universidad austral de chile facultad de ciencias veterinarias

UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS
INSTITUTO DE FARMACOLOGÍA
DETERMINACION DE LA DL50 Y DE TOXICIDAD SUBAGUDA A SIETE DIAS
DEL EXTRACTO DE Shizantus sp. EN RATONES.
Memoria de Título presentada como parte de
los requisitos para optar al TÍTULO DE
MÉDICO VETERINARIO.
ALONSO ALEJANDRO RUIZ ALVAREZ.
VALDIVIA – CHILE
2007
PROFESOR PATROCINANTE
Dr. Elías Caballero B._________________
Nombre
PROFESOR COLABORADOR
Dr. Orlando Muñoz M.________________
Nombre
PROFESORES CALIFICADORES
Firma
Firma
Dr. Oscar Araya B.___________________
Nombre
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Dra. Magaly Riveros G.________________
Nombre
FECHA DE APROBACIÓN: 21 de Junio de 2007.
Firma
ÍNDICE
Capítulo
Página
1. RESUMEN..................................................................................................
1
2. SUMMARY................................................................................................
2
3. INTRODUCCIÓN......................................................................................
3
4. MATERIAL Y MÉTODOS........................................................................
9
5. RESULTADOS...........................................................................................
14
6. DISCUSIÓN................................................................................................
25
7. BIBLIOGRAFÍA........................................................................................
41
8. ANEXOS.....................................................................................................
47
1
1. RESUMEN
La evaluación toxicológica de los extractos de Shizantus sp., a través de los estudios
de toxicidad aguda y subaguda a siete días se llevó a cabo con el objetivo de aportar
información acerca de la inocuidad o toxicidad del extracto, además de servir como referente
para evaluar las características, ventajas y/o desventajas de la utilización de este producto.
Se utilizaron 80 ratones Rockefeller, machos y hembras de aproximadamente 20
gramos de peso.
En el estudio de toxicidad aguda se emplearon dos series de 20 animales cada una, a
las que se les administró el extracto por vía oral a una serie, dosis de 1.200 mg/kg de peso. La
segunda serie se utilizó como grupo control y se le administró agua destilada.
Después de administrar el extracto, se observó a los animales en busca de letalidad
durante 24 horas y aquellos que sobrevivieron, fueron observados por una semana para evaluar
la existencia de alguna reacción tóxica posterior. Una vez terminado el período de
observación, se realizó necropsia a todos los animales.
En el estudio de toxicidad retardada a siete días, se utilizaron dos series de 20 animales
cada una, a los cuales se les administró diariamente, en el agua de bebida una dosis de 100
mg/kg de peso. Para el grupo control se le administró agua destilada durante los siete días. Los
animales fueron observados durante ese período de tiempo, en busca de letalidad o signos de
toxicidad. Posteriormente, todos los animales fueron sometidos a necropsia.
No se presentaron muertes en ninguno de los dos estudios. En el estudio de toxicidad
aguda se observó disminución de la actividad motora, piloerección dentro de los primeros 10
minutos post administración del extracto y conducta pasiva.
A las dosis y concentraciones utilizadas, tanto en el estudio de toxicidad aguda como
subaguda, no hay indicio clínico de toxicidad del extracto de Shizantus sp.
Palabras claves: Toxicidad aguda, ratones, toxicidad subaguda, Shizantus sp.
2
2. SUMMARY
“DETERMINATION OF LD50 AND THE SEVEN-DAY SUBACUTE TOXICITY OF
Shizantus sp. EXTRACT IN MICE”.
The toxicologic evaluation of the extracts of Shizantus sp. through the studies of acute
and subacute toxicity to seven days was carried out with the objective of giving information
concerning or toxicity of the extract, besides to serve as a referent to evaluate the
characteristics, advantages and /or disadvantages in the use of this product.
Eighty Rockefeller mice, males and females with approximately 20 grams of body
weight were used for the experiment. In the acute toxicity study, two groups of 20 animals
each were used. One series was given dose of 1200 mg/kg of weight in their mouth. The
second group was used as control group and was given distilled water.
After the extract was administered, the animals were observed during 24 hours, looking
for lethal effects. The animals that survived were observed throughout the rest of the week to
evaluate the appearance of any toxic reaction. Once the observation period was over, a post
mortem examination was done to all of the animals.
In the study of subacute toxicity to seven days, two groups of 20 animals each were
used which were given every day in the water a dose of 100 mg/kg of weight. The second
group was used as control group and was given distilled water during the seven days. The
animals were observed during that period of time to see if it was lethal or for some signs of
toxicity. Once the observation period was over, a post mortem examination was done to all of
the animals.
Death was not present in neither of the studies. In the study of acute toxicity a lower
motor activity , piloerection within the first ten minutes after giving the dose and passive
behaviour were observed.
