Ruiz López, S.

Ruiz López, S.
Fecundación IN VITRO en
la especie porcina:
Situación actual
y perspectivas
Dr. SALVADOR RUIZ LÓPEZ
Dpto. Fisiología (Fisiología Veterinaria)
Facultad de Veterinaria. Universidad de Murcia
E-mail: [email protected]. http://www.um.es/grupo-fisiovet
Tan sólo diez años después de que
en 1978 naciera Louise Brown, la primera niña probeta, ya se habían producido cerca de 2.500 nacimientos mediante
fecundación in vitro (FIV) en el mundo
y en la actualidad, la técnica de FIV en
la especie humana se ha convertido en
un tratamiento rutinario en mucho tipos
de infertilidad. Sin embargo, el desarrollo
de los sistemas de FIV en los animales
domésticos, y en concreto en la especie
porcina, aunque inicialmente fue escaso,
debido sobre todo a la incertidumbre sobre
las posibles aplicaciones prácticas de esta
técnica, ha ido adquiriendo cada vez una
mayor importancia al vislumbrarse un abanico cada vez más amplio de posibilidades
en un futuro no demasiado lejano.
La FIV es una técnica empleada hoy en
día en la mayoría de las especies animales de interés zootécnico y en la especie
humana, aunque con fines diferentes. Así,
mientras que en la vaca su aplicación
comercial y productiva es muy elevada,
como lo demuestran los datos relativos al
número de embriones producidos in vitro
y transferidos anualmente en Sudamérica
(196.791, un 67% del total mundial), Asia
(82.307, un 28%), Europa (6.845, un 2’4%)
o Norteamérica (4.309, un 1’5%; Thibier,
2007), en la cerda es una técnica todavía
lejos de utilizarse a este nivel.
La FIV ha sido definida como la penetración de espermatozoides capacitados en
ovocitos maduros fuera del tracto genital
femenino. Sin embargo, esta definición
clásica ha sido hoy en día modificada con
el desarrollo de la técnica de inyección
intracitoplasmática de espermatozoides
(ICSI), que se considera una variante de la
FIV tradicional.
En cualquier sistema de FIV, los espermatozoides ya sean eyaculados o epididimales, deben ser sometidos a un proceso
de capacitación espermática mediante
procedimientos in vitro con medios de
cultivo adecuados y lavados. Por otro lado,
los ovocitos utilizados en los programas de
FIV pueden ser ovocitos madurados in vivo
o madurados in vitro. Tras el cocultivo de
ambos tipos de gametos se procede a la
valoración de los resultados de penetración
espermática o bien al cultivo adicional de
los cigotos resultantes durante un tiempo
variable y la posterior transferencia a hembras receptoras en sincronía fisiológica.
66
Figura 1. Lechón transgénico obtenido mediante
sistemas de FIV/ICSI (García Vázquez et al., 2008).
Sin embargo, no es menos importante
el uso de la FIV en la especie porcina en
el ámbito de la investigación tanto básica
(estudio de moléculas implicadas en la
interacción espermatozoide-ovocito, por
ejemplo, Coy et al., 2008) como aplicada
(producción de animales transgénicos para
xenotrasplantes, para obtención de células
madre, investigación sobre terapias génicas, transferencias nucleares o biomedicina
experimental, etc; García Vázquez et al.,
2008, 2010) (Fig.1).
