se evita la contaminación
automáticos.
por proteínas y otras macromoléculas. Los ratios de absorbancia (A260/A280) oscilan
La baja celularidad de la muestra inicial, no afecta al rendimiento del ADN
recuperado, dado que se obtiene ADN en una concentración de 80 μg/mL.
entre valores de 1,7 y 1,9; lo que es indicativo de la baja contaminación y
fragmentación del ADN.
Cantidades mínimas de partida (1 mL de líquido amniótico o 5 mg de vellosidad
coriónica) aseguran un alto rendimiento (aproximadamente 3 μg/ml de líquido
amniótico y 13 μg/ml de vellosidad coriónica)
AMNIOTIC FLUID
CHORIONIC VILLUS
141,26
150,00
500
424,3
400
100,00
300
78,22
229,64
200
100
50,00
72,83
0
0,00
50.000
150.000
250.000
50.000
100.000
Figura 2. Rendimiento de gDNA LC Kit. Concentraciones de ADN (ng/μL) obtenidas a partir
de diferentes concentraciones celulares desde A) Vellosidades Coriónicas; B) Líquido
Amniótico.
Figura 3. Ratios A260/A280 y A260/A230. Espectro de absorción de un ADN genómico obtenido a
partir de 2 mg de vellosidad corial mediante gDNA LC Kit.
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gDNA LC Kit ®
ADN obtenido válido para cualquier uso posterior
Almacenamiento a temperatura ambiente
La constante evolución de la biología molecular necesita, cada día más, de
El producto, a diferencia de la mayoría de los competidores, no necesita de
métodos capaces de trabajar a menores concentraciones, sin que se vean
refrigeración para su conservación a largo plazo. Se ha comprobado con éxito la
afectados la calidad, eficacia y rendimientos de los métodos. El Kit de Extracción
estabilidad de todas sus soluciones a temperatura ambiente durante 3 meses.
de ADN Genómico de IGEN Biotech se adapta perfectamente a los nuevos
Estabilidad vs Tiempo Almacenamiento
métodos de análisis, siendo el ADN obtenido capaz de ser analizado mediante
microarrays, q-PCR, a-CGH, X-MAP y cualquier tipo de secuenciación masiva
como,
por
ejemplo,
pirosecuenciación
ya
que
apenas
se
producen
fragmentaciones de ADN.
2,5
100
2,4
ng/μl
2,3
80
2,2
2,1
60
2
1,9
40
1,8
A 280/A 260
20
1,7
1,6
0
1,5
2
4
5
DÍAS TRAS PRODUCCIÓN
8
14
16
21
ng/μl
24
28
36
45
52
69
77
A280/A260
Figura 5. Gráfico de estabilidad frente al tiempo de almacenamiento. Extracciones realizadas
con gDNA LC Kit almacenado a temperatura ambiente los 3 meses siguientes a su
producción. Eje de ordenadas, días transcurridos tras producción. Eje de abcisas izquierdo:
concentraciones de ADN a partir de muestras con 50.000 células de líquido amniótico. Eje de
abcisas derecha: ratios A280/A260 obtenidos.
Optimización de los tiempos de extracción
A pesar de la especialización del kit en muestras de extracción complicada, esto
no aumenta el tiempo de ensayo. El tiempo de procesamiento aproximadamente
Figura 4. Electroforesis en Agarosa 0,8% de ADN´s genómicos obtenidos a partir de muestras
prenatales (AF, líquido amniótico; CVS, vellosidad corial) mediante gDNA LC Kit en
comparación con ADN genómico obtenido por métodos tradicionales a partir de muestras
de sangre.
es de 90 minutos (a partir de líquidos amnióticos) y de 120 minutos (a partir de
muestras de vellosidad coriónica), para un tiempo total de ensayo de
aproximadamente 3 horas.
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gDNA LC Kit ®
Protocolos optimizados de aislamiento de ADN Genómico
Protocolo aislamiento DNA genómico a partir de líquido amniótico*
1.
Pipetear 1 ml de líquido amniótico, previamente resuspendido, en un eppendorf
safe lock (I).
Nota: en función de la semana de gestación, la concentración final podrá fluctuar. Se
ha comprobado de forma reproducible la obtención de >3μg a partir de 1 ml de
líquido amniótico de 15 semanas (50.000 células).
2.
3.
4.
5.