In the study of acute and subacute toxicity and according to the dose and concentration
used, there was no indication of toxicity in the Shizantus sp. extracts.
Key words: Acute toxicity, mice, subacute toxicity, Shizantus sp.
3
3.
INTRODUCCIÓN
3.1 MEDICINA TRADICIONAL Y FITOTERAPIA
En todas las épocas el hombre ha utilizado los medios que le ha brindabo la naturaleza,
para paliar las enfermedades (Lewis, 1977).
La fitoterapia (Phyton: planta; terapia: tratamiento) es tan antigua como la historia del
hombre mismo y los primeros documentos que tratan de ello se remontan a 4000 años a.C. y
se refieren a drogas como el opio, mandrágora y el beleño (Lewis, 1977).
Muchas de esas plantas en la antigüedad poseían para el hombre connotaciones
mágicas y su conocimiento fue transmitiéndose de generación en generación. Fueron
utilizadas para ceremonias rituales, en medicina, en la preparación de los alimentos, para
perfumar las casas y las calles, para la fabricación de cosméticos y para muchos usos más
según Hoffman, 1992.
En el siglo XI aparecen las primeras escuelas de medicina en Italia y, al mismo tiempo,
los monasterios se convierten en los centros más importantes de estudio y cultivo de las
hierbas medicinales (Hoffman, 1992)
En América, desde hace 500 años, cronistas, viajeros y naturalistas denotaron la
utilización de la flora nativa por los pueblos originarios. En Chile, durante el siglo pasado,
etnólogos y botánicos han sistematizado estos antecedentes y particularmente han iniciado un
trabajo con las comunidades indígenas, logrando un conjunto de información sobre el uso y
función de las plantas, la forma en que estos pueblos las categorizan y las posibilidades que
estos conocimientos otorgan a la medicina, a la farmacopea, a la alimentación, etc. (Castro,
1995).
Planta medicinal, es todo vegetal que contiene en uno o mas de sus órganos sustancias
que pueden ser utilizadas con fines terapéuticos o que son los precursores de hemisíntesis
farmacéutica. El valor medicinal de una planta se debe a la presencia en sus tejidos de una o
varias sustancias químicas que producen una acción fisiológica concreta sobre el organismo
humano. Estas sustancias son las que denominamos principios activos. Muchos de los
principios activos son de estructura química sumamente compleja y para algunos se desconoce
su naturaleza química. Otros, en cambio, han sido aislados, purificados e incluso sintetizados e
imitados (Montes y col., 1992).
Entre los estudios mencionados anteriormente hay que considerar la farmacognosia,
ciencia que estudia todas las drogas simples, es decir, todas las materias primas naturales
utilizadas como medicamentos y provenientes de los reinos animal, vegetal y mineral. Se
4
ocupa de plantas que se utilizan en la alimentación y de las llamadas plantas tóxicas para el
hombre y el ganado (Magalhaes, 1999).
La medicina tradicional forma parte del acervo cultural de todos los países del mundo,
es decir, conceptos y prácticas heredadas de generación en generación. Su desarrollo no se ha
limitado a la acumulación de conocimientos derivados de la practica sanatoria, sino que se
refleja también en el diseño del cuerpo teórico completo sobre el arte de curar (Soler y Porto,
1995).
El término medicina tradicional se refiere al uso de una amplia gama de preparados a
partir de plantas utilizadas ancestralmente y a los cuales se le atribuye propiedades curativas
no siempre demostradas científicamente (Magalhaes, 1999).
Según Betancourt (1995), se cree que la capacidad terapéutica de las plantas depende
de una serie de factores, entre los cuales se incluyen los principios activos, que varían según
los periodos de crecimiento, floración o fructificación, y otros constituyentes de acción
sinérgica que potencian su acción y la hacen mas compleja y duradera que el principio o los
principios activos aislados.
Dentro del concepto general, el termino Fitoterapia se aplica a todas las modalidades
de administración de las plantas medicinales, incluyendo los principios activos que de ellas se
extraen. Es decir, es el conjunto de tratamientos terapéuticos basados en el uso de las drogas
vegetales (Montes y Col, 1992)
A nivel mundial, el desarrollo tecnológico del estudio de los productos naturales ha
logrado un alto grado de especificidad extractiva, alta sensibilidad analítica y precisión en la
caracterización de sus efectos farmacológicos; se puede entonces validar con un elevado nivel
de confianza la eficacia terapéutica de estos recursos. Gracias a este desarrollo tecnológico,
muchas de las grandes corporaciones farmacéuticas han renovado su interés en el estudio de
plantas medicinales. Con el estudio de un mercado cada vez mas globalizado, ha surgido así
un conjunto de medicamentos de origen sintético. Otro elemento de gran relevancia para este
resurgimiento en el interés por las plantas ha sido la posibilidad de patentar extractos o
procesos extractivos de productos naturales, como una manera de proteger la inversión
dedicada a este rubro (Montes, 1995).
