peste bovina

CAPÍTULO 2.1.15.
PESTE BOVINA
RESUMEN
La peste bovina es una enfermedad vírica aguda del ganado bovino doméstico, de los búfalos y de
los yaks, que se caracteriza por las altas tasas de morbilidad y mortalidad. También puede afectar
a las ovejas, cabras, cerdos y ungulados salvajes. Clínicamente, esta forma de enfermedad se
caracteriza por fiebre, una aparición progresiva de erosiones superficiales en las encías, la lengua,
los carrillos y el paladar, junto con descargas oculares y nasales serosas o mucopurulentas. Las
complicaciones en el tracto digestivo están marcadas por la aparición de diarrea o disentería que
provoca una deshidratación grave y depresión. Este cuadro clínico no se ha descrito desde 2001
(Pibor, sur de Sudán). Una forma más leve de la enfermedad, que puede readquirir las
características clásicas, solía ocurrir en el este de África asociaciada con situaciones endémicas,
pero no ha sido diagnosticada desde 1997 (Tanzania) y podría haber desaparecido, en cuyo caso
es posible que el virus original de la peste bovina no exista la actualidad. Basándose en las
colecciones históricas existentes del virus, se han reconocido tres estirpes del virus de la peste
bovina, genéticamente diferentes, como agentes de la enfermedad en África y Asia. La estirpe 1 se
limitó a Etiopía y Sudán, la estirpe 2 al este de África y la 3 a Asia. Recientemente, tanto el sur de
Sudán como el oeste asiático estaban infectados, pero ambas zonas se consideran libres de la
peste bovina en la actualidad. La Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la
Alimentación (FAO) inició en 1992 un Programa Mundial de Erradicación de la Peste Bovina
orientado a erradicar el virus en el año 2010. El éxito de dicho programa puede juzgarse por el
hecho de que dos de las tres líneas independientes de la peste bovina seguramente se han
erradicado del mundo y con la tercera podría haber sucedido lo mismo.
Identificación del agente: La confirmación clínica de la peste bovina se basa en el hallazgo de
individuos o de pequeños grupos de animales que muestran fiebre, inapetencia, depresión,
erosiones superficiales en el labio superior e inferior y en las encías, erosiones o escamaciones de
las papilas de los carrillos, secreción ocular serosa o mucopurulenta y rinorrea, diarrea, postración
e incluso la muerte. La confirmación en el laboratorio se basa en la demostración de la presencia
del virus, de ARN específico del virus o de antígenos precipitantes, en muestras del bazo, de los
nódulos linfáticos o de las secreciones nasales u oculares de los animales con una infección en
fase aguda. Es muy importante aislar el virus si ha tenido lugar un importante deterioro de la salud
animal o una extensión geográfica del mismo. Después del éxito de su total erradicación, los
países libres de peste bovina pueden confirmar ahora la presencia de la peste de los pequeños
rumiantes (PPR) en las ovejas o las cabras basándose en los síntomas clínicos de los animales
infectados y en la presencia de antígenos precipitantes, aunque los síntomas clínicos y los
antígenos inducidos sean comunes a ambos virus.
En la necropsia de casos sospechosos de peste bovina se debe dedicar una atención especial al
abomaso, que puede estar muy engrosado o mostrar una decoloración grisácea; a las placas de
Peyer, que pueden mostrar necrosis linfoide; y al desarrollo de un engrosamiento lineal y un
ennegrecimiento de las crestas de los repliegues del ciego, del colon y del recto. El diagnóstico
diferencial principal ha de realizarse con la PPR en las ovejas y las cabras, y la diarrea bovina
vírica y enfermedad de las mucosas junto con la fiebre catarral maligna en el ganado bovino; la
diferenciación entre estas enfermedades requiere la utilización de métodos de laboratorio
adecuados.
Pruebas serológicas: La OIE ha elaborado una serie de normas recomendadas para la Vigilancia
Epidemiológica de la Peste Bovina (la “vía de la OIE”) que orienta las acciones que han de llevar a
cabo en los países miembros que desean demostrar que han logrado verse libres de la
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enfermedad. Con este fin se ha descrito un enzimoinmunoensayo de competición (ELISA) que
determina la presencia de anticuerpos en animales que se han infectado con el virus natural o que
han sido vacunados contra la peste bovina. También se ha descrito un ELISA indirecto. Cualquiera
que sea la prueba escogida, debe ser sensible de acuerdo con la estirpe del virus que puede
presentarse y es muy específica. Con la misma finalidad puede utilizarse la estimación de los
anticuerpos neutralizantes. Los países miembros pueden buscar consejo en los laboratorios de
referencia de la OIE o en el Secretariado GREP respecto a la selección de la prueba más
adecuada para sus fines.
Requisitos para las vacunas y el material de diagnóstico: Se dispone de una vacuna viva
atenuada en cultivos celulares. Su utilización se ha restringido considerablemente en los últimos
años porque la inmunidad duradera que induce puede interferir con las evaluaciones serológicas
post-campaña orientadas a obtener la acreditación de un país como libre de la peste bovina.
Debido a que el uso de esta vacuna ha originado resultados confusos en la serovigilancia, y a que
todavía está disponible una gran cantidad de la misma, los países miembros deben catalogar y
asegurar todas las existencias restantes para salvaguardar la capacidad de realizar campañas de
seroevaluacion y vigilancia.
A. INTRODUCCIÓN
En los últimos años, el Programa Mundial de Erradicación de la Peste Bovina, dependiente de la Organización de
las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO), ha realizado un enorme avance organizando y
documentando el descenso de la peste bovina (13). Históricamente, el virus estaba ampliamente distribuido por
toda Europa, África y Asia: Sin embargo, recientemente solo se ha detectado en África y Asia. El análisis de
secuencias genéticas ha mostrado que todos los aislamientos del virus de la peste bovina encajan en una de las
tres estirpes filogenéticas no superpuestas, y ahora es posible describir la distribución del virus en términos de
estirpes específicas. Así, la llamada estirpe asiática (estirpe 3) siempre se ha descrito exclusivamente en
Afganistán, India, Irán, Irak, Kuwait, Omán, Pakistán, Rusia, Arabia Saudita, Turquía, Sri Lanka y Yemen. Como
consecuencia de una vacunación concertada y coordinada, y de campañas de vigilancia, esta estirpe de virus no
ha vuelto a aparecer desde septiembre de 2000 (en Pakistán). Aunque las estimaciones no son todavía
completas, es casi seguro que este virus ha sido erradicado con éxito.
