Métodos de detección de Métodos de detección de

Métodos de detección de
colorantes con la actual ISO 3632
y con la nueva propuesta SAFFIC
Alicante, 17/09/2009
Actual ISO 3632
D
Determinación
i
ió d
de
colorantes
hidrosolubles ácidos
mediante HPLC con
detector DAD
Análisis de los colorantes hidrosolubles ácidos
¾ Amarillo de quinoleína
¾ Amarillo
A
ill crepúsculo
ú
l o amarillo
ill ocaso ((amarillo
ill nºº 5)
¾ Tartracina
¾ Amaranto
A
t
¾ Rojo Ponceau 4R
¾ Azorrubina
A
bi o carmoisina
i i
¾ Naranja II
¾ Eritrosina
E it i
¾ Rojo Roccelline
Actual ISO 3632
1. Extracción
1
2. Aislamiento
3 Concentración
3.
Análisis HPLC
¾Técnica isocrática
¾Técnica de gradiente
3
Extracción
Aislamiento
Concentración
HPLC
Colorantes
ácidos
hid
hidrosolubles
l bl
Técnica isocrática:
Condiciones cromatograficas
– Fase móvil A: buffer A/acetonitrilo (70:33)(% v/v) (Buffer A:
disolución acuosa de pH 4.5 conteniendo 0.001 mol/L de tetra-n-butilamonio
hid ó
hidrógeno
sulfato
lf t y 0
0.001
001 mol/L
l/L d
de potasio
t i d
de hid
hidrógeno
ó
ffosfato).
f t )
– Velocidad flujo: 1,0 mL/min
– Columna cromatográfica
g
por HPLC,, tipo
p
p C18 ((25 cm x 4
mm i.d.)
– Temperatura Columna: 30 ºC
– Tiempo de análisis minimo: 70 min
Técnica de gradiente:
Condiciones cromatograficas
– Fase móvil A: buffer A/acetonitrilo (70:33)(% v/v) (Buffer A: disolución acuosa de pH 4.5
conteniendo 0
0.001
001 mol/L de tetra-n-butilamonio hidrógeno sulfato y 0
0.001
001 mol/L de potasio de hidrógeno fosfato)
fosfato).
– Fase móvil B: buffer B/acetonitrilo (50:53)(% v/v) (Buffer B: disolución acuosa de pH 4.5
conteniendo 0.0014 mol/L de tetra-n-butilamonio hidrógeno sulfato y 0.0014 mol/L de potasio de hidrógeno fosfato).
– Velocidad flujo: 1,0 mL/min
– Columna cromatográfica por HPLC, tipo C18 (25 cm x 4 mm i.d.)
– Temperatura Columna: 30 ºC
Tiempo (min)
Fase móvil A (%)
Fase móvil B (%)
Velocidad flujo (mL/min)
0
100
0
1.0
14
100
0
1.0
30
0
100
1.0
40
0
100
1.0
Propuesta
p
de modificación
SAFFIC
Análisis
á s s de los
os co
colorantes
o a es po
polares
a es
¾ Alizarina
¾ Alizarina Red S
¾ Acido Carminico
¾ Chrysoidina G
¾ Crocina
¾ Curcumina
¾ Riboflavina-5-monofosfato Sodico
Análisis de los colorantes polares
p
Preparación del extracto de azafrán
¾ Pesar 500 mg de azafrán molido en un
pesasustancias y echarlo en un matraz
aforado de 1 L con 900 mL de agua destilada.
¾ Agitar la disolución durante 1 h.
¾ Enrasar el matraz con agua destilada y
homogenizar la disolución.
Técnica de gradiente:
Condiciones cromatograficas
–
–
–
–
–
Fase móvil A: 1% Acido acético en Agua HPLC
Fase móvil B: 1% Acido acético en Acetonitrilo HPLC
Velocidad flujo: 1,0 mL/min
Columna cromatográfica por HPLC, tipo C18 (25 cm x 4 mm i.d.)
Columna a T ambiente
Tiempo (min)
Solvente A (%)
Solvente B (%)
Velocidad flujo (mL/min)
0
80
20
1.0
4.5
80
20
1.0
20
40
60
1.0
30
5
95
10
1.0
30.1
80
20
1.0
35
80
20
1.0
Cromatograma de una disolución estándar
de colorantes polares
DAD1 C, Sig=440,16 Ref =of f (D:\DATA2~2\SAFFIC\SAF00060.D)
mAU
160
140
Alizarin
Orange G
Suadan O
Chrysoidine G
Crocin
n
20
Alizarin
n Red S
40
Carmiinic acid
60
Ribofl avin 10%
80
Riboflavin 5 monoph
hosphate
100
Curcumin
120
0
5
10
15
20
25
Análisis de los colorantes no polares
¾ Sudan I
¾ Sudan II
¾ Sudan III
¾ Sudan IV
¾ Sudan Red 7B
¾ Sudan Red B
¾ Trans apo-8-carotenal
Análisis de los colorantes no polares
Preparación del extracto de azafrán
¾P
Pesar 100 mg de
d azafrán
f á molido
lid y echarlo
h l en
un matraz aforado de 10 mL.
¾ Añadir 4 mL de cloroformo.
f
¾ Colocar el matraz en una gradilla y mantener en el
ultrasonidos 15 minutos.
¾ La temperatura del agua del ultrasonidos no deberá
superar 25ºC.
Análisis de los colorantes no polares
p
Preparación del extracto de azafrán
¾ Filtrar la disolución con filtros de membrana PTFE
de 0,45 mm. Recogerla en un matraz 5 mL y
enrasar con cloroformo.
¾ Evaporar el cloroformo con flujo de nitrógeno
nitrógeno.
¾ Reconstituir el extracto con 90 µL de cloroformo y
210 µL de la fase móvil A.
Técnica de g
gradiente:
Condiciones cromatograficas
– Fase
F
móvil
ó il A:
A Acetonitrilo/Metanol/Agua
A t it il /M t
l/A
(45:45:10)(%
(45 45 10)(% v/v)
/ )
–
–
–
–
Fase móvil B: Cloroformo
Velocidad flujo: 1,5 mL/min
Columna cromatográfica por HPLC, tipo C18
Columna a T ambiente
Tiempo
(min)
Solvente A
(%)
Solvente B
(%)
Velocidad flujo
(mL/min)
0
98
2
1.5
2.5
98
2
1.5
16
73
27
1.5
Cromatograma de una disolución estándar
de colorantes no polares
Métodos de detección de
colorantes con la actual ISO 3632
y con la nueva propuesta SAFFIC
Alicante, 17/09/2009