CRECIMIENTO POBLACIONAL Concepto y diseño: Ricardo Hernández Delgadillo Crecimiento poblacional. Cuando un organismo, o un conjunto de organismos, es colocado en un ambiente física, química y nutricionalmente favorable, se reproduce con el consecuente... aumento en el número de individuos En la microbiología, el término “crecimiento poblacional” se reduce a la palabra crecimiento, conservando exactamente el mismo significado: Densidad poblacional. Es el número de individuos por unidad de volumen, o de masa, y se expresa en… UFC/ml o UCF/g células/ml o células/g La densidad poblacional se simboliza como N. Para poblaciones en las que las células muestran algún tipo de asociación (e.g. estrepto), el término “células” se substituye por el término “UFC” (Unidades Formadoras de Colonia) y la densidad poblacional se expresa en… Reproducción microbiana. En la naturaleza, la reproducción ocurre por: Reproducción asexual: no implica la unión de núcleos, células u órganos sexuales. Reproducción sexual: implica la unión de diferentes células sexuales llamadas gametos. dos Los procariotos se reproducen asexualmente. Los eucariotos sexualmente. se reproducen asexual y Reproducción de procariotos. Fisión binaria e.g. Escherichia coli Gemación e.g. Rhodopseudomonas acidophila Fragmentación e.g. Nocardia Formación de exoesporas e.g. Streptomyces Fisión binaria (I). material citoplásmico DNA Alargamiento celular Replicación del DNA Multiplicación del contenido celular Fisión binaria (II). Inicio de la formación del septo Partición del material genético Partición del contenido celular Fisión binaria (III). Cierre del septo Separación en dos células Tiempo de generación. El tiempo de generación es el intervalo en que la densidad poblacional cambia desde un valor N dado, hasta 2N. tiempo de generación g El símbolo para el tiempo de generación es g. Número de generaciones (n). n = 0 1 2 3 número de generaciones N = 1 2 4 8 densidad poblacional células g g g N = N0 2n N en la generación n N0 en la generación inicial tiempo de generación Crecimiento vs número de generaciones 3.0 log N = log N0 + n.log 2 2.4 768 1.8 log N Densidad poblacional (n) 1024 512 1.2 256 0.6 N = N0.2n 0 0.0 0 2 4 6 8 núm ero de generaciones (n) N log N 10 Tiempo de incubación. El tiempo de incubación es el intervalo en que la densidad poblacional cambia desde un valor No dado, hasta N. tiempo de incubación t El símbolo para el tiempo de incubación es t. Relación entre n, t y g. En la práctica, las medidas de N se hacen a intervalos de tiempo t y no a intervalos de tiempo g, por lo que n es un valor calculado, no un dato experimental. La relación entre n, t y g es: n=t/g Velocidad de crecimiento. En un periodo de tiempo infinitamente pequeño, una población crece en una fracción diferencial que es directamente proporcional al tamaño de la densidad poblacional inicial: dN / dt a N0 en donde para establecer la igualdad dN / dt = µN0 µ se incorpora proporcionalidad. como una constante de Velocidad específica de crecimiento (µ). La integración de dN / dt = µN0 con respecto al tiempo produce N = N0 (eµt) en donde µ es la medida del cambio de la densidad poblacional (N) por unidad de tiempo (t), i.e. la velocidad específica de crecimiento Cálculo de µ. La transformación logarítmica natural de produce N = N0 (eµt) ln N = ln N0 + µt y por despeje se obtiene la ecuación µ = (ln N - ln N0) / t que permite calcular µ a partir de datos experimentales de N0, N y t. Cálculo de g. Cuando t es igual a g, N es igual a 2N0, la ecuación cambia a µ = (ln N - ln N0) / t µ = ln 2 / g y por despeje se obtiene g = ln 2 / µ que permite calcular g a partir de datos experimentales de N0, N y t. 1024 7.0 7.00 20.50 ln N = ln N0 + µt 5.6 5.60 768 19.88 4.20 4.2 19.26 512 2.8 18.64 2.80 256 1.40 18.02 1.4 N = N0.eµt 0.00 17.40 0 0.0 0 2.8 0 2 5.6 8.4 4 11.2 6 8 14 10 t, tiemtiem po en po horas (t) N N calculada N ln N ln N ln N calculada ln ln N N 8 Densidad N = 10poblacional UFC/ml (N) Crecimiento vs tiempo Crecimiento: primera reflexión. El cambio en el número de individuos en una población depende exclusivamente del balance entre los individuos que nacen y los individuos que mueren en un intervalo de tiempo dado, i.e. el ambiente es cerrado y no ocurre la entrada (inmigrantes) o salida (emigrantes) de individuos. tercera reflexión. El crecimiento se