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33 C A P Í TU L O 2 • OBSTETRICIA 35 CÉLULAS MADRE. ¿LA NUEVA FRONTERA DE LA MEDICINA? Dr. Alberto Costoya A. Profesor Asociado. Escuela de Medicina. Facultad de Ciencias Médicas. Universidad de Santiago de Chile. Past President Federación Latinoamericana de Sociedades de Esterilidad y Fertilidad. [email protected] INTRODUCCIÓN El National Institute of Health de Estados Unidos (NIH) define a las células madre (CM) como aquellas que poseen ciertas características fundamentales que las diferencian de los otros tipos de células. En primer lugar, son células no especializadas, que se auto renuevan durante largos períodos de tiempo mediante división celular, sin tener ninguna función. La segunda característica es que, bajo ciertas condiciones fisiológicas o experimentales, ellas pueden ser inducidas a transformarse o diferenciarse en células con funciones especiales o específicas tan diferentes como neuronas, cardiomiocitos, o células pancreáticas productoras de insulina; esta capacidad o característica se denomina plasticidad. Los conceptos de células no especializadas, potencialmente “inmortales” así como su plasticidad, han alimentado la esperanza de que las CM puedan jugar un rol protagónico en el tratamiento de una gran cantidad de enfermedades consideradas hasta hoy incurables, desatando un tremendo interés en el mundo médico-científico y en el público general. Prestigiosas entidades médicas, universitarias y científicas se han referido a estas maravillosas células con términos tales como la “nueva frontera de la medicina”, “la bala de plata de la medicina” y otras denominaciones que traducen la esperanza de poder llegar a trasplantarlas para reparar tejidos dañados, e incluso obtener órganos nuevos a través de ellas. De alguna manera, y desde esta nueva perspectiva, la salud puede entonces ser considerada como un balance entre la muerte y degeneración celular y la regeneración o reemplazo de células enfermas por otras nuevas, originadas a partir de las CM(1). ORIGEN Y TIPOS DE CÉLULAS MADRE Las células madre también han sido denominadas células troncales, células primordiales, células estaminales y también se conocen genéricamente por su nombre en inglés: stem cells. Se han identificado y aislado muchos tipos de CM tanto in vivo como in vitro, las que básicamente se han dividido según su origen en células madre adultas, de cordón umbilical, embrionarias y fetales (Figura 1). En realidad las primeras CM son las blastómeras, las que aparecen en el desarrollo del embrión en sus primeros días de evolución. Éstas son CM totipotentes, pues cada una de ellas puede duplicarse en otra idéntica, Figura 1. Clasificación de las células madre según su origen. 36 capaz de llegar a producir un organismo completo. Al llegar a la etapa de blastocisto expandido, alrededor de los 5-6 días, y junto con la diferenciación del macizo celular interno y del trofoectodermo, las células que conforman el embrión pierden su capacidad totipotencial de producir un organismo idéntico y completo. Las células del macizo celular interno sin embargo, son capaces de producir los derivados de las tres capas embrionarias, es decir el ectodermo, el mesodermo y el endodermo; estas células madre embrionarias (CME) son llamadas pluripotentes. Pueden entonces dar origen a muchos tipos de células de distintos sistemas, pero no un organismo o individuo completo. Más adelante en el desarrollo embrionario aparecerán las células madre multipotentes, que serán aquellas que van a dar origen a células de un sistema específico como por ejemplo el sistema linfo hematopoyético, pero no a todas las células que conforman otros órganos o sistemas(1). Algunos científicos han optado por líneas de investigación principalmente en CME por las posibilidades derivadas de la gran plasticidad y pluripotencialidad que ellas poseen, pero muchos otros han desarrollado este tipo de estudios en CM madre adultas y de cordón umbilical o también fetales (provenientes de abortos), las que no tienen los reparos éticos expresados desde distintas sensibilidades, y que han sido utilizadas en terapias específicas en clínica humana. Es muy probable sin embargo, que en el futuro el conocimiento científico proveniente de ambas líneas de investigación sea no sólo complementario sino que sumatorio. El avance en el conocimiento de las CM debiera necesariamente llegar a contestar en forma precisa dos preguntas fundamentales: la primera es conocer, cuáles y cómo actúan los factores que hacen que las CM permanezcan dividiéndose y no especializadas, y la segunda es identificar cuáles son las señales y mecanismos que causan que ellas abandonen ese estado y den origen a células especializadas y con funciones específicas. El conocimiento de ambos mecanismos es imprescindible para poder multiplicar CM en cultivo y despues poder “dirigirlas” hacia células y tejidos específicos(2). CLASIFICACIÓN, FUENTES Y PROPIEDADES DE LAS CÉLULAS MADRE A) CÉLULAS MADRE ADULTAS Las más conocidas son las células madre hematopoyéticas, que incluyen las provenientes de la Capítulo 2 - Obstetricia médula ósea y también las de sangre periférica. Estas células han sido utilizadas desde hace más de treinta años en miles de trasplantes autólogos (células provenientes del mismo paciente) o alogénicos (provenientes de un donante compatible) con el objeto de regenerar médula ósea en el tratamiento de patologías oncológicas. Hay evidencias sin embargo, de que estas células no sólo pueden regenerar elementos hematopoyéticos sino que también poseen una plasticidad que ha demostrado poder dar origen a varias estirpes celulares diferentes, tanto in vitro como in vivo(3). En el estroma de la médula ósea se encuentran también las células madre mesenquimales, que son diferentes a las hematopoyéticas. Se han descrito también CM mesenquimales en el periostio, piel y grasa. Este tipo de células son multipotentes, capaces de diferenciarse en