Los virus de la peste bovina de las estirpes 1 y 2 sólo se han descrito en África. La estirpe 1 parece haberse
distribuido desde Egipto hasta al sur de Sudán, por el este a Etiopía y hacia el norte y el oeste de Kenia. Por otra
parte, la estirpe 2 se ha descrito tanto en el este como en el oeste de África y, en tiempos, pudo estar distribuido
por el cinturón sub-sahariano a lo ancho de todo el continente (12). Ahora, no obstante, como resultado de otro
programa de vacunación coordinada y de vigilancia (en particular la Campaña Panafricana de la Peste Bovina),
ni en el oeste de África ni en África central se han descrito casos de peste bovina desde 1988 (Ghana Burkina
Faso). Hasta hace poco ambas estirpes se describían en el este de África, pero ahora está claro que la estirpe 1
se eliminó del sur de Sudán en 1998 como consecuencia de una vacunación intensa.
La estirpe 2, que reapareció en 1994, 1996 y 2001 en la fauna salvaje, ha estado transmitiéndose en el
ecosistema relacionado con el pastoreo de Somalia (9), donde su continua presencia causó una considerable
preocupación (10). En 1994 este virus reapareció en el sudeste de Kenia, con efectos dramáticos sobre los
búfalos del Parque Nacional de Tsavo (7), ilustrando de este modo su capacidad para llevar a cabo una
persistencia críptica durante un período de al menos 30 años. En este período es probable que se transmitiera
con un bajo nivel de virulencia entre el ganado susceptible. Aunque ahora parece que este virus ha evolucionado
hasta el punto de escapar a la atención veterinaria en áreas remotas, su presencia no pasó desapercibida entre
los pastores nómadas a cuyo ganado infectaba. Sin embargo, parece claro que este virus no ha sido confirmado
en este último reservorio desde 2001 y, aunque no se puede acreditar tal logro, es más que probable que la
vacunación esporádica haya roto la cadena de transmisión de la estirpe 2.
La peste bovina está causada por un virus con ARN de polaridad de antimensajero, que pertenece al género
Morbillivirus dentro de la familia Paramyxoviridae. En las descripciones clásicas de la peste bovina se considera
como una enfermedad muy grave del ganado bovino doméstico, de los búfalos y de los yaks. El virus también
afecta a las ovejas, cabras, algunas razas de cerdos, y a una amplia variedad de especies salvajes dentro del
orden de los artiodáctilos, aunque no siempre con una forma clínica aparente: una revisión reciente considera a
las ovejas y las cabras como animales susceptibles, pero con escasa importancia epidemiológica como
reservorios de la peste bovina (14).
Aunque se encuentran en las fases finales de erradicación, y algunas cepas de peste bovina evolucionaron para
producir una enfermedad infecciosa leve y no fatal, todas las cepas retuvieron dos atributos muy peligrosos. El
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primero fue una casi segura capacidad para experimentar modulaciones de la virulencia. El segundo fue su
capacidad para infectar a especies animales de caza y causar una infección aguda asociada a mortalidad
elevada en los búfalos, los antílopes elands (Taurotragus oryx), las jirafas, los kudus y los cerdos verrugosos.
La peste bovina clásica tiene un período de incubación entre 1 y 2 semanas, y la enfermedad clínica posterior se
caracteriza por un acceso febril agudo en el que se pueden distinguir fases prodrómicas y erosivas. El período
prodrómico dura aproximadamente 3 días, en los que los animales afectados desarrollan fiebre de 40–41,5°C
junto con anorexia parcial, estreñimiento, congestión de las mucosas visibles, rinorrea y una secrección ocular
serosa, depresión y sequedad del morro. Sin embargo, no puede hacerse un diagnóstico clínico preliminar de la
peste bovina hasta el comienzo de la fase erosiva y el desarrollo de las lesiones bucales necróticas. En el pico
febril aparecen, en el labio inferior y en la encía, manchas de epitelio necrótico y, en una sucesión rápida, pueden
extenderse a la encía superior y a la almohadilla dental, a la parte inferior de la lengua, a los carrillos y a las
papilas de los carrillos y al paladar. Mediante el aumento de las lesiones existentes y el desarrollo de nuevos
focos, la extensión de la necrosis oral puede aumentar notablemente en los 2 ó 3 días siguientes. Parte del
material necrótico se desprende, originando erosiones no hemorrágicas y superficiales de las mucosas.
La diarrea es otra propiedad característica de la peste bovina y se desarrolla 1–2 días después de la aparición de
las lesiones bucales. Al principio es copiosa y acuosa, pero después puede contener mucosidades, sangre y
restos de epitelio, y, en los casos graves, puede estar acompañada por espasmos. Durante la fase erosiva, se
puede ver una necrosis en los agujeros nasales, en la vulva, en la vagina y en el prepucio. Aparece anorexia, el
morro se seca por completo, el animal muestra depresión, el aliento es fétido y se desarrollan descargas
oculares y nasales mucopurulentas.
Aunque se producen muertes, la mortalidad es variable y aumenta a medida que el virus tiene acceso a más
animales susceptibles. Las tasas de mortalidad inicial son probablemente del 10–20%, y, en las fases terminales
de la enfermedad, los animales muestran postración 24–48 horas antes de la muerte. Algunos animales mueren
con lesiones necróticas graves, fiebre alta y diarrea, pero otros lo hacen después de un descenso súbito de la
temperatura corporal a valores inferiores a los normales. Alternativamente, puede remitir la fiebre hacia la mitad
del período erosivo y, 2–3 días más tarde, alcanzar la temperatura normal con una rápida resolución de las
lesiones bucales, detención de la diarrea e inicio de una convalecencia sin complicaciones.
