Español

Revista del Instituto Nacional de
Enfermedades Respiratorias
Volumen
Volume
Número
Number
18
4
Octubre-Diciembre
October-December
2005
Artículo:
Detección de Mycoplasma pneumoniae
mediante PCR-hibridación in vitro en
niños con infección respiratoria
Derechos reservados, Copyright © 2005:
Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias
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REV INST NAL ENF RESP MEX
VOLUMEN 18 - NÚMERO 4
OCTUBRE-DICIEMBRE 2005
PÁGINAS: 265-270
ORIGINAL
Detección de Mycoplasma pneumoniae mediante PCRhibridación in vitro en niños con infección respiratoria
MARÍA FERNANDA ESCOBAR*
MARÍA DEL PILAR DELGADO*
CARLOS JARAMILLO*
* Grupo de Investigación del Laboratorio de Diagnóstico Molecular,
Departamento de Ciencias Biológicas. Universidad de los Andes,
Bogotá, Colombia.
Trabajo recibido: 07-X-2005; aceptado: 24-XI-2005
RESUMEN
ABSTRACT
Antecedentes: Las infecciones respiratorias agudas
(IRA) son una de las causas más frecuentes de enfermedades en el mundo y pueden asociarse a complicaciones graves, entre las que la neumonía ocupa un lugar prioritario; diversos agentes virales y
bacterianos se implican en su desarrollo. Recientemente Mycoplasma pneumoniae ha adquirido gran
importancia ya que estudios epidemiológicos sugieren un aumento en la incidencia de enfermedades
respiratorias causadas por este patógeno.
Palabras clave: In- Sin embargo, los laboratorios clínicos enfección respirato- frentan varias dificultades para su detecria, detección, M. ción, haciendo necesario el estudio de
p n e u m o n i a e , nuevas técnicas moleculares.
PCR-hibridación Objetivo: Detección de M. pneumoniae
mediante PCR-hibridación in vitro en niin vitro.
Key words: Respi- ños con infección respiratoria.
ratory infection, Métodos: Utilizando la técnica de PCR-hidetection, M. pneu- bridación in vitro se analizaron 36 hisomoniae, PCR- hy- pados orofaríngeos de niños entre los 0 y
9 años de edad con infección respiratoria;
bridization.
36% presentaron neumonía y el 30%
bronconeumonía.
Resultados: La implementación y utilización de la
técnica de PCR-hibridación in vitro para la detección
de M. pneumoniae permitió detectar su ADN en el
67% de los pacientes estudiados. De éstos, el 33%
tenía diagnóstico de neumonía.
Conclusión: La técnica de PCR-hibridación in vitro
demostró ser útil en la detección de M. pneumoniae
en las muestras analizadas. Los resultados de este
estudio evidencian que la presencia de ácidos nucleicos de este patógeno es frecuente en las mues-
Background: Acute respiratory infection is considered one of the main causes of morbidity worldwide; it can be associated to serious complications.
A great number of viral and bacterial agents have
been implicated in the development of the disease.
Recently, importance has been given to Mycoplasma pneumoniae as a respiratory pathogen, since
epidemiologic studies suggest a raise in the incidence of diseases due to this microorganism. Nevertheless, nowadays clinical laboratories deal with
a variety of difficulties in the diagnosis of this agent,
raising the need for other molecular methods for its
detection.
Objective: The detection of M. pneumoniae in children with respiratory infection by a PCR-in vitro
hybridization technique.
Methods: 36 oropharyngeal swabs from children
between 0 and 9 years of age with respiratory
infection were analyzed by PCR-in vitro hybridization; 36% had pneumonia and 30% bronchopneumonia.
Results: The implementation of the PCR-in vitro
hybridization for the detection of M. pneumoniae in
patients with respiratory infection allowed the detection of the pathogen’s DNA in 67% of the patients studied. Of these, 33% had pneumonia.
Conclusion: PCR-in vitro hybridization is useful for
the detection of M. pneumoniae. Our results show
the frequent presence of nucleic acids of M. pneumoniae in the samples studied and suggest this microorganism can be a frequent causal agent of respiratory infection.