cartílago, grasa, músculo, hueso, etc. Pero también se han encontrado algunas escasas poblaciones de CM mesenquimáticas capaces de dar origen a células no solamente mesodérmicas, sino que también endodérmicas, lo que expresa una capacidad pluripotencial. Aunque los dos tipos y orígenes anteriores son los accesos más fáciles y los más reportados en la literatura, existen varios otros tejidos en los que se han encontrado CM adultas. Entre ellas encontramos las CM intestinales, que son las responsables de una renovación permanente del epitelio gastrointestinal. Estas células multipotentes se ubican en las criptas de Lieberhahn, y constituyen también un modelo en vivo para la investigación del comportamiento de las CM al disponer de una ubicación precisa donde encontrarlas. En los últimos años, y a raíz de la constatación referente a la gran capacidad regenerativa del hígado, se ha observado con interés la existencia de CM hepáticas, no derivada de médula ósea ante la posibilidad de poder trasplantar pacientes con ellas. A nivel del ojo, también se han encontrado células madre retinales, incluyendo neuronas bipolares, fotorreceptores y glías. Junto a estas células nerviosas, se han encontrado también células madre neurales en ratas, contrariando el concepto de que no se producen nuevas neuronas en el cerebro después del nacimiento(4-8). Otro tipo de células madre que tienen un inmenso interés son las células madre pancreáticas, por sus implicancias en lo relativo a poder tratar la diabetes mellitus en el futuro. Aunque ha existido controversia sobre si realmente el páncreas contiene este tipo de células o simplemente las células β (ya especializadas) se duplican, recientemente se han podido identificar claramente estas CM en los ductos del páncreas humano(9). Células madre. ¿La nueva frontera de la medicina? Las CM madre mesenquimales de médula ósea pueden diferenciarse a células cartilaginosas y óseas bajo condiciones adecuadas. Sin embargo, aunque el hueso ha demostrado poseer CM y también osteoprogenitoras “dedicadas” (una etapa intermedia entre CM y células especializadas), no está claro sin embargo, que el cartílago articular posea CM, y de hecho in vivo el cartílago tiene una escasa capacidad de regeneración(10). Se han encontrado células madre en los folículos pilosos, que dan origen a la continua regeneración de piel y pelos, así como también CM en tejido graso. En este último caso, en modelos animales, se ha logrado constatar células con características pluripotentes, capaces de dar origen a varias líneas celulares, entre ellas células adiposas y también osteoblastos, capaces de producir formación de hueso(11). B) CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS Como se ha expresado anteriormente, las CM de origen embrionario son las que tienen la mayor plasticidad, al poder dar origen a cualquier tipo de célula, e incluso a un individuo completo como es el caso de las blastómeras de la mórula temprana. Sin embargo, muchos investigadores piensan que son las células embrionarias provenientes de blastocistos expandidos, capaces de dar origen teóricamente a cualquier linaje celular (aunque no a un individuo completo), la gran fuente de CM pluripotenciales para la medicina regenerativa del futuro. La primera línea de células madre embrionarias obtenidas a partir de un blastocisto humano fueron reportadas en 1993 a partir de embriones después de una fertilización in vitro(12). Actualmente, las posibles fuentes de estos blastocistos son tres: 1. Embriones llamados “sobrantes” de fertilización in vitro. 2. Embriones creados específicamente para este propósito mediante técnicas de reproducción asistida. 3. Embriones provenientes de una clonación: ello a través de un procedimiento de transferencia del núcleo de una célula somática en el citoplasma de un óvulo. Es evidente que todas estas fuentes de blastocistos han suscitado reparos éticos dependiendo de las distintas culturas, filosofías, religiones y sensibilidades. Sin embargo, en varios países, que representan en conjunto más de 2.700 millones de habitantes, existe 37 una política “permisiva” frente a la investigación en CM embrionarias, incluyendo clonación por transferencia nuclear. Otros países que suman un total de más de 700 millones de habitantes, tienen una política llamada “flexible” para investigar en células madre provenientes de donación de embriones congelados “sobrantes” de clínicas de fertilidad, frecuentemente bajo ciertas restricciones, guías, o reglamentos. Sin embargo, todos estos estados se oponen a la clonación reproductiva. El resto de los países tiene una política nacional restrictiva o ninguna política establecida(13). La Santa Sede ha expresado oficialmente su fuerte oposición a la clonación humana de cualquier tipo, por ser incompatible con la dignidad humana; al mismo tiempo declara su apoyo a la investigación con CM adultas y de cordón umbilical, la que en su opinión no presenta ningún reparo ético y debe ser francamente estimulada(14). En nuestro país, mientras tanto, se encuentra en discusión final el proyecto de ley que regula la investigación científica en el ser humano y su genoma, y prohíbe la clonación humana terapéutica o reproductiva así como también la destrucción de embriones humanos para obtener células troncales(15). Aparte de los reparos éticos antes comentados, existen dos escollos mayores a vencer antes de que las CM de origen embrionario puedan ser utilizadas en clínica. El primero es lograr que estas células dirigidas y “purificadas” deben demostrar ser absolutamente seguras para su empleo en usos clínicos; el segundo paso es lograr que ellas puedan ser expandidas, es decir multiplicadas muchas veces en forma estable en los cultivos, de manera de tener un número suficiente y necesario para poder aplicarlas en forma terapéutica. Existen dos métodos para lograr separar y cultivar las CM provenientes del macizo celular interno de un blastocisto proveniente de una fertilización in vitro o una