Biotecnología de Alimentos y Medicamentos

INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOTECNOLOGICAS
UNIVERSIDAD DE SAN MARTIN
BIOTECNOLOGIA DE
MEDICAMENTOS Y ALIMENTOS
GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS
Biotecnología de Alimentos y Mmentos
CLASES
Clases Teóricas: Miércoles de 14 a 16.30; Viernes de 17.30 a 19.30
Trabajos Prácticos: Miércoles de 8.30 a 13
Docentes:
Dr. Pablo Nikel
JTP: Dra. Marcela Brocco
Silvina Rosa
Virginia Tribulatti
Juan Burdiso
Claudia Hermann
María Ana Meira
Soledad Guidolín
Raúl Cosentino
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Biotenología de Medicamentos y Alimentos
Biotecnología de Alimentos y Medicamentos
Cronograma de clases teóricas 2010
Fecha
Marzo
Docente
Miércoles 10
Viernes 12
Pablo I. Nikel
Miércoles 17
Viernes 19
Miércoles 24
Viernes 26
Miércoles 31
Pablo I. Nikel
Abril
Pablo I. Nikel
Miércoles 14
Viernes 16
Miércoles 21
Viernes 23
Miércoles 28
Viernes 30
Silvina M. Rosa
Pablo I. Nikel
Nancy I. López
Pablo I. Nikel
Mayo
Pablo I. Nikel
Viernes 14
Miércoles 19
Viernes 21
Miércoles 26
Viernes 28
Formulación de medios de cultivo industriales.
Fuentes de carbono utilizadas en medios de cultivo
industriales. Aditivos de bajo costo. Inóculos.
Transferencia de masa y energía en biorreactores.
Ciclo de seminarios I.
Utilización industrial de algas. Aceite unicelular y
otras aplicaciones. Fotobiorreactores.
Herramientas para la optimización racional de
bioprocesos: producción heteróloga de polihidroxialcanoatos bacterianos como ejemplo.
Enzimas y microorganismos extremófilos.
Ciclo de seminarios II.
Primer examen parcial
Miércoles 5
Viernes 7
Miércoles 12
Introducción. Definiciones y conceptos importantes.
Historia e hitos en Biotecnología. Impacto de la
Biotecnología en la sociedad.
Revisión de conceptos básicos de metabolismo
microbiano. Metabolismo primario y secundario.
Cinética del crecimiento microbiano. Sistemas de
cultivo: en lote, lote alimentado y continuo.
Relaciones
estequiométricas,
rendimiento
y
productividad.
Termodinámica del crecimiento microbiano. Modelos
metabólicos sencillos y balances. Nociones de
Ingeniería metabólica.
Feriado
Libre
Diseño de fermentadores. Concepto de escala.
Descripción matemática y aplicaciones.
Feriado
Viernes 2
Miércoles 7
Viernes 9
Tema
Sergio Angel
M. Julia Pettinari
Pablo I. Nikel
Producción industrial de ácidos orgánicos.
Producción industrial de bioetanol. Producción
industrial de biomasa de levadura.
Obtención de antibióticos.
Utilización de sistemas recombinantes para la
producción de proteínas recombinantes.
Obtención de bioproductos reducidos utilizando
mutantes regulatorias de Escherichia coli.
Análisis de flujos metabólicos como herramienta
relevante en Biotecnología. Metodologías.
Análisis de flujos metabólicos. Aplicaciones.
Biotenología de Medicamentos y Alimentos
Junio
Miércoles 2
Viernes 5
Miércoles 9
Viernes 12
Miércoles 16
Viernes 19
Miércoles 23
Edgardo O.
Albertó
Fermentación en estado sólido.
Cultivo de hongos comestibles.
Pablo I. Nikel
Ciclo de seminarios III y IV.
Gustavo Curutchet Biorremediación y tratamiento de efluentes.
Pablo I. Nikel
Procesamiento industrial ʻaguas abajoʼ. Escalado.
Gustavo Curutchet Biorremediación y tratamiento de efluentes.
Segundo examen parcial
Biotecnología de Alimentos y Medicamentos
Programa teórico 2010
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Unidad I. Biotecnología: definiciones básicas e hitos históricos en el desarrollo de
las disciplinas asociadas a la Biotecnología. Disciplinas y campos de actividad. Tecnologías
concurrentes y vinculación con disciplinas básicas. Impacto económico (mercados, productos
y perspectivas regionales de desarrollo). Estado actual en el mundo, la región y el país.
Prioridades en Biotecnología.
Unidad II. Metabolismo, cinética y termodinámica del crecimiento microbiano.
Anabolismo y catabolismo. Metabolismo microbiano primario y secundario. Conversión del
sustrato en biomasa, energía y productos del metabolismo celular. Fases en la curva de
crecimiento y velocidad específica de crecimiento. Cinética de formación de productos y
utilización de sustrato. Productividad y rendimiento. Ecuación de Monod y cinética
enzimática. Sistemas de cultivo: en lote, lote alimentado y continuo. Ecuaciones de balance
de masa. Análisis energético y termodinámico del crecimiento microbiano. Análisis de
consistencia. El modelo metabólico de caja negra. Balances estequiométricos y de grado de
oxidación/reducción. Balance de generación de calor. Sistemas sobre-determinados.
Nociones de Ingeniería metabólica y su aplicación para el diseño racional de bioprocesos.
Unidad III. Fermentadores y sistemas de cultivo. Características generales de las
fermentaciones confinadas. Condiciones físico-químicas necesarias para el crecimiento
microbiano. Fermentaciones sumergidas y utilizando sustratos sólidos. Fermentadores:
diseño, operación y control. Modos operacionales y sus aplicaciones. Cultivos de alta
densidad celular. Requerimientos en los biorreactores utilizados para el cultivo de células de
mamífero y células vegetales. Operaciones unitarias. Operaciones monosépticas:
esterilización y limpieza in situ de biorreactores. Condiciones técnico-económicas para el
desarrollo de fermentaciones industriales. Sistemas de control y bioseguridad. Sensores y
monitoreo en línea. Formulación de medios de cultivo compatibles con la producción a escala
industrial. Selección de componentes y aditivos de bajo costo. Requerimientos especiales
para el cultivo de células de mamífero. Preparación de inóculos.
Unidad IV. Transferencia de masa y energía. Mezclado y heterogeneidad en
fermentaciones industriales. Fuerzas de corte. Adición de oxígeno y eliminación de dióxido
de carbono en fermentaciones aeróbicas. Coeficientes de difusión. Transferencia de masa
gas-líquido: el concepto de kLa. Metodologías para la determinación de la velocidad de
transferencia de oxígeno. Generación de sub-productos. Sistemas no ideales: comportamiento
de las dispersiones. Disipación de calor y control de la temperatura.
Unidad V. Aplicaciones biotecnológicas de las algas. Características generales de la
fisiología, bioquímica y filogenia de algas relevantes en la industria. Cultivo masivo de algas.
Fotobiorreactores: características generales, ventajas y desventajas de su utilización.
Productos de interés a partir de algas: aceite unicelular como ejemplo. Producción industrial
de ácido docosa-4:7:10:13:16:19-hexaenoico (DHA) utilizando microalgas del género
Auriantiochytrium. Optimización de las condiciones de crecimiento y acumulación de DHA.
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Unidad VI. Metodologías para el diseño racional y mejoramiento cuantitativo de
bioprocesos. Estrategias clásicas, de Ingeniería Genética y de Ingeniería Metabólica para la
manipulación y mejora de bioprocesos. Obtención y utilización de mutantes con propiedades
modificadas para su aplicación industrial. Mutantes regulatorias. Manipulación del
metabolismo redox y catabolismo de carbono. Estrategias del tipo un factor a la vez.
Metodologías de optimización evolutiva. Diseños experimentales estadísticos, metodología
de superficies de respuesta y redes neuronales artificiales.
Unidad VII. Tecnología enzimática y aplicaciones industriales de las enzimas.
Enzimas: generalidades. Microorganismos como fuentes de enzimas. Utilización de enzimas
aisladas como biocatalizadores: amilasas, proteasas y lipasas. Otras enzimas bacterianas.
Utilización industrial de las enzimas. Campos de aplicación, mercados e importancia
económica. Enzimas inmovilizadas. Métodos para la inmovilización de enzimas y sus
ventajas. Organismos extremófilos y Biotecnología. Características de algunos
microorganismos extremófilos: termófilos, acidófilos, alcalófilos, etc. Enzimas provenientes
de organismos extremófilos y sus aplicaciones.
Unidad VIII. Ácidos orgánicos. Producción industrial de ácidos orgánicos.
Aplicaciones y estado del mercado mundial. Microorganismos productores y secretores de
ácidos orgánicos. Producción biotecnológica de ácido cítrico. Características fisiológicas,
bioquímicas y morfológicas de algunos microorganismos productores de ácido cítrico:
Aspergillus niger como ejemplo. Factores que afectan la producción en cultivos industriales.
Elección del sistema de cultivo. Características físico-químicas y nutricionales del medio de
cultivo e influencia de cationes metálicos divalentes. Tratamiento de sustratos complejos para
la producción biotecnológica. Metodologías para separación y purificación del producto.
Unidad IX. Aplicaciones de las levaduras en Biotecnología. Levaduras de interés
industrial: Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris y levaduras no convencionales. Cepas
industriales y de laboratorio: obtención utilizando metodologías clásicas y de ADN
recombinante. Estabilidad genotípica y fenotípica. Procesos y materias primas utilizados para
la obtención de biomasa de levadura para panificación. Propiedades metabólicas durante la
fermentación aeróbica y anaeróbica: el efecto Crabtree y el efecto Pasteur. Sub-productos y
procesamiento ʻaguas abajoʼ . Osmotolerancia, tolerancia a etanol y ácidos orgánicos.
Resistencia al estrés. Aplicaciones de levaduras en la industria enológica.
Unidad X. Antibióticos. Revisión del metabolismo microbiano primario y
secundario. Cinética de formación de productos. Tipos de antibióticos y sus mecanismos de
acción. Regulación de la biosíntesis y su impacto en las tecnologías de producción.
Biosíntesis de antibióticos en Streptomyces y Penicillium. Manipulación de cepas en el
laboratorio y su aplicación en procesos industriales: sistemas de cultivo y utilización de
materias primas de bajo costo. Purificación. Clonado de genes que dirigen la síntesis de
antibióticos. Nuevos antibióticos.
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Unidad XI. Producción de proteínas recombinantes en distintos sistemas de
expresión. Vectores de expresión en procariotas. Características de diferentes cepas
bacterianas para optimizar la producción de proteínas recombinantes. Protocolos para
resolver algunos de los problemas comunes encontrados durante la expresión y purificación
de proteínas recombinantes. Clonado y vectores de levaduras. Transformación de
Saccharomyces cerevisiae. Expresión y purificación de proteínas recombinantes en
levaduras. Expresión de proteínas heterólogas en plantas. Métodos de transformación.
Vectores virales y amplicones. Expresión de proteínas en células de mamíferos. Vectores y
clonado. Aplicaciones biotecnológicas.
Unidad XII. Análisis de flujos metabólicos como herramienta relevante en
Biotecnología. Integración de los conceptos de genómica, transcriptómica, proteómica y
metabolómica. Análisis de flujos metabólicos estequiométrico (balance de flujos). Modelos
metabólicos matemáticos. Alcances y limitaciones. Funciones de ajuste: crecimiento y
generación de energía. Análisis de flujos metabólicos basados en marcación isotópica.
Solución a las limitaciones impuestas por el modelo estequiométrico. Metodologías para la
marcación. Marcación radioactiva: experimentos de pulso. Marcación isotópica no radiactiva:
sustratos conteniendo 13C. Isotopómeros posicionales y de enriquecimiento. Matrices de
mapeo atómico. Metodologías de derivatización de metabolitos y detección (cromatografía de
gases acoplada a espectrometría de masas y resonancia magnética nuclear). Integración de los
datos experimentales in silico. Funciones de ajuste y criterios de convergencia. Interpretación
fisiológica de los resultados.
Unidad XIII. Fermentación en estado sólido y cultivo de hongos comestibles.
Fermentación sólida (FES): sustratos empleados, pre-tratamientos y microorganismos
involucrados. Propiedades de los hongos que favorecen el uso de FES. Biorreactores,
clasificación y tipos. Medición de biomasa. Aplicaciones de FES. Ventajas y desventajas.
Comparaciones entre FES y fermentación líquida. Cultivo de hongos comestibles: producción
de alimentos en FES. Especies mundialmente cultivadas. Propiedades nutritivas y
medicinales de los hongos comestibles. Etapas del cultivo. Obtención de cepas. Factores a
considerar para la selección y evaluación de cepas. Sustratos no compostados y compostados:
formulación, tratamiento térmico, siembra, incubación y producción. Mecanismos de
inducción. Salas de producción y control del medio ambiente. Ventilación y control de CO2.
Cultivo de Pleurotus en sustrato no compostado y de Agaricus bisporus en sustrato
compostado. Principales diferencias en las metodologías. Producción de Lentinula edodes en
troncos.
Unidad XIV. Procesamiento industrial ʻaguas abajoʼ y escalado. Separaciones
sólido-líquido. Centrifugación. Filtración: filtros de presión reducida (o vacío), micro- y
ultra-filtración. Ruptura celular y recuperación de productos. Precipitación. Separaciones
líquido-líquido. Aplicación de técnicas cromatográficas para separación y purificación de
productos de interés biotecnológico. Metodologías para el secado y formulación de productos
sólidos. Tratamiento de efluentes y biorremediación. Ejemplos prácticos. Factores limitantes
para el escalado de bioprocesos. Criterios para el salto de escala: igualdad en el consumo de
energía, en la transferencia de oxígeno, en el tiempo de mezclado y en la velocidad de los
agitadores.
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Biotecnología de Alimentos y Mmentos
Bibliografía básica de Biotecnología
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Bains W. (1993). Biotechnology from A to Z. IRL Press, Oxford.
Baltz RH, Hegeman G, Skratud PL (1993). Industrial Microorganism, Basic and
Applied Molecular Genetics. ASM Press.
Debergh P, Zimmerman R (Eds.) (1991). Micropropagation: Technology and
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Demain A (1984). Biology of Industrial Microorganisms. Addison-Wesley, USA.