No se pretende despertar la idea que solamente por su origen natural las plantas son
elementos utiles. Para lograr, mediante su empleo, beneficios en salud deben cumplir los
requisitos de todo fármaco, es decir, conocimiento de sus propiedades, efectos colaterales y
adecuada prudencia en su utilización (Montes y col., 1992)
3.2 ESTUDIOS TOXICOLÓGICOS
No es frecuente someter a un conjunto de pruebas toxicológicas a las plantas que se
ensayan por varios motivos: fundamentalmente, porque las plantas consideradas como
medicinales vienen siendo utilizadas en medicina popular, demostrando a través del tiempo
cierta inocuidad; por otra parte, farmacológicamente no suelen ser muy potentes. Sin embargo,
5
siempre es una recomendación hacer una determinación de toxicidad en aquellas especies que
por sus resultados se hayan seleccionado para continuar el estudio farmacológico y el
aislamiento del principio activo (Villar, 1996).
Paracelsus (1493-1541) dijo que “todas las substancias son venenos; no hay ninguno
que no sea veneno. La dosis correcta diferencia el veneno del remedio” (Goodman and
Gillman`s, 1996).
Al introducir en el organismo animal sustancias extrañas se pueden ocasionar
problemas de toxicidad, por lo tanto es necesario evaluar el riesgo de toda sustancia no
conocida mediante la experimentación toxicológica (Jurado, 1989).
La toxicología es una disciplina científica que se preocupa de los efectos adversos de
distintos agentes en los sistemas biológicos. Es un área multidisciplinaria que extrae la
información de diversas disciplinas relacionadas, que incluyen la biología, química, fisiología,
inmunología, patología, farmacología y salud pública (Kalant y col., 1998).
La muerte de las especies experimentales es la respuesta que más comúnmente es
utilizada en pruebas toxicológicas preliminares. Cuando una sustancia está siendo evaluada
inicialmente, los rangos tóxicos específicos deben ser caracterizados. Generalmente, una dosis
es administrada, y/o aumentada o disminuida hasta que un rango crítico haya sido encontrado.
Este rango ve desde que todos los animales sobreviven hasta que todos mueran (Ottoboni,
1997).
Los propósitos de un estudio de toxicidad aguda son la obtención de información
acerca de la actividad biológica de un compuesto químico y tratar de introducirse en su
mecanismo de acción. La información generada en toxicidad sistémica aguda por los estudios
es usada en la identificación del riesgo de manejo en el contexto de la producción, manejo y
uso de los compuestos químicos (Walum, 1998).
Las pruebas de toxicidad aguda son aquellas diseñadas para determinar los efectos que
se producen dentro de un periodo de tiempo corto luego de la administración de las sustancias
que se desea probar. Estas pruebas pueden determinar la relación dosis-respuesta y el valor de
la DL50, es decir, DL significa dosis letal, y 50 significa que la dosis es agudamente letal para
el 50% de los animales a quienes la sustancia en cuestión fue administrada bajo condiciones
de laboratorio controlada. Un nivel subíndice 0 significa que la dosis no fue letal para ninguno
de los animales y un nivel subíndice 100 significaría de que la dosis fue letal para el 100% de
los animales. Las unidades de DL50 son mg/kg, que significa miligramos de la sustancia por
kilogramo de peso corporal del animal. Mientras menor la DL50, menor son los miligramos de
la sustancia por kilogramo de peso corporal que es requerido para matar a los animales, u
mayor es la toxicidad aguda. Viceversa, mientras mayor la DL50, menor es la toxicidad aguda.
DL50 y toxicidad aguda están inversamente relacionadas (Malachowski, 1995).
La relación dosis-tiempo muestra dos tipos distintos de toxicidad que deben ser
distinguidos uno del otro: la toxicidad aguda de la crónica. La toxicidad aguda de una
6
sustancia se refiere a la habilidad de ésta para producir daño sistémico como resultado de una
exposición única a cantidades relativamente altas de la sustancia (Malachowski, 1995), o en
ocasiones en multidosis recibidas en 24 horas (Jurado, 1989). La toxicidad crónica se refiere a
la habilidad de una sustancia de producir daño sistémico como resultado de recibir varias
exposiciones repetidas durante un período prolongado de tiempo, en niveles relativamente
bajos (Malachowski, 1995).
A pesar de las diferencias anatómicas, fisiológicas, metabólicas y de muchos otros
tipos que presentan las especies e incluso rasgos individuales dentro de ellas, todos lo seres
vivos comparten una larga serie de caracteres comunes que permiten la comparación de datos
obtenidos experimentalmente entre ellos y, por supuesto, con el hombre. Debe quedar claro
que existen importantes excepciones a las reglas generales de la estructura de los seres vivos;
pero es un hecho innegable que en particular los mamíferos funcionan con mas semejanzas
bioquímicas y metabólicas que diferencias, y en ello se fundamenta el empleo de modelos
animales para probar los compuestos químicos que por diferentes razones se van a poner en
contacto con los seres humanos (Moreira, 1995).
