presencia de fitoplasmas asociados al síntoma de “yema

PRESENCIA DE FITOPLASMAS ASOCIADOS AL SÍNTOMA DE
“YEMA GRANDE” EN CHILE PARA SECADO EN ZACATECAS,
MÉXICO
Presence of phytoplasmas associated to the “big bud” symptom in dry chile pepper in
Zacatecas, Mexico
Analí Arredondo-Pérez1, Luis Roberto Reveles-Torres1 y Rodolfo Velásquez-Valle1
Campo Experimental Zacatecas – INIFAP, Km. 24.5 Carr. Zacatecas – Fresnillo, Calera de V. R.,
Zacatecas, México. CP 98500. e-mail:[email protected]
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RESUMEN
Los fitoplasmas son bacterias diminutas que viven en el
floema de las plantas y pueden ocasionar síntomas como amarillamientos, escoba de bruja, declinamiento y distintas malformaciones foliares. Plantas de chile para secado en parcelas
comerciales del estado de Zacatecas, mostraban diferentes
síntomas asociados a la infección por fitoplasmas; uno de esos
síntomas es conocido como “yema grande” (YG) y existe poca
información acerca de su expresión y distribución en plantas de
chile para secado, consecuentemente, el objetivo de este trabajo consistió en determinar la tendencia de distribución de esas
estructuras en plantas de chile para secado. Plantas afectadas
fueron colectadas y el número de YG se contó en cada rama
y su localización fue registrada en un diagrama. La incidencia
general de YG por planta varió entre 5.7 y 75.4%; sin embargo,
su distribución en las ramas de una planta puede ser diferente:
en plantas bifurcadas y trifurcadas la incidencia de YG osciló
entre 0 y 76.9% y de 6.7 a 94.7% respectivamente. En la mayoría de las plantas colectadas la primera YG fue localizada en la
porción más joven de las plantas infectadas. De un total de 193
muestras de la parte inmediata superior o inferior de cada YG
encontrada por planta, el 43.52% resultaron positivas en la detección de fitoplasmas por PCR. La distribución e incidencia de
esta sintomatología, fue irregular en las ramas de una misma
planta o a lo largo de ellas, debido posiblemente al movimiento
del patógeno, el flujo del floema o la transmisión aleatoria por
parte de vectores.
Palabras Clave: Capsicum annuum L., expresión de síntomas, incidencia, vectores.
SUMMARY
The phytoplasmas are small bacteria that live in the phloem
of plants and can cause symptoms such as yellowing, witches’
broom, and various foliar malformations as well as plant decline.
Dried chile plants in commercial fields of Zacatecas, showed
different symptoms associated with phytoplasma infection, one
of these symptoms has been named “Big Bud” (BB) and very
little is known about their expression and distribution in plants for
dried chili, consequently, the aim of this study was to determine
the trend of distribution of these structures for dry chile pepper
plants. Affected plants were collected and the number of BB
was counted in each branch and its location was recorded on a
diagram. The overall incidence of BB per plant varied between
5.7 and 75.4%, however, the distribution of BB in the branches
of a plant may be different, in bifurcated and trifurcated plants
incidence BB ranged from 0 to 76.9% and from 6.7 to 94.7%
respectively. In most plants collected the first BB was located in
the younger portion of infected plants. Tissue from the branch
immediate before and after a BB was PCR-analyzed to detect
the phytoplasma presence; a total of 193 samples were taken
and analyzed; 43.52% were positive to phytoplasma presence.
The distribution and incidence of these symptoms, was irregular
in the branches of the same plant or along them, possibly due
to movement of the pathogen, phloem flow and random transmission by vectors.
Keywords: Capsicum annuum L., expression of symptoms, incidence vectors.
INTRODUCCIÓN
El estado de Zacatecas es el principal productor de chile
seco (Capsicum annuum L.), a partir de los años ochenta. De
1991 a 1996, aportó 29 032 t año-1 de chile mirasol/guajillo y
ancho, principalmente, esto es el 51.16% de la oferta nacional.