clonación: El método llamado “copiar y pegar”, que consiste en colocar estas células (separadas mecánicamente después de digerir la zona pelúcida), en placas de cultivo sobre una capa de fibroblastos murinos o de células tubarias humanas irradiadas. Este fue el primer método empleado en la obtención de CM madre embrionarias. La técnica puede significar largos períodos de tiempo para obtener un número importante de CM después de varios cambios de cultivo(12). El método del “bulto” consiste en cultivar directamente cúmulos de estas células cortados mecánicamente, transferirlos inicialmente a capas de células alimentadoras (fibroblastos murinos 38 irradiados), para después químicamente desagregarlos y “sembrarlos” en capas de fibroblastos tratadas con mitomicina C. De estas células desagregadas surgen luego “brotes” de CM embrionarias, las que pueden ser replicadas, habiéndose publicado recientemente la obtención de 17 líneas celulares diferentes(16). Con cualquier método empleado, las CM de origen embrionario se diferencian espontáneamente cuando se aíslan de su colonia original, cuando exceden un cierto tiempo de crecimiento en cultivo, o también cuando no existe una capa de células alimentadoras adecuadas. De las tres capas celulares fundamentales, actualmente se han logrado sistemas de diferenciación experimental para vías ectodérmicas que resultan en células neurales y gliales, así como mesodérmicas resultantes en células cardíacas y varias otras que incluyen células hematopoyéticas y endoteliales. El direccionamiento hacia endodermo y sus derivados parece haber sido más dificultoso. Existen reportes de cultivos ricos en keratinocitos, células de cresta neural, epitelio retinal pigmentado, neuronas motoras, progenitores hepáticos. Células que contienen algunos marcadores de tejido intestinal, y células que contienen marcadores del tipo pancreático. Las posibilidades en relación al uso futuro de células madre embrionarias son significativas, y existe optimismo en cuanto a su posible utilización en medicina regenerativa(17). Ya que la mayoría de las CM embrionarias han provenido de embriones “sobrantes” de fertilización in vitro, existe preocupación que aunque se puedan obtener líneas celulares estables, los tejidos resultantes de su aplicación pudiesen tener un rechazo después de su uso en terapia celular. Y aunque existen varias maneras teóricas de disminuir esta histo incompatibilidad, ya sea modificando los antígenos celulares de superficie, o teniendo al igual que en los trasplantes de médula ósea (células madre hematopoyéticas) una especie de banco con células clasificadas de acuerdo a los antígenos HLA, lo cierto es que recientemente se ha descrito que estas células son privilegiadas desde el punto de vista inmunológico, y que inyectadas en ratas, son incapaces de inducir una respuesta inmune, del mismo modo como sucede cuando se transfiere un embrión humano donado a una receptora(18). Las estrategias de diferenciación, de manera de producir células que adquieran propiedades de células diferenciadas desde su condición de no especializadas, en el caso de las CM embrionarias, están en plena etapa de investigación. De hecho, en cultivos con alta densidad, o en condiciones sub óptimas, estas células tienden a diferenciarse espontáneamente en varios tipos celulares diferentes, con una cierta tendencia Capítulo 2 - Obstetricia hacia células de tipo neuronal o cardiomiocitos. Después de algún tiempo en cultivo, de hecho se forman células que representan las tres líneas básicas de endo, meso y ectodermo. Pero la inducción de diferenciación deseada debiera ser obtenida mediante técnicas específicas, únicas o confluyentes, tales como separación mecánica, tratamiento con factores de crecimiento específicos (por ejemplo ácido retinoico para producir neuronas), co cultivos con células fetales del tipo requerido, con la esperanza de que estos tejidos acompañantes produzcan estos factores, o también con procedimientos de transfección génica que “dirijan” a las CM hacia el tipo específico deseado. En teoría, las células pluripotenciales embrionarias debieran poder producir la totalidad de los 210 tipos de células diferentes del organismo humano(19). En resumen, y aunque este tipo de células troncales embrionarias son las que tienen una mayor pluripotencialidad, son inmensos los escollos a salvar y los conocimientos que deberán ser adquiridos antes de llegar a utilizarlas en terapias celulares para la producción de tejidos, y más aún de órganos, con sistemas seguros y reproducibles. Además de adquirir el conocimiento para “direccionarlas” o diferenciarlas, existen otros escollos a vencer como son la obtención de CM embrionarias libres de proteínas extrañas en cocultivos, la expansión de estas líneas, el testeo cromosómico y de defectos genéticos, su caracterización fenotípica, genómica y proteómica, tests adecuados de pluripotencialidad, adecuada evaluación morfológica, de antígenos de superficie, y cultivos libres de infección con chequeos periódicos. Además se deberán lograr análisis detallados respecto a la expresión génica y proteica, tests de actividad biológica in vitro con caracterización específica de líneas celulares progenitoras; pruebas en animales, demostración de eficiencia y eficacia, testeo de rechazo, seguridad en relación a la formación de tumores benignos o malignos, para finalmente llegar a los ensayos clínicos fase I(20). Por último, y no menos importante, cabe hacer notar que también se ha publicado la utilización de embriones que han detenido completamente su desarrollo in vitro, pero que poseen algunas células viables de las que se pueden obtener células troncales embrionarias. Lo anterior evitaría caer en los reparos éticos que representa la utilización de las células madre embrionarias obtenidas de blastocistos vivos(21). C) CÉLULAS MADRE FETALES En general se denomina así a las CM provenientes de fetos y de embriones post implantacionales. Células madre. ¿La