Entre las pruebas de observación se encuentran los signos clínicos de comportamiento,
como actividad o inactividad espontánea, agresividad, sedación, posiciones extrañas, lagrimeo,
moqueo, excretas, disnea, piloerección, cianosis, características de las heces, tono muscular,
posiciones anormales, etc., así como la muerte, que es una de las características más precisas
de la toxicidad crónica. Todas estas observaciones deben realizarse diariamente (Jurado,
1989).
Estas determinaciones implican estudios integrales de las propiedades tóxicas; la
demostración de dosis que no producen efectos negativos observables; el establecimiento de
relaciones dosis-efecto y dosis-respuesta; estudios quimicobiocinéticos y de biotransformación
(Lu, 1992).
3.3 SHIZANTUS SP., INFORMACIÓN BOTANICA Y PROPIEDADES
Las plantas del género Shizantus, pertenecientes a la familia Solanaceae, concentran
una variada gama de bases de tipo esqueleto de tropano (Muñoz, 1992). Este género incluye a
doce especies originarias de Chile, con la excepción de Shizantus grahamii cuya área de
dispersión alcanza también a Argentina (Coccuci, 1989). Son conocidas más bien por sus
características ornamentales que por sus propiedades químicas o su potencial aplicabilidad
medicinal. Se han demostrado numerosos efectos biológicos para los alcaloides con esqueleto
tipo tropano (Lounasmaa y Tamminen, 1993).
No se conocen antecedentes etnobotánicos en relación con las posibles propiedades
medicinales de alguna de las especies de Shizantus, aunque pinnatus, ha sido manipulado
genéticamente desde hace años, y es de existencia común como planta ornamental en países de
Europa y Estados Unidos (Walters, 1969). Algunas de las especies del género Shizantus suelen
ser conocidas por una serie de sinonimias comunes: “orquídea del hombre pobre”, “flor de
pajarito”, “pajarito”, etc. Informes no confirmados señalan que algunas especies de este género
7
son usados en la cordillera andina de Chile central por arrieros y montañistas, quienes le
atribuyen propiedades estimulantes de efecto similar al provocado por la cocaína; sin
embargo, ello no ha sido demostrado (Muñoz, 1992).
Los estudios químicos del genero Shizantus en Chile comenzaron con las investigaciones
de Castillo y colaboradores a partir de los años 80 (San Martín y col., 1980; Gambaro y col.,
1983). Se pudo inferir que el género acumula un amplio espectro de alcaloides derivados del
tropano con estructuras únicas (San Martín y col., 1987; De la Fuente y col., 1988), con
formación de mono y diésteres derivados principalmente de los ácidos angélico, tíglico,
senecioico, itacónico y/o mesacónico; así como la síntesis de derivados de higrina e higrolina.
La presencia de estas últimas no había sido descrita para la Familia Solanaceae, y en su tiempo
constituyó un hecho notable dada su estrecha relación con higrina, uno de los precursores de la
ruta metabólica de las bases de tropano (Gambaro y col., 1983).
Las plantas de la Familia Solanáceae producen una variedad de alcaloides, algunos de
innegable importancia terapéutica. Precisamente en esta familia de plantas fue donde primero
se encontraron los alcaloides de tropano y es la que ha recibido mayor atención,
particularmente los géneros Datura, Atropa y Scopolia, de donde se extraen comercialmente
los principales alcaloides de tropano de Interés medicinal: atropina y escopolamina,
inhibidores de los efectos muscarínicos de la acetilcolina, que bloquean sobre todo los órganos
que reciben inervación parasimpática. Los efectos se manifiestan a nivel cardíaco, vascular,
visceral (tracto digestivo y urinario), en las secreciones (digestivas, pancreáticas, sudorales y
salivales), a nivel bronquial y ocular (Brachet y col., 1997).
La mayoría de los fármacos con propiedades anticolinérgicas (antimuscarínicas)
provienen de la familia Solanaceae y comparten una estructura básica común: el anillo
tropánico. El género Shizantus presenta una variada gama de bases tropano, lo que permite
suponer que algunas de estas estructuras tendrían actividad anticolinérgica o bien precursores
que den origen a estructuras con actividad biológica relacionada (Gringauz, 1997).
Esto incentiva a investigar la química y farmacología de los alcaloides presentes en
Shizantus como una eventual fuente de novedosas estructuras con potencial acción selectiva
(Hartmann y col., 1996; Katzung, 1998).
3.4
HIPÓTESIS
En base a los antecedentes descritos anteriormente, se planteó la siguiente hipótesis:
Los extractos del genero Shizantus no provocan letalidad ni toxicidad subaguda a siete
días en ratones.