Una característica de las canales de los animales muertos es que se encuentran deshidratadas, macilentas y
sucias. Las fosas nasales muestran signos de rinorrea mucopurulenta, los ojos están hundidos y la conjuntiva
congestionada. En la cavidad oral hay una extensa descamación del epitelio necrótico, que siempre aparece
separado de las áreas adyacentes de mucosa sana. Las lesiones se extienden a menudo al paladar y pueden
implicar a la faringe y a la porción superior del esófago; normalmente, los preestómagos y el abomaso no se
encuentan afectadas, aunque ocasionalmente aparecen placas necróticas en los pilares del rumen. La región
pilórica está especialmente afectada y muestra congestión, petequias y edema de la submucosa. La necrosis
epitelial tiene un color grisáceo a la membrana mucosa. Por lo general, el intestino delgado no está afectado,
excepto por cambios notables en las placas de Séller, donde la necrosis linfoide y la descamación dejan la
estructura orgánica engrosada o ennegrecida. En el intestino grueso los cambios afectan a la válvula ileocecal, el
ganglio cecal y las crestas de los repliegues longitudinales de las mucosas del ciego, colon y recto. Los
repliegues aparecen muy marcados en los casos de muerte aguda y con color oscuro en los casos duraderos; en
ambos casos las lesiones se conocen como "bandas de cebra".
Tomando como ejemplo a la peste bovina asociada con la estirpe 2 del virus como ejemplo de la forma
escasamente virulenta del virus en situaciones endémicas, el período de incubación es de entre 1 y 2 semanas y
la enfermedad clínica posterior no pasa de ser una manifestación subfebril en el ganado. La fiebre es de corta
duración (3–4 días) y no muy alta (38–40°C). La anorexia que caracteriza las formas más agudas de la peste
bovina no se presenta en animales con la enfermedad leve, y por tanto es posible que no pierdan el apetito y
continúen con un comportamiento semejante al de los animales no infectados. Normalmente en estos animales
no se presenta la diarrea. Un examen más detallado puede revelar alguna congestión leve de las membranas
mucosas visibles y pequeñas áreas focales, levantadas y de color blanquecino, de necrosis epitelial en la encía
inferior – a veces de tamaño no superior a una cabeza de alfiler – junto con unas cuantas papilas erosionadas en
los carrillos. En algunos animales no se aprecian esas erosiones, cuya aparición es efímera. Otros pueden
mostrar una ligera secreción serosa ocular o nasal pero que, a diferencia de las formas más graves de la
enfermedad, no llega a ser mucopurulenta.
Aunque las infecciones con virus de la estirpe 2 pueden pasar inadvertidas en el ganado, el virus es muy
infeccioso para las especies de vida salvaje, y entre las especies susceptibles (búfalo, jirafa, eland y kudu) se
origina fiebre, rinorrea, estomatitis erosiva típica, gastroenteritis y muerte. Kock (7) observó además que los
búfalos infectados por la estirpe 2 tenían los ganglios linfáticos periféricos inflamados, lesiones de la piel con
placas queratinizadas y queratoconjuntivitis. Los kudus se infectaron de modo similar, pero aunque la ceguera
fue común – causada por una queratoconjuntivitis aguda – la diarrea no fue un síntoma frecuente. Los elands
también mostraron necrosis y erosiones en la mucosa bucal junto con deshidratación y extenuación. Por tanto,
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en las presentes circunstancias, el diagnóstico de la peste en cualquiera de estas especies indica probablemente
la transmisión simultánea del virus al ganado circundante, aunque a un nivel subclínico.
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
1.
Identificación del agente
En vista del alto nivel de expectación que despierta la Campaña Mundial de Erradicación de la Peste Bovina,
cualquier brote reciente de esta enfermedad tendría un importante significado epidemiológico, no solo como
amenaza de pandemia sino también como indicador de una fallo en la vigilancia. Por ello, hasta que un país haya
alcanzado la acreditación de estar libre de la peste bovina (basándose en la serovigilancia), las muestras de
todos los brotes sospechosos de ser diagnosticados como peste bovina sobre bases clínicas o patológicas,
deben ser enviadas para su confirmación mediante un examen de laboratorio. Se dispone de una adecuada
variedad de pruebas de laboratorio, pero, en las circunstancias antes indicadas, es de capital importancia aislar
el virus, identificar su linaje y establecer su virulencia en ganado experimental (1). La muestra preferida, siempre
que sea posible, deberá ser sangre con un anticoagulante. La aparición de la viremia suele preceder ligeramente
a la aparición de la fiebre y continuar durante 1–2 días después de que la pirexia empiece a desaparecer. En
consecuencia, los animales con fiebre son probablemente virémicos y constituyen, por tanto, la mejor fuente de
sangre con la que se ha de intentar el aislamiento del virus. No obstante, como en algunas ocasiones, algunos
animales febriles pueden no ser virémicos, se deben tomar muestras de diferentes animales con fiebre. Es
importante asegurarse de que haya una suficiente muestra disponible para intentar al menos, dos aislamientos
del virus en el envío inicial cuando aparece un brote sospechoso. Los otros procedimientos descritos deben
intentarse solo si hay un mucha cantidad de muestra disponible.
a)
Aislamiento del virus
El virus de la peste bovina puede cultivarse a partir de la fracción de leucocitos de la sangre completa
recogida con heparina o EDTA (ácido etiléndiamino tetraacético) a una concentración final de 10 unidades
internacionales (UI)/ml y 0,5 mg/ml, respectivamente. Las muestras deben mezclarse cuidadosamente y
llevarse al laboratorio con hielo, pero no congeladas. El virus también puede aislarse a partir de muestras
de ganglios linfáticos del bazo, preescapulares o mesentéricos de animales muertos; estas muestras
pueden congelarse para su transporte.