Además, se cultivan otros tipos de chile, entre los cuales predomina el chile puya y pasilla (Reyes-Rivas et al., 2001). A lo largo
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del proceso de producción, el cultivo se ve afectado por diversos microorganismos que causan enfermedades y así reducen
la población de plantas, dañan su potencial productivo y afectan
directamente la calidad y cantidad de la cosecha. Aparte de los
hongos, virus, bacterias y nematodos como agentes patológicos, en los últimos años a tomado importancia la presencia de
una sintomatología conocida como “faroles chinos” (la cual será
nombrada en adelante como yema grande: YG), causada presumiblemente por fitoplasmas (Velásquez et al., 2011).
Los fitoplasmas son bacterias de tamaño diminuto que habitan en el floema de las plantas y que son diseminados naturalmente por chicharritas y periquitos; la sintomatología provocada por la infección de estos patógenos es altamente variable
e incluye amarillamientos, escoba de bruja, declinamiento y
distintas deformaciones foliares; sin embargo, se ha encontrado que la identidad de los fitoplasmas es inconsistente con los
síntomas que inducen en las plantas infectadas, es decir, síntomas similares pueden ser inducidos por tipos distintos de fitoplasmas (Lee et al., 1998). El objetivo del presente trabajo fue
detectar la presencia y distribución de fitoplasmas en plantas
de chile con la sintomatología de yema grande.
MATERIALES Y METODOS
La presente investigación incluyó trabajo de campo, en el
que se realizó la colecta de plantas en las parcelas del Campo
Experimental Zacatecas con síntomas de YG pertenecientes a
las variedades “mirasol”, “ancho Calera” y de “ancho Fresnillo”.
Estas plantas se trasladaban al laboratorio de Fitopatología del
Campo Experimental Zacatecas (CEZAC), (INIFAP). Las plantas colectadas se dividieron de acuerdo con el tipo de ramificación inicial en bifurcadas o trifurcadas según presentarán dos o
tres ramas después del tallo respectivamente. De cada planta
colectada se elaboró un diagrama para ubicar las ramas afectadas y localizar dichas estructuras en cada rama. Se tomó una
muestra del tejido inmediato anterior y posterior al sito donde
aparecía la YG. A cada muestra se le extrajo DNA total por el
protocolo de Dellaporta et al., (1983) y posterior a ello, se aplicó
la técnica de PCR anidada. La primera amplificación, y la PCR
anidada fueron hechas utilizando los pares de primers universales, para amplificar secuencias de rRNA 16S de los fitoplasmas, P1/Tint y R16F2n/R16R2, respectivamente (Gundersen
y Lee, 1996; Smart et al., 1996; Lee et al., 1998). Las PCR se
realizaron en un termociclador de Applied Biosystems con el
programa: 1 ciclo de desnaturalización a 95°C durante 2 min y
30 ciclos adicionales con el siguiente programa: 1 min de desnaturalización a 94°C: 1 min de hibridación a 55°C, 2 min de
polimerización a 72°C, y una extensión final de 72°C durante
5 min. Las muestras de extracción de DNA y los productos de
PCR, se analizaron por electroforesis en gel de agarosa al 1%
con bromuro de etidio y visualizados mediante luz ultravioleta
(Smart et al., 1996).
RESULTADOS Y DISCUSION
Se colectaron un total de 17 plantas de diferentes tipos de
chile para secado dentro de las instalaciones del CEZAC con
presencia de YG. De esta total, 11 (64.7%) correspondían a
plantas bifurcadas y el resto (35.3%) a plantas trifurcadas.
La presencia de YG no resultó uniforme en todas las ramas
de las plantas bifurcadas; en 36.4% de ellas solamente se observó ese síntoma en una de las ramas. Por otro lado, todas las
ramas de las plantas trifurcadas mostraban al menos una de
esas estructuras (Cuadro 1).