nueva frontera de la medicina? También aquéllas obtenidas del líquido amniótico y la placenta, donde también es posible recuperarlas. La evidencia de existencia de células troncales en el líquido amniótico es reciente; estas CM exhiben propiedades similares a las células mesenquimáticas adultas y a varios tipos de células neurales, algunas con liberación de dopamina, lo que ha hecho surgir esperanzas para su eventual uso en enfermedades neurodegenerativas(22). Más interesante aún, un reciente estudio experimental reafirma acerca de las fascinantes posibilidades de neurorregeneración y neuroprotección que podrían brindar en el futuro los trasplantes con CM mesenquimales con propiedades neurogénicas, obtenidas de tejido placentario. Por otra parte, se han aislado varios tipos de CM a partir de abortos espontáneos, tales como progenitoras de islotes pancreáticos, CM hematopoyéticas, y también CM neurales con capacidad de diferenciarse en neuronas y células gliales. En una elegante y muy reciente publicación, investigadores del Instituto de Células Madre del Hospital Universitario de Lund, Suecia, han demostrado que las CM neurales derivadas de la corteza y el stratium de embriones humanos abortados (6-9 semanas post concepcionales), y diferenciadas in vitro durante cuatro semanas, produjeron marcadores neuronales y neuro transmisores específicos; una vez injertadas en cerebros de ratas recién nacidas, estas células fueron capaces de sobrevivir, migrar, exhibir diferenciación regional específica, y formar neuronas maduras, las que se multiplicaron muchas veces en un período de cuatro meses después del trasplante. Lo anterior abre un campo insospechado para el posible tratamiento de daños cerebrales, especialmente en prematuros, y afirma la esperanza de poder usarlas en enfermedades neurodegenerativas en el futuro(23-27). D) CÉLULAS MADRE DE SANGRE DE CORDÓN UMBILICAL En los últimos años, la sangre del cordón umbilical ha sido objeto de especial atención, ya que contiene una gran cantidad de células madre, las que tienen usos terapéuticos actuales y futuros. Su empleo actual en trasplantes de células madre hematopoyéticas con el objeto de repoblar la médula ósea es una alternativa establecida frente a la utilización de CM adultas provenientes de este último sitio. Los trasplantes de CM hematopoyéticas, son empleados en conjunto con tratamientos mieloablativos en enfermedades malignas, principalmente linfo hematopoyéticas, y también en patologías metabólicas y hereditarias; esta 39 indicación se revisará extensamente más adelante en este mismo capítulo (28-31). Al mismo tiempo, sin embargo, y en forma progresiva, se publican otras aplicaciones que prometen un esperanzador futuro para su uso en medicina regenerativa, ya que se ha evidenciado que la sangre de cordón no sólo contiene células troncales multipotentes sino también una sub población de células pluripotentes, parecidas a las células troncales embrionarias. Recientemente, Kögler y cols, en una publicación conjunta de las Universidades de Nevada, USA, y Dusseldorf, Alemania, describen células pluripotenciales del cordón capaces de diferenciarse en cardiomiocitos, osteoblastos, condroblastos, neuronas, astrocitos, hepatocitos, y adipocitos, las que son capaces de reconstituir tejidos en modelos animales. La gran ventaja de las CM de cordón es obviamente su facilidad de obtención, ya que no se requiere de ningún método invasivo para su recolección, y se utiliza material biológico que hasta ahora se había desechado luego del parto. Las técnicas de separación de las CM por gradientes de densidad y centrifugación, en condiciones de asepsia estricta, son de una complejidad y sofisticación moderada, y por lo tanto factibles de replicar sin requerimientos humanos o materiales extremos. Su identificación se obtiene a través del conteo de un tipo de células mononucleares que presentan un antígeno de superficie “marcador” de CM llamado CD 34, el que se cuantifica a través de una citometría de flujo. Normalmente, alrededor de 1 a 2% de las células monucleadas obtenidas después de la separación por gradientes de densidad resultan ser CM. La bolsa de almacenaje, que contiene alrededor de 25 ml de concentrado mononuclear y criopreservante, es sometida en un bio freezer a un programa computacional que desciende gradualmente la temperatura en un estricto protocolo hasta -80°C, para luego depositarla finalmente en un estanque con nitrógeno líquido a -196°C. Este proceso permite obtener al momento de la descongelación, alrededor de un 90% de CM viables(32-35). ESTADO ACTUAL DEL USO DE CÉLULAS MADRE Las células madre provenientes de la médula ósea son utilizadas exitosamente para regenerar médula ósea desde hace más de treinta años. El procedimiento, antes llamado trasplante de médula ósea, actualmente se denomina más correctamente trasplante de células hematopoyéticas, y consiste en una infusión endovenosa del concentrado de CM, después de un régimen mielo 40 ablativo de mayor o menor intensidad dependiendo de las indicaciones. Se estima que cada año se realizan entre 45.000 y 50.000 de estos procedimientos en el mundo, constituyendo la mayor parte de las veces el único procedimiento terapéutico para salvar la vida de un paciente(28). Existen básicamente dos tipos de trasplantes de este tipo: los autólogos, provenientes de células del mismo paciente extraídas previamente a la terapia mieloablativa, las que se criopreservan para ser utilizadas posteriormente y así colonizar la médula destruida por la terapia antineoplásica. El segundo tipo de trasplante es el denominado alogénico, a partir de CM hematopoyéticas donadas en programas que conservan un detallado registro de miles de donantes y sus respectivos antígenos de histocompatibilidad (HLA), con el objeto de disponer de la mayor diversidad de individuos y así algunos resulten compatibles con el receptor para evitar una enfermedad de huésped contra injerto (rechazo). Actualmente existen entidades