Para aislar el virus en la sangre, se centrifuga la sangre no coagulada a 2.500 g durante 15 minutos hasta
producir una capa leucocitaria en la interfase entre el plasma y los eritrocitos. Esta capa se extrae tan
limpiamente como sea posible, se mezcla con 20 ml de solución salina fisiológica y se recentrifuga en un
proceso de lavado diseñado para eliminar cualquier anticuerpo neutralizante presente en el plasma. El
precipitado celular resultante se suspende en un medio de mantenimiento para cultivo celular y se distribuye
en alícuotas de 2 ml sobre monocapas establecidas en tubos rodantes con células primarias de riñón de
cordero, células linfoblastoides B95a de mono tití o células de riñón de mono verde africano (Vero). El
medio de cultivo se decanta y se reemplaza cada 2–3 días y se observa la monocapa al microscopio para
observar el desarrollo de efectos citopáticos (ECP). Estos se caracterizan por la refractibilidad, el
redondeamiento celular, la retracción de las células con formación de puentes citoplásmicos alargados
(células estrelladas) y/o formación sincitial. La velocidad a la que se desarrolla el ECP varía en función del
substrato y de la cepa del virus. En células primarias se puede esperar hasta 12 días, en células Vero una
semana y en células B95a 2–4 días. Antes de declarar negativa una muestra importante se pueden intentar
pases, pero una técnica preferible sería inocular intravenosamente la suspensión celular, y cualquier
residuo de la muestra original, en un buey susceptible e intentar reaislar el virus de su sangre. Los
aislamientos de virus se pueden identificar parcialmente demostrando la presencia de precipitógenos
específicos de morbilivirus en los restos de células infectadas, o bien identificar por completo mediante
inmunofluorescencia específica utilizando un anticuerpo monoclonal (MAb) conjugado.
Alternativamente, se pueden emplear suspensiones al 20% (p/v) de ganglios linfáticos o de bazo. Estas se
deben hacer homogenizando los tejidos sólidos con medio de mantenimiento de los cultivos sin suero y
utilizando técnicas normalizadas de homogenización o de corte e inoculando las monocapas como antes.
La liberación de virus de los tejidos consistentes puede realizarse de varios modos. El método más sencillo
es el mortero, pero esta técnica requiere utilizar arena estéril como abrasivo. Alternativamente, el tejido
puede homogenizarse sin abrasivo utilizando homogenizadores de vidrio, como por ejemplo uno de tipo
Ten Broek. También se aplican técnicas de corte empleando, por ejemplo, homogenizadores de tipo Silver
o Wender. Las suspensiones que contienen los virus se clarifican por centrifugación a velocidad baja. El
volumen del inóculo no es importante y el volumen de trabajo más común está entre 1 y 2 ml. Los
antibióticos más empleados son la penicilina y la estreptomicina en combinación, cada uno de ellos a una
concentración de 100 IU/ml. Un espectro de acción similar se logra con neomicina a 50 µl/ml. Se debe
incluir fungizona a 2.5 µg/ml.
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b)
Detección de antígeno por inmunodifusión en gel de agar
Las pruebas de inmunodifusión en gel (IGDA) pueden hacerse en placas Petri o en portas de vidrio para
microscopio (5). En cualquier caso, la superficie se cubre con agar hasta una profundidad de unos 4 mm
utilizando una solución acuosa de agar o agarosa al 1% de alta calidad. Se cortan los pocillos en
disposición hexagonal, con seis pocillos periféricos alrededor de un único pocillo central. En los portas, los
pocillos deben tener 3 mm de diámetro y estar separados 2 mm. En las placas Petri, los pocillos pueden
aumentarse a 4 mm y la distancia entre los pocillos a 3 mm. Cuanto más juntos se coloquen entre sí, menor
es el tiempo de reacción.
Con una pipeta de pequeño volumen, se coloca en el pocillo central un suero de conejo hiperinmune contra
la peste bovina. De modo similar, se coloca en los pocillos periféricos alternativos (es decir, en el pocillo
uno, tres y cinco) un control positivo de antígeno preparado a partir de ganglios linfáticos homogenizados
de conejos infectados con la cepa de peste lapinizada Nakamura III. El control de antígeno negativo se
coloca en el pocillo cuatro. Los antígenos problema se obtienen de exudados de un corte del bazo o de
nódulos linfáticos enviados como muestra para la prueba; alternativamente, se homogeneiza un pequeño
trozo de la muestra en solución salina. Las secreciones oculares se pueden tomar directamente de los frotis
o por compresión con una micropipeta (debe quitarse el algodón del hisopo de toma de muestra, y colocarlo
en el extremo ancho de una punta desechable de plástico de una micropipeta de 50–250 µl; luego, con la
varilla del hisopo, se comprime el algodón y se fuerza hasta que salga un pequeño volumen del exudado
por el extremo delgado de la punta de la micropipeta). Las muestras se añaden a los pocillos dos y seis.
Las pruebas se desarrollan mejor a 4°C o a temperatura ambiente baja. El área de reacción debe
inspeccionarse a partir de las 2 horas para la aparición de líneas de precipitación limpias y netas entre los
pocillos, formando una línea de identidad con los controles. Si no se obtiene resultado en 24 horas, las
pruebas se desechan. Los resultados no son válidos si no se obtiene también reacciones de precipitación
que den una línea de identidad con la preparación de control positivo de antígeno.
Aunque la prueba no es muy sensible ni muy específica, es resistente y adaptable a las condiciones de
campo. Una reacción positiva en un rumiante doméstico grande debe considerarse como peste bovina. En
los pequeños rumiantes, un resultado positivo debe considerarse como derivado de un caso de peste de los
pequeños rumiantes (PPR) y requiere un diagnóstico diferencial posterior.
c)
Histopatología e inmunohistoquímica
En el examen post mórtem, se recogen los tejidos y se colocan en 10% de formalina neutra tamponada
para histopatología e inmunohistoquímica; los tejidos de elección son la base de la lengua, el ganglio
linfático retrofaríngeo y el tercer párpado. Se deben examinar los cortes teñidos con hematoxilina y eosina
para ver la formación de sincitios celulares y de células con cuerpos de inclusión víricos intranucleares. La
presencia de antígenos de la peste bovina puede demostrarse en los mismos tejidos fijados con formalina
mediante tinción con inmunoperoxidasa después de determinar la actividad de la peroxidasa basal
endógena. Si se utiliza un anticuerpo policlonal, esta prueba no sirve para diferenciar entre peste bovina y
PPR. Sin embargo, este problema puede resolverse utilizando anticuerpos monoclonales específicos de la
peste bovina y de la PPR en pruebas por duplicado (3).