Cuadro 1. Presencia de yema grande en plantas de chile para secado bifurcadas y trifurcadas.
1
Porcentaje de plantas con presencia de YG en una rama determinada; NA: no aplica.
El porcentaje de dicotomías mostrando YG resultó altamente variable en cada planta; en forma general osciló entre 5.7 y
75.4%, independientemente del tipo de chile o tipo de ramificación inicial. En plantas bifurcadas la incidencia de YG por rama
varió entre 0 y 76.9% (Cuadro 2) mientras que en plantas trifurcadas osciló entre 6.7 y 94.7% (Cuadro 3). El número total de
dicotomías así como el número de YG son variables aún dentro
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de las ramas pertenecientes a una misma planta; en el caso
de plantas bifurcadas la media para ambas variables resultó
de 37.4 y 13.3 respectivamente, pero sus valores individuales
son altamente variables; entre 8 y 141 para el número total de
dicotomías y entre 0 y 34 para el número de YG (Cuadro 2). En
el caso de las plantas trifurcadas la media para el número de dicotomías fue de 22.9 y de 8.9 para el número de YG por rama.
PRODUCCIÓNAGRÍCOLA
La desviación estándar para el número total de dicotomías en
el caso de plantas bifurcadas fue de 26.3, por lo que es similar estadísticamente al número total de dicotomías (22.9) en el
caso de plantas trifurcadas. De acuerdo con los valores de des-
viación estándar, la media del número de YG por rama en las
plantas trifurcadas (8.9) resultó similar a la media de las plantas
bifurcadas (13.3). Sin embargo es necesario contar con un número mayor de muestras (plantas) para confirmar lo anterior.
Cuadro 2. Presencia de yema grande por rama en plantas de chile bifurcadas.
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Cuadro 3. Presencia de YG por rama en plantas de chile trifurcadas.
La localización de la primera dicotomía presentando una
YG es variable entre plantas y entre las ramas de una misma
planta; en la mayoría de las plantas bifurcadas la primera YG
se ubicó en el segundo o tercer tercio (los más jóvenes) de las
ramas respectivas. Aunque el número de dicotomías presentes
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en cada rama dentro de una misma planta es variable, también la localización de la primera YG es irregular. La planta 10,
donde la primera YG aparece en la cuarta dicotomía en ambas
ramas constituye la única excepción a la disparidad en la aparición de YG en cada rama (Cuadro 4).
PRODUCCIÓNAGRÍCOLA
Cuadro 4. Localización de la primera dicotomía mostrando YG por ramas dentro de plantas bifurcadas de chile.
La localización de la primera dicotomía con YG en plantas
trifurcadas sigue la misma tendencia mostrada por las plantas
bifurcadas, es decir a mostrar las primeras YG en la segunda o
tercera porción de la planta; solamente en pocos casos la primera YG aparece en el primer tercio de la planta. Sin embargo,
en cinco de las seis plantas trifurcadas la primera dicotomía con
YG apareció simultáneamente en dos de las tres ramas mientras que en la sexta planta apareció al mismo tiempo en las tres
ramas (Cuadro 5).
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Cuadro 5. Localización de la primera dicotomía mostrando YG por ramas dentro de plantas trifurcadas de chile.
En plantas bifurcadas y trifurcadas una vez que se presentó una dicotomía con YG, las siguientes dicotomías mostraban
esas deformaciones florales en todas las dicotomías de una
rama o en forma irregular (alternando dicotomías sin YG con
dicotomías con YG) y en algunos casos permitiendo que dos o
tres de las última dicotomías presenten flores sin deformaciones visibles hasta el momento de muestreo. Este patrón de presencia/ausencia de YG explica las diferencias en la incidencia
del síntoma (Cuadros 2 y 3).