Demain A, Solomon N (1986). Manual of Industrial Microbiology and
Biotechnology. ASM Press, Washington DC, USA.
Demain A, Davies J (Eds. in chief) (1999). ). Manual of Industrial Microbiology and
Biotechnology 2nd Ed. ASM Press, Washington DC, USA.
Franks F (1993). Protein Biotechnology. Isolation, Characterization and
Stabilization. Human Press Inc., NY, USA.
Glazer A, Nikaido H (Eds.) (1995). Microbial Biotechnology. WH Freeman & Co.,
USA.
Glick B, Pasternak J (1994). Molecular Biotechnology. ASM Press, Washington DC,
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Hui Y, Kachaturian G (Eds.) (1994). Food Biotechnology Microorganisms. VCH
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Moses V, Moses Sh (1995). Exploiting Biotechnology. Harwood Acad. Publichers
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Peters JH, Baumgarten H (Eds.) (1992). Monoclonal Antibodies. Springer Verlag,
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Sheehan D (Ed.) (1997). Bioremedaition Protocols. Humana Press, NJ, USA.
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Wang D (Ed. in chief) (1979). Fermentation and Enzyme Technology. Wiley &
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Woodward J (Ed.) (1985). Inmobilized Cells and Enzymes. A Practical Approach.
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Publicaciones en Biotecnología
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Applied Microbiology & Biotechnology. Springer Verlag.
Bio-Biotechnology. Nature Publishing Co. NY, USA.
Biotechnology & Bioengineering
Biotechnology Progress
Biotechnology Newswatch. McGraw Hill Inc. NY, USA.
Critical Reviews in Biotechnology
Genetic Engineering and Biotechnology. Emerging Technology Series. United
Nations Industrial Development Organization.
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Biotecnología de Alimentos y Mmentos
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Trends in Biotechnology
Trends in Food Science & Technology. Elsevier Science Publ. Ltd. NY USA.
Journal of Agricultural and Food Chemistry
Journal of Food Science
Journal of Pharmaceutical Science
Journal of th Science fo Food and Agricultural
Nature Biotechnology
Algunas de estas publicaciones pueden ser consultadas en la biblioteca del INTI.
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Biotecnología de Alimentos y Mmentos
PREPARACIÓN DE INFORMES
¿Por qué preparar informes?
El proceso de descubrimiento científico depende de una correcta y eficiente
comunicación entre los actores involucrados, es decir los investigadores. Este flujo de
información ocurre en su mayor parte mediante los periódicos científicos (journals) y
forma parte integral del proceso que mencionamos anteriormente. Es por ello muy
importante aprender las reglas y costumbres que se utilizan en la comunicación escrita
entre científicos. La elaboración de informes es una etapa importante en el aprendizaje
de la comunicación escrita que ocurre no sólo en la ciencia básica, sino también en la
ciencia aplicada donde es habitual la elaboración de informes dentro de las compañías o
como resultado de análisis.
Por tanto, no sólo el contenido de los informes, sino también la claridad,
gramática, ortografía como así también la estructura, el formato y la presentación del
texto serán evaluados en cada informe.
A continuación se detallan algunas normas que sirven como referencia para
escribir informes. Esta lista no pretende ser extensiva sino sólo una guía de ayuda.
Estructura de un informe
Cuando hablamos de estructura podemos mencionar dos conceptos diferentes, la
estructura formal, que consta de las secciones en que se divide el informe y la estructura
lógica que es la manera en que organizaremos la presentación de los datos siguiendo una
secuencia lógica. La primera es relativamente fácil conocerla y no tenemos más que
seguir las instrucciones para autores que nos brindan todos los periódicos científicos. La
segunda es más difícil, es donde no existen reglas específicas sino más bien generales:
como claridad, precisión lógica y orden. Allí es donde más esfuerzo y trabajo debemos
invertir para que el informe sea legible. Puesto que por más que sigamos las reglas de la
estructura formal pero sin contenido, el informe es absolutamente irrelevante.
A continuación y a modo de instrucciones para autores se describe la estructura
formal que debe contener al informe a presentar.
A. El informe se debe presentar en forma claramente legible, con información muy
precisa y ordenada, utilizando tercera persona (en algunas ocasiones se puede utilizar
la primera persona del plural). No debe extenderse en temas irrelevantes. Tendrá un
mínimo de 2 páginas y un máximo 4 páginas. Todas las páginas deben estar
numeradas.
B. El informe (que constará de gráficos y/o figuras) tiene que ser editado con un
procesador de texto, corregido (la mayoría de los procesadores tiene corrector
ortográfico, ¡úselo!) e impreso con calidad y tamaño de letra aceptable. Es decir usar
letra de 10 a 12 puntos.
C. El informe debe contener las siguientes partes:
1- Encabezamiento: Este incluye el título del T. Práctico y nombre del alumno,
asi como el año y nombre de la materia.
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Biotecnología de Alimentos y Mmentos
2- Introducción: Debe contestar la siguiente pregunta: ¿cuál es el tema?
Consiste en una explicación del trabajo a realizar y una presentación de los principales
antecedentes bibliográficos. La intención de escribir la introducción es situar el tema en
perspectiva y permitir la comprensión de los resultados y discusión que se escriben a
continuación. Es fundamental comprender que no debe incluir temas no relacionados
con el objetivo del trabajo, para facilitar la compresión de los resultados y la discusión.
Debe incluir citas bibliográficas y debe indicarse el fundamento del/los método(s)
empleado(s) ¿Qué se mide? ¿Cómo se mide?. La extensión debe ser alrededor de una
página.
3- Objetivo: Corresponde la definición de las metas y logros a alcanzar en el
proyecto, especificando el marco del tema y las consideraciones ó simplificaciones a
realizar.
4- Metodología: Debe indicarse los distintos tipos de materiales y
procedimientos experimentales utilizados. Esta sección constituye una enumeración de
los pasos del procedimiento o un esquema del mismo.
5- Resultados: Se deben presentar los resultados resumidos. Por un lado, se
exponen los datos experimentales (cuadros, tablas, etc.) y se realiza un breve
comentario, si fuera necesario, de las observaciones cualitativas de los ensayos
realizados. La segunda parte se conforma con los cálculos de resultados (reglas de tres
explicitadas). En caso de instrumentos controlados por computadora inserte las imágenes
o datos en el informe.
Los resultados deberán estar indicados con las unidades correspondientes y el
correcto número de cifras significativas. Cuando se crea conveniente, indicar los
principales errores y confiabilidad de los resultados reportados.
Tablas: es la forma más habitual de presentar los datos, permite describir datos
paralelos en forma concisa. La tabla no debe estar sobrecargadas de líneas y debe estar
contenida en una página. Lo óptimo es presentar los datos es en forma de columnas. Se
debe incluir las unidades utilizadas en la medición, el lugar más habitual es a
continuación del título de la columna de datos, entre paréntesis. Todos los datos de la
tabla deben estar completos, en caso de carecer del dato correspondiente se debe incluir
el texto NR (no realizado) o NA (no aplicable) o ND (no detectado). Al pie de tabla se
debe aclarar el significado de esta abreviatura. La tabla debe tener un titulo acorde asi
como un número de acuerdo al orden de aparición en el informe. Este número sirve para
hacer referencia en el texto. Al pie de tabla se debe incluir una leyenda conteniendo las
abreviaturas utilizadas, así como una corta referencia metodológica que permita
comprender la misma.
Gráficos: Existen, básicamente, tres tipos de gráficos: de línea, de barra y tortas;
los últimos no son utilizados con frecuencia en la literatura de bioquímica y biología
molecular. En tanto que los dos primeros son muy comunes. El gráfico de línea es
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Biotecnología de Alimentos y Mmentos
utlizado para presentar una línea de tendencia, o cambio de estado, en función de una
variable continua. También se lo utiliza para mostrar la dependencia entre dos variables.
Debe incluir un título y un número de gráfico que permita referirlo cuando se escribe.
Siempre debe incluir los títulos de los ejes, asi como las unidades de medición a
continuación del mismo, entre paréntesis. Incluir los errores de los datos mediante barras
asociadas a cada punto. La leyenda debe incluirse en el texto al pie de la figura, así como
una breve referencia metodológica que permita su interpretación. Los gráficos de barras
se utilizan para mostrar datos groseros o cambios de estado en función de variables
discontínuas, las reglas son las mismas que para el gráfico de líneas.
Decidir la forma de presentación de los datos, barras, lineas o tablas, es parte del
trabajo de elaboración de un informe. Para elegir entre las tres formas hay que utilizar
criterios de claridad y lógica.
6- Discusión: Consiste en un análisis crítico del trabajo realizado, incluyendo un
análisis de los errores cometidos durante la experiencia. Comparar los valores de las
variables de operación, coeficientes, rendimientos, etc., con los antecedentes obtenidos
de la literatura. También se pueden incluir recomendaciones o sugerencias para futuras
experiencias. Se suelen incluir referencias bibliográfias que situan los resultados en el
contexto del conocimiento actual. Es muy importante aprender a distinguir cuando se
menciona un resultado, dato objetivo obtenido por mediciones o cálculos, y la discusión
correspondiente, elaboración personal que brinda una interpretación del resultado. Esta
diferencia debe estar reflejada en las secciones resultados y discusión.
7- Conclusiones: En esta sección se presentan en forma resumida las diversas
deducciones que se originan del trabajo realizado, respaldadas por los resultados
obtenidos y en concordancia con los objetivos planteados. Lo óptimo es enumerar las
distintas conclusiones mediante una lista de puntos o ítems.
8- Bibliografía: Las referencias a la bibliografía se anotan en el texto del
informe con un número entre paréntesis, el que corresponde al orden indicado en la
sección de bibliografía.Las referencias bibliográficas son de dos tipos: las de revistas
científicas y las de libros.
Revistas: autores (año) titulo del artículo. Journal, volumen, páginas. Ejemplo:
Tugendreich, S., Bassett, D.E.,Jr, McKusick, V.A., Boguski, M.S. and Hieter,P. (1994)
Genes conserved in yeast and humans. Hum. Mol. Genet., 3, 1509-1517.
Libros: autores (año) título del capítulo editor, título del libro. nombre y
dirección de la editorial, volumen, páginas. Ejemplos:
Gehring, W. (1994) A history of the homeobox. In Duboule, D. (ed.), Guidebook to the
Homeobox Genes. Oxford University Press, Oxford, UK, pp. 1-10.
Lewin, B. (1994) Genes V. Oxford University Press, Oxford, UK.
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Biotecnología de Alimentos y Mmentos
La producción de un texto científico
En un texto científico, buscamos información, no belleza literaria por lo que los datos
tienen que ser claramente expuestos. Sin embargo, es importante que haya un hilo
conductor a lo largo de todo el texto para poder contar una historia. Pese a tratarse de
textos científicos, el texto tiene que ser entendido por personas que no manejan el tema.
Además, quiénes leen los textos no son necesariamente expertos en el tema pero sí
necesitan comprender lo que queremos comunicarle.
He aquí una lista de los principales ítems a tener en cuenta al momento de producir un
texto científico (informes, papers, exámenes, etc.).
Optar por la voz activa. Es más directa y vigorosa, además las oraciones en voz
activa son más breves que las escritas en voz pasiva.
Para compensar la concentración de sales en el agua, los sulfatos fueron
adicionados 24 h después del tratamiento.
Para compensar la concentración de sales en el agua,
sulfatos 24 h después del tratamiento.
adicionamos los
En este experimento, las ratas fueron entrenadas para evitar la descarga de
corriente. La descarga de corriente fue asociada con estímulos diversos (por los
animales).
En este experimento, las ratas fueron entrenadas para evitar la descarga de
corriente. Los animales asociaron la descarga de corriente con estímulos diversos.
Sin embargo, la voz pasiva tiene su lugar y es adecuado usarla cuando corresponde:
ƒ Cuando se sobrentiende quién es el sujeto a partir del contexto:
Para este experimento, las ratas fueron entrenadas para evita la descarga de corriente.
[El contexto deja claro que los investigadores entrenaron a las ratas.]
ƒ Cuando el sujeto es desconocido:
La galaxia fue mencionada por primera vez en la antigüedad.
[No sabemos quién mencionó la galaxia.]
ƒ Cuando el sujeto es menos importante que la acción:
El paciente fue llevado rápidamente al hospital por la policía.
ƒ
Cuando mencionar al sujeto puede resultar inconveniente, peligroso o
inapropiado.
Su contrato no ha sido renovado
[Podría no ser apropiado decirle quién no le renovó el contrato.]
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Biotecnología de Alimentos y Mmentos
Limitar el uso del verbo ser. Cuando un texto abunda en este verbo resulta
débil. Las oraciones que no lo incluyen genera un texto más directo y preciso.
Este mecanismo es un factor importante para el entendimiento de las infecciones
citomegalovirales en el cerebro.
Este mecanismo explica cómo el citomegalovirus infecta el cerebro.
EPO es el principal factor de crecimiento para el crecimiento, proliferación
diferenciación y supervivencia de los precursores de glóbulos rojos.
El factor de crecimiento EPO permite que los precursores de glóbulos rojos
crezcan, proliferen, se desarrollen y sobrevivan.
La amígdala es la principal estructura del sistema límbico y funciona en la
regulación de la memoria emocional.
La amígdala, la principal estructura del sistema límbico, regula la memoria
emocional.
Evitar el uso de sustantivos derivados de verbos, tales como los terminados en
–ión (regulación, formación), -miento (funcionamiento, requerimiento), -encia
(dependencia, resistencia). En su lugar, usar los verbos correspondientes para
obtener una escritura más clara y precisa.
Este estudio es el resultado de la investigación de estos fenómenos usando
movimientos pasivos.
Investigamos estos fenómenos usando movimientos pasivos.
Concluimos que el interferón gamma produce la activación microglial y podría
tener un papel significativo en los cambios en la plasticidad sináptica relacionados con la
edad.
Concluimos que el interferón gamma activa la microglía y...
Comenzar las oraciones con la información conocida. Finalizarlas con lo
novedoso, con la información que los lectores no podrían anticipar.
Estos factores derivados del órgano blanco contribuirían a la formación de árboles
de neuronas pontinas complejos en la corteza cerebelar.
En la corteza cerebelar, estos factores derivados del órgano blanco
contribuirían...