3.5
OBJETIVOS DEL TRABAJO
3.5.1. Determinar la toxicidad aguda a través de la medición de la DL50 del extracto de
Shizantus sp.
8
3.5.2. Determinar si existen efectos secundarios en los individuos sometidos a toxicidad
aguda, posterior a la ingesta del extracto de Shizantus sp.
3.5.3. Determinar si existe o no toxicidad subaguda a siete días del extracto de Shizantus sp.
3.5.4 Determinar si existen efectos secundarios en los individuos sometidos a toxicidad
subaguda, posterior a la ingesta del extracto de Shizantus sp.
9
4. MATERIAL Y MÉTODOS.
4.1 LUGAR DE REALIZACIÓN Y DURACIÓN DEL EXPERIMENTO
El experimento se realizó en el Instituto de Farmacología de la Facultad de Ciencias
Veterinarias de la Universidad Austral de Chile, provincia de Valdivia, XIV región.
El período experimental se efectuó durante los meses de septiembre a noviembre de
2003.
4.2
MATERIAL
4.2.1. Material biológico
En el estudio de toxicidad aguda se emplearon 40 ratones Rockefeller, adulto jóvenes
de los cuales los 20 eran machos y 20 eran hembras de un peso de 20 gramos promedio (18 g.
- 22 g.) al momento del experimento.
En el caso del estudio de toxicidad retardada, se utilizó 40 ratones, los cuales tenían las
mismas características qué aquellos empleados en el estudio de toxicidad aguda.
Los animales utilizados provenían de Bioterio de Experimentación del Instituto de
Farmacología de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Austral de Chile.
4.2.2. Material Farmacológico
Extracto de Shizantus sp. proporcionado por el Dr. Orlando Muñoz,
departamento de Química, Facultad de Ciencias, Universidad de Chile.
4.3 MÉTODO
4.3.1. Toxicidad aguda:
4.3.1.1. Peso corporal: se pesó en función de seleccionar a los animales el día de
inicio del trabajo. El peso se expresó en gramos.
4.3.1.2. Series experimentales: Para seleccionar las dosis a utilizar en las series
experimentales, se llevó a cabo un tanteo con lotes de cuatro animales.
La distribución de los animales se realizó en forma aleatoria en dos series de 20
ratones cada una. A la primera de las series formadas se les administró una concentración de
10
1.200 mg/kg de Shizantus sp ya que técnicamente fue imposible concentrar mas la dosis y la
segunda serie se utilizó como grupo control.
Las dosis empleadas fueron las siguientes:
•
Serie 1: solución de extracto de Shizantus sp., en una concentración de 60 mg/ml y
una dosis de 1.200 mg/kg de peso.
•
Serie 2: agua destilada.
4.3.1.3. Condiciones experimentales: los ratones eran mantenidos en un ambiente con
una temperatura controlada de 20 ± 2 ºC, con un ciclo luz/oscuridad de 12:12 h, cuyas horas
luz correspondían al lapso comprendido entre las 08:00 y las 20:00 horas.
La experimentación se realizó durante el fotoperíodo de horas luz.
Los animales se mantuvieron en gavetas plásticas, con agua y alimento adlibitum.
Previo al inicio de la experimentación se sometió a los animales a dos horas de
ayuno, manteniéndolos en gavetas especiales, en las que se les daba agua ad-libitum. En estas
gavetas permanecían por dos horas posteriores a la administración del extracto, luego de las
cuales eran devueltos a sus gavetas originales en las cuales contaban con agua y alimento adlibitum.
4.3.1.4. Procedimiento y tiempo de observación: la vía de administración utilizada
fue la oral, utilizando para ello una jeringa con una sonda buco-esofágica de polietileno. La
administración del extracto se realizo en una dosis única de 0.4 ml por animal,
correspondiendo dicho volumen al 2% del peso corporal.
Luego de administrar el extracto a los animales, estos fueron observados en
busca de letalidad durante un día, en los siguientes intervalos de tiempo: a los 10 minutos, 30
minutos, 1 hora, 6 horas, 12 horas y 24 horas.
Posterior a esto, los animales que sobrevivieron fueron apartados y observados
a intervalos diarios por una semana, ante la eventual aparición de toxicidad subaguda. Se
empleó para esto la “Pauta de Observación Programada para Ratones” (Anexo 1).
Finalizado el tiempo de observación, todos los animales fueron sometidos a
eutanasia y posterior necropsia para visualizar la presencia o ausencia de procesos patológicos
que no fueron apreciables al examen clínico externo. Para ello, se utilizó la pauta contemplada
en el anexo 2, en la cual los siguientes órganos fueron examinados.