como el National Marrow Donor Program en Estados Unidos (NMDP) que disponen de más de 6.000.000 de donantes registrados, y una red internacional mediante la cual se puede acceder a 4.000.000 de donantes adicionales provenientes de centros en 35 países. Lo anterior resulta en que alrededor de 40% de los trasplantes provenientes del NMDP son de un paciente norteamericano que recibe estas células de un donante internacional, o de un paciente internacional que recibe células de un donante norteamericano(29). Esta misma entidad entrega el siguiente listado de enfermedades tratables actualmente con un trasplante de células madre hematopoyéticas: Leucemias y linfomas, incluyendo: • Leucemia mielógena aguda • Leucemia linfocítica aguda • Leucemia mieloide crónica • Leucemia linfocítica crónica • Leucemia monomielocítica juvenil • Linfoma de Hodgkin • Linfoma no Hodgkin Mieloma múltiple y otros de células plasmáticas Anemia aplástica severa y otras fallas medulares: •Anemia aplástica severa •Anemia de Fanconi •Hemoglobinuria paroxística nocturna •Aplasia pura de células rojas •A mega ca r iocitosis / t h rombocitope n ia congenita Inmunodeficiencias y otros desórdenes hereditarios, incluyendo: • Inmunodeficiencia hereditaria Capítulo 2 - Obstetricia • Síndrome de Wiskott-Aldrich Hemoglobinopatías, incluyendo: • Beta talasemia mayor • Anemia de células falciformes Síndromes metabólicos heredados, incluyendo: • Síndrome de Hurler • Adrenoleucodistrofia • Leukoeucodistrofia metacromática Síndromes mielo displásticos y mielo proliferativos, incluyendo: • Varios tipos de anemias refractarias • Leucemia crónica mielo monocítica • Mielo fibrosis Linfohistocitiosis eritrofagocítica familiar y otros desórdenes histiocíticos. Diversos tipos de patologías que requieren un tratamiento quimioterápico o radio terápico en altas dosis y que requieren regeneración medular. En general, la obtención de CM hematopoyéticas adultas ha ido cambiando desde un proceso de aspiración de médula ósea desde la cresta ilíaca, practicado con anestesia, hacia procesos de estimulación medular y recuperación posterior en sangre periférica. Casi 60% de los trasplantes son autólogos, utilizados principalmente en los mielomas múltiples y linfomas, y por lo tanto en pacientes generalmente mayores de veinte años. Los trasplantes alogénicos son utilizados mayoritariamente en leucemias y en enfermedades hereditarias, y con una distribución etárea del recipiente en que la mayoría de los pacientes son menores de cuarenta años. Para este tipo de trasplantes obviamente se prefieren donantes compatibles relacionados. Un problema grave es la mortalidad relacionada al tratamiento, la que puede superar el 30% en los trasplantes alogénicos con donante no relacionado, para disminuir progresivamente cuando éste es efectuado con uno relacionado, y con donante hermano compatible. Por lo tanto, cabe tener presente que en los trasplantes alogénicos las principales causas de muerte posterior son las complicaciones tales como la enfermedad injerto contra huésped, además de las infecciones y órgano toxicidad; como causa de muerte posterior a un trasplante alogénico, la recurrencia abarca alrededor de 1/3 de los casos. En los trasplantes autólogos, en cambio, la principal causa de muerte es la recurrencia, la que puede llegar al 75% de los casos dependiendo de la patología tratada, pero la mortalidad relacionada al tratamiento cae al 2%. En los trasplantes alogénicos la posibilidad de encontrar un donante de CM de médula o sangre periférica compatible ha aumentado desde un 55% en 1993 a un 84% en 2003, debido al gran aumento Células madre. ¿La nueva frontera de la medicina? de posibles donantes registrados en el NMDP de Estados Unidos(29). La Utilización de la Sangre de Cordón Umbilical como Alternativa al Trasplante de Médula Ósea Desde hace casi una década que se practican trasplantes de CM hematopoyéticas a partir de sangre de cordón umbilical, los que comenzaron fundamentalmente en niños; su número ha aumentado progresivamente, incorporando cada vez más su uso en adultos. NETCORD, que es la mayor red internacional de bancos públicos de sangre de cordón umbilical, publica un registro de inventario que alcanza a casi 125.000 muestras a Octubre de 2006 con 4.934 trasplantes efectuados, 2.898 a niños y 2.079 a adultos(30). Las ventajas de trasplantar con CM de cordón en vez de médula ósea o sangre periférica de acuerdo a NMDP, y al Parents Guide to Cord Banks(29, 34), son: • La recuperación de CM desde médula requiere de anestesia general para el donante (el que está expuesto a infección), y desde sangre periférica necesita de una estimulación medular. La recuperación de la sangre de cordón en cambio no posee ningún rasgo invasivo, y prácticamente no tiene riesgo ni para la madre ni para el niño. • La sangre de cordón puede ser guardada en freezers criogénicos luego de ser tipificada, y por lo tanto está lista para ser utilizada de inmediato. Normalmente está disponible antes de un mes de requerida a una red de bancos públicos, y de inmediato si se ha recurrido a un banco privado para uso familiar o propio. La búsqueda de un donante no relacionado compatible para un trasplante alogénico de médula o sangre periférica puede en cambio demorar varios meses. • Los trasplantes de CM de médula o sangre periférica necesitan una histocompatibilidad de al menos 5 de 6 antígenos. Los de sangre de cordón sólo necesitan 4 de 6 HLA compatibles. Esto último significa que alrededor del 95% de los receptores pueden encontrar un cordón compatible. • La incidencia de enfermedad de injerto contra huésped es menor en el caso de las CM de cordón umbilical. Tanto así, que la incidencia de esta temida complicación es similar cuando la muestra de cordón tiene compatibilidad 4/6 a cuando la médula ósea tiene histocompatibilidad 6/6. Las desventajas del trasplante con CM de cordón son: • El tiempo que demora en “prender” un trasplante 41 de CM hematopoyéticas provenientes