La idea de reemplazar las neuronas colinérgicas dañadas en la enfermedad de
Alzheimer con terapia de neuroreemplazo con células madre es atractiva.
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Biotecnología de Alimentos y Mmentos
En pacientes con enfermedad de Alzheimer, la terapia con células madre
permitiría reemplazar las neuronas colinérgicas dañadas.
Evitar las frases con demasiados sustantivos y adjetivos seguidos, confunde y
hace que el texto sea aburrido. El lector se pierde antes de llegar al verbo que le
dará la idea de lo que se quiere expresar.
La disfunción cognitiva post-operativa es común en pacientes ancianos y ha sido
atribuida a la anestesia general.
Frecuentemente, pacientes ancianos sometidos a anestesia general
experimentan disfunción cognitiva.
Una activación talámica ipsilateral significativa fue observada con la estimulación
dolorosa en estudios previos de PET.
Los estímulos dolorosos activan el tálamo ipsilateralmente en forma
significativa.
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Biotecnología de Alimentos y Mmentos
LIDIANDO CON EL SAA EN SCIENCE
William D. Romey. East Orleans, MA USA.
Science (1999) 293: 1067
Por más de treinta años, he leído regularmente la revista Science y finalmente he
decidido protestar contra el síndrome de abuso de abreviaturas (SAA). Como la mayoría
de mis ocupados colegas, dispongo de poco tiempo para leer artículos por lo que tengo
un sistema de lectura acelerada que consiste en una mirada rápida (MR) inicial al
artículo en el siguiente orden: título, resumen, primer párrafo (PP), títulos destacados en
negritas (TDN), figuras y leyendas (FL) y el último párrafo (UP), con algunos vistazos
al cuerpo del artículo (CA) para ver si hay algo que me llame la atención. Si esta lectura
rápida atenta (HRA) me indica que puede haber algo de interés, leo el trabajo más en
detalle.
Días atrás, leía un artículo y un TDN me llamó la atención: “El LGS y la deglaciación”.
No recordé inmediatamente qué significaba LGS y tuve que leer el resumen para
decodificar la abreviatura. Líneas más abajo, leí sobre concentraciones Cl- y NO3- en el
LGM. Es esperable que -si estoy leyendo Science, sin importar mi área- recuerde los
símbolos de los elementos de la tabla periódica (TP). Sin embargo en el CA, me topé
con la DCR, el YD y el GISP. El artículo era de un área de la geología, muy relacionada
con mi propio trabajo, sin embargo me sentí muy molesto pues el SAA me había
forzado a salirme de mi habitual HRA y a leer varios párrafos en busca de los
significados de estas abreviaturas. De igual manera, las FL me llevaron al texto para
decodificarlas.
Preguntándome si el SAA era un problema particular de AG, miré artículos de otras
áreas. Allí también el SAA impidió que llevara a cabo mi HRA. Aunque se habla mucho
por estos días de la literatura científica (LC), el problema del SAA parece ser aceptado,
aceptando textos de aquellos especialistas que continúan expresándose con sus colegas
mediante códigos oscuros...
Moraleja:
No incluir abreviaturas en títulos y resúmenes.
Usar solo las necesarias y aclararlas en el texto la primera vez que aparecen.
Si el texto excede las 2-3 carillas, incluir una lista de las abreviaturas al pie de la
primera carilla.
12
Biotecnología de Alimentos y Mmentos
PREPARANDO UN RESUMEN
Existe cada vez más bibliografía disponible, con lo cual no es posible leer todos los
artículos de una disciplina particular, y por supuesto, es imposible escuchar todas las
conferencias de un congreso multitudinario. Por eso, usamos los resúmenes para
decidirnos acerca de cuál artículo leer o cuál conferencia escuchar. La búsqueda
bibliográfica se ha facilitado desde la aparición de PubMed y de los libros de resúmenes
de los congresos, por ello la confección de los resúmenes es de crucial importancia. El
resumen es la unidad básica de comunicación. Se usa como carta de presentación para
la mayoría de las actividades: manuscritos, pedidos de subsidios, congresos, tesis,
informes, etc.
¿Por qué es esencial que los resúmenes sean fáciles de entender? Porque eso incrementa
las posibilidades de ser leídos (o que alguien escuche la conferencia de uno). En unas
cuantas oraciones, los resúmenes deben indicar explícitamente el objetivo del
trabajo, cómo se hicieron los experimentos, los resultados más importantes y su
importancia. Un título específico e informativo también resulta un incentivo para el
potencial lector y/o oyente. El resumen es para el éxito de un manuscrito desde el
momento que es enviado a la revista. Muchas veces, la primera impresión que causa el
resumen en el editor le sirve para tomar la decisión de enviarlo a revisión o no. De
manera similar, un revisor puede decidir revisarlo o no, dependiendo del resumen. Este
tipo de impresiones no siempre son correctas, pero un resumen mal escrito, usualmente,
es indicativo de un artículo deficiente. Por otro lado, un muy buen artículo puede pasar
desapercibido, si el resumen no está bien escrito.
A continuación, una guía para la escritura de un resumen:
¾ Usar un título específico e informativo pero que sea llamativo.
¾ Informar solo uno o dos resultados por resumen.
¾ Usar oraciones en voz activa y limitar el uso del verbo estar.
¾ Evitar detalles innecesarios en materiales y métodos y resultados.
¾ Limitar el uso de la estadística.
¾ Evitar el uso de abreviaturas (excepto para los términos comunes).
¾ Excluir las referencias.
¾ Respetar el límite del número de palabras (usualmente 200-300).
¾ Pedirle a alguien que trabaje fuera del tema que lea el borrador.
13
Biotecnología de Alimentos y Mmentos
Problemas
1.
¿Cuál será el % p/v de una solución que presenta 45 g de triptona disueltos en
240 ml de solución?
2.
¿Cuántos gramos de solución al 15 % p/p de glucosa se necesita para tener 39 g
de glucosa?
3.
¿Cuántos gramos de agua deberán usarse para disolver 150 g de NaCl de modo
de obtener una solución al 20% p/p?
4.
¿Cuántos ml de acetona se deben agregar a 250 ml de agua para que la solución
resulte al 10 % v/v?
5.
p/v?
¿Cuántos gramos de Ca(NO3)2 están contenidos en 75 ml de solución al 25 %
6.
¿Cuántos ml de acetona se debe agregar a 300 ml de agua para que la solución
resulte al 5 % v/v?
7.
¿Cuántos ml de metanol se debe agregar a 250 ml de agua para que la solución
resulte al 15 % v/v?
8.
Calcular el % p/p de una solución que contiene 7,5 g de NaNO3 en 150 g de
agua.
9.
¿Cuál es la cantidad de Na2HPO4 necesaria para preparar 130 ml de solución al
3 % p/v.
10.
Un frasco de laboratorio tiene escrito un rótulo con 10,0 M NaOH. (PM 40)
¿Cuántos gramos de NaOH hay contenidos en 0.2 l de solución?
11.
¿Cuál es la molaridad de una solución que se prepara disolviendo 18,56 g de
KOH (PM 56) en 100 ml de solución?
12.
¿Cuál es la molaridad de una solución preparada por solución de 20 g de
Na2CO3 (PM 106) en cantidad suficiente de agua para hacer 600 ml de solución?
13.
Se prepara una solución disolviendo 15 g de Al(OH)3 en agua suficiente para
completar 300 ml de solución. ¿Cuál es la molaridad de la solución?
14.
Tenemos una solución de HCl (PM 36) 0,70 N. Para una determinada reacción
necesitamos 0,0525 moles de HCl. ¿Qué volumen de la solución debemos tomar?
14
Biotecnología de Alimentos y Mmentos
15.
¿Cuál es la molaridad de una solución que contiene 25 g de K2CrO4 (PM 194)
disueltos en cantidad de agua suficiente para tener 300 ml de solución?
16.
Se mezclan 25 ml de propanol con 55 ml de CCl4. Calcular el % v/v para cada
compuesto.
17.
Se disponen de 0,05 l de etanol. Calcular el volumen de solución al 30 % v/v que
podría preparar.
18.
Se disuelven 7 g de CuSO4 en 53 g de agua. Calcular la concentración en % p/p.
19.
Se disuelven 45 g de NaNO3 en 300 ml de agua, obteniéndose 321 ml de
solución. ¿Cuál es la concentración en % p/p y % p/v?
20.
¿Cuántos gramos de NaNO3 son necesarios para preparar 50 ml de una solución
al 7 % p/v?
21.
¿Cuántos gramos de BaCl2 son necesarios para preparar 125 g de solución al 12
% p/p?
22.
¿Cuántos gramos de una sal deberá disolverse en 315 g de agua para darnos una
solución al 25 % p/p?
23.
El etanol es esterilizante en soluciones al 70 % v/v. Teniendo en cuenta que el
alcohol común se comercializa al 95 %, calcule cuanta agua deberá agregar a 0,5 l de
alcohol para obtener la solución esterilizante.
24.
Un ácido sulfúrico concentrado tiene una densidad de 1,81 g/cc y una riqueza del
91,6% en masa de ácido puro. Calcule el volumen de esta solución concentrada que se
debe tomar para preparar 500 cc de solución de ácido 0.5M.
25.
¿Qué volumen (ml) de una solución de etanol (C2H6O) que tiene 94 % de pureza
en masa, contiene 0,2 moles de etanol? La densidad de la solución es 0,807 g/ml
26.
¿Cuántos gramos de sosa (NaOH) húmeda se necesitan pesar para preparar 250
ml de una solución 1,5 M? (La sosa contiene 10 % en masa de agua).
27.
Se quiere preparar un volumen de 8 l de una solución de KNO3 al 20% en masa
y una densidad de 1,1326 g/ml a 20 °C. ¿Qué volumen de agua (densidad del agua para
este problema: 1 g/ml) y qué masa de nitrato de potasio se deben mezclar?
28.
Calcule el volumen de H2SO4 que se necesita para preparar 300 ml de una
solución 0,75N. Considere que el H2SO4 tiene una densidad de 1,4 g/ml y 80 % de
pureza.
15
Biotecnología de Alimentos y Mmentos
29.
Se tomaron 5 ml de H2SO4 cuya densidad es de 1,8 g/ml y 90 % de pureza, y se
aforaron hasta un volumen final de 500 ml, calcule la concentración de la solución en %
m/m, molaridad y normalidad.
30.
Para preparar la solución A se pesa 1 g de NaOH y se afora hasta un volumen
final de 20 ml.
Para preparar la solución B se toman 10 ml de la solución A y se llevan a un volumen
final de 25 ml.
Para preparar la solución C se toman 10 ml de la solución B y se llevan a un volumen
final de 25 ml.
Calcule la concentración de las soluciones A, B y C.
31.
En el laboratorio se prepara una solución (a la que llamaremos solución A)
pesando 5 g de cromato de potasio y agregándole agua hasta llegar a 1 l de solución. De
esta solución A, se toma una alícuota de 100 ml y se coloca en un matraz aforado de 250
ml, agregándole agua hasta la marca de aforo (solución B). Finalmente, de la solución B
se toma una alícuota de 25 ml y se coloca en un vaso de precipitado.
a) ¿Cuál es la concentración molar de la solución A?
b) ¿Cuál es la concentración normal de la solución B?
c) ¿Cuál es la concentración en porcentaje en peso de la solución A?
d) ¿Cuántos moles de cromato de potasio hay en la solución A, en la solución B y en el
vaso de precipitado donde se colocó la alícuota final?
e) ¿Cuál es la concentración molar de la solución que se encuentra en el vaso de
precipitado que contiene la alícuota final?
32.
Se desean preparar 3 l de una solución de glucosa 2,5 mM. Explique cómo debe
prepararse esta solución.
33.
¿Qué concentración final tiene una solución de permanganato de potasio que se
prepara diluyendo 1 ml de solución 0,1M a un volumen final de 1l? Si de la solución
anterior si se toma una alícuota de 10 ml y se afora con agua a 100 ml. ¿Qué
concentración obtendrá?
34.
Se desea preparar una solución 0,2 M de NaOH, pero sólo se tienen dos matraces
aforados de 50 ml, una pipeta graduada de 10 ml, 2 g de NaOH previamente pesado. No
se cuenta con una balanza para pesar una menor cantidad de NaOH. Diga cómo preparar
la solución 0,1 M de NaOH en las condiciones anteriores.
35.
Las diluciones 10:100; 2,5:25,0; 50:500 son:
a) Todas de la misma molaridad
b) Todas diluciones 1:10
c) Todas de la misma estequiometría
Justifique.
16
Biotecnología de Alimentos y Mmentos
36.
La soda (Na2CO3) se vende en dos formas: como sal anhidra Na2CO3 y como
sal decahidratada. Considerando que el constituyente activo es el Na2CO3, ¿cuál forma
resulta más barata al consumidor, la sal anhidra a 20 centavos por kilo o la sal
decahidratada a 10 centavos por kilo?
37.
Se hicieron varios recuentos celulares. Complete la siguiente tabla calculando el
número de células en la muestra original:
Recuento
45
100
88
155
Dilución y vol analizado
1/250; 1 μl
1/1000; 0,1 μl
1/300; 0,5 μl
1/500; 0,2 μl
Volumen original
100 ml
50 ml
1l
250 ml
Número de células
38.
Complete la siguiente tabla, calculando el volumen de agua necesario para
resuspender los siguientes oligonucleótidos, de modo de obtener soluciones madre 100
M. Luego indique los volúmenes de solución madre y de agua necesarios para
preparar las soluciones de trabajo indicadas. Finalmente, indique el volumen de solución
de trabajo necesario para cada reacción.
NCAM F
381,85 μg
(5485,6 μg /μmol)
Actina
155, 21 μg
(7058,6 μg /μmol)
IIB R
56,1 nmoles
(6888,6 μg /μmol)
IIB F
69,6 nmoles
(8098,6 μg /μmol)
Volumen
de Volúmenes para
agua
para preparar la sol de
solución madre trabajo
100 μM.
10 μM, 50 μl
Volúmenes
solución de
para la PCR
de
trabajo
mix 5x, conc en la
PCR: 0,3 μM.
20 μg/μl, 100 μl
mix 18x, conc en la
PCR: 0,25 μM.