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REVISTA DEL INSTITUTO NACIONAL DE ENFERMEDADES RESPIRATORIAS
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María Fernanda Escobar y cols.
tras respiratorias analizadas y sugiere que el microorganismo puede ser un agente etiológico frecuente
de neumonías atípicas y de otras patologías respiratorias.
INTRODUCCIÓN
266
La infección respiratoria aguda (IRA) constituye
uno de los mayores problemas de salud en los
países en vías de desarrollo1. La neumonía es considerada la principal consecuencia de estas infecciones. La neumonía adquirida en comunidad
(NAC) produce un impacto importante en los índices de morbimortalidad2,3.
Los agentes causales de IRA incluyen un amplio rango de microorganismos. En los últimos
años Mycoplasma pneumoniae ha adquirido una
importancia creciente como agente causal, especialmente de la neumonía en niños de edad escolar en los que se puede causar hasta 40% o
más de NAC, y es responsable de aproximadamente el 18% de los casos que requieren hospitalización3-5. Estudios basados en pruebas convencionales mostraron que la prevalencia de
neumonía por M. pneumoniae en Colombia varía entre 3 y 12.5%6,7.
M. pneumoniae causa manifestaciones clínicas
no patognomónicas, similares a las de otras infecciones causadas por distintos patógenos, situación
que dificulta el diagnóstico y tratamiento de las
enfermedades, incrementando las posibilidades
de complicaciones y muerte, especialmente en
niños menores de cinco años y adultos de alto
riesgo.
Así, en Colombia y en otros países se hace
necesario el adecuado manejo y la utilización racional de las técnicas de laboratorio, tanto tradicionales como nuevas que, se encuentran disponibles para el diagnóstico etiológico6,7, aunque es
difícil implementar pruebas rápidas, confiables,
específicas, sensibles y reproducibles; por tanto,
el diagnóstico de estas afecciones es eminentemente clínico sin determinación del agente
causal8. Además, las pruebas más utilizadas son
poco específicas (títulos de crioaglutininas) o dispendiosas (cultivo)3; sin embargo, las técnicas
moleculares para el diagnóstico de la infección
respiratoria son altamente sensibles y específicas,
permitiendo una detección rápida y confiable9,10.
Objetivo. Detectar M. pneumoniae en hisopados orofaríngeos mediante la técnica de PCRhibridación in vitro para contribuir a la implementación de estrategias diagnósticas que permitan
un mejor conocimiento de la situación real de las
infecciones respiratorias causadas por él, y el
establecimiento de pruebas útiles para un diagnóstico preciso que permita una terapéutica específica.
MATERIAL Y MÉTODOS
Población de estudio
Treinta y seis pacientes con diagnóstico de infección respiratoria de acuerdo con los criterios establecidos por la OMS; las muestras fueron obtenidas como parte de un proyecto de Vigilancia
epidemiológica de la gripe y otros virus respiratorios, en el cual se incluyeron a varias instituciones hospitalarias de Bogotá DC, Colombia.
Especímenes
Se tomaron exudados orofaríngeos mediante un
hisopo Virocult® (Medical Wire & Equipment Co.
Ltd, Corsham, Wilts., England) dentro de las primeras 96 horas de evolución del proceso infeccioso y fueron conservados a -70oC. Las muestras
atemperadas se recuperaron del hisopo en un 1.5
mL de medio de infusión cerebro-corazón suplementado con antibiótico y antimicótico y agitadas
en vortex.
Extracción del ADN
Doscientos µl de muestra (hisopado orofaríngeo)
fueron transferidos a un tubo estéril y procesados
de acuerdo con el protocolo establecido en el Kit
QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN), donde se
incluyó una lisis con proteinasa K y una posterior
purificación de ADN por medio de una columna
de afinidad. El ADN obtenido fue mantenido en
congelación a -20ºC hasta su uso en la PCR.
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Detección de Mycoplasma pneumoniae mediante PCR-hibridación in vitro en niños con infección respiratoria
Ensayo de PCR-hibridación in vitro
Se realizó la prueba OligoDetect®-Mycoplasma
pneumoniae (Chemicon), con una mezcla de iniciadores que amplificaron una secuencia de 143
pb del gen ATPasa de M. pneumoniae. Cada reacción tenía un volumen final de 25 µl que contenía una concentración de 200 µM de dATP,
dGTP, dTTP y dCTP, 2.5 U de Taq polimerasa, 3
mM de MgCl2, 0.3 µM de la mezcla de primers
y buffer 1X. Después de una desnaturalización
inicial por 1 minuto a 94°C, se realizaron 40 ciclos de desnaturalización por 1 minuto a 94°C,
anillaje a 45°C por 30 segundos y elongación a
72°C por 1 minuto. Posteriormente se realizó una
extensión final por 8 minutos a 72°C en un termociclador Cycler (Bio-Rad).