•
Corazón
•
Pulmones
11
•
•
•
Hígado
Bazo
Riñones
4.3.2 Toxicidad Subaguda:
4.3.2.1. Fase experimental: en este estudio, se utilizaron dos lotes de animales, compuestos
por 20 animales cada uno, los que tenían las mismas características y bajo las mismas
condiciones que los utilizados en el estudio de toxicidad aguda.
La cantidad de agua de bebida suministrada durante el fotoperíodo de oscuridad fue de
48 ml (González, 1999).
4.3.2.2. Series experimentales: los animales se distribuyeron aleatoriamente en dos grupos de
20 ratones cada uno.
Las series utilizadas para este estudio de toxicidad subaguda fueron las siguientes:
•
Serie 1: solución de extracto de Shizantus sp. en una concentración de 0.729 mg/ml y
una dosis de 100 mg/kg de peso, aplicados en 48 ml de agua de bebida.
•
Serie 2: agua destilada, en una cantidad de 48 ml
4.3.2.3 Peso Corporal: los ratones fueron pesados como lote entero, diariamente y a la misma
hora durante todo el ensayo.
4.3.2.4 Condiciones experimentales: los ratones fueron mantenidos en iguales condiciones
ambientales, de bebida y de alimentación que el estudio de toxicidad aguda.
A los animales se les mantuvo en ayuno de agua durante dos horas previas a la
administración del extracto.
Al finalizar la administración durante las 12 horas del fotoperíodo de oscuridad, se
mantenían con agua potable por el resto del día.
4.3.2.5 Procedimiento y tiempo de observación: a los 48 ml de agua de bebida, se le
administraron 35 mg del extracto de Shizantus sp.
La administración del extracto se realizó por un período de 7 días, en el lapso entre las
20:00 y las 08:00 horas, correspondientes al fotoperíodo de oscuridad.
Los animales fueron observados durante siete días, a partir del inicio del experimento,
en busca de letalidad u otra alteración visible externamente, utilizando para ello una pauta de
observación igual a la empleada para la evaluación de la toxicidad aguda (Anexo 1).
12
Al terminar el período de observación, todos los animales fueron sometidos a eutanasia
y posterior necropsia, según la pauta del anexo 2. Los órganos examinados fueron: corazón,
pulmones, bazo, hígado y riñones.
4.3.3. Análisis de los resultados:
4.3.3.1. Toxicidad aguda: se realizó una descripción de los hallazgos correspondientes a la
letalidad, comportamiento y necropsia.
4.3.3.2. Toxicidad retardada: para letalidad y estudio del comportamiento se hizo una
descripción de los hechos observados y hallazgos a la necropsia.
Se analizó el peso corporal de los grupos en estudio utilizando la prueba t de Student
para establecer si existían o no diferencias significativas considerando p ≤ 0,05 como
significativo.
13
5. RESULTADOS
5.1 ESTUDIO DE TOXICIDAD AGUDA.
5.1.1 Dosis letal media (DL50)
La tabla Nº1 muestra los resultados de letalidad de los extractos de Shizantus sp.
•
Tabla Nº 1: Letalidad observada en ratones sometidos a extracto de Shizantus sp.
shizantus sp 1.200 mg/kg
control
Nº ratones
20
20
Nº ratones muertos
0
0
La tabla Nº 1 muestra que no se observó letalidad en el extracto de Shizantus sp.
5.1.2 Observación del comportamiento:
Posterior a la administración del extracto se pudo observar una disminución de la
actividad motora y conducta pasiva hasta aproximadamente una hora post-administración.
5.1.3 Necropsias:
En este estudio, ningún animal murió con la dosis utilizada. Al realizar las necropsias
no se encontraron lesiones macroscópicas que avidencien diferencias entre los órganos de los
animales tratados y los controles.
5.2. ESTUDIO DE TOXICIDAD RETARDADA.
5.2.1 Letalidad
No se observó letalidad en la dosis utilizada.
5.2.2. Observaciones post administración (siete días).
Al final de los siete días, no se encontró letalidad ni alteración del comportamiento en
ninguno de los animales, tanto tratados como controles.
5.2.3. Peso Corporal
14
•
Tabla Nº 2: Pesos corporales totales de 10 animales tratados con el extracto de
Shizantus sp. en una dosis de 1.200 mg/kg y de los 10 animales controles, valores obtenidos
durante 7 días.
DIA
1
2
3
4
5
6
7
PROMEDIO
Peso en gramos
GRUPO CONTROL
GRUPO SHIZANTUS
216
220
224
224
242
228
240
234
242
232
243
233
243
234
236
229
El análisis de los pesos corporales con la prueba de t de Student mostró que no
existieron diferencias significativas entre los grupos tratados y no tratados.
5.2.4. Necropsia
No se observó alteraciones macroscópicas en los órganos examinados.
