y Fecundación In Vitro

Reproducci ón Asistida en Bovino
usando Ovum Pick -Up (OPU) y
Fecundaci ón In Vitro
Dpto. de Reproduccion Animal y Conservación
de Recursos Zoogenéticos
INIA - Madrid
INDICE
• Introducci ón
• Aplicaci ón del Ovum Pick-Up
• Problemas asociados
– Intervalo de sesi ón
– Pre-estimulaci ón
– Equipo para el OPU
– Técnica de recogida de ovocitos
Impacto de las Tecnolog ías de
Reproducci ón Asistida
I.A.
5 transferable embryos/ flush= 50 freezable embryos/
donor/year=30 calves born after ET
MOET
Transg énesis
Mejora Reproducti va
Clonaci ón
FIV
Sexaje
OPU
2 OPU/week=150 embryos/year=70 calves
Can be used different bull @ each batch of oocytes
Embryos can be produced during 2nd and 3rd month of pregnancy
FIV/Ovum pick up
• Obtención de ovocitos de ovarios de animales
vivos.
• Se puede acceder a animales de alta calidad.
– Podemos colectar ovocitos repetidamente, incluso en
estado de preñez.
• Cuando la alta calidad genética del donante está
unida a un buen laboratorio de FIV – podemos
producir alta cantidad de embriones de alta
calidad.
è Eficaz en mejora genética.
Ovum Pick Up
vOPU no requiere que el animal tenga un ciclo reproductivo normal.
Cuando se usa conjuntamente con técnicas de FIV, se acorta el
intervalo generacional y aumenta la mejora genética maternal
produciendo más progenie que por métodos convencionales.
vEl éxito del OPU se mide mediante la tasa de recuperación de ovocitos
expresando el porcentaje sobre el total de folículos aspirados.
Ø La tasa de recuperación está influenciada por:
üAspiración al vacío
üPre-tratamiento hormonal de animales
üFrecuencia de punción
üEstado del ciclo: estro
üExperiencia del operador
Etapas del Ovum Pick Up
Anestesia local
Técnico con equipo de
OPU
Colecta OPU
FIV
Aisla y clasifica
ovocitos y embriones
TE el día 7
OPU
Obtención de ovocitos
Diagrama de OPU
Grado 1-2
Grado 3-4
Adaptado de Rizos, 2007
Recuperación de ovocitos
y clasificación
Los complejos cúmulos-ovocito (COCs) se clasificaron en 4 categorías
morfológicas:
Ø (1) Rodeados de numeros as capas de células del cúmulo compac tas
Ø (2) Rodeados de 2 a 3 capas de células del cúmulo compactas
Ø (3) Ovocitos denudados
Ø (4) Capas celulares expandidas
Adaptado de Rizos, 2007
Morfología de los ovocitos
80
60
División %
Blastocistos %
40
20
0
Ward et al. (1999)
Adaptado de Rizos, 2007
Producción de Embriones In Vitro
maduración
fecundación
¿?
Blastocisto
Desarrollo embrionario
División
Adaptado de Rizos, 2007
Maduración (MIV)
• Espontánea in vitro
• Maduración nuclear
– Reanudación de la meiosis
– Profase I - Metafase II (=ovulación)
• Maduración citoplásmica
– Migración de gránulos corticales (bloquean la
poliespermia)
– Redistribución de orgánulos
• 24 h en 5% CO2 en aire, 39° C
Adaptado de Rizos, 2007
Grado 1 y 2
Grado 3 y 4
MIV durante 24 h
39o C, 5% CO2
Antes de la maduración
Después de la maduraci ón
1er corpúsculo polar
Adaptado de Rizos, 2007
Fecundación (FIV)
• Descongelar el semen
• Capacitación - heparina
• Selección espermática
– Swim-up
– Gradiente de densidad de Percoll
• 0.5-1 millón spz/ml
• Co-cultivo durante 24 h en 5% CO2 en aire
Adaptado de Rizos, 2007
Separación espermática
con Swim-up
Con Percoll
0.25 ml semen
+
1 ml medio
Antes de centrifugar
Después de centrifugar
Adaptado de Rizos, 2007
FIV durante 24h
39o C, 5% CO2
Zigoto
Adaptado de Rizos, 2007
Cultivo (CIV)
Determina la calidad embrionaria:
•
•
•
•
•
Atmósfera de humedad saturada
Medio definido vs co-cultivo vs cultivo in vivo
Suero
5% CO2 + 5% O2 + 90% N2
Período más largo in vitro (~7 días)
Adaptado de Rizos, 2007
Día 2
Día 6
Día 3
Día 7
Día 4
Día 5
Día 8 - 9
Adaptado de Rizos, 2007
El origen de los ovocitos en OPU-IVF
• Ovocitos de folículos de tamaño >2mm
– Intervalo de sesión de OPU
• Ovocitos más homogéneos que con MOET o FIV,
debido a las sesiones repetidas se eliminan los
folículos dominantes y atrésicos
– Los ovocitos de FIV se recogen de folículos en cada
fase del desarrollo.