Como control positivo, en cada reacción de
PCR, se utilizó el control de amplificación incluido
en el kit. Asimismo, se utilizó agua bidestilada
estéril como blanco de reacción en cada montaje realizado. El producto del control positivo se
visualizó como una banda de 100 pb, luego de
una electroforesis por 1 hora y media en geles de
agarosa al 1.5% teñidos con bromuro de etidio.
Todas las muestras fueron evaluadas para descartar una posible inhibición de la reacción
de PCR, mediante la amplificación del gen de
la β-globulina humana utilizando los iniciadores
PCO3 y PCO4, lo que resultaba en un producto
de 110 pb11.
La prueba de hibridación in vitro diseñada para
detectar la región amplificada del gen de la ATPasa, consistió en una denaturación bajo condiciones alcalinas seguida de una hibridación, cuyos
resultados eran determinados mediante la absorbancia de los controles y las muestras.
En cada reacción de hibridación se incluyeron
controles positivos y negativos. Los dos controles
positivos incluidos correspondieron a un control
de la reacción de hibridación, proporcionado por
el kit comercial y un segundo control, constituido por el control positivo del PCR. Como controles negativos se utilizaron el blanco de reacción
de PCR y de tres a cuatro controles negativos en
cada prueba. El blanco de reacción de hibridación
constaba de todos los reactivos utilizados en la
prueba, menos los productos de amplificación o
controles.
La absorbancia de cada muestra se midió en
modo dual en un lector Microplate Reader Benchman (Bio-Rad), usando dos filtros de longitud
de onda de 450 nm y 650 nm. Los puntos de
corte para las muestras positivas y negativas fueron calculados de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
Inmunofluorescencia indirecta
Con el fin de descartar la posibilidad de virus
como agentes etiológicos, se realizó una prueba
de inmunofluorescencia para la detección de los
siete virus respiratorios detectados con mayor frecuencia en nuestro medio. En vista de la negatividad de los especímenes y el incremento sugerido por algunos estudios epidemiológicos en la
frecuencia de infección por otros agentes, entre
ellos M. pneumoniae, se procedió a investigar la
presencia de este microorganismo.
RESULTADOS
La población de estudio estuvo conformada por
36 individuos; de ellos, 36% presentaron un
diagnóstico clínico de neumonía en sus distintas
clasificaciones: NAC, por aspiración, multilobular,
atípica o viral. De la misma manera se analizaron
muestras de pacientes con diagnósticos de bronconeumonía, bronquiolitis, bronquitis, síndrome
coquelochoide, síndrome broncoobstructivo y
neumonitis, que pueden ser ocasionadas por M.
pneumoniae u otros patógenos. Los pacientes incluidos tenían de 0 a 9 años, el 83% hasta 3
años (Tabla I).
La prueba de inmunofluorescencia (Respiratory Panel 1 Viral Screening & Identification IFA
Kit, Light Diagnosis), aplicada a todas las muestras utilizadas en el estudio resultó negativa para
virus del sincicio respiratorio, virus de la influenza A y B, virus de la parainfluenza tipo 1, 2 y 3
y adenovirus.
Tras la amplificación de un fragmento del gen
de la ATPasa de M. pneumoniae, un ensayo de
hibridación in vitro realizado en forma consecutiva permitió la detección de los productos de amplificación obtenidos en 24 de las 36 muestras
analizadas. La Figura 1 muestra algunos de los resultados en la prueba de PCR-hibridación in vitro.
