Uso de levaduras como productores de proteinas de interés farmacéutico INTRODUCCION Un microorganismo de uso industrial debe producir la sustancia de interés; debe estar disponible en cultivo puro; debe ser genéticamente estable y debe crecer en cultivos a gran escala. Otra característica importante es que el microorganismo industrial crezca rápidamente y produzca el producto deseado en un corto período de tiempo. El microorganismo debe también crecer en un relativamente barato medio de cultivo disponible en grandes cantidades. Además, un microorganismo industrial no debe ser patógeno para el hombre o para los animales o plantas. Así tenemos las levaduras las cuales se vienen utilizando desde hace miles de años para la fabricación de pan y bebidas alcohólicas. La levadura que sin duda fue la primera y aún hoy en día sigue siendo la más utilizada por el hombre es Saccharomyces cerevisiae de la que se emplean diferentes cepas para la fabricación de cerveza, vino, pan y alcoholes industriales. Kluyveromyces fragilis es una especie fermentadora de la lactosa que se explota en pequeña escala para la producción de alcohol a partir del suero de la leche. Yarrowia lipolytica es una fuente industrial de ácido cítrico. Página 1 Uso de levaduras como productores de proteinas de interés farmacéutico ORIGEN El descubrimiento de la levadura de pasta natural se atribuye a los egipcios. Sin duda, se debió al azar. Un trozo de masa agria que provenía de otra anterior se añadiría a una masa nueva y el resultado fue notable y apreciado. En efecto, la masa así obtenida era mucho más ligera, y el pan, menos pesado después de cocción. DEFINICIÓN Se denomina levadura a cualquiera de los diversos hongos microscópicos unicelulares que descomposición son importantes mediante por fermentación su de capacidad diversos para cuerpos realizar la orgánicos, principalmente los azúcares o hidratos de carbono, produciendo distintas sustancias Las levaduras son minúsculos organismos vivos, micro hongos monocelulares que crecen y se multiplican prodigiosamente. La levadura se reproduce por gemación y por división. Los medios nutritivos más apropiados para la multiplicación de las células son los siguientes: los azúcares, las sales minerales, las materias nitrogenadas y el oxígeno. La melaza, subproducto del azúcar, constituye su mejor medio nutritivo si se le añaden productos nitrogenados. Aunque en algunos textos de botánica se considera que las levaduras "verdaderas" pertenecen sólo a la clase Ascomycota, desde una perspectiva microbiológica se ha denominado levadura a todos los hongos con predominio de una fase unicelular en su ciclo de vida, incluyendo a los hongos basidiomicetes. A veces suelen estar unidos entre sí formando cadenas. Producen enzimas capaces de descomponer diversos sustratos, principalmente los azúcares. Página 2 Uso de levaduras como productores de proteinas de interés farmacéutico Una de las levaduras más conocidas es la especie Saccharomyces cerevisiae. Esta levadura tiene la facultad de crecer en forma anaerobia1realizando fermentación. La fabricación de la levadura Se hace a partir de una célula única que se alimenta para que se multiplique. El proceso parte del laboratorio para llegar a las salas de cultivo y de ellas, finalmente, a las cubas de fermentación comercial, que se llenan regular y constantemente con elementos nutritivos y que se airean a fin de llevar el oxígeno necesario para la reproducción de las células. La melaza, que constituye la materia principal de este alimento, es el residuo de la fabricación del azúcar de remolacha; se presenta bajo el aspecto de un jarabe espeso, muy rico en sacarosa. Realizado el cultivo, las levaduras producidas son separadas del líquido residual por medio de centrifugadoras; el producto obtenido se pasa por un filtro de vacío y después por una moledora, a la salida de la cual los panes de levadura son troceados y empaquetados. La levadura provoca la fermentación de los azúcares de la harina, que se traduce en una liberación gaseosa que facilita la subida del pan y su estructura alveolado. Asimismo, tiene la propiedad de descomponer el azúcar en alcohol y anhídrido carbónico, gracias a las enzimas que contiene, y por supuesto, influye en la coloración de la corteza del pan y a través de los productos secundarios de la fermentación, en su aroma. Página 3 Uso de levaduras como productores de proteinas de interés farmacéutico QUÉ SON LAS LEVADURAS * Hongos microscópicos unicelulares * Importantes por su capacidad de fermentación * Produciendo distintas sustancias. * Las levaduras son abundantes en la naturaleza * Se encuentran en el suelo y sobre las plantas * Hongo perteneciente al phylum Ascomycota. * Su reproducción se da por gemación. PARA QUE SIRVEN * Producción de vino * Alimentos fermentados (pan, cerveza derivados lácteos) * La biotecnología, es decir, la utilización de organismos vivos o de sus partes en procesos industriales, es casi tan antigua como el hombre. Página 4 Uso de levaduras como productores de proteinas de interés farmacéutico CARACTERÍSTICAS GENERALES Las levaduras se clasifican en base a sus caracteres morfológicos, aunque para algunos microbiólogos, sus propiedades fisiológicas tienen mayor importancia. La mayoría de las levaduras son hongos unicelulares sencillos microscópicos, la mayoría se reproducen asexualmente por gemación, y otras especies lo hacen por fisión múltiple. Las levaduras que pueden reproducirse sexualmente se conocen como “verdaderas”, este proceso implica la formación de ascosporas, sirviendo