– Los ovocitos de MOET han sufrido una fase dominante
y un desarrollo preovulatorio final.
15
Tamaño del
folículo (mm)
Folículo preovulatorio
8
7
OPU
6
5
4
3
SOV
2
Matadero
Fase folicular
Procesos que afectan a OPU-IVF
•
•
•
•
Intervalo de sesión
Pre-estimulación con FSH
Equipo de OPU
Técnica de recogida de ovocitos
Intervalo de sesiones
Efecto del intervalo entre las sesiones de OPU en la calidad del ovocito y la posterior
tasa de producción in vitro de embriones (Merton et al. 2003).
Esquema
Intervalo
(días)
Sesiones 1
(n)
Ovocitos/
sesión (n)
Índice calidad
ovocito
Embriones/
ovocitos (%)
3-4
3
516
7.2a
0.66
19.7a
4
502
6.6b
0.30
17.1b
7
7
48
9.1a
0.0
13.5c
2-5
2
259
3.9
1.29a
14.1a
5
259
4.0
0.97b
10.5b
Pre-estimulación con FSH
Efecto de la pre-estimulación con FSH en los resultados de OPU-IVP (Merton 2003)
Trata.
FSH 1
Ovocitos/
Sesión (n)
División
(%)
Embriones/
Ovocitos
(%)
Embriones
por
sesión (n)
2 veces/semana
Lunes-Jueves
No
7.8a
60.4
19.9
1.5a
1 vez/2 semanas
+
13.2b
65.6
26.0a
3.3b
2 veces/semana
Lunes-Jueves
No
5.9c
58.5
16.3b
1.0c
Periodo
Colectas ultrasonogr áficas sobre vacas gestantes SOV
(P<0.001)
Tratamiento
% Colectados
Ovocitos/vaca
% División
+40 mg FSH
43
10.8+5.3
67 a
+20 mg FSH
28
1.7+0.7
40 b
Control
19
0.3+0.2
0c
Equipo de OPU
• La técnica de OPU es realizada por una o
dos personas.
– Técnico – manipula el ovario
– Asistente – realiza la punción folicular
• Ambas personas afectan significativamente
a la cantidad de COCs recogidos
Técnica de recogida de ovocitos
• El número de ovocitos recogidos por animal
dependen del técnico y la ruta utilizada.
– mediante aspiración: 32 ovocitos GI y II
– mediante OPU: 8 ovocitos GI y II
• Estas diferencias son principalmente debidas a la
baja resolución del ecógrafo para OPU comparado
con el ojo humano.
Efecto del tamaño folicular en la tasa de producción in vitro de embriones usando OPU
seguida de la aspiración de los ovocitos restantes después de morir el donante
(Merton, 2003).