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De los 24 pacientes que:rop
resultaron
positivos
odarobale
FDP
para la prueba
de AS,
PCR-hibridación
VC ed
cidemihparGin vitro, 20
(83%) se encontraron en el rango de menos de
0 a 3 años, 3 tenían entre 4 y 6arap
años (12.5%),
y 1 entre 7 y 9 años. Al 50% se les había diagnosticado
neumonía,
neumonitis
o bronconeuacidémoiB
arutaretiL
:cihpargideM
monía viral (bronconeumonía viral, 25% y neumonía
viral, 21%). NAC, 8% y bronquiolitis, 21%
sustraídode-m.e.d.i.g.r.a.p.h.i.c
(Tabla I).
Los síntomas y signos de los pacientes positivos versus los pacientes negativos fueron muy
similares: Tos, rinorrea, fiebre y dificultad respiratoria
fueron descritos en todos los pacientes, aunque
Tabla de resultados del ensayo
Muestra
Pozo 1 y 2. Blancos
Pozo 3. Control
positivo de PCR
Pozo 4. Control
positivo de hibridación
Pozo 5. Control
negativo 1
Pozo 6. Control
negativo 2
Pozo 7. Control
negativo 3
Pozo 8. Muestra de
paciente
Abs
Resultado
—
—
>4
Positivo
2.35
Positivo
-0.03
Negativo
-0.029
Negativo
-0.015
Negativo
-0.053
Negativo
Abs: Absorbancia punto de corte negativo: menos
0.03 (-0.03). Punto de corte positivo: 0.015
268
Figura 1. Resultados de hibridación para la detección de M. pneumoniae.
Pozo 1, blanco; Pozo 2, blanco; Pozo 3, control
positivo de PCR; Pozo 4, control positivo
hibridación; Pozo 5-7, controles negativos; Pozo
8, muestra de paciente (negativa por hibridación).
Tabla I. Distribución del total de pacientes y pacientes positivos mediante la prueba de PCR e hibridación
de acuerdo con el diagnóstico clínico y edad.
Diagnóstico clínico
0-3
Total
NAC
Neumonía aspirativa
Neumonía multilobular
Neumonía atípica
Neumonía viral
Neumonitis viral
Bronconeumonía viral
Bronconeumonía
Bronquiolitis
Bronquitis
Síndrome coqueluchoide
Síndrome broncoobstructivo
Total
2
0
1
2
5
1
6
3
4
1
2
2
29
Edad de los pacientes (años)
4-6
Positivos
Total
Positivos
2
0
0
1
2
1
6
0
4
1
2
1
20
0
0
0
0
2
0
0
1
1
0
0
0
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0
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Total
Positivos
0
1
0
0
1
0
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1
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3
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
1
NAC: Neumonía adquirida en comunidad
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Detección de Mycoplasma pneumoniae mediante PCR-hibridación in vitro en niños con infección respiratoria
el vómito fue más frecuente en los negativos en
la prueba de PCR.
DISCUSIÓN
Los síntomas y signos de las infecciones respiratorias no son patognomónicos de un agente etiológico determinado3; los virus son los responsables más frecuentes en los niños, por lo que
deben ser considerados como posibles causales
de las mismas. En los casos en que se evidencie
su ausencia por medio de una prueba que detecte los virus o algunos de sus antígenos, deben
usarse otros métodos para establecer la etiología
específica.
En los últimos 15 años las técnicas moleculares, como el PCR, han permitido evidenciar algunos microorganismos en diferentes tipos de
muestras. Estudios moleculares recientemente
realizados en escolares con diagnóstico de IRA
han permitido establecer que, además de los virus, las infecciones por las denominadas “bacterias atípicas” como M. pneumoniae se presentan
en una proporción significativa de casos, contrario a lo que antes se pensaba10,12. Hoy en día, la
incidencia de M. pneumoniae es subestimada debido a que las técnicas utilizadas en el diagnóstico de M. pneumoniae son poco específicas o
dispendiosas12,13.
Con base en lo anterior, es necesario desarrollar
técnicas diagnósticas sensibles, específicas, rápidas
y económicas que permitan precisar el agente etiológico e implementar un tratamiento adecuado.