d)
Identificación de la estirpe por medio de la reacción en cadena de la polimerasa de trascripción
inversa
La reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) (8) genera el ADN adecuado
para el análisis de las secuencias de los genes. El ARN vírico puede purificarse del bazo (no es lo ideal
debido a su elevado contenido en sangre), de los ganglios linfáticos y de las amígdalas (lo ideal), de los
linfocitos de la sangre periférica (PBL) o de los frotis oculares o de las lesiones bucales. Los tejidos sólidos
(0,5–1,0 g) se trocean y se homogeneizan con 4,0 ml de solución desnaturalizante, los frotis oculares y
bucales se tratan con 1,0 ml y los PBL purificados (de 5–10 ml de sangre completa) con 0,4 ml, según el
procedimiento publicado. Solución D (solución desnaturalizante de rotura): el procedimiento es el
recomendado para reducir el riesgo de manejar tiocianato de guanidina, que es venenoso. Debe realizarse
en una cabina de seguridad química. Se indican las cantidades de tiocianto de guanidina para un frasco de
250 g, pero los volúmenes se pueden ajustar para otras cantidades. No se debe intentar pesar el tiocianato
de guadina, sino disolverlo en el frasco del fabricante añadiendo 293 ml de agua destilada estéril, 17,6 ml
de citrato sódico 0,75 M, pH 7,0, y 26,4 ml de sarcosil al 10%; luego se calienta en un baño de agua a 65°C
hasta una completa disolución. Esta solución se mantiene varios meses en la oscuridad a temperatura
ambiente en una cabina de seguridad química. La solución D final se hace añadiendo 0,36 ml de 2mercaptoetanol a 50 ml de la solución stock. Esta solución no debe mantenerse más de 1 mes. En los
últimos años se ha extendido el uso de columnas de extracción de ARN para una rápida purificación de
ARN de elevada calidad (kit RNeasy. Qiagen). El ARN obtenido se precipita con 2,5 volúmenes de etanol,
se lava con etanol al 70%, se disuelve en agua estéril o en tampón TE (Tris/EDTA, 10 mM, pH 7,5, con
EDTA 1 mM), y se guarda a –70°C o a –20°C hasta su empleo. La síntesis de ADN complementario (ADNc)
se realiza con cebadores hexanucleotídicos aleatorios para utilizar más tarde diferentes lotes específicos de
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cebadores en el paso de amplificación por la PCR. Después se amplifican alícuotas del ADNc resultante,
usando al menos tres lotes de cebadores que puedan detectar y diferenciar entre los dos morbilivirus. Estos
juegos incluyen dos lotes “universales” basados en regiones muy conservadas en los genes de la
fosfoproteína y nucleoproteína que se detectan en todos los morbilivirus, y un lote específico del virus de la
peste bovina basado en las secuencias de los genes de las proteínas de fusión del virus. Los productos de
la PCR se analizan en un gel de agarosa al 1,5% (p/v) junto con marcadores adecuados de ADN para
identificar el producto específico de ADN. En cada RT-PCR se debe incluir un control positivo, como el ARN
del virus del sarampión o del moquillo canino, y un control negativo con agua destilada estéril en vez de
ARN. Las reacciones positivas deben confirmarse usando lotes de cebadores “anidados” sobre secuencias
del gen F o por análisis de las secuencias del ADN producido. Es importante utilizar más de un juego de
cebadores en el paso de la PCR cuando se prueba la presencia de virus con ARN, pues su secuencia
nucleotídica puede variar considerablemente y un cambio en el extremo 3 de la secuencia del cebador
ocasiona la imposibilidad de amplificar el ADN. El laboratorio de referencia mundial en Inglaterra, que es
también un laboratorio de referencia de la OIE para la peste bovina, y el laboratorio de referencia de la OIE
en Francia (véase el cuadro en la parte 3 de este Manual) pueden asesorar sobre el uso de la técnica para
el análisis de muestras de campo.
Más recientemente, se ha descrito una prueba simple Taqman RT-PCR en tiempo real para el diagnóstico
de RPV. Esta prueba RT-PCR en tiempo real para el virus se ha validado como muy sensible en
sobrenadantes de cultivos celulares infectados y en muestras clínicas de ganado infectado
experimentalmente. La prueba es capaz de detectar aislamientos que representan todos los linajes
filogenéticos conocidos del virus y de diferenciarlos del virus PPR y los productores de otras enfermedades
similares (fiebre aftosa, diarrea vírica bovina, herpesvirus bovino, estomatitis vesicular). La sensibilidad
analítica del sistema cebador-prueba L10 superó 1–100 TCID50 (dosis infectiva del 50% en cultivo de
tejidos) dependiendo de la cepa del virus de la peste bovina. La comparación de las muestras procedentes
de animales infectados experimentalmente indicó que los leucocitos y los frotis de la conjuntiva son las
muestras preferidas para el control epidemiológico de la enfermedad que permiten la detección preclínica
de la enfermedad en 2–4 días. En el caso de un brote de peste bovina, esta prueba de la RT-PCR en
tiempo real, que tiene el formato de un tubo único, con capacidad de efectuar un diagnóstico preclínico,
puede suplementar los esfuerzos orientados a evitar futuras transmisiones de la enfermedad.
e)
ELISA de inmunocaptura diferencial
Ni las observaciones clínicas ni las pruebas IGDA sirven para diferenciar entre la peste bovina y la PPR.
Por ello, en los países en los que coinciden ambas enfermedades, se deben emplear otras pruebas como la
PCR en tiempo real si se sospecha cualquiera de estas enfermedades en las ovejas o las cabras. Se puede
conseguir una diferenciación rápida utilizando una prueba ELISA de inmunocaptura diferencial (8). Esta
prueba emplea MAb dirigidos contra la proteína N de los dos virus. Se utiliza como anticuerpo de captura un
MAb que reacciona contra los dos virus, mientras que un segundo MAb, que está biotinilado y es específico
para un sitio antigénico no superpuesto de la proteína N, y que puede ser específico de la peste bovina, o
bien de la PPR, se utiliza para determinar la proteína N que ha sido capturada.
Las placas (o tiras) para ELISA con una alta capacidad de unión de proteínas se recubren con 100 µl de
antígeno de captura por pocillo. Después de tres lavados, se añaden a los pocillos 50 µl de la muestra
problema diluida 1/10 en un tampón de lisis, 25 µl de la dilución recomendada por el fabricante del MAb
específico para el virus y 25 µl de estreptavidina-peroxidasa a una dilución final de 1/3.000. Los pocillos se
llevan a continuación a un agitador orbital durante 1 hora a 37°C y después se lavan de nuevo. Después de
la adición de 100 µl de orto-feniléndiamina (OPD), los pocillos se reincuban durante 10 minutos a
temperatura ambiente. Las reacciones se detienen añadiendo 100 µl de ácido sulfúrico 1 N y los resultados
se miden a 492 nm en un lector ELISA automático y se expresan como valores de absorbancia.
f)
Prueba cromatográfica de tira
Aunque no es una prueba de diagnóstico definitivo, una prueba rápida de cromatografía de tira (ref. 4)
resulta útil como ayuda al personal de campo para investigar los brotes sospechosos de peste bovina.