10 μg/μl, 150 μl
mix 10x, conc. final
en la PCR: 0,45 μM
20 μM, 200 μl
mix 35x, conc en la
PCR: 0,2 μM.
39.
De acuerdo a la fórmula indicada, calcule las cantidades necesarias para preparar
las siguientes soluciones, teniendo en cuenta las soluciones madre que se enumeran.
17
Biotecnología de Alimentos y Mmentos
a.
b.
c.
d.
e.
f.
1 l de medio ABC
50 ml de buffer borato
100 ml de medio XYZ
20 ml de buffer MOPS
500 ml de medio IIB agar
15 ml de solución UNSAM
Medio ABC
triptona
extracto de levadura
NaCl
PO43Agua c.s.p.
5g
10 g
80 g
1 mM
1l
Buffer borato
borato de sodio
ácido bórico
NaCl
50 mM
75 mM
145 mM
2,5 g
1,5 g
0.15 M
100 ml
4,3 % p/v
25 µmoles
50 ml
Medio XYZ
Compuesto X
Compuesto Y
Compuesto Z
Agua c.s.p.
100 µM
0,75 g
500 ml
Buffer MOPS
MOPS
Na2HPO4
NaCl
agua c.s.p.
Medio IIB agar
IIB
Agar
Agua c.s.p.
3g
1,5 g
250 ml
Solución UNSAM
UN
SAM
Etanol 95 % c.s.p.
Soluciones stock
NaCl (PM 58)
Na2HPO4 (PM 119)
Borato de sodio
Ácido bórico
Compuesto X
Compuesto Y (PM 200)
MOPS
IIB
SAM
Etanol absoluto
1,38 M
1M
0,5 M
0,5 M
50x
20 % p/v
10 % p/v
30 %v/v
2,5 M
40.
En un laboratorio se crecen bacterias en medio ABC-agar. Se usan alrededor de
10 placas/día. Tenga en cuenta que el componente A no es estable en solución y que el
componente B precipita a 4 ºC. Indique cómo preparar las soluciones stock para 1 mes
de trabajo, especificando cuánto debe pesar de cada droga, en qué volumen diluirá las
mismas. Diga cuánto medio debe preparar por día e indique los volúmenes de cada
solución stock qué debe agregar. (Una placa lleva 15-20 ml de medio).
18
Biotecnología de Alimentos y Mmentos
Medio ABC
A
10 mg
B (PM 100) 50 Mm
C
2g
NaCl
Agua c.s.p.
280 mM
1l
19
Biotecnología de Alimentos y Mmentos
TRABAJO PRACTICO Nº 1
Aislamiento y selección de microorganismos
Objetivo
Seleccionar microrganismos por sus características metabólicas.
Introducción
Los microorganismos, como los seres vivos, pueden modificar su entorno y
utilizar los compuestos presentes en él, como fuente de carbono y energía para su
crecimiento y reproducción. En todas estas actividades celulares intervienen enzimas
que actúan en forma aislada o secuencial. Se puede determinar la dotación enzimática de
un tipo de microorganismo dado, determinando la aparición de los productos finales de
una reacción enzimática o bien la desaparición del sustrato del medio. A su vez, es
posible identificarlo, diferenciándolo de otras especies relacionadas.
Se denomina METABOLISMO al conjunto de reacciones químicas que tienen
lugar en la célula viva. Participan numerosos sistemas enzimáticos y abarca tanto
reacciones de degradación de nutrientes, o CATABOLISMO, como de síntesis, o
ANABOLISMO. Los intermediarios que se forman en estas reacciones reciben el
nombre de metabolitos y la secuencia de reacciones en sí vía o ruta metabólica.
Dado que los microorganismos permiten reemplazar procesos químicos o
mejorar bioprocesos ya existentes, se hace necesario seleccionar y mejorar las cepas de
interés. En la siguiente tabla se señalan algunos criterios a tener en cuenta al momento
de seleccionar y mejorar cepas.
TABLA I: Criterios generales para la selección de microorganismos aplicables a
fines determinados
• El diseño del procedimiento de selección debe tener en cuenta tanto al tipo de
actividad requerido como las condiciones del proceso a escala comercial.
• La selección y el mejoramiento del agente biológico deben considerarse actividades
permanentes y en contínua evolución, ya que la competitividad del mercado así lo exige.
• Producción en cantidad elevada en tiempo relativamente corto y preferentemente en
cultivo sumergido (resistencia a estrés hidrodinámico).
• Alta velocidad de crecimiento a gran escala con máxima utilización de nutrientes.
• Producción constitutiva de enzimas, preferiblemente termofílicas y en forma
exocelular; resistencia a represión catabólica.
• Utilización de nutrientes de bajo costo y disponibles a gran escala.
• Los procesos de separación de células y/o productos deben ser sencillos y de bajo
costo.
• El agente biológico no debe ser patógeno ni estar relacionados filogenéticamente con
un patógeno.
• El agente biológico no debe producir compuestos indeseables (alergenos,
carcinógenos, antibióticos, ciertas enzimas, sustancias odoríferas o de fuerte sabor, etc.).
20
Biotecnología de Alimentos y Mmentos
• El agente biológico debe ser genética y fisiológicamente estable y no susceptible a
virus.
Las metodologías de obtención y mejoramiento de cepas de microorganismos y
de líneas aplicables a fines biotecnológicos requieren su inserción en un proceso global
de optimización. Para ello se deben tener en cuenta las características generales de dicho
proceso y evaluar el agente biológico obtenido en la condición más aproximada posible
a la de utilizacion. Esto permitirá efectuar una estimación práctica de factibildad de
implementación que involucra aspectos técnicos, económicos y legales de muy diversa
índole. Si bien el investigador de laboratorio en general no interviene en todas estas
facetas, es de suma importancia que no pierda de vista el proceso global, ya que el éxito
del mismo dependerá de la integración e interacción de todas y cada una de las
disciplinas y etapas que lo componen. En la fig. 1 se muestran las más importantes
operaciones de obtención y mejoramiento de cepas aplicables a fines biotecnológicos.
21
Biotecnología de Alimentos y Mmentos
DEFINIR PROPIEDADES DEL
AGENTE BIOLOGICO BUSCADO
Diseño y ejecución del
aislamiento selectivo
Mejoramiento del
procedimiento
Aislar positivos o
eliminar negativos
Selección secundaria
(propiedades adicionales)
Mutagénesis, manipulación
genética, selección adaptativa,
fusión de protoplastos
Cultivos positivos
Evaluación del catalizador
Controles: productos, cepas de referencia
Caracterización
Scale-up
Patentes
Estudios económicos
y legales
PRODUCCION
Figura 1: Diagrama de flujo de las operaciones más importantes de selección y mejoramiento de cepas
aplicables a fines industriales. La definición de las características deseables del biocatalizador está
generalmente fijada a priori por el proceso productivo.
22
Biotecnología de Alimentos y Mmentos
PARTE PRÁCTICA
A continuación se detallan tres experiencias sencillas (pruebas metabólicas) que
permiten seleccionar microorganismos con determinadas características metabólicas, y
una vez obtenidas las cepas, podrán ser utilizadas posteriormente en procesos
biotecnológicos.
LOS ALUMNOS DEBERÁN TRAER:
* Anzas
* Granos de maíz, porotos, garbanzos, semillas, arroz, cebada, etc.
* Papeles de envoltorios de alimentos y medicamentos.
1. Selección de microorganismos amilolíticos
Se tomará en este caso como sustrato al ALMIDON, que es un polisacárido,
polímero de glucosa. Para que los microorganismos lo asimilen, debe ser
hidrolizado, y para ello deben contar en su metabolismo con las enzimas apropiadas,
denominadas AMILASAS. En ese caso se dice que el organismo posee poder
amilolítico.
¬ Materiales y métodos:
Caja de Petri con agar almidón (almidón soluble 0,2 %)
Anzas estériles.
Solución de Lugol.
Muestra a analizar.
•
•
•
•
•
•
Se siembra a partir de las muestras una anzada para formar una colonia
gigante en la caja de Petri que contiene agar almidón.
Se incuba a 37°C y 28°C durante 48 horas.
Una vez visibles las colonias de microorganismos se agrega a la caja la
solución de lugol.
Si se produce un halo incoloro que rodea la colonia gigante, el cultivo es
amilolítico.
Cepas a ensayar: Bacillus subtilis y Bacillus megaterium.
Tratamiento de muestras: granos de maíz (u otro) partidos, salvado de trigo,
suspendidos en agua estéril y agitados a 28 ºC durante 1 h.
2. Selección de microorganismos proteolíticos
Las proteínas son moléculas demasiado grandes para penetrar en la célula
microbiana, ésta debe degradarlas para poder utilizarlas como elementos nutritivos.
El proceso de degradación de proteínas se denomina PROTEOLISIS y se lleva a
cabo mediante enzimas extracelulares segregadas por los microorganismos,
PROTEASAS. La capacidad de elaborar enzimas proteolíticas se limita a pocas
especies bacterianas.
La proteólisis puede ocurrir en dos etapas:
proteínas + H2O
polipéptidos
23
Biotecnología de Alimentos y Mmentos
proteinasas
polipéptidos + H2O
aminoácidos
peptidasas
¬ Materiales y métodos:
Tubos de ensayo con caldo carne - gelatina bacteriológica.
Extracto de carne
3g
Peptona (o triptona)
5g
150 g
Gelatina bacteriológica
Agua c.s.p.
1 l.
Agujas estériles.
Muestra a analizar.
• A partir de una muestra dada, se siembra por punción en un medio de gelatina
(caldo carne adicionado con 15% de gelatina bacteriológica).
• Se lo incuba a 37°C durante 24 a 48 horas.
• La gelatina funde a más de 20°C, por lo tanto, cuando se saque el tubo de la
estufa de 37°C deberá ser llevado a temperaturas de refrigeración.
• Si la gelatina permanece líquida, el cultivo es proteolítico (el sustrato fue
degradado).
• Cepas a ensayar: Bacillus cereus y Bacillus megaterium.
3. Selección de microorganismos celulolíticos
La metodología descripta a continuación es utilizada para establecer la
resistencia fúngica de papeles, en particular de aquellos que han sido sometidos a
tratamientos para evitar el deterioro causado por hongos. Este es el método aprobado por
la Asociación Técnica de la Industria de la Pulpa y el Papel (Technical Association of
the Pulp and Papers Industry –TAPPI, ver documento anexo).
Se usan las siguientes cepas de hongos para esta prueba: Aspergillus niger y
Aspergillus terreus. Otras especies pueden ser incluidas, pero deben ser aisladas de
papeles que hayan sido atacados por las mismas. Los stocks de hongos se mantienen en
un medio agar-dextrosa-papa. En tanto que el medio de cultivo para las pruebas es un
medio agar-sales minerales, en donde la única fuente de hidratos de carbono es la
celulosa del papel en análisis.
Medio agar-sales minerales
NH4NO3
K2HPO4
KCl
MgSO4⋅7H20
Agar
Agua dest. c.s.p.
3,0 g
1,4 g
0,25 g
0,25 g
10,0 g
1l
24
Biotecnología de Alimentos y Mmentos
Procedimiento
Piezas de papel de 5 cm de lado se incuban en placas de Petri de 100 mm con
medio agar-sales minerales (una placa por cada cepa de prueba para cada muestra de
papel). Si el papel es grueso, es conveniente utilizar placas más grandes con mayor
cantidad de medio.
Las placas son inoculadas con una solución de esporas y micelios de cada uno de
los microorganismos.
La incubación se lleva a cabo durante 2 semanas a 28 °C, preferiblemente en
atmósfera húmeda.
La lectura de los resultados consiste en la examinación visual de las placas. Es
necesario examinar las placas varias veces durante la primera semana para controlar que
no se produzca el crecimiento de otros hongos.
Un papel se considera resistente al deterioro fúngico cuando no hay crecimiento
al cabo de dos semanas, en comparación con controles positivos. Si hay crecimiento
durante los primeros 7 días, se dice que el papel no tiene resistencia fúngica. Si al cabo
de una semana, no se observa desarrollo de hongos, se continúa la incubación por una
semana adicional. Durante esta segunda semana puede existir un desarrollo leve, en
cuyo caso, se considera que el papel es moderadamente resistente.
25
Biotecnología de Alimentos y Mmentos
TRABAJO PRACTICO Nº2
Levaduras - Obtención de Biomasa
Objetivo
Valorar el desarrollo de biomasa trabajando con un cultivo de S. cerevisiae.
Introducción
Las levaduras son hongos unicelulares que intervienen en distintos procesos
productivos: elaboración de pan, vino, cerveza, bebidas destiladas; síntesis de proteínas
y vitaminas; son fuente de proteína microbiana y de vitaminas del grupo B; sus
subproductos se usan como resaltadores de sabores en alimentos, se utilizan para
producir pigmentos, etc. Algunas son agentes de deterioro (jugos de frutas, dulces,
encurtidos), pero no se los considera peligrosos para la salud del consumidor al ser
ingeridos.
Desde el punto de vista tecnológico, las levaduras tienen sus ventajas en relación
con otros microorganismos por la capacidad de asimilar gran variedad de sustratos,
velocidades de crecimiento altas y su biomasa es fácilmente separable.
Están difundidas ampliamente en frutos, granos, suelos, aire, etc. Inicialmente los
procesos fermentativos se realizaban con levaduras naturales, pero con la aparición de
un mercado cada vez más exigente en cuanto a la constancia de la calidad de los
productos, se fueron seleccionando cepas, por lo tanto es importante poder identificarlas.
Para ello se estudian las siguientes características:
1) Morfología de las células y de las colonias
Se observa la forma de las células: esférica, ovoide, cilíndrica o elipsoidales
(por ej: Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus).
Las colonias se identifican en medio sólido por su aspecto, borde, consistencia y
color (ver TP N 1). Además se estudia, en medio de malta líquido, la capacidad de
formar película (crecimiento superficial) y anillo (crecimiento por las paredes del
frasco).
2) Fisiología (bioquímica y metabolismo).
Se utilizan ciertas características del metabolismo de las levaduras para su clasificación:
por ejemplo fermentación de azúcares determinados (a concentraciones ≥ 2% p/v en el
medio) con producción de ácido (viraje de un indicador en el medio de cultivo) y gas
(tubo de Durham). También se investiga la asimilación aeróbica de los mismos azúcares
( < 2% ).
