8. Instrumentación del microscopio confocal espectral

8. Instrumentación
del microscopio
confocal espectral
8. Instrumentación del microscopio confocal
Parámetros importantes del microscopio confocal:
●
Fuente de iluminación: Láser
●
Pinhole
●
Detector: Fotomultiplicador
¡! Microscopio óptico
8. Instrumentación del microscopio confocal
Microscopio óptico
La primera visualización de la muestra se hace con
el microscopio óptico:
1) Seleccionar el área de interés
2) Seleccionar los aumentos adecuados
3) Enfocar
4) Ajustar la iluminación de Köhler
5) Pasar al modo confocal
8. Instrumentación del microscopio confocal
Microscopio confocal
Sistema de láseres
8. Instrumentación del microscopio confocal
Microscopio confocal
Fuente de iluminación: LÁSER
Propiedades:
●
Elevado grado de monocromatismo
●
Divergencia pequeña
●
Brillo elevado
●
Elevado grado
temporal
de
coherencia
espacial
y
8. Instrumentación del microscopio confocal
Láser
Láseres de onda continua: láser de gas
●
Ión de argon (Ar):
458 nm
476 nm
488 nm
514 nm
●
Helio-neon (He/Ne)-Verde: 543 nm
●
Helio-neon (He/Ne)-Rojo: 633 nm
●
Diodo UV: 405 nm
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Láser
405
UV
476 514
Ar Ar
458
Ar
488
543
Ar He/Ne
verde
633
He/Ne
rojo
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Láser
Configuración
predeterminada
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Láser
Elección del láser
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Láser
Potencia:
≈ 50 %
A mayor potencia, mayor intensidad de la señal,
pero mayor fotoblanqueado del fluorocromo.
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Pinhole
Los
microscopios
de
barrido
confocal
son
particularmente atractivos en virtud a su resolución
lateral aumentada y el seccionado óptico.
La última propiedad es la más útil y da lugar a la
posibilidad de obtener imágenes de muestras
gruesas en tres dimensiones.
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Pinhole
Esto es posible porque el sistema óptico detecta
información sólo de una región delgada en la
vecindad del plano focal lo que permite almacenar
muchas secciones de imágenes en un ordenador
para obtener un conjunto de datos tridimensionales
que describan al objeto.
Hoy en día existen muchos sistemas de software
que muestran estos datos de muchas maneras.
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Pinhole
La única diferencia entre un microscopio de barrido
confocal y un microscopio de barrido convencional
es que el confocal utiliza un detector puntual en
lugar de un área grande.
Todas las considerables ventajas de la microscopía
confocal derivan del pequeño tamaño de este
detector, el PINHOLE.
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Pinhole
El éxito o fracaso en alcanzar una verdadera
operación de microscopía confocal depende de la
correcta elección de la forma y tamaño del pinhole
que se aproxime tanto como sea posible a las del
detector puntual ideal.
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Microscopio confocal
8. Instrumentación del microscopio confocal
Pinhole
El pinhole está presente para evitar que llegue al
detector luz que se origina en un plano que no sea
el plano de foco.
Se monta en un plano imagen y si su tamaño se
reduce más de lo que corresponde a un spot
limitado por la difracción en la muestra, entonces
reducirá severamente el número de fotones que
alcanzan el detector mientras que se producirá sólo
una mejora marginal en la resolución xy o z.
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Pinhole
Haciendo el pinhole mayor que el spot limitado por
difracción permite que se detecten más fotones
pero como casi todos los que se originan en el
plano de foco ya se recogen, la mayoría de la señal
adicional viene de planos adyacentes, reduciendo
la resolución z.
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Pinhole
Luz láser
Diafragma
(PINHOLE)
Divisor
del haz
Detector
Objetivo
Muestra
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Pinhole
El valor óptimo del pinhole es el que corresponde a
Airy 1.
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Pinhole
Patrón de difracción de Airy:
La imagen de un punto de luz tiene un tamaño finito
y una forma característica determinada por los
efectos de difracción del llamado “Patrón de
difracción de Airy”.
Es un patrón con un disco central muy intenso
rodeado de una serie de pequeños anillos de
difracción.
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Pinhole
Disco de Airy:
Disco de Airy
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Pinhole
En la microscopía confocal el tamaño del pinhole
debe ser el mismo que el del disco de Airy porque
de este modo se permite el paso de la mayor
cantidad
de
luz
(95
%)
condiciones de confocalidad.
manteniendo
las
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Pinhole
El diámetro del disco de Airy es aproximadamente
igual a 1,22 veces la longitud de onda dividido por
la apertura numérica del objetivo:
diámetro = 1,22 λ / A.N.
Depende por tanto del
objetivo que se esté usando.
d
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Pinhole
El criterio de Rayleigh para la resolución:
Dos puntos se pueden resolver, cuando sus discos
de Airy están separados.
La mínima distancia resoluble entre dos puntos se
da cuando el máximo de uno de los patrones de
difracción de Airy coincide con el primer mínimo del
otro, es decir, cuando la distancia centro a centro
entre los máximos es mayor que la anchura de los
máximos.
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Pinhole
El criterio de Rayleigh para la resolución:
Resueltos
Límite de resolución
No resuelto
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Pinhole
El criterio de Rayleigh para la resolución:
La mínima distancia resoluble entre dos puntos
corresponde al radio de un disco de Airy:
diámetro = 1,22 λ / A.N.
radio = 0,61 λ / A.N.
El valor óptimo del pinhole es el de Airy 1
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Detector
El sistema de detección del microscopio separa la
señal emitida por la muestra en bandas: sistema
espectral.
Recoge
la
señal
fotomultiplicadores (PMT).
mediante
detectores
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Detector
8. Instrumentación del microscopio confocal
Detector
Fotomultiplicador:
Un dispositivo que convierte la energía de la luz
incidente en fotoelectrones emitidos al vacío, los
cuales son multiplicados en un proceso de emisión
secundaria.
El tubo fotomultiplicador tiene una alta sensibilidad
y un bajo ruido.
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Detector
Puede ajustarse un valor Gain y un valor Offset
para cada detector.
El valor Gain permite modificar el refuerzo de la
señal detectada y, de esta forma, también la
luminosidad y el contraste de la imagen.
El valor Offset permite determinar el valor umbral.
Sólo se detectan y muestran en la imagen las
señales que están por encima de este valor umbral.
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Detector
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Detector
Un valor elevado de Gain aumenta la entrada de
ruido y puede dar una señal saturada.
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Detector
Se ajusta ayudándose de una paleta de colores
“Glow over-under”
"Glow (O&U)" visualiza el valor
máximo azul y el valor mínimo
verde.
Por
ello,
está
especialmente
indicada para la optimización de la
calidad de imagen.
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Detector
8. Instrumentación del microscopio confocal
Ajustes de instrumentación
Equilibrio entre:
●
●
●
Potencia del láser
Tamaño del pinhole
Ganancia del fotomultiplicador