En otras especies, como la yegua, la
FIV clásica presenta muchas dificultades
y se prefiere la fecundación mediante ICSI
para la obtención de embriones in vitro
(Dell’Aquila et al., 1997), mientras que en
la perra, la FIV y el cultivo de embriones
se han realizado tanto con la finalidad de
generar conocimiento sobre la biología
reproductiva en esta especie como con el
objetivo de desarrollar métodos de conservación de razas o especies de carnívoros
en peligro de extinción (Luvoni et al.,
2006). En relación a este último aspecto,
cada año se producen nuevos nacimientos
de animales de especies muy diferentes
en zoológicos o centros de recuperación
en los que el uso de esta técnica es una
herramienta básica para el éxito del proceso (así, en Enero de 2007 nació el primer
bebé rinoceronte por FIV en el Zoológico
de Budapest). Finalmente, los datos de
la International Embryo Transfer Society
(IETS) relativos al incremento progresivo
del número de transferencias de embriones
en ovejas, cabras y cérvidos (sobre todo en
Australia, China y Nueva Zelanda) demuestran que si estos embriones pudieran obtenerse eficazmente in vitro su uso en el
sector productivo sería inmediato (Thibier,
2007). En todos los casos, el rendimiento
de la FIV está muy alejado del 100% y muy
por debajo del porcentaje de éxito que se
obtiene en condiciones de fecundación
natural. Precisamente por este motivo, la
técnica no deja de estar en continua evolución y ser objeto de investigación para
mejorarla a todos los niveles, con especial
incidencia en la especie humana, donde el
número de parejas sometidas a ciclos de
FIV aumenta en todo el mundo cada año
(Adamson et al., 2006).
Uno de los principales problemas que
presenta la FIV porcina en la actualidad
Fecundación IN VITRO en la especie porcina: Situación actual y perspectivas
es la elevada tasa de polispermia, posiblemente debido a que el número de espermatozoides utilizado es demasiado alto en
comparación con la fecundación in vivo
(Hunter, 1999). Se ha especulado que parte
del problema de la polispermia sea debido
a una inadecuada maduración ovocitaria;
sin embargo, cuando se utilizan ovocitos
recién ovulados y fecundados in vitro se
obtienen también fecundaciones polispérmicas (Coy et al., 1993a,b,c; Martínez et al.,
1993). Además, se han obtenido lechones
mediante la transferencia de ovocitos MIV
a una hembra receptora y posteriormente
inseminada (Coy et al., 1999), lo cual también indica que el problema de la polispermia podría ser inherente a la FIV y no a la
MIV. En este sentido, resulta de gran interés
la revisión realizada por el Dr. Funahashi
(2003) sobre la problemática de la polispermia en los sistemas MIV-FIV en porcino.
Otras variables estudiadas en relación
a la FIV en esta especie en el intento de
conseguir una reducción de la polispermia
son: la concentración espermática (Coy et
al., 1993b; Xu et al., 1996; Martínez et al.,
2002), la procedencia de los espermatozoides (Rath & Niemann, 1997), el volumen
del medio de cocultivo (Coy et al., 1993a),
los tratamientos de lavado espermático,
centrifugación o selección previos a la FIV
(Matás et al., 2003; Park et al., 2009), el
tiempo de coincubación espermatozoideovocito (Coy et al., 1993c; Martínez et al,
2002; Alminana et al., 2008a) e incluso
modificaciones en el propio sistema de
cocultivo (microgota vs. pajuela) (Alminana
et al., 2008b).
En la actualidad, la generación de nuevos conocimientos relacionados con el proceso fisiológico de la fecundación puede
tener una aplicación directa en la mejora de
los sistemas de fecundación in vitro en las
diferentes especies de mamíferos de interés.
Así, estudios recientes en este sentido, han
conseguido demostrar el efecto beneficioso
de una glicoproteína específica del oviducto (oviductina) sobre la monospermia
en la vaca y en la cerda (Coy et al., 2008)
(Fig. 2). Esta proteína, además, afecta a la
viabilidad espermática y mejora la calidad
de los embriones producidos. Llegados a
este punto, sería de gran interés el intentar
producir la proteína recombinante de la
“oviductina” para valorar la posibilidad de
introducirla en los medios de cultivo que se
emplean en FIV. Además, se debe valorar el
papel de otras moléculas, como glicosidasas, activador de plasminógeno (Grullón et
al., 2008) y de ciertas proteasas en los resultados de FIV, para considerar su posible uso
en los medios de cultivo, con el objetivo de
conseguir una mejora en el rendimiento de
la técnica en cuanto a la calidad y cantidad
de embriones producidos in vitro.
k MIV-FIV y Cultivo de
embriones
A continuación, vamos a detallar el
proceso en la técnica de FIV a partir de ovocitos que previamente van a ser madurados
in vitro. Este método es el que llevamos a
cabo en los laboratorios de Fisiología de la
Facultad de Veterinaria de la Universidad
de Murcia.