La valoración de la técnica de PCR-hibridación
in vitro en la detección de M. pneumoniae fue
la base de este trabajo. Tras la aplicación del
método, usando exudados orofaríngeos, se observó que 24 de 36 pacientes resultaron positivos
(67%). En varios estudios se ha reportado que M.
pneumoniae puede causar del 5 al 50% de las
infecciones respiratorias en niños10. Probablemente los resultados encontrados se debieron a
la inclusión de pacientes que tenían una alta probabilidad de infección por este patógeno y/o
que, el momento de la toma de muestras era una
época de gran afluencia o un pico de actividad del
M. pneumoniae, descrito como un agente etiológico muy común en niños de 5 a 15 años de
edad. Aunque éste no es un estudio epidemio-
lógico,
la elevada frecuencia que encontramos
sustraídode-m.e.d.i.g.r.a.p.h.i.c
entre
los 0 y los 4 años sugiere que se deben
cihpargidemedodabor
realizar estudios para determinar la importancia
del patógeno en niños de estas edades, los cuales son considerados dentro del grupo de alto
riesgo para padecer complicaciones.
Todos los pacientes incluidos en el estudio tenían diagnóstico clínico de infección respiratoria
y más del 30% de los pacientes positivos para
M. pneumoniae, mediante el PCR-hibridación in
vitro, diagnóstico de neumonía, lo que podría sugerir una alta prevalencia de este agente en pacientes que la padecen.
Los resultados de nuestro estudio hacen evidente que las técnicas de detección son fundamentales para distinguir entre infecciones virales
y bacterianas, sobre todo en pacientes que padecen complicaciones como la neumonía. Algunas
de las ventajas de utilizar técnicas moleculares
son la confiabilidad y rapidez; su aplicación arroja resultados en un intervalo de tiempo corto si
se compara con el cultivo y algunas pruebas serológicas que utilizan sueros pareados. En el estudio se podían obtener resultados en un par de
horas. Adicionalmente, en la literatura se ha descrito que la prueba de PCR-hibridación in vitro es
más sensible que el PCR simple9.
Durante el presente estudio todas las extracciones resultaron positivas para la β-globulina utilizada como control interno de inhibición de la
reacción, permitiendo inferir que el ADN era calidad PCR y que los hisopados nasofaríngeos son
muestras adecuadas para este tipo de pruebas.
LIMITACIONES DEL ESTUDIO
Este estudio descriptivo involucró el análisis de
muestras respiratorias provenientes de un proyecto de vigilancia centinela para la detección de virus respiratorios; por tanto, no se incluyó una población control, sino solamente una de pacientes
seleccionados con base en un criterio clínico. En
este sentido, el estudio presenta una limitación
pues a través de los resultados obtenidos no es
posible realizar cálculos de sensibilidad y especificidad de la prueba, razón por la cual no incluimos esto como parte de los objetivos del mismo.
Nuestros resultados, plantean la necesidad de
realizar estudios adicionales en diferentes perío-
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dos de tiempo, incluyendo un grupo control y
pruebas que apoyen el diagnóstico, como el cultivo, las crioglutininas y la detección de anticuerpos tipo IgM e IgG (a través de serologías pareadas), con el fin de obtener datos que permitan
estimar la prevalencia real de M. pneumoniae en
nuestro medio y establecer si la presentación del
agente se puede asociar a una época definida o
es constante.
CONCLUSIONES
270
La aplicación de la técnica molecular usada, PCRhibridación in vitro, demostró ser de gran utilidad
para la detección de M. pneumoniae en hisopados orofaríngeos, ya que la presencia de ácidos
nucleicos de M. pneumoniae es frecuente en las
muestras respiratorias estudiadas. El presente estudio no pretendió evaluar la técnica de PCR
como un método diagnóstico, sino como una
herramienta de ayuda para la detección de M.
pneumoniae debido a que la sintomatología y el
diagnóstico clínico no son patognomónicos de
esta infección.
Agradecimientos
A los participantes del proyecto: Vigilancia Centinela de Virus Respiratorios-año 2003, y miembros
del Laboratorio de Diagnóstico Molecular. Universidad de los Andes. Bogotá, Colombia.
A Aventis Pasteur S.A, y al Fondo de Investigaciones de la Facultad de Ciencias. Universidad
de los Andes. Bogotá, Colombia.
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Correspondencia:
María del Pilar Delgado.
Departamento de Ciencias Biológicas,
edificio J (Laboratorio 203).
Universidad de los Andes.
Bogotá, Colombia.
Teléfono: (57-1) 3394949, extensión 3761;
fax: (57-1) 3394949, extensión 2817
e-mail: [email protected]
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