15
6. DISCUSIÓN
El principal propósito de las pruebas de toxicidad es de proveer una base de datos que
pueda ser utilizada para evaluar el riesgo o peligro a humanos asociados con la situación en
que el agente químico, el sujeto y las condiciones de exposición son definidos. Es evidente
que la situación ideal es cuando el agente, el sistema biológico y las condiciones de exposición
utilizados para las pruebas de toxicidad sean idénticas a aquellos para los cuales estas pruebas
están siendo determinadas (Klaassen, 1986).
En esta situación, el agente y las condiciones (vía oral) son las mismas, aunque el
sistema biológico cambia. El ratón y el humano son seres distintos, pero al ser ambos
mamíferos, la mayoría de los efectos de las sustancias tóxicas son similares (Lu, 1992).
La DL50 es a veces utilizada para estimar las dosis letales para humanos; sin embargo,
cuando se hace, debe ser reconocido que son basados en animales de experimentación. La
razón y el juicio deben ser utilizados para poder traducir su significado a términos humanos.
Cuando se utiliza una DL50 oral para estimar la cantidad de sustancia que podría ser
potencialmente letal para un niño o adulto, el peso de la persona (en kilos) es multiplicado por
el valor de la DL50 para la sustancia en particular (en miligramos) (Kalant y col., 1998).
8.1 ESTUDIO DE TOXICIDAD AGUDA
8.1.1 Letalidad
En este estudio, la dosis máxima aplicada fue de 1.200 mg/kg debido a que no fue
posible técnicamente concentrar mas el extracto de Shizantus sp.
Respecto a los grupos tratados, no se presentó letalidad posterior a la administración
del extracto de Shizantus sp. por vía oral, en la dosis indicada en la tabla Nº 1. Al no
producirse letalidad en los animales, fue imposible determinar la DL50 exacta. El estudio de
toxicidad aguda de una sustancia sirve como base para el conocimiento de la relación
Dosis/Respuesta. (Loomis, 1982). De acuerdo a lo anterior podemos decir que la dosis letal
para Shizantus sp está por sobre la dosis máxima probada que fue de 1.200 mg/kg por vía oral
en ratones.
La vía de aplicación fue la oral porque el producto químico sometido a prueba debe
administrarse por la vía de exposición más utilizada en los humanos (Lu, 1992). Por esta
razón, el extracto fue administrado por vía oral puesto que en medicina tradicional la forma
más frecuente de uso es a través de la infusión de plantas medicinales para uso humano.
Debido a que la toxicidad de las sustancias químicas administradas por vía oral puede
variar según la frecuencia en que se realice y si son mezcladas con alimentos o administradas
16
con el estómago vacío (Loomis, 1982). Por esta razón los grupos tratados se sometieron a
ayuno. Al utilizar la vía oral se esperaba obtener una mejor absorción del extracto para poder
detectar efectos tóxicos que la planta pudiera presentar, en este caso no se observó toxicidad a
las dosis utilizadas.
El género Shizantus presenta una variada gama de bases tropano, lo que permite
suponer que algunas de estas estructuras tendrían actividad anticolinérgica o bien precursores
que den origen a estructuras con actividad biológica relacionada (Gringauz, 1997). De los
géneros Datura, Atropa y Scopolia, se extraen comercialmente los principales alcaloides de
tropano de Interés medicinal: atropina y escopolamina, inhibidores de los efectos muscarínicos
de la acetilcolina, que bloquean sobre todo los órganos que reciben inervación parasimpática.
Los efectos se manifiestan a nivel cardíaco, vascular, visceral (tracto digestivo y urinario), en
las secreciones (digestivas, pancreáticas, sudorales y salivales), a nivel bronquial y ocular
(Brachet y col., 1997).
Esto revela que las plantas Atropa belladona y Datura stramonium de las cuales se
extrae la atropina e Hyoscyamus níger de la cual se extrae escopolamina, a pesar de pertenecer
a una misma familia de plantas, sus principios activos son mas tóxicos ya que, 50 mg pueden
ser fatales en la mitad de los casos. La dosis fatal de escopolamina es aproximadamente 8 mg
(Thienes y Haley, 1972).
Jurado (1989), expresa que aunque en el estudio de toxicidad aguda, el único
parámetro tenido en cuenta es la letalidad y que esta no presupone el mecanismo de acción
tóxica, sino que solamente sugiere la magnitud de la potencia de la sustancia, esta tiene la
virtud de ser precisa, cuantificable e inequívoca.
8.1.2. Observaciones post administración (7 días)
Respecto a la observación posterior a la administración de los extractos, estos deben
ser examinados no sólo para conocer el número y tiempo de muertes, sino para evaluar
cualquier otro efecto (Lu, 1992).
La observación de los grupos tratados y no tratados debe ser de por lo menos una
semana y con los datos obtenidos se puede llegar a ciertas conclusiones respecto del centro y
mecanismo de la acción de los compuestos sometidos a prueba (Loomis, 1982).