3) Métodos actuales de clasificación: Además de las características mencionadas arriba
entre las técnicas de la biología molecular utilizadas para identificar levaduras podemos
citar: contenido de bases (G-C) del ADN, hibridización DNA-DNA, DNA-RNA,
patrones de isoenzimas, ultraestructura de la pared celular, etc.
4) Reproducción
Algunas especies de levaduras presentan reproducción asexual y sexual y se las
incluye dentro de la Clase Ascomycetes, otras tienen solamente reproducción asexual y
se las clasifica como Deuteromycetes u hongos imperfectos. Las levaduras que
presentan reproducción sexual forman ascos con ascosporas y el número (2-8) y forma
30
Biotecnología de Alimentos y Mmentos
(esféricas, cilíndricas, como sombreros, etc) de las ascosporas son útiles para la
clasificación. Las levaduras imperfectas se llaman así porque solo se les conoce la
reproducción asexual por gemación (o por fisión como ocurre con
Schizosaccharomyces). Muchas formas levaduriformes (con reproducción asexual por
gemación) forman parte del ciclo de vida de hongos filamentosos de la Clase
Basidiomycetes.
Existen aproximadamente 33 géneros con más 350 especies reconocidas de
levaduras de Ascomycetes.
Ciclos de vida: (Figura 1) Si bien típicamente S. cerevisiae presenta alternancia
de generaciones haploides (n), producto de la meiosis y diploides (2n, producto de la
unión de núcleos (n) cada generación se propaga asexualmente por gemación).
Aunque las levaduras son predominantemente unicelulares, en algunas especies
(v.g. S.cerevisiae), se produce un seudomicelio (fase 2n) o un micelio invasivo (fase n) ,
como respuesta a alguna deficiencia nutricional. Además, la formación de seudomicelio
es una caracteristica diferencial entre especies.
Figura 1. Ciclo de vida de levaduras con reproducción por gemación y por fisión.
Las levaduras crecen mejor en medios a una temperatura óptima está entre 25 y
30°C (mesofílicas) y a un pH entre 4.5 - 5.5.
31
Biotecnología de Alimentos y Mmentos
Desde el punto de vista de su metabolismo las levaduras son microorganismos
heterótrofos (no fijan CO2)y quimiorganotrofos (la fuente de energía proviene de la
oxidación de compuestos químicos de naturaleza orgánica) como por ejemplo azúcares .
S. cerevisiae es capaz de utilizar monosacáridos como glucosa, manosa y fructosa;
disacáridos: sacarosa, maltosa (pero no lactosa) y no utiliza polisacáridos
eficientemente.
La degradación de los azúcares la hacen en forma anaeróbica (fermentación), o
aeróbica (respiración). Las ecuaciones globales correspondientes son:
En anaerobiosis:
a) vía glicólisis (EMP): más del 95% del metabolismo de la glucosa
C6 H12 O6
2 C2 H5 OH + 2 CO2 + 2 NADH2
ATP/mol glucosa
hexosa
etanol
b) vía de la pentosa-fosfato (o hexosa-fosfato):
1 Glucosa P
6 CO2 + 12 NADPH2
Ambos caminos ocurren en el citoplasma y ocurren aún en condiciones aeróbicas.
En aerobiosis:
C6 H12 O6 + 6 O2
6 CO2 + 6 H2O
36 ATP/mol glucosa
hexosa
Las reacciones aeróbicas se llevan a cabo por el ciclo de Krebs y se forma CO2,
H2O y NADH2. Este último (al igual que el proveniente de glucólisis) se oxida por la
cadena de transporte de electrones generando ATP. Ambos procesos ocurren en la
mitocondria (matriz y crestas respectivamente).
Ambos procesos, aeróbico y anaeróbico, no tienen el 100% de rendimiento, ya
que se forman productos secundarios (glicerina, aldehídos, ácidos orgánicos) a expensas
del azúcar.
Las levaduras pueden usar alternativamente una u otra ruta metabólica. Por
ejemplo, en la elaboración de cerveza y durante la panificación con S. cerevisiae, se
utiliza un proceso fermentativo (producción de etanol y CO2 ), en el cual no hay
aireación, pero para la generación de biomasa (levadura para panadería), resulta un
mayor rendimiento/ Sustrato utilizado (5 veces mayor) si se realiza con aporte de
oxígeno (Efecto Pasteur).
En el proceso de producción de biomasa de levadura el requerimiento de oxígeno
es alto como lo indica la siguiente ecuación de balance de masa (aproximado):
Sacarosa + NH4 + O2 + minerales
Levadura + CO2 + H2O
200 g
10 g 102 g 8 g
100 g
145 g 77 g
Propagación de la Levadura
De la ecuación anterior se puede ver que S. cerevisiae, además de una fuente de
azúcar fermentescible y O2, necesita de una fuente de nitrógeno en forma reducida
(generalmente NH3, NH4.OH, urea, sulfato de amonio u otra) y de determinados
minerales (PO4-3, SO4-2, K+, Mg+2), micronutrientes (Ca, Zn, Cu, Mo, Fe, Mn, etc.)
además de vitaminas del grupo B. En general los medios de propagación industrial,
32
Biotecnología de Alimentos y Mmentos
generalmente melaza de caña o de remolacha, representan una buena fuente de azúcares
utilizables, micronutrientes y de varias vitaminas pero son deficientes en N, P y Mg
como para satisfacer los requerimientos para producir biomasa de levadura (basándose
en la composición elemental de la misma)
Para evaluar la biomasa, se determina el número de microorganismos totales y
viables mediante distintas técnicas de dosaje habituales:
1- Recuento microscópico
Ventajas:
• barato, rápido, sencillo.
• no requiere material estéril.
• posibilita la diferenciación de algunos microorganismos y la detección precoz de
contaminaciones.
Desventajas:
• Se emplea poca muestra en relación al volúmen a cuantificar.
• el método resulta inseguro a concentraciones celulares < 104/ml y > 109/ml.
• las células vivas pueden no diferenciarse de las muertas o pueden hacerlo
dificultosamente.
• el método puede resultar tedioso a altas concentraciones microbianas o con
microorganismos muy pequeños.
• resulta muy dificultoso el recuento cuando las células se aglutinan o forman cadenas.
Error del método: 10%.
Recuento en cámara de Neubauer
cuadrante
1 cuadrado de 25 del
reticulado central
Figura 3. Reticulado de la cámara de Neubauer
33
Biotecnología de Alimentos y Mmentos
Atención: Para contar células que están
sobre las líneas, adoptar el mismo criterio en
todos los casos para no contar dos veces una
misma célula (Ej. Siempre contar las células
que están sobre las líneas derecha e inferior
como pertenecientes a ese cuadrado. Fig. 4).
En el caso de las levaduras, tener en cuenta
que al dividirse pueden permanecer unidas.
Se cuenta como 2 células si las hijas tienen el
mismo tamaño y se cuenta como una célula,
2 células
1 célula
si la hija es de menor tamaño que la célula
madre (fig. 4).
Figura 4. Recuento de células en división y
células que caen sobre las líneas divisorias
Para suspensiones de células diluidas, se cuenta en los cuadrantes de 16 cuadrados.
Volumen de 1 cudrante = lado x lado x altura = 1 mm x 1 mm x 0,1 mm = 0,1 mm3
Ejemplo: Para contar células de un frasco agitado de 50 ml, se diluyó la muestra 1/10 y
se contó lo siguiente:
25 células por cuadrante
20
"
32
"
35
"
112 células
- El promedio = 112 / 4 = 28 células por cada cuadrante en 0,1 mm3 ≡ 0,1 μl.
28 células
0,1 μl
1000 μl ≡ 1 ml
X cél/ml = 280000
- Corregir por la dilución si se hubiere contado una muestra diluida. En este caso
multiplcar x 10 = 2800000 = 2,8 x 106 cél/ml.
- Finalmente, se calcula el número total de células de la suspensión:
2,8 x 106 cél
1 ml
X cél = 140 x 106 cél
50 ml
Para suspensiones de células concentradas, se cuenta en el cuadrante central de 25
cuadrados. Se cuentan por lo menos 5 cuadrados
Volumen de 1 de los 25 cuadrados = 0,2 mm x 0,2 mm x 0,1 mm = 0,004 mm3
34
Biotecnología de Alimentos y Mmentos
Ejemplo: Para contar células de un frasco agitado de 50 ml, se diluyó la muestra 1/10 y
se contó lo siguiente:
17 células por cuadrado
23
"
23
"
18
"
19
"
100 células
- El promedio = 100/5= 20 células por cada cuadrado en 0,004 mm3 ≡ 0,004 μl.
20 células
0,004 μl
1000 μl ≡ 1 ml
X cél/ml = 5000000
- Corregir por la dilución, en este caso multiplcar x 10 = 50000000 = 5 x 107 cél/ml.
- Finalmente, se calcula el número total de células de la suspensión:
5 x 107 cél
1 ml
50 ml
X cél = 250 x 107 cél
Por lo tanto, para calcular el número por ml deben aplicarse las siguientes fórmulas:
- Suspensiones diluidas
cél./ml = N x 10000
donde N es el promedio de células por cuadrante.
- Suspensiones concentradas
cél./ml = N x 0,25 x 106
donde N es el promedio de células por cuadrado del retículo central.
2- Recuento en placa
Ventajas:
• Permite la determinación de microorganismos viables en un amplio rango de
concentraciones.
Desventajas:
• como se determinan las “unidades formadoras de colonias” (U.F.C.), las células
aglutinadas se contarán como una sola unidad (error por defecto).
• por inadecuada composición del medio o inadecuadas condiciones de incubación,
algunos microorganismos potencialmente viables pueden resultar incapaces de
formar colonias.
• errores sistemáticos en las diluciones.
Error del método: 100% o más.
3- Centrifugación
En estos métodos se requieren preparaciones limpias, sin partículas extrañas. Por ser un
método gravimétrico (por pesada) conlleva bastantes errores: es difícil pesar menos de 1
mg con exactitud en las balanzas habituales de laboratorio y 1 mg de peso seco equivale
a unas 5 x 10 9 bacterias.
35
Biotecnología de Alimentos y Mmentos
• Peso húmedo:
Ventaja: es rápido y sencillo
Desventaja: grandes errores, debido al líquido intercelular retenido, que depende a su
vez de la forma y tipo de agrupaciones de la cepa, intensidad del empaquetamiento, etc.
• Peso seco: como el anterior, pero el sedimento se seca antes de ser pesado
(105ºC, toda la noche).
Ventaja: más preciso que el anterior
Desventaja: método tedioso (requiere mucho tiempo).
4- Absorción o turbidimetría:
Ventajas:
• Da información sobre el peso seco. Muy útiles y poderosos. La absorbancia es
directamente proporcional al peso seco, independientemente del tamaño celular del
microorganismo.
Desventajas:
• cuando los tamaños de las células bacterianas son diferentes se encuentran
absorbancias muy diferentes por partícula o por UFC (Unidad Formadora de
Colonia).
• debe realizarse una "curva de calibración" con cada tipo de microorganismo,
microorganismos totales o con UFC para establecer el rango de linearidad.
PARTE PRÁCTICA
1- Se trabaja con frascos agitados de 250 ml de capacidad conteniendo 50 ml de caldo
Sabouraud (pH 5.5). Es un medio semi-sintético que contiene los nutrientes necesarios
para el crecimiento de S. cerevisiae.
2- Se prepara un inóculo de S. cerevisiae, sembrando un caldo Sabouraud a partir de una
estría joven. El caldo así sembrado se incuba a 28°C durante 24 horas, con agitación.
3- Se inocula el frasco, se homogeiniza y se toma una muestra estérilmente (Muestra
Inicial o tiempo 0). Se inoculan además 4 frascos más que se crecerán aproximadamente
por 8; 12; 24 y 48 hs
4- Se incubarán los frascos en un baño termostatizado a 28-30 °C con agitación y
abundante aireación.
Sobre alícuotas de todas las Muestras (T0, T8, T12, T24 y T48), se efectuará:
1. Recuento microscópico directo: se cuentan las levaduras en la Cámara de Neubauer
(número de levaduras/ml). Contar de manera directa (sin preparar diluciones), las
muestras T0 y T8. Realizar diluciones para el resto de las muestras.
36
Biotecnología de Alimentos y Mmentos
2. Recuento en placa: se harán
diluciones seriadas para sembrar en cajas
de Petri con agar Sabouraud. Las cajas se
incubarán de 3 a 5 días a 28°C. Se
contarán aquellas diluciones que tengan
entre 20 y 200 colonias. Realizar
diluciones seriadas partiendo de 100 μl
de cada cultivo (ver fig.2).
Figura 2. Esquema de diluciones seriadas
3. Densidad óptica: Leer por duplicado cada muestra (2 alícuotas) a 600 nm. El rango
de absorbancia donde la medición es lineal es 0,150 a 0,500. Por lo tanto, las muestras
que tengan una absorbancia mayor, deberán ser diluidas y medidas nuevamente.
4. Peso húmedo por centrifugación: a 5000 rpm durante 15 minutos. Con este método
se determinará:
I. Rendimiento al final de la fermentación, expresado como gramos de levadura
obtenida en función de g de azúcar utilizado : Y X/C
II. Velocidad de crecimiento específico de la fermentación (μ total):
i)
Tomar dos tubos de 1,5 ml para cada muestra. Pesar el tubo vacío, anotar.
Agregar 1 ml de cultivo previamente homogeneizado. Centrifugar 1 ml de la suspensión
de células a 5000 rpm x 10 min. Descartar el sobrenadante. Pesar nuevamente el tubo,
sacar el peso húmedo por diferencia.
ii)
Teniendo en cuenta el volumen del frasco, calcular la biomasa (X) de la levadura
como: x (g/l). Vol (ml). Obteniéndose X (en g). Mediante la diferencia XT48 – XT0 =
X neta [biomasa neta de la levadura producida (g)].
iii)
Calcule el YX/C: [X neto (g) /azúcar en el fermentador (g) x 100] = Rendimiento
de biomasa de levadura en función del azúcar consumida expresado como gramos de
levadura obtenida vs. g de azúcar utilizado (se presume que la levadura utilizó todo el
azucar presente en el medio Sabouraud al final de la fermentación).
iv)
Calcule el: μ total = ln X final – ln X inicial
Δ tiempo
37
Biotecnología de Alimentos y Mmentos
TRABAJO PRACTICO N° 3
Producción de ácido cítrico
Objetivos:
Comparar el efecto de la agitación y de la adición de Mn2+ sobre el rendimiento de ácido
cítrico en cultivos de Aspergillus niger
Introducción
El ácido 3 - carboxi - 3 – hidroxipentanodioico o ácido cítrico es el ácido
orgánico más producido mediante fermentaciones. Es ampliamente usado en varias
ramas de la industria, particularmente en la industria alimenticia (alimentos y bebidas,
70 % de la producción); en la fabricación de detergentes y limpiadores (18 %); en la
industria farmacéutica y cosmética (6 %) y en la producción química e industrial (6 %).