de sangre de cordón es más prolongado que con médula o sangre periférica (alrededor de siete días más), dejando al paciente vulnerable a una infección fatal al estar éste inmunodeprimido por la terapia mieloablativa. • La cantidad de CM puede alcanzar para trasplantar sólo a un niño o un adulto pequeño. Ello puede ser contrarrestado trasplantando más de una unidad compatible, y en el futuro con una “amplificación” en laboratorio, tema que será tratado más adelante. • En caso de necesitar un segundo trasplante, la muestra donada no será la misma, aunque pueden encontrarse otras unidades de sangre de cordón con idénticos HLA. LA CONTROVERSIA RESPECTO A LOS BANCOS PRIVADOS DE SANGRE DE CORDÓN UMBILICAL La apertura de bancos privados, destinados a guardar sangre de cordón umbilical como un seguro para uso propio, en caso de que el niño o un pariente cercano lo necesite en el futuro, ha generado una intensa controversia, con opiniones negativas de algunas sociedades científicas y similares(36, 37). Estas opiniones contrarias están basadas en: • La poca probabilidad de usar la sangre de cordón críopreservada como una especie de “seguro biológico”. • La contraindicación para su uso en enfermedades hematológicas tales como las leucemias, que pueden ya contener agentes o células “pro leucémicas” al momento del nacimiento. • La utilidad del efecto injerto contra leucemia en esta última patología. • La limitante en cuanto a que la sangre de cordón sólo sirve para trasplantar a un niño o un adulto pequeño (limitante del número de CM recuperadas) en caso de alternativa al trasplante de médula ósea. • Un concepto de poca utilidad real dado que la medicina regenerativa está dando recién sus primeros pasos. • No menor, es el aspecto ético por los alcances comerciales acerca del almacenaje de esta sangre para uso propio. • La afirmación de que en el futuro se podrán obtener CM casi de cualquier tejido, lo que haría inútil guardar las del cordón. Al respecto, se deben tener las siguientes consideraciones: 42 Los reparos referentes a la escasa probabilidad de uso propio de las CM de cordón provienen exclusivamente de consideraciones relativas a la posibilidad de un trasplante hematopoyético en individuos jóvenes. Es así como la probabilidad de uso antólogo para regenerar médula ósea hasta los veinte años ha sido calculada en 4 en 10.000 (0.04%). Sin embargo, y considerando el crecimiento de las indicaciones de trasplantes autólogos de CM hematoyéticas en individuos hasta setenta años, la posibilidad real de un trasplante autólogo es de 1 en 450 (0.23%), y la posibilidad de trasplante de material biológico para uno mismo o proveniente de un hermano con fines hematológicos, es de (0.46%) o 1 en 220(38,39). Lo referente a la contraindicación de trasplantar CM hematopoyéticas autólogas es cierto, pero sólo en la mayoría de los individuos jóvenes y sólo en enfermedades hereditarias y algunos tipos de leucemias. Sin embargo los reportes del NMDP indican claramente que los trasplantes autólogos son de hecho mucho más frecuentes que los alogénicos ya que la mayoría de los trasplantes se hacen en enfermedades tales como linfomas y mielomas, que ocurren en mayores de veinte años, y que a nivel celular son cánceres completamente diferentes a los de los individuos más jóvenes. Hay que recordar que los trasplantes alogénicos pueden llegar a una mortalidad relacionada al tratamiento cercana al 30%, versus 2% de la observada en los autólogos(29). La posibilidad de que la sangre de cordón no alcance para un trasplante de CM hematopoyéticas no considera la amplificación, es decir el cultivo y replicación de estas células en laboratorio, aspecto en el que hay importantes avances, aprovechando la capacidad de auto replicación de estas células en condiciones de cultivo especiales, así como en sistemas de producción celular automatizados (biorreactores). Recientemente, autores franceses, mediante una extensa amplificación, pudieron obtener casi dos millones de glóbulos rojos por cada célula madre. Bastaría amplificar una vez la recolección original de CM de cordón para tener células suficientes para la gran mayoría de los pacientes beneficiarios de un trasplante de CM linfohematopoyéticas(40,41). Referente al tema comercial, los bancos privados tienen en general un costo de alrededor de 1.000 dólares americanos para el procedimiento de separación y críopreservación y de 100 dólares anuales a partir del segundo año de conservación. Los bancos públicos en cambio reciben gratis las muestras donadas, pero debido a sus costos de operación, la liberación de una muestra para su uso implica para el usuario que Capítulo 2 - Obstetricia la requiere, seguro de salud o el estado cancelar un valor superior a los 20.000 dólares(34). Por lo tanto “público” no quiere decir “gratis”, ya que la donación es altruista, pero no así la liberación de la muestra. Por otra parte, la criopreservación de la sangre de cordón es un acto voluntario, generalmente visto como un seguro biológico (excepto en los casos de uso en un familiar). La necesidad de conseguir el financiamiento para la liberación de la muestra en un banco público (sea institucional o propia) ocurre generalmente en momentos de gran angustia y urgencia, y no tiene carácter de “voluntario”. En relación a la multiciplidad de fuentes de CM es cierto, como se ha descrito anteriormente, que hay varios tejidos desde donde pueden extraerse células madre, pero la verdad es que en la gran mayoría de ellos se necesita algún tipo de conducta invasiva, o bien la posibilidad de lograr un número suficiente de CM es demasiado baja. En cuanto a la poca utilidad real de la medicina regenerativa y lo incierto de su futuro, la afirmación no considera la contundente evidencia experimental que hoy día tiene la terapia celular, que aunque está en sus primeros pasos en clínica humana, y como se verá más extensamente, es extraordinariamente prometedora en base a las evidencias experimentales y a los