1. Preparación de medios de manipulación, MIV y FIV de ovocitos porcinos
Los medios de manipulación y cultivo
de gametos y embriones se caracterizan
por ser muy específicos para cada una de
las funciones a que están destinados. Por
este motivo, distinguiremos los medios de
manipulación de los medios de cultivo propiamente dicho. Como su nombre indica,
los primeros se emplean para la recogida, transporte y lavado de los gametos,
generalmente antes de introducirlos en un
cultivo. En estos medios los ovocitos permanecen un tiempo muy limitado, y como
se utilizan en el ambiente exterior, es decir
nº 30
“fuera” del incubador, necesitan tampones
en su composición que mantenga el pH
estable si llevan bicarbonato. Los medios
de cultivo, por el contrario, se emplean
generalmente dentro de un incubador, en
una atmósfera CO2 controlada, en ellos los
gametos o embriones permanecen durante
varias horas o días, y el pH se suele mantener alrededor de un valor de 7’4 mediante
el equilibrio que se establece entre el ión
bicarbonato que se incluye en su composición, y el CO2 del aire del incubador, que se
emplea al 5%
Como norma general, los medios de
manipulación se preparan con agua bidestilada, o si es posible ultrapura, mientras que
los medios de cultivo siempre deben prepararse con agua ultrapura, libre de pirógenos.
Una vez preparados, los medios de cultivo
se esterilizan por filtración, haciéndolos
pasar a través de una membrana con un
diámetro de poro de 0.22 μm. Se envasan
en recipientes estériles y se guardan en frigorífico (2-8ºC) durante un tiempo variable.
En el día de su uso, si se van a suplementar,
se hará dentro de una cabina de flujo laminar, para guardar la esterilidad.
1.1. Medios de Manipulación:
- Solución de transporte: 0’9% p/v de
NaCl con 100 mg/l kanamicina sulfato.
- Medio de lavado de ovarios porcinos:
Solución de cetrimida (Bromuro de hexadecil-trimetilamonio: Cetab) al 0’04% (w/v).
- Medio de recogida y selección de ovocitos: Tampón Fosfato Salino de Dulbecco
modificado (PBSDm), suplementado con 1
mg/ml de alcohol de polivinilo (PVA) y 0’005
mg/l de rojo fenol, como indicador de pH.
Este medio se conserva a 4ºC hasta su utilización, momento en el cual se atempera en
estufa a 39ºC.
1.2. Medios de cultivo:
- Medio de maduración de ovocitos
porcinos (NCSU-37). Se prepara una solución stock de NCSU-37 de acuerdo con lo
descrito por Petters y Wells (1993) con agua
ultrapura. A continuación, se esteriliza por
filtración haciéndolo pasar a través de un
filtro de membrana (0’22 μm) y se conserva
en condiciones estériles a 4°C un máximo
de dos semanas.
Figura 2. Estudio de moléculas implicadas en la interacción espermatozoide-ovocito “oviductina” (Coy
et al., 2008).
En el día del uso, se añaden diferentes suplementos que deben prepararse
con agua purificada: Solución de eCG/hCG,
conteniendo 1000 UI/ml de cada hormona,
se añaden 10 μl de la solución a cada poci-
67
Ruiz López, S.
llo con 500 μl de NSCU-37. Dibutiril AMP cíclico (dbAMPc, 1 mM),
se añaden 10 μl a cada pocillo. `-mercaptoetanol (50 μM). Cisteína
(0’57 mM). Insulina (5 mg/l) y fluido folicular porcino (PFF, 10% v/v)
(Funahashi et al., 1997).