mantiene a una velocidad exponencial mientras la disposición de nutrientes y espacio lo permiten. segunda reflexión. El crecimiento ocurre con una sobreposición de generaciones, i.e. no existe un momento particular para la reproducción o para la muerte de los individuos. La consecuencia práctica de esta simplificación es que N se comporta como una variable continua entre límites temporales definidos y toma valores fraccionales cuantificables a través del cálculo diferencial. Crecimiento desbalanceado. Una célula está en condición de crecimiento desbalanceado, cuando sus constituyentes están siendo sintetizados a velocidades desincronizadas, de modo tal que no se promueve el crecimiento. Por ejemplo, algún tipo de RNAm se sintetiza a una velocidad proporcionalmente mayor o se están produciendo metabolitos secundarios. Crecimiento balanceado. Una célula está en condición de crecimiento balanceado, cuando sus constituyentes están siendo sintetizados a velocidades sincronizadas, de modo tal que se promueve el crecimiento. En esta condición, la medida de cualquier actividad o componente celular (consumo de sustrato, actividad enzimática, biomasa, etc.) es un reflejo directo de la densidad poblacional. Curva de crecimiento 7.0 20.50 fase estacionaria µ = 0 19.88 fase de muerte µ < 0 4.2 19.26 ln N N = 10 8 UFC/ml 5.6 fase exponencial µ > 0 2.8 18.64 1.4 18.02 fase de adaptación µ = 0 0.0 17.40 0 4 8 12 t, tiem po en horas N N calculada 16 20 Fase de adaptación. En la fase de adaptación o lag, las células están reconociendo las condiciones físicas, químicas y nutricionales del ambiente, e iniciando la expresión genética que le permita crecer en ese medio. La aplicación del modelo exponencial a la fase de adaptación predice que µ = 0, por lo que la población se encuentra en una condición de crecimiento desbalanceado, esto es: no crece aunque sintetiza algunos metabolitos primarios. Fase exponencial. En la fase exponencial del crecimiento, también llamada fase log, las células ya adaptadas al medio crecen sin mayores restricciones que las que impone el crecimiento mismo, i.e. el agotamiento de los nutrientes y del espacio. La aplicación del modelo exponencial a la fase exponencial predice que µ > 0, por lo que la población se encuentra en una condición de crecimiento balanceado, esto es, crece sintetizando metabolitos primarios. Fase estacionaria. En la fase estacionaria, las células han dejado de duplicarse como consecuencia de que han encontrado una limitación, nutricional o de espacio, para continuar creciendo. La aplicación del modelo exponencial a la fase estacionaria predice que µ = 0, por lo que la población se encuentra en una condición de crecimiento desbalanceado, esto es, no crece aunque sintetiza metabolitos secundarios. Capacidad de soporte. Una mejor descripción del crecimiento debe considerar el agotamiento de los nutrientes y el espacio que sufre el medio a medida que la población crece. Esta consideración se incluye en la ecuación: dN / dt = µ N (1 - (N / K)) en donde K es la capacidad de soporte del crecimiento que tiene el medio. Modelo logístico. La integración con respecto al tiempo de la ecuación anterior produce la ecuación logística de Verhulst-Pearl: N = K / (1 + ea - µt) en donde a incorpora el valor de N0 y es igual a ln ((K-N0)/N0) La transformación logarítmica natural de la ecuación de Verhulst-Pearl resulta en ln ((K - N) / N) = a - µt Tasa de crecimiento máxima. La tasa de crecimiento máxima se calcula con la ecuación dN / dt máxima = µ K / 4 y su tiempo de ocurrencia (ttm) se calcula con la ecuación ttm = a / µ 7.0 0.9 5.6 0.7 4.2 0.5 2.8 0.4 1.4 0.2 ttm 0.0 0.0 0 2.8 5.6 8.4 11.2 14 t, tiem po en horas N N calculada dN/dt dN/dt calculada dN / dt Densidad poblacional (N) Crecimiento vs tiempo Cultivo continuo. Es un cultivo en equilibrio dinámico, en el que la concentración de los nutrientes y el volumen de medio, se mantienen constantes a través del tiempo, lo cual mantiene una densidad poblacional constante desarrollándose a una velocidad de crecimiento constante Quimiostato. válvulas de paso otros suministros salida de gases entradas flujo de líquidos suministro de medio de cultivo salidas recipiente crecimiento hasta µ cosecha de células y productos flujo de líquidos 1. La concentración de un nutriente esencial controla la velocidad de crecimiento. 