primeros reportes de su uso en infartos, melanomas metastásicos e injuria raquimedular entre otros usos(41-53). Por último cabe preguntarse: ¿si es que la separación y la conservación de CM de cordón fuese gratuita, habría alguna razón para no criopreservarlas y descartar esta fuente de células troncales en un procedimiento inocuo, no invasivo y sin los reparos éticos de las fuentes embrionarias? Los bancos públicos de cordón umbilical, destinados a servir como fuente de células madre en pacientes que presenten adecuada compatibilidad con el donante, no se oponen con los bancos para uso propio, sino que tienen un fin diferente, y toda mujer embarazada debiera tener el derecho de elegir entre descartar la sangre del cordón umbilical del bebé luego del parto, donarla a un banco anónimo, si ello es posible, o preservarla como “seguro biológico”, para uso propio o de algún familiar en el futuro. PERSPECTIVAS DE USO TERAPÉUTICO NO ONCOHEMATOLÓGICO DE LAS CÉLULAS MADRE. MEDICINA REGENERATIVA El hallazgo y demostración de CM provenientes de la médula ósea o del cordón umbilical con capacidad pluripotencial están bien establecidos. En la figura 43 Células madre. ¿La nueva frontera de la medicina? 2 puede encontrarse un resumen de la capacidad de plasticidad publicada para las CM provenientes de médula ósea y cordón umbilical. Para la utilización clínica de la terapia celular o medicina regenerativa la investigación deberá resolver los siguientes problemas respecto a las células troncales: • Lograr que éstas proliferen extensamente y generen suficiente cantidad de tejido. • Controlar la diferenciación hacia el o los tipos celulares deseados. • Sobrevivir en el huésped después del trasplante. • Integrarse y “comunicarse” adecuadamente con los tejidos circundantes. • Funcionar adecuadamente durante el resto de la vida del recipiente. • No producir ningún daño en el huésped. Desde el punto de vista clínico, uno de los usos en plena fase de investigación y desarrollo es el tratamiento del infarto cardíaco mediante la infiltración directa de CM en el músculo cardíaco, transferencia a través de catéteres intracoronarios, o incluso vía vascular periférica. Desde la publicación del estudio BOOST, en 2004, una investigación prospectiva y randomizada en que se utilizó este tipo de terapia mediante transferencia intracoronaria, existen numerosos artículos en la literatura médica que avalan la mejoría estadísticamente significativa de la función ventricular resultante después de este procedimiento; una revisión en Medline realizada en enero de 2007 revela 640 artículos relacionados a este tema, 187 de ellos publicados el último año. Es interesante señalar que por una parte la investigación en modelos animales sugiere que la mejoría de la función ventricular se debe la transdiferenciación de CM de médula ósea en cardiomiocitos que repoblan el músculo dañado, pero también por angioneogénesis debida a diferenciación de CM hacia células endoteliales. Por otra parte, en clínica humana los pacientes que sufren un infarto del miocardio exhiben una correlación positiva entre el número de células madre movilizadas después del evento y la fracción de eyección ventricular izquierda, así como una correlación negativa con los marcadores de necrosis miocárdica(42-47). Aunque la fuente de células troncales en terapias del infarto cardíaco normalmente ha sido la médula ósea, existe creciente evidencia experimental de que la sangre de cordón umbilical también podría ser una fuente útil para estos fines. Del mismo modo, también se ha publicado evidencia experimental acerca del tratamiento del infarto agudo mediante CM embrionarias en animales en que se indujo la isquemia mediante ligaduras coronarias. Con todo, el tratamiento de infarto miocárdico a través de la movilización de CM con factores estimulantes de la médula ósea, en conjunto con la angioplastía coronaria, puede tener resultados similares a la inyección directa o infusión intracoronaria de CM(47-50). Figura 2. Células y tejidos obtenidos a partir de células madre de médula ósea y de cordón umbilical. 44 La terapia celular de la injuria raquimedular, por otra parte, tiene bases experimentales sólidas, con demostración que tanto las CM originadas de médula ósea como del cordón umbilical son capaces de promover la recuperación de la función motora causada por una injuria traumática. Recientemente se ha publicado el primer caso clínico en que una mujer de 37 años, con una paraplejia de 19 años de evolución resultante de un trauma raquimedular, fue sometida a un trasplante de CM obtenidas a partir de sangre de cordón umbilical. En este caso las CM fueron inyectadas directamente en el espacio intra y extradural después de una laminectomía. Previamente estas CM fueron inducidas a transformarse en células neuronales en cultivos con medios de crecimiento neurogénicos por más de dos semanas. Estas células fueron capaces de expresar proteínas cito esqueléticas de neuronas y astrocitos. Una vez efectuado el trasplante, se pudo comprobar recuperación motora y sensorial progresiva a contar del día siete y hasta el día 41 post operatorio en los territorios distales al daño medular. La recuperación fue documentada por electromiografía, y los potenciales evocados de los dermátomos sómato sensoriales demostraron recuperación desde T 11 y T 12 hasta L 2 en ambas piernas, respectivamente. Las imágenes de tomografía axial computarizada y resonancia magnética pre y post trasplante, corroboraron la regeneración raquimedular en la paciente(51-53). El hecho de que las células troncales o progenitoras neurales in vitro den origen a neuronas, astrocitos y oligodendrocitos tiene una gran importancia, pues en condiciones adecuadas, este tipo de CM son capaces de ser amplificadas hasta cuarenta transferencias de medio de cultivo, con un tiempo de duplicación de aproximadamente dos días, por lo que con la actual tecnología, el cultivo in vitro permite mantenerlas indemnes por un período