El PFF se obtiene por aspiración de folículos antrales (3-6 mm Ø)
de ovarios procedentes del sacrifico en matadero de hembras
prepúberes; el contenido folicular aspirado se centrifuga a 1500
g, 30 minutos a 4ºC. El sobrenadante se dispensa, previa filtración
a través de una serie de filtros con un poro de membrana de 0’8,
0’45 y 0’22 +m, este último de baja adsorción proteica, en alícuotas
de 1 ml, para proceder a su almacenamiento a -20ºC hasta su uso.
- Medio 199 modificado para fecundación in vitro de ovocitos
porcinos. Medio 199 con sales de Earle y L-glutamina, sin bicarbonato sódico. El TCM-199 se elabora en laboratorio con agua
ultrapura, se esteriliza mediante filtración y se conserva bajo condiciones estériles a 4°C un máximo de cuatro semanas.
- Medio TALP para fecundación in vitro de ovocitos porcinos
(Medio Fert-TALP). La solución stock de TALP se elabora en laboratorio con agua ultrapura. A continuación, se esteriliza mediante
filtración y se conserva bajo condiciones estériles a 4°C un máximo
de dos semanas. El medio TALP stock se suplementa con 3 mg/ml de
albúmina sérica bovina libre de ácidos grasos (BSA-FAF) y 0’12 mg/
ml de piruvato sódico, tal y como describen Rath et al. (1999). El pH
se ajusta hasta 7’4 en incubador al 5% de CO2, 38’5°C y atmósfera
saturada de humedad durante 3 h antes de su uso
- Medio de cultivo de embriones porcinos (NCSU-23). Se prepara según lo descrito por Petters y Wells (1993) con agua ultrapura.
A continuación, se esteriliza por filtración haciéndolo pasar a través
de un filtro de membrana con diámetro de 0’22 μm.
2. Obtención de ovocitos
Los ovarios procedentes de hembras prepúberes (90-100 Kg/pv)
se obtienen en la cadena de matadero y son transportados, en un
tiempo no superior a 60 minutos desde el sacrificio, al laboratorio
en un recipiente isotermo con solución salina a 38ºC. En el laboratorio, se retiran los restos de oviducto y se lavan en Cetab y solución
salina. Se seleccionan los ovarios con buen desarrollo folicular, desechando los que presentan cuerpos lúteos, formaciones quísticas o
morfología anormal (Fig. 3) Los ovarios seleccionados se mantienen
en solución salina en baño María a 38ºC hasta su procesamiento.
atrésicos y con diámetro aproximado entre 3-6 mm. El contenido
folicular se recoge en placas de Petri de 35 mm de diámetro sobre
placa calefactora, conteniendo medio PBSDm atemperado y suplementado con 1 mg de PVA. Mediante pipetas Pasteur estériles,
todo el contenido formado por fluido folicular, complejos cúmuloovocito y PBSDm se lleva a tubos estériles de 10 ml, donde se
dejan sedimentar (en placa calefactora) durante aproximadamente
10 minutos. Posteriormente, se elimina el sobrenadante mediante
decantación y el sedimento se vierte en placas de Petri con medio
PBSDm fresco atemperado.
Los COCs se seleccionan mediante estereomicroscopio a 20x y
se aspiran mediante pipetas Pasteur de vidrio (estiradas por calor
para reducir su grosor y con el extremo romo). La pipeta se conecta
a un tubo flexible de silicona, en el que se intercala un filtro para
impedir posibles contaminaciones. Solamente se deben seleccionar
para la posterior maduración, los COCs obtenidos antes de que
transcurran 2 h desde el sacrificio de los animales (Matás et al.,
1996), y con un citoplasma granulado y homogéneo, de aspecto
compacto y rodeado de al menos 3 a 4 capas de células del cúmulo.