Sus ventajas son alta solubilidad, poder quelante, sabor agradable y baja toxicidad,
clasificado como GRAS (generally recognized as safe) por la Administración de Drogas
y Alimentos de EE.UU. (FDA). Se utiliza como condimento, conservante (en bebidas y
dulces), antioxidante en conjunto con ácido ascórbico y para ajustar el pH (en conservas
de frutas enlatadas). En la industria farmacética es usado en la formulación de tabletas
efervescentes y como anticoagulante en transfusiones sanguíneas. Adicionalmente, el
ácido cítrico en combinación con otros principios activos elimina bacterias, mohos y
hongos patogénicos causantes de olor, remueve la espuma de jabón, herrumbre, limos y
depósitos de calcio; por lo que es incluido en la formulación de desinfectantes,
fungicidas y otros pesticidas. Estos productos son usados en baños y en la limpieza de
equipos de procesamiento de lácteos y carnes. En ciertos detergentes reemplaza el
tripolifosfato de sodio, un contaminante ambiental.
El ácido cítrico se encuentra ampliamente distribuido en la naturaleza, en
diversas frutas y en animales, en hueso, músculo y sangre. Puede ser extraido de cítricos,
pero a escala industrial se produce por métodos microbiológicos a partir de materias
primas que contengan azúcares. Si bien se han empleado un gran número de
microorganismos para producir este ácido, el hongo Aspergillus niger continúa siendo el
principal productor industrial, existiendo cepas capaces de exceder el rendimiento
teórico sobre la fuente carbonada del 70%. Bajo una condición de glicólisis activa, tal
como sucede en medios ricos en azúcares, los hongos filamentosos son capaces de
acumular ácidos orgánicos en el medio. La composición del medio de fermentación tiene
una muy fuerte influencia en la producción de ácido cítrico, ya que sólo se acumula
cuando ciertos nutrientes están presentes en altas concentraciones (i.e. azúcar, acidez,
oxígeno disuelto) y otros en cantidades limitadas (i.e fósforo, nitrógeno y cationes
divalentes como Fe2+ y Mn2+). Dado que son varios los eventos bioquímicos que
contribuyen conjuntamente a la sobreproducción, muchas veces no es posible estudiar el
efecto de factores individuales sin afectar los otros.
Metodología
38
Biotecnología de Alimentos y Mmentos
1- Cultivo
i- Preparación de medio de cultivo: Se preparan Erlenmeyers de 250 ml conteniendo 50
ml de medio de cultivo definido (Shu & Johnson, 1947):
Componentes principales (g/l)
Glucosa:
100,00
(NH4)2NO3:
2,50
KH2PO4:
1,00
Mg2SO4.7H2O:
0,25
Micronutrientes (mg/l)
Cu2+:
2,4
Zn2+:
0.34
0.8
Fe2+:
A la mitad se le adicionan 9 mg/l de Mn2+.
ii- Obtención de esporas: Se agregan 5 ml de agua destilada con una gota de Tween-20 a
un cultivo de Aspergillus niger en pico de flauta agar papa-dextrosa. Se agita hasta
obtener una suspensión de esporas
iii- Inoculación: Los Erlenmeyers se inoculan con 0,5 ml de la suspensión de esporas.
iv- Cultivo: Los cultivos se incuban durante 10 días a 28 ºC a 200 rpm y en condiciones
estáticas. Antes de cosechar, se observa y registra la morfología del hongo en las
diferentes condiciones ensayadas (forma de pellet o filamentosa, presencia de esporas,
etc); se pueden observar estructuras reproductivas y vegetativas al microscopio óptico.
v- Cosecha: Los cultivos se filtran sobre un papel de filtro pesado previamente
(TRABAJAR CON CUIDADO, EVITANDO ESPARCIR LAS ESPORAS). El filtrado
se lava dos veces con 50 ml de agua destilada. Se centrifuga 1 ml del filtrado para
realizar las determinaciones de glucosa y ácido cítrico.
2- Determinaciones
i- Peso seco: Retirar el papel de filtro del embudo y colocarlo en una placa de Petri
(pesar previamente la base); dejar secar en estufa a 80 ºC durante 24 h. Volver a pesar y
obtener el peso neto del micelio.
ii- Determinación enzimática de glucosa: Diluir la muestra aproximadamente 1:10 –
1:100. Agregar 1 ml de solución de glucosa oxidasa (1000 U/ml) y peroxidasa (120
U/ml) a 10 μl de la muestra y agitar. Incubar a 37 ºC durante 10 minutos. Leer
absorbancia a 505 nm. Realizar una curva de calibración con 5, 10 y 20 μl de una
solución de glucosa 1g/l. Se utilizará el test para la determinación de glucosa en sangre,
de uso habitual en los laboratorios de análisis clínicos (ver anexo).
ii- Determinación de ácido cítrico: TRABAJAR BAJO CAMPANA! Agregar 0,7 ml de
anhídrido acético a 125 μl de la muestra (sin diluir o a diluciones 1:10 a 1:100) y agitar.
A continuación, agregar 0,160 ml de piridina y mezclar cuidadosamente. Incubar a 30 ºC
durante 20 minutos. Leer absorbancia a 435 nm (cubrir las cubetas con parafilm).
Realizar una curva de calibración con 10, 30 y 70 μl de una solución de ácido cítrico
1g/l.
39
Biotecnología de Alimentos y Mmentos
Cálculos
Calcular el rendimiento de ácido cítrico respecto al azúcar consumido y la biomasa.
Discutir el efecto de los distintos tratamientos ensayados.
Referencias
Shu, P; Johnson, MJ. Effect of the Composition of the Sporulation Medium on Citric
Acid Production by Aspergillus niger in Submerged Culture. 1947. J Bacteriol. 54
(2):161–167
Papagianni, M. 2007. Advances in citric acid fermentation by Aspergillus niger:
biochemical aspects, membrane transport and modeling. Biotechnol. Adv. 25(3):244263.
Soccol, C; Vandenberghe, L; Rondriques, C. & Pandey, A. 2006. New perspectives for
citric acid production and application, Food Technol. Biotechnol. 44, 141–149.
40
Biotecnología de Alimentos y Mmentos
TRABAJO PRÁCTICO Nº 4
Fermentación alcohólica
Objetivo
Obtener alcohol por fermentación de harina de maíz.
Introducción
Una de las fermentaciones industriales más importante y mejor conocida es la
que da lugar al alcohol etílico al actuar las levaduras sobre los azúcares.
El alcohol etílico puede obtenerse a partir de cualquier azúcar fermentescible, por
acción de las levaduras, en condiciones favorables. Puesto que el almidón y otros
hidratos de carbono pueden ser hidrolizados a azúcares fermentescibles por métodos
biológicos o químicos, se puede disponer de muchas fuentes de azúcar.
La materia prima puede clasificarse en tres tipos principales:
a) materias sacaroideas: azúcar de caña, remolacha, melazas y jugos de frutas.
b) materias que contienen almidón: comprenden los cereales (maíz, malta, cebada,
avena, centeno, trigo, arroz, sorgo y otros), papas, batatas.
c) materias celulósicas: madera y los residuos de fabricación de la pasta de papel.
Las materias sacaroideas requieren por lo general poco o ningún tratamiento
preliminar aparte de la dilución; las materias amiláceas y las celulósicas deben ser
hidrolizadas a azúcares fermentescibles antes que actúen sobre ellas las levaduras.
En todos los casos el éxito depende de la eficacia del tratamiento preliminar (si lo
hubiera), del empleo de una concentración óptima de azúcar, de un pH y temperatura
óptimos, del empleo de una variedad fuerte de levadura con alta tolerancia alcohólica,
capaz por lo tanto de producir grandes cantidades de alcohol.
Concentración de azúcar: 10-18%. Valor más corriente: 12%.
Sustancias nutritivas: en algunos casos, para suplir la posible deficiencia en P o
N, puede añadirse PO43-ó SO42- amónico.
pH del mosto: 4- 4.5. Este favorece a la levadura y es lo suficientemente bajo
para inhibir el desarrollo de muchos tipos de bacterias. Para alcanzar este pH se emplean
SO4H2 y ácido láctico.
Tensión de O2: en los primeros momentos es necesaria una alta concentración de
este gas para la reproducción de las células de levadura. Durante la fermentación se
desprende CO2 y se establecen pronto condiciones anaerobias.
Obtención del alcohol a partir de harina de maíz
Por ser la harina de maíz una materia prima de naturaleza amilácea, debe
efectuarse un tratamiento preliminar para transformar el almidón en azúcares
fermentescibles.
El almidón es un polisacárido que desempeña funciones de reserva en tejidos
vegetales, y está compuesto por dos tipos de polímeros: la amilosa y la amilopectina.
La amilosa es una cadena lineal formada por unidades de glucosa (en número
elevado), unidas entre sí por uniones α-1-4 (uniones entre el grupo aldehído de cada
molécula con el OH del C4 de la molécula siguiente).
43
Biotecnología de Alimentos y Mmentos
La amilopectina tiene una estructura ramificada en la que las unidades de glucosa se
unen por enlaces glucosídicos α-1-4 y α-1-6. En cada C6 que participa de una unión se
produce un punto de ramificación.
En su estado natural en el tejido vegetal, el almidón se encuentra formando
gránulos. El tamaño de los gránulos varía entre los 5 y 100 μm y poseen una estructura
interna consistente en capas concéntricas. En ellos coexisten regiones internas cristalinas
y amorfas. Las regiones amorfas representan el 70% de la estructura y contienen la
mayor parte de la amilosa. Un comportamiento particular de los gránulos de almidón es
su capacidad de gelificar al ser calentados en presencia de agua. La gelificación del
almidón implica la ruptura de los puentes hidrógeno intercatenarios especialmente en las
regiones cristalizadas del gránulo.
Los métodos para sacarificar materiales amiláceos implican el uso de
preparaciones enzimáticas, ácidos diluídos o una combinación de ambos.
Entre las preparaciones enzimáticas se incluyen la malta y otras de origen
microbiológico derivados de hongos y bacterias. Estas preparaciones contienen amilasas,
enzimas capaces de hidrolizar el almidón y el glucógeno a diversos productos.
Las distintas amilasas se pueden clasificar de la siguiente manera:
AMILASAS
Endoamilasas α amilasas (enzima licuante)
Ataca las uniones α- 1-4 de la amilosa y la
amilopectina a ambos lados de la unión α- 1-6.
Produce maltosa, glucosa, oligosacáridos.
Exoamilasas β amilasas (enzima sacarificante)
Ataca las uniones α- 1-4. Produce matosa y dextrinas
límites.
amiloglucosidasa (enzima sacarificante)
Ataca las uniones α- 1-6 y α- 1-4. Produce glucosa.
La designación de α y β amilasas no se refiere a la configuración del enlace
glucosídico que hidrolizan, ya que ambos grupos de enzimas hidrolizan los enlaces α-14.
La β-amilasa hidroliza rápidamente la fracción amilosa a maltosa, a partir de los
extremos no reductores de la molécula. Esta conversión es prácticamente cuantitativa sin
que se formen cantidades apreciables de dextrinas (oligosacáridos superiores).
Cuando la β-amilasa actúa sobre la amilopectina, la hidrólisis se realiza en un 5060% aproximadamente de la máxima teórica (calculada como maltosa). Este efecto
puede ser prácticamente completo en la amilosa de cadena lineal, sin ramificar; en
cambio en la amilopectina la acción enzimática cesa en los puntos de ramificación de la
cadena, es decir en los enlaces α-1-6 glicosídicos (dejando dextrinas límites).
En contraste con las αamilasas, las β-amilasas hacen muy lento el ritmo de
aparición de la maltosa. En este caso la hidrólisis del polisacárido tiene lugar en los
enlaces glicosídicos del interior de la cadena, formándose oligosacáridos que se escinden
lentamente en maltosa y glucosa.
44
Biotecnología de Alimentos y Mmentos
Otra diferencia que presentan las α amilasas con respecto a las β amilasas, es que
las primeras pueden hidrolizar los enlaces α-1-4 de las amilopectinas a uno y otro lado
de las ramificaciones formando oligosacáridos del orden de los pentasacáridos, unidos
por enlaces α-1-6. Este acortamiento tan grande de la cadena lleva a una disminución
rápida de la viscosidad. De ahí que a las α amilasas se las llame también “enzimas
licuantes”. Preparan así el camino para la β amilasa a la que se llama “sacarificante”. En
la malta existen α y β amilasas. Trabajando a alta temperatura se favorece la acción de la
α (70-75°C) con lo cual tiene lugar la licuefacción, mientras que a temperaturas más
bajas (60°C) trabaja la β amilasa produciéndose la sacarificación.
La amiloglucosidasa (enzima sacarificante) es otra amilasa que ataca las uniones
α-1-6 y α 1-4 a partir de los extremos no reductores de la molécula de almidón,
produciendo glucosa. La velocidad de hidrólisis de la amiloglucosidasa aumenta con el
peso molecular del sustrato. La velocidad de hidrólisis de los enlaces α-1-6 es un orden
de magnitud menor que para las uniones α-1-4.
Estructura del almidón:
45
Biotecnología de Alimentos y Mmentos
PARTE PRACTICA
La práctica tiene por objeto preparar el mosto a partir de harina de maíz,
mediante dos enzimas (α amilasa y amiloglucosidasa), y la posterior fermentación del
mosto por la acción de levaduras, en condiciones anaeróbicas.
El rendimiento de la fermentación se calcula en base al peso de etanol obtenido.