Los fitoplasmas son diseminados por medio de vectores
como las chicharritas pertenecientes a la familia Cicadellidae,
entre otros, sin embargo, en Zacatecas se ha identificado la
presencia de Neoaliturus tenellus Baker, (previamente Circuli-
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fer) la cual es responsable de la transmisión de patógenos virales y bacterianos (Velásquez-Valle et al., 2008; Christensen et
al., 2005). Es posible que la distribución irregular de fitoplasmas
dentro de una planta o rama pueda deberse a nuevas infecciones provocadas por los patrones de alimentación de las poblaciones del vector.
De las 17 plantas anteriormente colectadas y analizadas, se
eligieron ocho para diagnosticarlas por PCR. De estas plantas,
se tomaron muestras en parte superior e inferior de cada YG
encontrado por planta. Se analizaron un total de 193 muestras,
de las cuales un 43.52% resultaron positivas para la presencia
de fitoplasmas (Cuadro 6) (Figuras 1, 2 y 3).
PRODUCCIÓNAGRÍCOLA
Figura 1. Electroforesis en gel de agarosa de los productos amplificados por PCR anidada de extractos de 12 muestras de YG (líneas 1 a 12) con amplificación de una banda de 1200 pb en las muestras
de las líneas 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 y 11. M Invitrogen 1kb marcador molecular. Control negativo (pasto).
Control positivo (chile) y H2O.
Figura 2. Análisis de ocho muestras de hojas de chile (Líneas 1-8) pertenecientes a la planta 1 con sintomatología de YG, resultaron positivas, con amplificación de una banda de 1200 pb con la utilización de pares de primers
universales F1/Tint y R16R2/. Se utilizaron tres muestras de nopal como controles positivos. Control negativo
(agua) y marcador molecular 1Kb (M).
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Figura 3. Electroforesis en gel de agarosa de los productos amplificados por PCR anidada de extractos de 10
muestras de YG (líneas 1 a 10) con amplificación de una banda de 1200 pb. Control positivo (chile), H2O control
negativo. M Invitrogen 1kb marcador molecular.
Los fitoplasmas se diversifican conformando grupos que infectan un gran número de plantas e insectos diferentes y que
son distintos en su origen geográfico, en las relaciones huésped/vectores, y los síntomas inducidos (Saccardo et al., 2012;
Gundersen y Lee, 1996), tal como se puede observar en la
figura 2, donde los controles positivos en muestras de nopal no
amplificaron con los pares de primers utilizados en este trabajo.
Estudios previos (Randall et al., 2011) también en Capsicum, indican el uso de pares de iniciadores P1/P7 con amplificaciones
de una banda de 1600 pb en tanto que Santos-Cervantes et
al., (2008) utilizan los iniciadores R16mF2/R16mR1 y R16F2n/
R16R2 con una banda amplificada de 1450 pb.
De estas ocho plantas, se tomaron muestras en parte superior e inferior de cada YG encontrado por planta. Se analizaron
en total 193 muestras, de las cuales un 43.52% resultó positivas a la presencia de esta bacteria (Cuadro 1).
Cuadro 6. Porcentaje total de muestras positivas a fitoplasmas .
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PRODUCCIÓNAGRÍCOLA
CONCLUSIONES
La presencia de fitoplasmas parece estar relacionado con
la formación de yemas grandes en variedades de chile para
secado. Por otra parte, la distribución e incidencia de esta sintomatología, fue irregular en lo que respecta a su presencia en
las ramas de una misma planta o a lo largo de ellas, sugiriendo
que además del movimiento del patógeno siguiendo el flujo del
floema, existen otros factores como la transmisión aleatoria por
parte de vectores como Neoaliturus tenellus, que pudieran estar involucrados en la expresión de este síntoma.
LITERATURA CITADA.
Christensen, N.M., Axelsen, K.B., Nicolaisen, M., Schulz,
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