3. Maduración (MIV)
Los ovocitos seleccionados para MIV se lavan una vez en PBS
atemperado y dos veces en medio NCSU-37, equilibrado previamente a 38’5ºC en incubador con 5% de CO2 y atmósfera saturada
de humedad durante aproximadamente 3 h.
Los ovocitos en grupos de 50 se cultivan en 500 μl de medio de
maduración NCSU-37 suplementado, durante un período de 20-22
h en incubador a 38’5ºC en atmósfera saturada de humedad y 5%
CO2. Pasadas 20-22 h de cultivo, los COCs se transfieren a placas
“multidish” de 4 pocillos con medio NCSU-37 sin hormonas ni
dbAMPc donde se lavan dos veces y se cultivan durante otras 20-22
h (Funahashi y Day, 1993).
4. Fecundación (FIV) de ovocitos porcinos
Los ovocitos, cultivados 40-42 h en el medio de maduración NCSU-37, se denudan de las células del cúmulo mecánicamente mediante ligeras aspiraciones con pipeta automática.
Posteriormente, se lavan 3 veces en medio TALP y se depositan en
grupos de 30-35 ovocitos en microgotas con 50 μl de medio de
FIV, equilibrado previamente a 38’5ºC y con 5% CO2 en incubador
y atmósfera saturada de humedad, cubiertas con aceite mineral en
placas de 4 pocillos.
Para la preparación de los espermatozoides, unos 100 μl de
semen criopreservado/descongelado se lavan tres veces en 10 ml
de PBSDm por centrifugación a 1900g x 3 min. Al finalizar los
lavados, se resuspende el sedimento resultante en medio de fecundación suplementado de forma que 50 μl de la resuspensión con
la concentración de espermatozoides deseada se adicionen a las
microgotas de medio con los ovocitos. Se utilizan de 1000 a 2000
espermatozoides por ovocito y un cocultivo de 2-4 horas (Fig. 4).
5. Cultivo de embriones porcinos
Figura 3. Ovario de cerda con folículos adecuados para la obtención de ovocitos.
Los complejos cúmulo-ovocito (COCs) se obtienen mediante
sección del ovario, con hoja de bisturí estéril, de folículos no
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Finalizado el tiempo de coincubación, los ovocitos se lavan
tres veces en medio de cultivo de embriones (NSCU-23 suplementado con 0’4% de BSA en gotas de 200 μl de medio cubiertas de
aceite mineral y se colocan en una placa “multidish” de 4 pocillos
para su desarrollo embrionario. En cada pocillo se incuban grupos
de 30-50 ovocitos en 500 μl de medio de cultivo de embriones
Fecundación IN VITRO en la especie porcina: Situación actual y perspectivas
cubierto por aceite mineral y equilibrado previamente 3 horas
en incubador a 38’5ºC, 5% CO2, 5% O2 y atmósfera saturada de
humedad. 18 horas después de la FIV, algunos ovocitos se fijan
y tiñen para valorar los parámetros de fecundación y el resto se
dejan en cultivo hasta un máximo de 9 días para analizar y valorar
el desarrollo embrionario.
6. Evaluación de resultados
6.1. Valoración de los parámetros de fecundación:
Parte de los ovocitos fecundados y cultivados in vitro se fijan
a las 16-18 horas post-fecundación y se tiñen para valorar los
parámetros de fecundación. Para ello, los ovocitos se lavan en
PBSDm, eliminándose mecánicamente el exceso de espermatozoides adheridos, y se colocan en microgotas del mismo medio (1
ovocito/microgota) en un portaobjetos, sobre el cual se colocan
previamente dos líneas paralelas de vaselina, depositando un total
de 10 ovocitos por portaobjeto. Inmediatamente, se coloca un
cubreobjetos sobre el porta, presionando suavemente hasta que
el cubre contacta con las microgotas. Los ovocitos son fijados en
etanol-acético (1:3, v/v) durante al menos 24 horas y teñidos con
colorante lacmoid u orceína (1%) para examen microscópico con
contraste de fases (objetivos de 40 y 20 x).
nº 30
nº 13
- Rendimiento o eficiencia de la fecundación: porcentaje de
ovocitos monospérmicos sobre el total de ovocitos analizados.