Microorganismo utilizado: Saccharomyces cerevisiae (levadura de alta).
1- Preparación del inóculo: en un Erlenmeyer de 250 ml de capacidad, se colocan 50 ml
de caldo Sabouraud y 0.5% p/v de macerado de maíz.
Se esteriliza 30 minutos a 110°C. Se enfría y se siembra con un cultivo de 24
horas de la levadura. Se incuba durante 24 horas, a 28°C, en agitador rotatorio.
2- Preparación del mosto: en un Erlenmeyer de 500 ml de capacidad previamente tarado
(incluyendo el tapón de algodón), se colocan 45 g de harina de maíz y 200 ml de agua
destilada.
a) Gelificación: el Erlenmeyer se coloca en el autoclave a 121°C durante media
hora, a fin de liberar el almidón contenido en la harina de maíz.
b) El Erlenmeyer se enfría a 70°C, y se le agrega 2 ml de amilasa bacteriana. El
contenido del Erlenmeyer se agita con una varilla durante 15 minutos, manteniéndolo
sumergido en un baño termostatizado a 70°C.
c) El Erlenmeyer se retira del baño termostatizado y se coloca durante 5 minutos
en un baño de agua hirviente. Este paso tiene por objeto inactivar la α amilasa.
d) Se enfría el Erlenmeyer a 55°C y se le agrega 4 ml de amiloglucosidasa.
El contenido del Erlenmeyer se agita con una varilla durante 30 minutos, en un
baño termostatizado a 55°C.
Se prepararán 4 fermentaciones:
Fermentación 1: sin enzimas
Fermentación 2: con ambas enzimas
Fermentación 3: solo con α-amilasa
Fermentación 4: solo con amiloglucosidasa.
3- Siembra del inóculo: el mosto se enfría a 28°C y se siembra con 5 ml del inóculo,
preparado según 1. Luego se incuba en forma estática a 28°C, durante 72 a 96 horas,
hasta que la fermentación haya terminado.
4- Destilación: finalizada la fermentación, se pesa el Erlenmeyer. Se miden 100 ml y se
pasan a un balón de destilación de 500 ml y se vuelve a pesar el Erlenmeyer, para
conocer el peso de la fracción que se va a destilar.
Se agregan al balón 100 ml de agua destilada, lavando la probeta en que se han
medido los 100 ml. Se destila lentamente, hasta asegurarse que la temperatura haya
llegado a 100°C. El destilado se recoge en un matraz aforado de 100 ml, se lleva a
volumen con agua destilada, y se determina su densidad por medio del densímetro
(alcoholímetro), ajustando la temperatura al valor indicado en las tablas de
concentración adjuntas.
Obtenida la densidad, se busca la concentración de alcohol en % p/v.
46
Biotecnología de Alimentos y Mmentos
5- Cálculo del rendimiento:
a) Rendimiento teórico
Ecuación de Gay-Loussac:
C6H12O6
2 C2H5OH + 2 CO2
PM 180
PM 2 x 46
PM 2 x 44
180 g glucosa
92 g alcohol
100 g glucosa
51.1 g alcohol
(C6H10O5)n + n H2O
n C6H12O6
almidón
glucosa
PM (162)n
n 180
n 162 g
n 180 g glucosa
100 g
111 g glucosa
100 g almidón
111 g glucosa
56.7 g alcohol
b) Rendimiento práctico
Se calcula el rendimiento de etanol por 100 g de harina integral de maíz
por 100 g de almidón, considerando que el contenido de almidón de la harina de
maíz es de 60% p/p.
El rendimiento en la práctica industrial, en la que se prepara el mosto con
enzimas de la malta, es de 59 litros de alcohol por 100 kg de almidón.
Esto corresponde aproximadamente a 82% del valor teórico.
c) Eficiencia de la fermentación
rendimiento práctico
Eficiencia =
x 100
rendimiento teórico
47
Biotecnología de Medicamentos y Alimentos
TRABAJO PRACTICO Nº 4
Purificación de α - amilasa de Aspergillus niger
Objetivos del trabajo práctico
Purificar la enzima α-amilasa.
Introducción
Las enzimas industriales se emplean en una variada gama de procesos relacionados con:
industria alimenticia, producción de detergentes, industria textil, curtiembre, diagnóstico
médico, farmacología e ingeniería genética. El mercado más importante corresponde a la
industria agroalimentaria que produce la transformación de alimentos utilizando
proteasas y amilasas para la degradación de distintos polímeros.
Las amilasas, en particular, se utilizan en los procesos de sacarificación para la
producción de jarabes de glucosa y fructosa, en la panificación y en los procesos de
fermentación alcohólica, como suplemento de amilasa de cereales en la producción de
cerveza, licores y alcoholes. A veces, la obtención de enzimas de origen animal o vegetal
resulta inconveniente, debido a que su producción y precio dependen de la disponibilidad
local y estacional.
Por razones técnicas y económicas, los microorganismos constituyen una fuente
apropiada para la obtención de enzimas. Las enzimas microbianas se producen por
métodos sencillos denominados "procesos fermentativos". Las amilasas bacterianas se
obtienen a partir de cultivos sumergidos, técnica que a nivel industrial implica costos
muy altos.
Los hongos, debido a sus características fisiológicas, son capaces de crecer en ausencia
de agua libre en un proceso denominado fermentación en estado sólido, razón por la
cual actualmente se producen enzimas a gran escala utilizando distintas cepas salvajes y
mutantes de Aspergillus, Penicillium, Mucor y Rhizopus.
Como se describió en el TP Nº 4, las amilasas son enzimas que catalizan o aceleran la
hidrólisis del almidón. Todas las α-amilasas son metaloenzimas con gran afinidad por el
calcio. En presencia de este catión, las enzimas adquieren mayor estabilidad frente a T y
pH extremos, proteasas y agentes desnaturalizantes como la urea.
Las α-amilasas fúngicas son obtenidas principalmente de Aspergillus oryzae y niger,
especies no productoras de micotoxinas.
PARTE PRÁCTICA
*Cultivo, condiciones de crecimiento y preparación del extracto enzimático.
• Los conidios de A. oryzae se obtienen a partir de una estría en medio salvado 5% (5 g
salvado, 1,5 g agar-agar en 100 ml de agua) incubada a 37 °C durante 48 hs y
posteriormente a 28 °C durante 7 días.
48
Biotecnología de Medicamentos y Alimentos
• A la estría se le agregan 2-3 ml de agua estéril adicionada con 0,01 % de Tween 80;
se raspa la superficie con una varilla estéril, y se filtra la suspensión de conidios a
través de un embudo con gasa estéril.
• Se toman 1-1,5 ml del inóculo con pipeta estéril y se agregan al sustrato (ver
Preparación del sustrato).
• Se incuba a 37 °C. La máxima actividad enzimática se obtiene a partir de las 36 hs.
• Luego del período de incubación, se agrega 30 - 40 ml de buffer y se disgrega el
micelio que ha crecido con una varilla de vidrio y se agita durante 30 min a 28 °C
para obtener la enzima disuelta en agua.
• Se pasa la suspensión obtenida a traves de un embudo con gasa para separar el
sólido del líquido con la enzima disuelta.
• Se centrifuga 10 min a 11000 rpm en tubos para centrífuga Sorvall.
• Se filtra por membrana de 45 μm de diámetro de poro.
*Preparación del sustrato
• Se autoclavan 10 g de salvado en 10 ml de agua durante 20 min a 121 °C.
• Se deja enfriar y luego se agrega el inóculo.
*Purificación
• Se concentra una alícuota del extracto (ej. 10-20 ml) utilizando una membrana de
diálisis que permite un corte en 3500 Da y polietilenglicol 8000 (PEG 8000) durante
1 h a 4 °C, reduciendo el volumen a la mitad. Tomar nota del volumen y una
pequeña alícuota (ej 1 ml) para medir proteínas y actividad.
• El concentrado se lleva a 20 mM de buffer acetato pH 5.
• Se siembra una alícuota (ej. 5-10 ml) de esta solución en una columna de DEAESepharose de 1 ml de volumen de lecho previamente equilibrada con 4 ml de buffer
acetato 20 mM pH 5.
• Se lava la columna con 4 ml de buffer acetato 20 mM pH 5.
• Se eluye con 5 ml de NaCl 0,3 M en el mismo buffer y se recolectan 3 fracciones de
1 ml cada una. Luego lavar la columna con 5 ml de NaCl 0,5 M y luego guardar en
etanol 20 %.
• Se toma una muestra para realizar un ensayo de actividad enzimática y otra para
determinar proteínas totales.
Determinación de la actividad enzimática por método colorimétrico indirecto de
punto final (Método Lugol)
• Se mezclan 0,4 ml de agua con 0,5 ml de almidón soluble 0,05 % en 20 mM de
buffer acetato pH 5 y se agregan 100 μl de muestra (extracto inicial y fracciones
purificadas) en un volumen final de la reacción de 1 ml. Se incuba a 37 ° durante 7,5
min.
• Se detiene la reacción con el agregado de 10 μl de reactivo de Lugol acidificado.
• El volumen de la muestra se lleva a 5 ml con agua y se mide la absorbancia a 640
nm.
49
Biotecnología de Medicamentos y Alimentos
Agua
Almidón 0,05 %
Muestra
Lugol
Vol. final
Blanco (almidón)
Muestra
0,5 ml
0,4 ml
0,5 ml
0,5 ml
------100 μl
Incubar 7,5 min a 37 °C
10 μl
10 μl
1 ml
1 ml
Se define como una unidad de α-amilasa a la cantidad dde enzima que, en las
condiciones del ensayo, hidroliza 10 mg de almidón en 30 min a un estado en el cual
no hay desarrollo dde color en presencia del reactivo de Lugol.
Determinación de actividad enzimática por método colorimético cinético (Kit
comercial - Wiener Lab)
• Para ver el fundamento del método referirse al protocolo adjunto a la guía de TP.
Para medir actividad en la muestra se sigue el protocolo a 37 °C. Brevemente, se
preincuba 1 ml de reactivo a 37 °C durante 3 min y luego se agrega 20 a 100 µl de
muestra y se registra la absorbancia al min 1 y min 2 a 405 nm.
Determinación de proteínas (Método de Bradford)
• Se va a determinar el contenido de proteínas totales de una alícuota del extracto y de
las fracciones eluídas de la columna de DEAE-Sepharose. En paralelo se construye
una curva de calibrado con Albúmina sérica bovina (1mg/ml).
Blanco
2
5
10
Muestra
Agua
800 µl
798 µl
795 µl
790 µl
BSA
(1mg/ml)
Muestra
-------
2 µl
5 µl
10 µl
-------
-------
-------
-------
-------
10 – 20 µl
Reactivo
Bradford
Vol. Final
200 µl
200 µl
200 µl
200 µl
200 µl
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
El reactivo de Bradford se agrega siempre al final, mezclando bien y se incuba 5 min
a temperatura ambiente antes de leer la absorbancia a 595 nm.
50
Biotecnología de Medicamentos y Alimentos
Actividades:
•
Grafique la curva de calibración que realizó para poder determinar la concentración
de proteína de las fracciones provenientes de las distintas etapas de purificación.
•
Realice una tabla de purificación y calcule el rendimiento (%).
•
Reseñe brevemente los fundamentos de las distintas técnicas de purificación
utilizadas durante la práctica de laboratorio y, en cada caso, el por qué de su elección.
•
Comente los resultados obtenidos.
Tabla de Purificación
Muestra
Volumen
Masa de
proteínas
(π)
Actividad
enzimática (A )
Actividad específica
Ae = A/π
Ind. de purificación
(IP) = Aen /Ae1
Extracto
fracción 1
fracción 2
fracción 3
fracción 4
Rendimiento (%) = (A en volumen total de la fracción/ A en el volumen extracto) x 100
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LINEA LIQUIDA
Amilasa 405
AA
Método cinético a 405 nm para la determinación de
amilasa en suero, plasma u orina. Sustrato CNPG3
SIGNIFICACION CLINICA
La amilasa, producida principalmente en el páncreas exócrino y en las glándulas salivales, escinde los enlaces α-1-4
glucosídicos de los polisacáridos (almidón y glucógeno). Se
encuentra elevada en el suero de pacientes con pancreatitis aguda alcanzando los valores más elevados entre las
24 y 30 horas posteriores al ataque, declinando luego para
volver a los niveles normales entre las 24 y 48 horas siguientes. También se ve aumentada en este caso la excreción urinaria de la enzima, persistiendo la hiperamilasuria 3
a 5 días, luego de que la actividad sérica ha alcanzado los
niveles normales. También es posible encontrar valores
aumentados en cualquier caso de "abdomen agudo" o intervención quirúrgica en regiones próximas al páncreas.
La parotiditis bacteriana y paperas se asocian también con
elevaciones en los niveles de amilasa sérica.
FUNDAMENTOS DEL METODO
La α-amilasa hidroliza el sustrato definido 2-cloro-p-nitrofenilα-D-maltotriósido (CNP-G3) para liberar 2-cloro-p-nitrofenol
(CNP), formándose 2-cloro-nitrofenil-α-D-maltósido (CNPG2), maltotriosa (G3) y glucosa. El CNP absorbe a 405 nm y
la velocidad de aparición del color es directamente proporcional a la actividad enzimática.
El uso de este sustrato definido, sustancia de estructura y
peso molecular conocido, posibilita la expresión de los resultados en U/l y no requiere enzimas auxiliares.
REACTIVOS PROVISTOS
Reactivo: solución conteniendo CNP-G3 2,25 mmol/l, acetato de calcio 6 mmol/l, cloruro de sodio 70 mmol/l, tiocianato
de potasio 900 mmol/l y buffer MES pH 6, 100 mmol/l.
INSTRUCCIONES PARA SU USO
Reactivo Provisto: listo para usar.
PRECAUCIONES
El Reactivo es para uso diagnóstico "in vitro".
ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE
ALMACENAMIENTO
Reactivo Provisto: estable en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.
Cuando el espectrofotómetro ha sido llevado a cero con agua
destilada, las lecturas de absorbancia del Reactivo superiores
a 0,500 D.O. (a 405 nm) son indicio de deterioro del mismo.
MUESTRA
Suero, plasma heparinizado u orina
a) Recolección: si se utiliza suero, obtener de la manera
usual. Separar el suero del coágulo lo más rápidamente posible. En caso de usar plasma éste debe ser heparinizado.