2. La concentración de este nutriente esencial es controlada por la velocidad de dilución. 3. La velocidad de dilución es el balance entre las velocidades de entrada de medio y la salida de cultivo, que mantiene la velocidad de crecimiento requerida. Cuantificación del crecimiento (I). Número total de células Cuenta directa Filtración, tinción y cuenta Turbidimetría Número de UFC’s Cuenta viable Filtración y cuenta viable Número más probable Biomasa Peso húmedo Peso seco Constituyentes celulares Método químico específico Actividad metabólica Consumo de sustrato Productos metabólicos Cuantificación del crecimiento (II). Métodos directos. Los datos tienen unidades de densidad poblacional. Cuenta directa Filtración, tinción y cuenta Cuenta viable Filtración y cuenta viable Turbidimetría y cuenta viable Número más probable Métodos indirectos. Los datos no tienen unidades de densidad poblacional. Peso húmedo Peso seco Constituyentes celulares Consumo de sustratos Productos metabólicos Cámara de Petroff-Hausser (I). Cámara de Petroff-Hausser cuadros grandes cuadros chicos Cámara de Petroff-Hausser (II). ⊙ El área de la cuadrícula es de 1 mm2 (0.01 cm2). 1 mm 1 mm ⊙ 0.02 mm La espacio entre el porta- y el cubreobjetos es de 0.02 mm (0.002 cm). ⊙ El volumen del espacio contable es de 0.00002 cm3 (0.00002 ml). Cámara de Petroff-Hausser (III). 1. Se cuentan las células en al menos 5 de los 25 cuadros grandes y se obtiene un valor promedio: 44 39 + 52 47 43 225 / 5 = 45 2. El número de células promedio se multiplica por 25 (cuadros grandes): 45 x 25 = 1125 3. Por regla de tres, se obtiene la densidad poblacional: si 1125 células están en 0.00002 ml ¿cuántas células habrá en 1 ml? 5.63 x 107 células / ml Cuenta directa en cámara. 1. Útil para cargas microbianas altas, 106 células/ml o mayores. 2. Es un método relativamente fácil, rápido y económico. 3. Se obtiene información sobre la diversidad, el tamaño y la morfología microscópica de las células. 4. La reproducibilidad del llenado de la cámara es baja. 5. No distingue entre células vivas y muertas. Filtración, tinción y cuenta(I). Un volumen conocido de muestra conteniendo una suspensión de bacterias es filtrada, las bacterias son teñidas sobre el filtro y contadas bajo el microscopio. Es frecuente el uso de anaranjado de acridina y la utilización del microscopio de epifluorescencia. Los filtro no deben fluorescer por si mismos y deben teñirse de negro para contrastar con el colorante fluorescente. Filtración, tinción y cuenta(II). filtro de membrana suspensión fluorescente celular tinción del colorante filtro de membrana soporte de filtro observación y cuenta al microscopio de fluorescencia Filtración, tinción y cuenta(III). Consideraciones: 1. Útil para cargas microbianas relativamente bajas. 2. Es un método relativamente rápido. 3. El manejo del colorante debe ser cuidadoso. 4. El colorante es diferencial y tiñe a las células vivas de color verde y a las muertas de color anaranjado. Cuenta viable (I). Factor de dilución 100 Volumen de siembra 0.1 10-1 10-2 0.1 10-3 0.1 10-4 0.2 0.1 Incubación Cuenta de colonias incontables 287 25 5 1 Colonias/ml en la dilución 2870 250 25 10 Colonias/ml en la dilución 100 Cuentas significativas 28700 25000 25000 100000 2.87 x 104 2.50 x104 2.50 x 104 1.00 x 105 Cuenta viable 2.69 x 104 Cuenta viable (II). 1. El método cuenta sólo células vivas. 2. La naturaleza del medio de cultivo y las condiciones de incubación determinan que tipo de bacterias pueden crecer y ser contadas. 3. Se asume que cada colonia surge de una célula o de una unidad formadora de colonia. 4. Por razones estadísticas, las placas contables son aquellas que tienen entre 30 y 300 colonias. Filtración y cuenta viable(I). Un volumen conocido de muestra conteniendo una suspensión celular es filtrada sobre un filtro estéril. Bajo condiciones asépticas, el filtro es colocado sobre una placa de Petri conteniendo el medio adecuado. El cultivo se incuba en las condiciones y por el tiempo adecuados, y se cuentas las colonias formadas. Filtración y cuenta viable(II). filtro de membrana suspensión celular soporte de filtro incubación cuenta de colonias Turbidimetría (I). . 1. Las partículas en suspensión, dentro de ciertos límites de tamaño, interfieren el paso de la luz en proporción a su concentración. 2. Una suspensión celular es una suspensión de partículas. 