- Espermatozoides / ovocito: número medio de espermatozoides, en cualquier estadio de descondensación, por ovocito penetrado.
6.2. Valoración del desarrollo embrionario:
El resto de ovocitos fecundados y cultivados in vitro se dejan
en medio de cultivo de embriones para valorar su desarrollo
embrionario in vitro. En el día 5 de cultivo se suplementan los
pocillos de medio de cultivo con los embriones con un 10% de
suero fetal bovino.
Figura 5. Evaluación de FIV mediante fluorescencia (Hoestch). Ovocito monospérmico con dos pronúcleos (izquierda) y ovocito polispérmico con 3 pronúcleos
(derecha) (20 x).
Los embriones se evalúan a los 2, 7 y 9 días del cultivo,
mediante la visualización bajo estereomicroscopio (Fig. 6). Los
parámetros a evaluar son los siguientes:
- División (“cleavage”): porcentaje de ovocitos que a las 48 h.
de la fecundación están divididos en 2-4 células y que además
presentan apariencia normal y uniforme en cuanto a tamaño, forma y coloración oscura de cada una de las células.
Figura 4. FIV: adición de los espermatozoides a la microgota que contiene los
ovocitos.
Alternativamente a esta técnica de tinción, puede realizarse la
fijación y tinción empleando un fluorocromo (Hoestch). Se debe
trabajar con microscopio de fluorescencia excitando con una longitud de onda de 495 nm. Esta técnica tiene como inconveniente
el que la membrana nuclear no es visible y que no se pueden distinguir claramente si los espermatozoides compactos están en el
interior o fuera del ovocito. Como ventajas podemos destacar, que
es una técnica más rápida y limpia que la anterior y la visualización
de los pronúcleos resulta muy evidente (Fig. 5).
- Blastocistos: porcentaje de ovocitos en alcanzan el estadio
de blastocisto a las 144-168 h, considerando sólo aquellos embriones en estadio de blastocisto temprano, expandido o eclosionado, que presentan un forma y coloración oscura adecuada y
además con masa celular interna visible.
- Eclosionados: porcentaje de blastocistos eclosionados el día
9 de cultivo con respecto al total de blastocistos evaluados el día
7 de cultivo.
Los parámetros de fecundación a evaluar son los siguientes:
- Ovocitos penetrados: porcentaje de ovocitos madurados nuclearmente (en metafase II) que son penetrados por 1 ó mas espermatozoides. Un ovocito se considera penetrado cuando se observan
en su interior los dos corpúsculos polares, el pronúcleo femenino,
cabezas espermáticas descondensadas con sus correspondientes
flagelos espermáticos y/o pronúcleos masculinos.
- Ovocitos monospérmicos: porcentaje de los ovocitos que presentan un pronúcleo femenino, una cabeza espermática descondensada con su flagelo o un pronúcleo masculino y los dos corpúsculos polares sobre el total de ovocitos penetrados.
Figura 6. Embriones porcinos in vitro en diferentes fases de desarrollo.
69
Ruiz López, S.
6.3. Resultados esperados:
- Ovocitos penetrados: 60-80%
- Ovocitos monospérmicos: 50-60%
- Eficiencia de la fecundación: 35-40%
- Espermatozoides/ovocito: 1’2-1’6
- Divididos: 40%
- Blastocistos: 20-25%
- Eclosionados: 2-5%
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