Si se emplea orina, la determinación puede efectuarse en
una muestra de orina ocasional.
b) Aditivos: en caso de usar plasma, debe utilizarse
heparina para su obtención. Si se usa orina ver d).
c) Sustancias interferentes conocidas: no se observan interferencias por bilirrubina hasta 200 mg/l, hemoglobina hasta 0,5 g/dl, ni triglicéridos hasta 13 g/l.
En el caso de orina no debe agregarse ácido clorhídrico
como conservador.
Referirse a la bibliografía de Young para los efectos de las
drogas en el presente método.
d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento:
en suero la amilasa es estable durante una semana a temperatura ambiente (si se evita la contaminación bacteriana)
o varios meses refrigerada.
En orina, si la muestra no se procesa en el día, es conveniente
ajustar el pH aproximadamente a 7 (con hidróxido de sodio)
dado que el pH ácido inactiva la enzima irreversiblemente. A pH
7 puede conservarse refrigerada por lo menos 10 días sin
pérdida de actividad, si no existe contaminación bacteriana.
MATERIAL REQUERIDO (no provisto)
- Espectrofotómetro.
- Micropipetas y pipetas para medir los volúmenes indicados.
- Cubetas espectrofotométricas de caras paralelas.
- Baño de agua a la temperatura de reacción seleccionada.
- Cronómetro.
CONDICIONES DE REACCION
- Longitud de onda: 405 nm
- Temperatura de reacción: 25, 30 ó 37oC
- Tiempo de reacción: 2 minutos
PROCEDIMIENTO
INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS
REACTIVOS
El Reactivo puede presentar una coloración amarillenta que
no afecta su funcionamiento.
A) 25-30oC
En una cubeta mantenida a la temperatura seleccionada, colocar:
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Reactivo
2 ml
Preincubar 3-4 minutos. Luego agregar:
Muestra
100 ul
Mezclar inmediatamente y leer absorbancia luego de 1 y
2 minutos. Determinar la diferencia entre la segunda y la
primera lectura. Utilizar este valor para los cálculos.
Se pueden disminuir proporcionalmente los volúmenes
usando 1 ml de Reactivo y 50 ul de Muestra.
B) 37oC
Como la actividad a esta temperatura es mayor, emplear
50 ul de Muestra. Seguir el procedimiento según A).
Se pueden disminuir los volúmenes usando 1 ml de Reactivo y 20 ul de Muestra.
CALCULO DE LOS RESULTADOS
Amilasa (U/l) = ∆A/min x factor
Temperatura
Reactivo
Muestra
Factor
25-30oC
2 ml
1 ml
100 ul
50 ul
1.628
1.628
37oC
2 ml
1 ml
50 ul
20 ul
3.178
3.953
VALORES DE REFERENCIA
Temperatura
Suero hasta
Orina ocasional hasta
25oC*
84 U/l
455 U/l
30oC*
100 U/l
540 U/l
37oC
125 U/l
680 U/l
* Calculados
Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.
hasta 0,250 D.O.. Para valores superiores se debe utilizar
muestra diluida con solución fisiológica (en caso de orina
diluir 1/10) y corregir consecuentemente los resultados.
PARAMETROS PARA ANALIZADORES AUTOMATICOS
Longitud de onda primaria ...................................... 405 nm
Longitud de onda secundaria (bicromática) .......... 600 nm
Tipo de reacción ..................................................... cinética
Dirección de la reacción ...................................... aumenta
Temperatura de reacción ............................................ 37oC
Relación muestra/reactivo .......................................... 1:40
Tiempo de equilibrio ......................................... 3 segundos
Tiempo de retardo ......................................... 40 segundos
Tiempo de lectura .......................................... 30 segundos
Absorbancia de Blanco .................................. < 0,800 D.O.
Límite de absorbancia ....................................... 2,000 D.O.
Valor normal inferior .................................................... 0 U/l
Valor normal superior .............................................. 125 U/l
Linealidad ............................................................... 2000 U/l
Factor (paso de luz 1 cm) ......................................... 3.178
Coef. extinción molar (ε405) .............. 12,9 [l x mmol-1 x cm-1]
Para las instrucciones de programación consulte el manual
del usuario del analizador en uso.
PRESENTACION
- 3 x 10 ml (Cód. 1021404)
- 3 x 10 ml (Cód. 1009326)
BIBLIOGRAFIA
- Rauscher, E. et al - Clin. Chem. 31/1:14, 1985.
- Tietz, N. - Clinical Guide to Laboratory Tests - W.B. Saunders
Co., 1983.
- Lorenzo, L.; Demaría, I.; Setta, F.; Taborda, M. - 44th National
Meeting, AACC, 19-23 julio, 1992, Chicago, Illinois. Clin.
Chem. 38/6:935, Abs. 3, 1992.
- Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología Molecular - Química Clínica 15/1:51, 1996.
- Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory
Tests", AACC Press, 3rd ed., 1990.
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA.
No pipetear con la boca.
Evitar el contacto con elementos de goma (tapones, contratapas) que deterioran el Reactivo.
PERFORMANCE
a) Reproducibilidad: procesando simultáneamente replicados de una misma muestra en un mismo día se obtienen
los siguientes valores:
Nivel
51 U/l
467 U/l
D.S.
± 0,978 U/l
± 2,139 U/l
C.V.
1,9 %
0,46 %
b) Sensibilidad: depende del fotómetro empleado. En espectrofotómetro a 405 nm con cubetas de caras paralelas
de 1 cm de espesor, para un ∆A/min de 0,001 el mínimo
cambio de actividad detectable será de 4 U/l (a 37oC).
c) Rango dinámico: el rango útil de lectura se extiende
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Elaborado por:
Wiener Laboratorios S.A.I.C.
Riobamba 2944
2000 - Rosario - Argentina
http://www.wiener-lab.com.ar
Dir. Téc.: Viviana E. Cétola
Bioquímica
Producto Inscripto M.S.
Disp. Nº: 154/02
Cert. Nº: 4484/02
Wiener lab.
2000 Rosario - Argentina
Biotecnología de Alimentos y Medicamentos
TRABAJO PRACTICO Nº6
Acción de la invertasa de células inmovilizadas de Saccharomyces cerevisiae
Objetivo:
Inmovilizar células de S. cerevisiae y evaluar la actividad invertasa.
Introducción
El uso de biocatalizadores para llevar a cabo biotransformaciones es un área en
continua expansión. Un aspecto clave del proceso es el uso del catalizador (célula o
enzima) en un sistema continuo que permite extender el uso del mismo en el tiempo
dando como resultado una disminución de los costos del proceso y otras ventajas como
una mayor pureza del producto, mayor productividad, etc. Para lograr este objetivo, es
posible inmovilizar el biocatalizador. La inmovilización consiste en prevenir el
movimiento celular libre por métodos naturales o artificiales.
La inmovilización de células (fig. 1) o enzimas tiene numerosas aplicaciones en
biomedicina, farmacología (producción de antibióticos), producción de bebidas y
alimentos
(producción
exopolisacárido),
de
agricultura
cerveza,
y
ganadería
(producción de esperma para mejoramiento
animal), biorremediación (decoloración de
colorantes
textiles,
remoción
de
metales
pesados), etc.
La
Federación
Europea
de
Biotecnología (1983) define el concepto de
inmovilización de la siguiente manera: “Los
biocatalizadores inmovilizados son enzimas o
células u organelas localizados en cierta región
Fig. 1. Células de levadura
inmovilizadas
definida del espacio, con retención de su
actividad catalítica y, si es necesario, de su viabilidad, y que pueden ser usados de modo
repetido y continuo”. A continuación se aclaran algunos aspectos de esta definición:
Localizados: esto quiere decir que el biocatalizador está compartimentalizado.
Hay una fase sólida que tiene la actividad catalítica y está en contacto con un medio
reactivo líquido libre de catalizador.
Retención de la actividad catalítica (y/o viabilidad): los tratamientos para lograr
la inmovilización reducen la actividad catalítica. Esta reducción no puede superar el 75
% de pérdida de actividad, para que el proceso sea rentable.
54
Biotecnología de Alimentos y Medicamentos
Uso repetido y continuo: aquí reside la gran ventaja de la inmovilización, esto se
relaciona con la fácil separación del catalizador del medio sin pérdida de actividad y por
consecuencia directa, con su reutilización.
Existen distintos métodos de inmovilización:
™ Unión a soportes
¾ Adsorción: sencilla, no daña las células,
pero como la fuerza de unión es baja, se produce elusión
de las células, lo cual produce pérdidas importantes de
células en los procesos continuos.
¾ Uniones
iónicas:
los
soportes
son
intercambiadores iónicos, es una metodología sencilla,
pero cambios en el pH o la concentración de sales, puede
separar las células del soporte.
¾ Uniones
covalentes:
estas
uniones son más fuertes, hay que modificar
proteínas de las células o regiones de la
enzima. Hay que verificar que no haya
pérdida de la actividad catalítica. Es más
costoso.
¾ Entrecruzamiento:
entre
aminoácidos de la proteína y agentes
polimerizantes como el glutaraldehído.
¾ Encapsulación/
Microencapsulación en polímeros: se rodean
células o enzimas físicamente en geles,
microcápsulas o polímeros fibrosos como la
celulosa.
Los
geles
son
polímeros
entrecruzados insolubles en agua, como la
poliacrilamida.
En
el
caso
de
las
Fig. 2: Imágenes de microscopía de barrido de C.
guillermondi inmovilizdas en una cápsula de gel de
alginato, con BaCl2 como agente polimerizante. Las
colonias se distribuyen sobre la superficie (flecha en A) y
en el interior de la cápsula (B)
microcápsulas, las células o enzimas se rodean
de una membrana semipermeable del polímero.
55
Biotecnología de Alimentos y Medicamentos
Las células pueden inmovilizarse sin soportes, y este proceso se llama
floculación. Son células unidas entre ellas. El ejemplo típico es la floculación de cepas
de Zymomonas mobilis empleadas en la producción de etanol a partir de glucosa.
La unión a soportes constituye el método más antiguo. Para esto debe tenerse en
cuenta:
¾ Estructura del soporte
¾ Tipo de unión
¾ Relación entre grupos hidrofílicos e hidrofóbicos
¾ Tamaño de la partícula
¾ Relación superficie/volumen
Se pueden usar soportes preformados, ampliamente usados para inmovilizar
enzimas, y menos para células ya que hay que encontrar condiciones y materiales que
permitan la adhesión celular.
Para la inmovilización de células, se usa la prepara el soporte durante el proceso
de inmovilización. Son soportes porosos que garantizan la completa retención de las
células.
Tipos de soportes:
™ Inorgánicos
¾ Naturales: arena, silicatos, arcillas
¾ Sintéticos: cerámicas, vidrios de porosidad controlada.
™ Orgánicos
¾
Naturales: virutas de madera, colágeno, celulosa, alginatos, carragenatos,
albúmina.
¾
Sintéticos: PVC, polipropileno, poliacrilamida, resinas de intercambio
iónico, epóxidos, poliuretanos.
La selección del material se realiza teniendo en cuenta:
‰
Materiales de alta disponibilidad y bajo costo.
‰
Materiales que permitan un proceso de inmovilización simple y
efectivo respecto de la retención de la actividad.
‰
Materiales con alta capacidad y eficiencia
‰
Materiales que permitan un diseño de reactores sencillo.
56
Biotecnología de Alimentos y Medicamentos
Los dos primeros criterios apuntan al uso de materiales naturales que permitan
técnicas de inmovilización por adsorción. En tanto que los dos últimos, apuntan la
elección hacia soportes orgánicos complejos. De todos modos, la elección final va a
depender del biocatalizador, del proceso en el que va a participar, y del producto que se
desea obtener.
En el caso de inmovilización de células, uno de los mayores problemas es la
resistencia a ala transferencia de masas, impuesta por el hecho de que el sustrato tiene
que difundir hasta el sitio de reacción y los productos de interés del proceso y las
sustancias tóxicas y/o inhibidoras de la reacción deben ser removidos. La transferencia
de oxígeno es también un problema a la hora de diseñar la inmovilización de un tipo
celular. Por esto, en líneas generales, las técnicas de inmovilización han sido aplicadas
principalmente a procesos anaeróbicos con organismos anaeróbicos estrictos o con los
componentes anaeróbicos de microorganismos facultativos.
El azúcar invertido es una mezcla de glucosa y fructosa en cantidades
equivalentes que se obtiene a partir de sacarosa. La conversión de un dímero de
sacarosa en monómeros se produce por la siguiente reacción:
glucosa-fructosa + H2O
sacarosa
glucosa + fructosa
azúcar invertido
Este proceso requiere una molécula de agua que se incorpora químicamente a los
monómeros. Esto es importante ya que el agua libre es removida y el peso del azúcar se
incrementa. Este incremento es significativo en la producción de grandes cantidades de
golosinas, que son comercializadas por peso. Otra característica importante es que el
azúcar invertido es higroscópico, por lo cual, por ej. es incluido en la fabricación de
chicles, para evitar que se resequen y tornen quebradizos; o en la elaboración confituras
bañadas en chocolate para prevenir una excesiva cristalización.
La reacción de conversión está catalizada por ácidos o por la enzima invertasa.
Parte Práctica
Materiales
• Agar-agar 1,2 % en agua;
• células de Saccharomyces cerevisiae en pan;
• aceite vegetal;
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Biotecnología de Alimentos y Medicamentos
•
•
sacarosa 20 % p/v;
buffer acetato 0,1 N, pH 5; agua para lavados.
Esquema de trabajo
Agar-agar 1,2 % p/v
células de Saccharomyces cerevisiae
esterilización
Mezcla a 50º C 25 % p/p
fase hidrofóbica
(aceite vegetal)
agitación
(formación de esferas)
enfriamiento a 0º C
lavado, filtración, recolección de esferas
llenado de la columna
sacarosa 20 % p/v
contacto, 15 min. t. amb.
Dosaje de glucosa por test de glicemia
En el caso del TP, se utilizará el test para la determinación de glucosa en sangre,
de uso habitual en los laboratorios de análisis clínicos, ya usado en el TP Nº 3.
58
Biotecnología de Alimentos y Medicamentos
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