considerable de tiempo(54). Por otra parte, la inducción de la diferenciación hacia tipos específicos de neuronas ofrece una firme línea de investigación. Bajo condiciones de cultivo adecuadas y definidas químicamente, Zhang y colaboradores han podido dirigir células neuroepiteliales derivadas de CM embrionarias hacia la formación de neuronas dopaminérgicas, con una gran implicancia potencial para el tratamiento del Mal de Parkinson(55). Pero no sólo las CM embrionarias son capaces de dar origen a células neurales. Hemos revisado la evidencia en el caso de CM de sangre de cordón al respecto; pero la evidencia sugiere también que las CM adultas, provenientes de médula ósea son capaces de transformarse en neuronas. Una impactante publicación Capítulo 2 - Obstetricia de la Academia Nacional de Ciencias de Estados Unidos muestra que, en cuatro mujeres en las que se practicó una autopsia después de fallecer a consecuencia de enfermedades oncológicas, y que habían sido tratadas con un trasplante de médula con donante masculino, el análisis cerebral en búsqueda de células conteniendo cromosomas Y demostró fehacientemente neuronas con este cromosoma sexual. Lo anterior es una confirmación de que las CM adultas de médula ósea se transdiferencian a neuronas in vivo(56). En publicaciones recientes se ha analizado el tratamiento de infartos cerebrales mediante terapia celular. A nivel experimental en animales, el trasplante de CM de sangre de cordón resulta en angioneogénesis en la periferia del tejido cerebral afectado, y ya sea por una estimulación de neurogénesis a partir de neuroblastos locales o transdiferenciación de células pluripotentes del cordón in vivo, se produce reconstitución de tejido neural en la zona de la injuria. Por otra parte, modernas técnicas de mapeo con medios de contraste específicos han permitido seguir la migración de las CM progenitoras neurales, confirmando que ellas son “atraídas” hacia el sitio de lesión isquémica cerebral. A fines de 2006, además, autores británicos confirman la excelente tolerancia en la administración de factores estimulantes de granulocitos y la liberación de CM al torrente circulatorio, en un estudio destinado a determinar el efecto de reparación celular mediante angioneogénesis y neurogénesis en un grupo de 36 pacientes que sufrieron un accidente vascular cerebral. Esta nueva manera de lograr llegar con CM al sitio de isquemia continúa en plena y promisoria investigación(57-59). Otras enfermedades neurológicas han sido también tratadas con éxitos notables. La esclerosis múltiple progresiva, por ejemplo, ha demostrado tener una mejoría hasta en un 59% y estabilización en 18% después de trasplantes autólogos con CM de médula ósea en pacientes refractarias a tratamientos habituales(60). La aplicación de una terapia celular también ha sido publicada como una forma de lograr una esperanza en enfermedades devastadoras tales como la artritis juvenil y otras enfermedades auto inmunes. En esta patología, el trasplante autólogo ha demostrado una remisión que alcanza al 53% de los casos seguidos entre 12 y 60 meses(61). Finalmente, existe una larga lista de tratamientos experimentales con CM que abarcan las siguientes patologías, según lo publicado en una reciente revisión del Parent´s Cord Blood Guide(31): • Artritis reumatoide 45 Células madre. ¿La nueva frontera de la medicina? • • • • • • • • • • Enfermedad de Crohn Diabetes tipo I Síndrome de Evan Esclerodermia Lupus sistémico Esclerosis lateral amiotrófica Enfermedad de Alzheimer Enfermedad de Parkinson Injurias traumáticas y quemaduras La terapia génica, es decir el trasplante de CM genéticamente alteradas ha sido también motivo de tratamientos experimentales en: • Anemia de Fanconi • Diversos desórdenes metabólicos hereditarios • Enfermedad de Parkinson Por último, y tal como se ha enunciado anteriormente, a principios de 2007 autores estadounidenses publican el aislamiento, cultivo y amplificación de células madre derivadas de líquido amniótico, tanto en humanos como en roedores, capaces de diferenciarse en múltiples líneas celulares. Estas últimas fueron el resultado de inducir la diferenciación de CM, resultando en la producción de células adipogénicas, osteogénicas, miogénicas, endoteliales, neuronales y hepáticas. Varias de ellas expresaron funciones especializadas, tales como producción del neurotransmisor L glutamato en el caso de las neuronas, producción de urea en el caso de las líneas hepáticas, o modelación de hueso en el caso de las osteogénicas. Lo anterior se suma a la obtención de células pluripotentes a partir de sangre de cordón umbilical, con capacidad también de reconstitución de tejidos tales como hígado, cartílago y hueso. La gran diferencia de las múltiples líneas celulares obtenidas a partir de CM pluripotentes tanto de cordón como de líquido amniótico es que no forman células tumorales, a diferencia de lo observado en CM de origen embrionario. Todo lo anterior hace que actualmente se tenga una gran esperanza de poder contar con una fuente de CM libre de problemas éticos, y a su vez con un tremendo potencial de poder establecer líneas celulares estables que permitan una terapia celular estandarizada en múltiples patologías en el futuro(33, 62 ). Es muy probable que en el futuro veamos notables avances de esta medicina basada en la reparación celular. No en vano, durante las últimas elecciones presidenciales en los Estados Unidos, California votó la proposición 71, destinando sólo en ese estado 3.000 millones de dólares para la investigación en células madre y creando el Instituto de Medicina Regenerativa de California. New Jersey, ha aprobado 270 millones de dólares. En varios países de Europa, los gobiernos y entes estatales también han iniciado un fuerte apoyo financiero a la investigación en este campo(63-65). BIBLIOGRAFÍA 1. http://stemcells.nih.gov/info/basics1.asp. Acceso el 30 de septiembre de 2006. 2. 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