Posterior a la administración, hubo una disminución de la actividad motora del grupo
tratado con Shizantus sp. Tal comportamiento podría atribuirse a un efecto de tipo depresor a
nivel central o por una caída de la presión. Se tendría que realizar mayores estudios para llegar
a una conclusión más clara.
La conducta atemorizada es atribuible a que los ratones son fácilmente afectados por el
estrés (Hime, 1984). La piloerección presentada es atribuible a un mecanismo de defensa ya
que, debe considerarse que la administración de los extractos se realizó por sondaje bucoesofágico de manera forzada, implicando este un manejo estresante para los animales y que
17
posterior a la administración de los extractos, estos debieron ser manipulados nuevamente para
su evaluación, situación que contribuye a mantener el estrés de los animales.
8.1.3. Necropsias
En los grupos utilizados no se observaron alteraciones macroscópicas de los órganos
examinados que pudieran indicar efectos tóxicos sobre algún órgano. Según Lu (1992), la
necropsia puede proporcionar información útil acerca del órgano objetivo, especialmente
cuando la muerte no se presentó poco después de la administración de la dosis.
8.2 TOXICIDAD RETARDADA
8.2.1 Letalidad
Se señala que la administración debe realizarse todos los días, pues se ha observado
que, si se efectúa 5 días de la semana, en lugar de los siete, el descanso de las 48 horas puede
permitir la recuperación de los efectos tóxicos (Jurado, 1989).
Debido a que no hubo letalidad en el estudio de toxicidad aguda, era esperable que no
se presentara en este caso a la dosis utilizada.
8.2.2 Observaciones post administración (7 días)
No fue evidenciada ninguna alteración tanto de comportamiento como en letalidad de
los animales. La conducta de los animales no se vio mayormente afectada con la
administración de los extractos, debido a que su administración se realizó en el agua de
bebida, disminuyendo así el estrés al que se sometían los animales.
8.2.3. Peso corporal
El análisis de los pesos corporales realizado con la prueba t de Student reveló que no
existen diferencias significativas entre los grupos.
Lo anterior indica la baja toxicidad del extracto, debido a que la pérdida de peso es un
índice simple pero sensible de los efectos tóxicos (Lu, 1992), y el no haber presentado
diferencias significativas en el peso evaluado durante los siete días que duró el experimento,
es un indicador de que el extracto es de baja toxicidad por vía oral en esta especie, bajo las
condiciones de temperatura y fotoperíodo a los que fueron sometidos los animales.
8.2.4. Necropsia
Macroscópicamente, no se observó alteración de los órganos examinados.
18
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21
8. ANEXOS
ANEXO 1
PAUTA DE OBSERVACION PROGRAMADA PARA RATONES
Efectuada por:
Fecha:
Solvente:
Concentración:
Dosis:
Extracto:
Evaluado por:
Animal Nº:
Sexo:
Peso:
mg/kg:
Minutos /
Tiempo post administración
Disminución de act. Motora
Aumento de act. Motora
Pérdida reflejo de enderezamiento
Reflejo palpebral
Lagrimación
Mucosas pálidas
Mucosas hiperémicas
Mucosas cianóticas
Erección de cola
Piloerección
Diarrea
Agresivo
Pasivo
Atemorizado
•
•
•
10
30
Filiación:
Color:
ml adm:
tiempo:
Horas
1
Sobrevivencia al completar el experimento
Tiempo de muerte post administración
Observaciones
6
12 24
/
Días
2
3
4
5
6
7
22
ANEXO 2
PAUTA DE NECROPSIA
•
CORAZON:
Latiendo:
Detenido:
Tamaño aumentado:
Peteq. Hemorr.:
Tamaño aumentado:
Peteq. Hemorr.:
Tamaño aumentado:
Comentario:
•
HIGADO:
Normal:
Comentario:
•
BAZO:
Normal:
Comentario:
•
PULMONES:
Normal:
Petequiado Hemorrágico:
Comentario:
•
RIÑONES:
Normal:
Petequiado Hemorrágico:
Comentario:
•
PARED PERITONEAL:
Normal:
Comentario:
Petequiado Hemorrágico:
23
ANEXO 3
•
Valores del análisis estadístico realizado a los datos obtenidos de las mediciones
diarias de peso corporal en el estudio de toxicidad retardada.
GRUPO CONTROL
7
GRUPO SHIZANTUS
7
216
243
220
234
Media
Desviación standard
Error standard
237.7
11.03
4.167
229.3
5.499
2.078
Bajo 95%
Sobre 95%
225.5
245.9
224.2
234.4
0.3655
P>0.10
si
ns
0.2606
P>0.10
si
ns
Numero de valores
Mínimo
Máximo
Test Normalidad
Distancia KS
Valor de P
Pasa test normalidad
Valor de P