Centrifugar a 12.000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente.
Eliminar el sobrenadante por simple inversión.
Añadir 500 μl de Solución A y agitar con vortex suavemente.
Incubar a 55ºC durante 30 minutos preferiblemente en agitación horizontal (100-150
rpm).
Nota: la incubación puede prolongarse sin inconvenientes durante un máximo de 48
horas.
6.
Por cada muestra centrifugar un vial de separación (II) a 12.000 rpm durante 20-30
segundos a temperatura ambiente.
7.
8.
9.
Verter todo el contenido del eppendorf (I) del paso 5 en un tubo de separación (II).
Añadir 250 μl de la Solución B.
Cerrar los tubos (II) y ejecutar 50 sacudidas fuertes hasta generar una emulsión
blanquecina.
10. Centrifugar a 12.000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente.
11. Pasar por inversión la fase superior del tubo II a un eppendorf estéril. Desechar el
resto como residuo citotóxico.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
Añadir 50 μl de la Solución C y 500 μl de la Solución D.
Agitar suavemente por inversión hasta lograr homogeneidad.
Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos en posición vertical.
Centrifugar a 12.000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente.
Eliminar el sobrenadante con la ayuda de una pipeta.
Añadir 500 μl de Solución D y agitar con los dedos.
Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos en posición vertical.
Centrifugar a 12.000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente.
Eliminar el sobrenadante con la ayuda de una pipeta.
Añadir 500 μl de Solución E.
24. Añadir 30 μl de Solución F.
25. Incubar a 37ºC o/n para solubilizar el ADN genómico.
26. Usar directamente o guardar a 4ºC (uso en las 48 horas siguientes) o a -20ºC (para
conservación prolongada).
Protocolo aislamiento DNA genómico a partir de vellosidad coriónica*
1.
Depositar una pequeña cantidad de vellosidad corial (entre 1-5mg) en un
eppendorf safe lock (I).
2.
3.
4.
Añadir 20 gotas de Solución A.
5.
Centrifugar por cada muestra un vial de separación (II) a 10.000 rpm durante 2
minutos a temperatura ambiente.
6.
7.
8.
Verter la resuspensión obtenida en paso 4 a uno de los tubos de separación (II)
9.
10.
11.
12.
Centrifugar a 10.000 rpm durante 2 minutos a temperatura ambiente.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
Incubar los eppendorfs a -20ºC durante 10 minutos en posición vertical.
Vortexear suavemente hasta resuspensión total.
Incubar a 55ºC durante 60 minutos preferiblemente en agitación horizontal (100-150
rpm). Nota: la incubación puede prolongarse sin inconvenientes durante un
máximo de 48 horas.
Añadir 10 gotas de la Solución B.
Cerrar los tubos (II) y ejecutar 50 sacudidas fuertes hasta generar una emulsión
blanquecina.
Pasar por inversión la fase superior a un eppendorf estéril. Desechar el resto.
Añadir 2 gotas de la Solución C y 20 de la Solución D.
Agitar suavemente por inversión hasta lograr homogeneidad. Nota: en la mayoría
de los casos es posible observar una medusa.
Centrifugar a 10.000 rpm durante dos minutos a temperatura ambiente.
Eliminar el sobrenadante por inversión.
Añadir 10 gotas de Solución E.
Centrifugar a 10.000 rpm durante 30 segundos a temperatura ambiente.
Eliminar el sobrenadante por inversión y drenar los restos de solución dejando los
eppendorfs invertidos abiertos sobre un papel de filtro o absorbente durante 5-10
minutos.
19. Añadir una gota de Solución F.
20. Dejar a 37ºC o temperatura ambiente durante 5 minutos para solubilizar el ADN
genómico.
Centrifugar a 12.000 rpm durante 5 minutos.
21. Usar directamente o guardar a 4ºC (uso en las 48 horas siguientes) o a -20ºC (para
Eliminar el sobrenadante con cuidado y dejar el eppendorf abierto, invertido sobre
un papel de filtro o absorbente durante 5 minutos. NOTA: no secar totalmente.
*Nota: ambos protocolos están optimizados tanto para pipeteo como para goteo.
conservación prolongada).
Gustavo Fernández Balbuena 11 - 28002. Madrid - ESPAÑA - Tel. +34 91 510 29 99 - Fax. +34 91 519 13 26 – igen@igenbiotech.com -