3. La medida de la cantidad de luz que pasa (transmitancia), o no pasa (absorbancia), a través de una suspensión de partículas puede ser utilizada para estimar su densidad. 4. En la mayoría de los casos, valores de absorbancia entre 0.1 y 0.7 mantienen una correlación lineal entre la densidad óptica (A) y la densidad poblacional (UFC/ml) de muchas suspensiones bacterianas. Turbidimetría (II). diluciones seriadas Suspensión celular de N conocida lectura de Anm Diluciones seriadas. 1 ml volumen 1.5de mltransferencia volumen 0.23 de ml transferencia volumen 10 mlde transferencia volumen de transferencia 9 ml 10 ml volumen 1.5 de ml dilución volumen 7.54 de ml dilución volumen 0.1 ml de dilución volumen de dilución volumen 3 ml totalvolumen 7.77total ml volumen 10.1 ml total volumen total 1:1 1:10 1.5:3 0.23:7.77 10:10.1 dilución individual 1:1 1:10 1:2 1:33.78 1:1.01 dilución individual 1:1 1:10 1:20 1:675.60 1:682.36 dilución acumulada Biomasa. 1. La cuantificación de la biomasas es fácil, rápida y económica. 2. Adecuado para crecimiento masivo como el de los hongos y las bacterias de crecimiento filamentoso. 3. Se puede medir en peso húmedo o en peso seco, siendo esto último el más recomendable. Absorbancia vs Densidad poblacional. 0.7 A nm A 0.1 nm =Nxb+a N N=A nm /b–a/b Número más probable (NMP) (I). ⊙ Debe establecerse un criterio de crecimiento observable a simple vista: turbidez, cambios de color, etc. ⊙ No es un recuento, es una estimación de la densidad poblacional. ⊙ El método es recomendable para cargas microbianas definitivamente bajas. ⊙ Se hacen diluciones seriadas para alcanzar un punto de extinción, esto es, un nivel de dilución al cual ni una sola célula es depositada en uno o más de los varios tubos en ese nivel de dilución. ⊙ El patrón de crecimiento es utilizado para estimar el NMP de bacterias en la muestra original, comparando con una tabla de probabilidades. Número más probable (NMP) (II). 1 ml 1 ml 10-1 1 ml 10-2 10-3 Incubación Patrón de crecimiento 10-1 10-2 10-3 2 1 1 NMP 20 Número más probable (NMP) (II). 1 ml 10-1 1 ml 10-2 1 ml 10-3 Incubación Patrón de crecimiento 10-1 10-2 10-3 2 1 1 NMP 20 Constituyentes celulares (I). Todos los enfoques bioquímicos para determinar el número de células dependen del desarrollo de procedimientos químicos analíticos para cuantificar una biomolécula en particular. Constituyentes celulares (I). Estos métodos indirectos para la enumeración de células han de satisfacer dos requerimientos fundamentales: 1. la certeza de que la biomolécula particular que esta siendo medida es exclusivamente de origen microbiano y 2. el desarrollo de factores de conversión apropiados para correlacionar la concentración de la biomolécula en particular con el número real de células microbianas. Constituyentes celulares (II). ⊙ La peptidoglicana para bacterias. ⊙ El lipopolisacárido para bacterias Gram negativas. ⊙ Estimaciones más generales del número de microorganismos pueden ser obtenidas indirectamente midiendo la concentración de proteína, ATP o DNA. Actividades metabólicas. N crecimiento producto metabólico La desaparición de un substrato o la acumulación de un producto metabólico, son estrategias cotidianas para la enumeración indirecta del crecimiento microbiano. sustrato consumido t Lecturas recomendadas. Atlas, R.M. 1988. Microbiology: fundamentals and applications, 2nd edition. MacMillan, New York, New York. pp. 87-111. Dawes, I.W. y I.W.Sutherland. 1992. Microbial physiology, 2nd edition. Blackwell, Oxford, London. pp. 38-42. Hernández-Delgadillo, R. 2003. Crecimiento bacteriano. Apuntes personales. Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, I.P.N. México. p. 15. Martínez-Jerónimo, F. 1983. Comparación de curvas de crecimiento de Ankistrodesmus falcatus (Chlorellales, Chlorolleceae) obtenidas al utilizar diferentes medios de cultivo. Aspectos ecológicos y de nutrición mineral en el cultivo de algas microscópicas. Tesis profesional. Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, I.P.N., México. Prescott, L.M., J.P.Harley y D.A. Klein. 1990. Microbiología, 4ª edición. McGraw-Hill/Interamericana, Madrid, España. pp. 115-124. Tortora, G.J., B.R. Funke y C.L. Case. 2001. Microbiology, 7th edition. Benjamin/Cummings, San Francisco, Cal., USA. pp. 170-179. Concepto y diseño: Ricardo Hernández Delgadillo