Método de
colecta de
ovocitos (n=6)
Tamaño del
Folículo (mm)
Numero total
de ovocitos
Tasa de
división %
Obtención de
blastocistos %
In vivo por OPU
2-10
40
82.5
37.5
Ex vivo por
aspiración
1-2
72
43.1
20.8
Observaciones finales
Número de embriones
Tratamiento antes de la colecta de ovocitos
Por sesión
Por semana
0.7
0.23
5
1
5.5
1.1
OPU (2/semana) a intervalos de 3 y 4 días
1
2
OPU (2/semana) a intervalos de 2 y 3 días
1
3
OPU después de pre-estimulación (FSH)
a 2-semanas de intervalo
3
1.5
Ciclo natural, IA y flushing el Día 7
MOET, superovulación normal
MOET, superovulación retirando el Fol Dominante
Diámetro folicular y tasa de recuperación de ovocitos después de repetidas sesiones
de OPU en vacas lecheras (Rizos et al. Datos no publicados)
Diámetro Folicular (mm),
(%)
Grado Ovocitario
(%)
Número de Ovocitos
.
2-4
5-7
8-10
11-13
14-16
>17
n Total
1-2
3-4
ZV*
Por novilla
Total
46.2
34.8
13.0
4.3
0.5
1.1
184
50
43.5
6.45
2.58
62
61.0
33.8
4.5
0.3
0.3
0.0
290
77.1
22.9
0
4.92
118
62.8
25.5
11.2
0.5
0.0
0.0
196
51.7
37.9
10.3
3.63
87
83.1
16.3
0.7
0.0
0.0
0.0
301
74.6
23.8
1.6
5.25
126
* zona pelúcida vacía
La aspiración al vacío se expresa nor malmente en milímetros
de mercurio y varia ent re 40 y 400 mm Hg.
La aspiración exacta en la punta de la aguja depende de:
v la construcción del dispositivo de OPU
v la longitud y el di ámetro del sistema de tubos
v el diámetro de la aguja
Diseño Experimental
• Seleccionamos cuatro presiones al vacío diferentes
• Como control tomamos la aspiración manual con una
aguja y una jeringa
• Los parámetros registrados para evaluar la capacidad de
desarrollo de los ovocitos fueron:
– Tasa de recuperación
– Grado de ovocitos recuperados
– Nº de blastocistos obtenidos
El aumento de presión al vacío baja la tasa
de recuperación
a
a
a
b
70
c
60
50
%
40
30
20
10
0
% Recovered
30
50
70
90
Manual
69.4
68.2
60.3
52.2
65.4
La producción de blastocistos decrece con el grado de los
ovocitos
25
20
15
%
10
5
0
Bl. Yield
5/22/2009
Class 1
Class 2
Class 3
Class 4
21.73
10.32
0.5
0.2
Ovocitos de Grado 1
70
a
a
60
b
50
% of total 40
recovered. 30
c
d
20
10
0
Class 1
5/22/2009
30
50
70
90
Manual
61
42.3
27.1
17.7
57.5
Ovocitos de Grado 2
70
60
50
% of total 40
recovered. 30
b
ab
a
a
a
20
10
0
Class 2
30
50
70
90
Manual
25.4
35.5
31.3
29.1
26.3
Ovocitos de Grado 3
70
60
d
50
c
% of total 40
recovered. 30
b
20
10
0
Class 3
b
a
30
50
70
90
Manual
5.9
12.6
32.7
45.9
9.3
Ovocitos de Grado 4
70
60
50
% of total 40
recovered. 30
20
10
0
Class 4
a
a
a
a
a
30
50
70
90
Manual
7.7
9.6
8.9
7.3
6.9
Nº Blastocistos/Ovario decrece con la
presión excepto a 50mm Hg
a
2
1.5
Blastocysts
/ovary
a
a
1
b
b
0.5
0
Day 8 bl/ovary
30
50
70
90
Manual
1.33
1.88
0.67
0.37
1.44
Resumen
• Presión de 30-50mm Hg:
n
Aumenta la calidad del ovocito
n
Aumenta la producción de blastocistos
• Presión de 70-90mm Hg:
nDisminuye
la tasa de recuperación
nDisminuye
la producción de blastocistos
Conclusiones
• Intervalo de sesiones: 3 – 4 días
• Pre estimulación con FSH: incrementa el numero de
embriones obtenidos por sesión.
• Pre estimulación en gestantes: + 40 mg de FSH
• Técnico y técnica: incrementa la colecta de ovocitos
• Tamaño folicular mas adecuado: de 2 a 10 mm de
diámetro
• Presión de aspiración óptima: de 30 – 50 mm Hg