2.
Pruebas serológicas
a)
El enzimoinmunoensayo de competición (prueba prescrita para el comercio internacional)
Se dispone de un ELISA competitivo para la detección de anticuerpos contra la peste bovina en el suero de
los animales de cualquier especie que se haya expuesto previamente al virus. La prueba se basa en la
capacidad que presentan los sueros problema positivos para competir en la unión al antígeno de la peste
bovina con un MAb anti-proteína H de la peste bovina. La presencia de tales anticuerpos en la muestra
problema bloqueará la unión del MAb, produciendo una reducción en el color esperado de la reacción
después de añadir IgG anti-ratón conjugada con una enzima y una solución de substrato/cromógeno. Como
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
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Capítulo 2.1.15. — Peste bovina
es un ensayo en fase sólida, se necesitan pasos de lavados para asegurar la eliminación de los reactivos
que no se unen.
El antígeno de la peste bovina se prepara a partir de cultivos celulares Madin–Darby de riñón bovino
infectados con la cepa atenuada Kabete ‘O’ del virus de la peste bovina. El antígeno viral se extrae de
células infectadas por ciclos repetidos de sonicación y centrifugación. El MAb se obtuvo fusionando
esplenocitos de ratones hiperinmunizados con la línea celular de mieloma NSO, y comprobando que era
específico para peste bovina (2); este MAb se designa en la actualidad como C1. Tanto el C1 como el
antígeno estandarizado de la peste bovina están disponibles en el laboratorio de referencia de la OIE para
la peste bovina en Inglaterra (véase el cuadro en la parte 3 de este Manual). Existen kits comercializados.

Procedimiento de la prueba
i)
Se reconstruye el antígeno liofilizado de peste bovina con 1 ml de agua estéril y, posteriormente, se
diluye con solución salina tamponada con 0,01 M de fosfato (PBS), pH 7,4, hasta la dilución de trabajo
recomendada por el fabricante
ii)
Se distribuyen de inmediato volúmenes de 50 µl del antígeno diluido en un número apropiado de
pocillos de una microplaca para ELISA con alta capacidad de unión de proteínas y con fondo plano,
utilizando dos pocillos por suero problema. Se golpea lateralmente la microplaca para asegurar que el
antígeno se distribuya uniformemente por el fondo de cada pocillo, se tapa la microplaca y se incuba
en un agitador orbital durante 1 hora a 37°C. Después se lavan los pocillos tres veces con 0,002 M de
PBS, pH 7,4.
iii)
Se añaden a cada pocillo de la prueba 40 µl de tampón de bloqueo (0,01 M de PBS, 0,1% [v/v] de
Tween 20 y 0,3% [v/v] de suero bovino normal) seguido por volúmenes de 10 µl a todos los sueros
problema.
iv)
Se siguen las recomendaciones del fabricante para preparar una dilución de trabajo del MAb en
tampón de bloqueo y añadir 50 µl del mismo a cada pocillo de la prueba. Se tapa la placa y se reincuba en un agitador orbital durante 1 hora a 37°C.
v)
Se siguen las recomendaciones del fabricante para preparar una dilución de trabajo de
inmunoglobulina de conejo anti-ratón conjugada con peroxidasa de rábano en tampón de bloqueo y
añadir 50 µl a cada pocillo de la prueba. Se tapa la placa y se re-incuba en un agitador orbital durante
1 hora a 37°C.
vi)
Se lavan las placas como antes e inmediatamente después se añaden volúmenes de 50 µl de mezcla
de substrato/cromógeno (1 parte de H2O2 al 3% y 250 partes de OPD) y se incuba a temperatura
ambiente durante 10 minutos sin agitación. A continuación, se añaden 50 µl de una solución de
parada, que consiste en ácido sulfúrico 1 M.
vii)
El sistema de prueba debe incluir muestras de suero positivas y negativas para la peste bovina, un
control de MAb y un control de conjugado.
viii) Los valores de absorbancia se miden en un lector de ELISA con un filtro de interferencia a 492 nm y
los resultados de la prueba se expresan como valores de porcentaje de inhibición respecto al valor
obtenido en el control de MAb. Valores de inhibición de 50% o más se consideran positivos, y valores
inferiores al 50% se consideran negativos.
Bajando al 40% o menos el umbral positivo/negativo, aumenta la sensibilidad de la prueba, pero ello afecta
inevitablemente a la especificidad, incrementando la proporción de resultados falsos positivos. En la
práctica, se recomienda el valor del 50% por el GREP, a cuyo nivel la sensibilidad es de al menos el 70% y
la especificidad sobrepasa el 99%. Es necesario tener en cuenta la sensibilidad cuando se diseñen
estrategias de muestreo para la serovigilancia.
Se ha desarrollado un método ELISA indirecto que podría ser útil para los programas de vigilancia de la
peste bovina, especialmente en las áreas en las que puede estar presente el virus del linaje II (17). Sin
embargo, las características de rendimiento de la prueba indican un problema de especificidad y, por tanto,
su utilización requerirá pruebas confirmativas.
b)
Neutralización del virus
La "norma de oro" en la prueba de neutralización vírica (NV) se lleva a cabo en cultivos de tubos rodantes
con células primarias de riñón de ternero siguiendo el método de Plowright & Ferris (11), dado que los
resultados obtenidos con esta prueba se validaron con ganado bovino infectado experimentalmente. En el
procedimiento de los tubos rodantes, se diluye un suero que no ha sido inactivado a intervalos decimales y
después, comenzando con el suero sin diluir, se mezcla con un volumen igual de virus que contenga
aproximadamente 103,0 DICT50 (dosis infectiva del 50% en cultivo de tejido) de la cepa vacunal atenuada
Kabete ‘O’ por ml. La mezcla se mantiene durante toda la noche a 4°C y después se inoculan volúmenes de
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Capítulo 2.1.15. — Peste bovina
0,2 ml en cada uno de cinco tubos rodantes, y a continuación 1 ml de células indicadoras dispersadas y
suspendidas en un medio de crecimiento a razón de 2 × 105 células por ml. Los tubos se incuban a 37°C,
se vierten a los 3 días, se rellenan con un medio de mantenimiento y se colocan en el aparato de rotación;
el examen final se hace a los 10 días.
Para calcular los puntos finales, la dosis vírica se considera satisfactoria si la dilución final está entre los
límites de 101,8 a 102,8 DICT50/tubo; hay que considerar que las diluciones del suero se doblan después de
mezclarlas con la dosis de virus. Esta prueba debe emplearse para examinar los sueros de los animales
que reaccionan con el ELISA durante los programas de vigilancia diseñados para demostrar la ausencia de
la infección o para cualificar al ganado susceptible para las pruebas de vacunación. En estas
circunstancias, se interpreta que la presencia de cualquier anticuerpo detectable en la dilución sérica final
(1/2) indica una infección previa con peste bovina. La prueba de NV es la prueba preferida para examinar
muestras de suero de animales salvajes.
Como prueba de análisis se puede utilizar un método en microplaca. En este procedimiento, se diluye una
dilución inicial de 1/5 a intervalos dobles. Después se incuban volúmenes de 50 µl de suero con volúmenes
de 50 µl de virus que contenga entre 101,8 y 102,8 DICT50 (15). Después de una incubación de 45 minutos o
de toda la noche, se añaden como indicadores 1–2 × 105 células de riñón de ternero, de riñón de cordero o
células Vero. Las pruebas terminan a los 6–7 días y pueden indicar una neutralización inespecífica a
concentraciones elevadas de suero. En algunos sueros normales (respecto a una exposición previa a la
peste bovina) parece haber factores que impiden la penetración y replicación del virus en las células
indicadoras. En la prueba en tubo estos factores probablemente se eliminan durante los cambios del medio
de mantenimiento, mientras que en el método de la microplaca permanecen presentes todo el tiempo. Si la
dilución final más concentrada de suero se limita a 1/10, este efecto desaparece.
REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIAL DE DIAGNÓSTICO
Muchos países han utilizado vacunas contra la peste bovina hasta reducir su incidencia a cero y luego han
seguido las recomendaciones de la OIE para que se reconociera internacionalmente su estado de libres de peste
bovina. Para obtener esta situación, el proceso de la vacunación anual contra la peste bovina ha sido
reemplazado en muchos casos por la vigilancia activa y pasiva, clínica y serológica. La vacunación intensiva en
los focos de enfermedad con la vacuna homóloga (inmunoesterilización) se ha reservado para tratar de controlar
las campañas de emergencia (16).
La vacuna viva atenuada en cultivo de tejidos contra la peste bovina (TCRV) descrita en ediciones previas de
este Manual fue desarrollada por Plowright mediante pases seriados de la cepa virulenta Kabete ‘O’ (RBKO) en
células primarias de riñón de ternero. En vista del éxito del Programa Mundial de Erradicación de la Peste
Bovina, parece que la mayoría de los fabricantes de vacunas ya no elaboran este producto, aunque algunos
conservan considerables stocks. Sin embargo, la descripción publicada en la edición previa de este Manual se
repite aquí para que esté disponible si las condiciones cambian.
1.
Control del inóculo
a)
Características del inóculo
Los lotes de inóculo empleados en la fabricación de TCRV deben producir una vacuna en cultivo celular
que sea segura, confiera una inmunidad en el ganado que dure al menos 5 años, retenga sus
características atenuadas durante al menos cinco pases en el ganado y que carezca de la capacidad de
extenderse por contacto. Las subcepas de RBOK que se empleen en la producción de TCRV deben ser
identificables mediante registros históricos escritos que incluyan información sobre el origen de la cepa y
sus manipulaciones posteriores.
b)
Método de cultivo
La siembra de la vacuna debe mantenerse por un sistema de lotes de inóculo entre los pases 90 y 120. Los
lotes de virus de siembra deben conservarse en estado liofilizado a –20°C o a temperatura inferior. El virus
debe cultivarse en células Vero o en células de riñón primarias o cultivadas de forma seriada y derivadas de
un feto bovino normal o de un ternero muy joven. Las células de cultivos seriados no pueden tener más de
diez pases del cultivo primario.
c)
Validación como una vacuna
Los lotes de inóculo deben ser:
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Capítulo 2.1.15. — Peste bovina
2.
i)
Puros: Libres de contaminación con virus, bacterias, hongos o micoplasmas.
ii)
Inocuos: Que no induzcan una reacción clínica anormal al inocularse en el ganado susceptible a la
peste bovina.
iii)
Eficaces: Que induzcan inmunidad a la peste bovina en el ganado susceptible.
Método de producción
Los lotes individuales de vacunas se preparan infectando cultivos celulares y, después de un tiempo de
incubación adecuado, se recoge el medio en el que se han liberado gran número de virus vivos. Para facilitar la
conservación a largo plazo y la distribución en la cadena de frío, este líquido se liofiliza en presencia de un
crioprotector que consiste en un 5% de hidrolizado de lactoalbúmina y un 10% de sacarosa. El virus puede
obtenerse en células primarias de riñón de embriones bovinos o de terneros, o en células derivadas de estas
fuentes hasta los diez pases seriados. Además, la vacuna se puede producir en líneas celulares continuas
aprobadas, con tal de que se sepa que no están infectadas con el virus de la diarrea bovina vírica (BVDV) y que
se mantengan por un sistema de lotes de siembra; a este respecto se han utilizado células Vero. Para constituir
un lote, los cultivos infectados deben haber sido inoculados con el mismo virus de siembra e incubados y
recogidos juntos. Se permiten dos recogidas de la misma serie de cultivos, las cuales pueden juntarse para
formar una suspensión completa. Todas las fases de la producción de vacunas deben ir acompañadas de los
correspondientes registros escritos.
3.
Control del proceso
Células: Las células primarias, las células cultivadas en serie o las líneas celulares continuas deben proceder de
animales o de embriones normales y mantener una morfología normal durante el cultivo. Deben estar libres de
contaminación por otros virus, particularmente por el BVDV. Cualquiera que sea el tipo de células empleadas en
la producción de las vacunas, se deben mantener cultivos control no infectados utilizando los mismos medios y
condiciones de incubación que con las células infectadas y deben someterse a frecuentes observaciones
microscópicas. Después de recoger la vacuna, los cultivos control se lavan para eliminar el suero bovino y se reincuban durante 10 días en un medio que contenga sustitutos del suero bovino. Se vuelven a observar
microscópicamente para efectos citopáticos. Simultáneamente, se debe examinar una muestra de los cultivos
para comprobar la presencia del BVDV no citopático mediante una prueba de inmunofluorescencia o de
inmunoperoxidasa, o por RT-PCR. El suero utilizado en los medios de cultivo debe proceder de animales
susceptibles a la peste bovina.
Virus: Se debe realizar una titulación vírica del lote de siembra con diluciones del virus 1/20 en una microplaca o
en un sistema de tubos rodantes y utilizar diez réplicas por dilución. Debe realizarse una titulación similar en el
producto final. El virus debe proceder de cultivos mantenidos en frascos rotatorios y no debe recogerse de
cultivos con más de 10 días de incubación desde la inoculación. El material recogido se clarifica por
centrifugación a baja velocidad antes de mezclarlo con un crioprotector. Se puede mantener sin liofilizar como
mucho durante 5 días a 4°C, pero por mucho más tiempo si se congela desde –20°C a –60°C. Como pueden
aparecer virus contaminantes durante las manipulaciones de fabricación o como consecuencia del uso de
medios contaminados, se utiliza suero de conejo hiperinmune para neutralizar el contenido de peste bovina de la
suspensión completa, después de lo cual la muestra debe utilizarse para infectar células Vero o de riñón de
ternero como se ha descrito anteriormente. El producto final debe probarse para verificar la ausencia de
bacterias, hongos y micoplasmas.
4.
Control de lotes
a)
Identidad
El contenido de un recipiente de cada lote de producción debe exponerse a la neutralización con un
antisuero de conejo contra la peste bovina, utilizando un método con virus variable/suero constante, e
inocularse en células de riñón bovino. Se verifica la identidad del producto si no aparece el ECP específico
de la peste bovina.
b)
Esterilidad
Las pruebas para la esterilidad y la ausencia de contaminación de materiales biológicos pueden
encontrarse en el capítulo 1.1.9.
c)
Inocuidad y eficacia
Disponiendo de ganado susceptible a la peste bovina, se junta el contenido de cinco viales seleccionados al
azar y se emplea para inocular un buey con un volumen equivalente a 100 veces la dosis de campo para el
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Capítulo 2.1.15. — Peste bovina
ganado y otro buey con un volumen equivalente a una décima parte de una dosis de campo para el ganado.
Estos animales se mantienen durante 3 semanas en estrecho contacto con un buey no inoculado. Durante
este período se controla diariamente la temperatura de los animales y se realizan inspecciones clínicas
frecuentes. Al final de las 3 semanas, se examina el ganado para observar la presencia de anticuerpos
neutralizantes contra la peste bovina y se inocula en desafío con una cepa de peste bovina capaz de
producir fiebre. La vacuna se considera inocua y eficaz si no induce ninguna reacción clínica anormal, si los
dos animales que recibieron la vacuna resultan protegidos y si no existe evidencia de transmisión del virus
vacunal. Esta prueba no es una prueba de potencia. Cada lote de vacuna debe probarse también para su
inocuidad en pequeños animales.
d)
Potencia
La estrecha relación entre la potencia inmunizante y la infectividad permite usar esta última como base para
las estimaciones de potencia. Se realizan tres titulaciones de infectividad utilizando células de una línea
celular aprobada o células de tres riñones de ternero diferentes o de embrión bovino. En la primera
titulación se puede utilizar el conjunto de viales empleados en la prueba de inocuidad. La segunda y la
tercera determinación se hacen con otros contenidos, en cada caso con el procedente de tres recipientes
finales. La sensibilidad de las células usadas en cada sesión de trabajo debe medirse utilizando una
preparación estándar de virus de la peste bovina. El título final es la media geométrica de las tres
determinaciones, realizando cada una con diluciones decimales y diez observaciones por cada dilución.
e)
Duración de la inmunidad
Es necesario establecer rutinariamente la duración de la inmunidad al TCRV. Los resultados descritos
indican que puede esperarse una inmunidad para toda la vida después de la vacunación satisfactoria del
ganado libre de todo vestigio de inmunidad maternal.
f)
Estabilidad
El TCRV es muy estable cuando se liofiliza correctamente, y se mantiene por mucho tiempo tanto a +4°C
como a –20°C con tal de que el producto se conserve al vacío. Recientemente se puso de manifiesto que la
velocidad de degradación del TCRV puede alterarse dependiendo del estabilizador y de las variaciones del
ciclo de secado. Los resultados más ventajosos se relacionaron con el empleo como estabilizadores de
hidrolizado de lactoalbúmina al 5% y sacarosa al 10%, un ciclo de secado de 72–74 horas bajo un vacío
reducido (100 miliTorr), un secado inicial de 16 horas a –30°C, y una temperatura final de conservación de
35°C. Con títulos elevados, la vacuna se puede utilizar en el campo durante 30 días sin refrigeración.
Después de la reconstitución en solución salina normal o en sulfato magnésico 1 M, el virus es mucho más
termolábil. El período para la distribución de la vacuna reconstituida en el campo no debería superar su vida
media, pero como este parámetro es dependiente de la temperatura y varía de 8 a 24 horas en un margen
de 4°C a 37°C, se debe aplicar un límite de acuerdo con el sentido común; el límite pueden determinarlo las
autoridades nacionales de control, pero puede recomendarse un período universal de 4 horas.
g)
Conservantes
El TCRV contiene hidrolizado de lactoalbúmina y sacarosa que se añaden como crioprotectores; por otra
parte, no contiene conservante químico específico.
h)
Precauciones (riesgos)
No se conoce ningún riesgo relacionado con la producción o el uso del TCRV.
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*
* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Peste bovina (véase el cuadro en la parte 3 de este
Manual de animales terrestres o consúltese la lista más actualizada en la página web de la OIE: www.oie.int
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
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