la propia levadura como asca, de aquí que ellas se clasifican como Ascomicetos; por el contrario las “falsas” que no producen ascosporas, pertenecen a los hongos imperfectos. CARACTERÍSTICAS DE CULTIVO En la mayoría de los casos, el crecimiento en masa de las levaduras no resulta apropiado para su identificación. En los cultivos con agar, es difícil diferenciar las colonias de levaduras de las colonias bacterianas, por lo que la observación microscópica es la única forma segura que existe para poderlas diferenciar. La mayoría de las colonias jóvenes de levaduras son húmedas y algo mucosas, y es posible que tengan aspecto harinoso. La mayoría de las colonias son blanquecinas, algunas tienen un color crema o rosado. Algunas colonias cambian poco de aspecto cuando envejecen, otras se secan y se vuelven rugosas. Las levaduras son oxidativas, fermentativas, o bien su actividad metabólica es a la vez de ambos tipos. En la superficie de un líquido, las levaduras oxidativas pueden crecer en forma de película, de velo, o de espuma, y por ello se denominan levaduras formadoras de película. Las levaduras fermentativas suelen crecer en toda la masa del líquido y producen dióxido de carbono. CLASIFICACIÓN E IDENTIFICACIÓN La clasificación de las levaduras es compleja, no obstante el desarrollo de nuevas técnicas basadas en Biología Molecular, ha permitido separar o reagrupar las especies. Las levaduras pertenecen al Reino Fungi y dentro de él a la división Eumicota que agrupa a los hongos verdaderos. En esta división, las levaduras se Página 5 Uso de levaduras como productores de proteinas de interés farmacéutico incluyen en 2 de las 5 subdivisiones de los Eumicetos (Tabla 1), la Ascomycotina representada por las levaduras capaces de producir ascosporas, llamadas por ello esporógenas, y la Deuteromycotina representadas por las levaduras incapaces de formar esporas llamadas no esporógenas. Los géneros de las levaduras esporógenas englobados todos ellos en la familia Saccharomycetaceae, se distribuyen en 3 subfamilias. Los géneros de las levaduras no esporógenas constituyen la familia Cryptococcaceae. Además las levaduras pueden ser clasificadas por debajo de los taxones género y especie, en subespecies y variedades, que a menudo adquieren rango de especie tras nuevas revisiones taxonómicas, o varias especies son unificadas en una sola como subespecies de la misma, con lo que la clasificación se complica aún más y se incrementa el número de sinonimias. Los principales criterios utilizados para la clasificación e identificación de las levaduras son los siguientes: 1.- Producción de ascosporas. 2.- Aspecto de las células vegetativas: forma, tamaño, color, inclusiones. 3.- Forma de reproducción asexual. 4.- Producción de micelio. 5.- Forma de película en medio liquido. 6.- Color de la colonia. 8.- Propiedades fisiológicas: producción de ácido, actividad ureásica. 9.- Caracterización bioquímica (Frazier y Weathoff, 1998; Hayes, 1993): - Fermentación de glucosa, galactosa, sacarosa, maltosa, lactosa y rafinosa. - Crecimiento en 18 sustratos carbonados: Pentosas: D-xilosa, L-arabinosa, D-ribosa, L-ramnosa. Hexosas: D-glucosa. Disacáridos: sacarosa, maltosa, celobiosa, trehalosa, lactosa. Trisacáridos: rafinosa. Polisacáridos: almidón. Alcoholes: eritriol, ribitol, D-manitol, inositol. Ácidos orgánicos: ácido succínico, ácido cítrico. Página 6 Uso de levaduras como productores de proteinas de interés farmacéutico - Asimilación de nitratos. - Crecimiento a 37ºC. - Crecimiento en medio con vitaminas. - Producción de almidón. SELECCIÓN DE LEVADURAS El estudio de la dinámica, cuantificación y composición de la microbiota responsable de las fermentaciones espontáneas, ha mostrado diferencias tanto cualitativas como cuantitativas, en las levaduras aisladas en una misma zona vitivinícola e incluso dentro de los depósitos de una misma bodega. Las causas de esta variabilidad pueden ser: cambios en las técnicas de aislamiento, cambios en las condiciones climáticas, etc. Por tanto, la necesidad de asegurar la fermentación alcohólica, así como la tipicidad y reproducibilidad de los vinos, requiere cada vez más, el uso de cultivos iniciadores. Las levaduras seleccionadas se han utilizado con excelentes resultados en muchos países, obteniéndose productos finales de calidad más uniforme que los que se producían con las fermentaciones espontáneas. Este último punto es el que genera el debate acerca de la utilización o no de inóculos, ya que garantizan repetitividad a expensas de perder algo de complejidad en el producto. A pesar de que existen levaduras comerciales para realizar las fermentaciones, es más efectivo el uso de cultivos puros de levaduras que procedan de la zona donde se van a utilizar, lo que se conoce como levaduras locales seleccionadas, ya que se cree que las levaduras que se encuentran en una microzona son: específicas del área, totalmente adaptadas a las condiciones climáticas de la zona y a la materia prima, es decir al mosto a fermentar, son responsables al menos parcialmente, de las características únicas de los productos obtenidos. Las características propias de la zona pueden ser por tanto, un aspecto interesante a la hora de seleccionar una levadura, aunque hay muchos otros que también se tienen que tomar en cuenta. La importancia de estos parámetros Página 7 Uso de levaduras como productores de proteinas de interés farmacéutico puede ser relativa, dependiendo del producto para el cual quieren ser utilizados, algunos de los criterios utilizados para seleccionar levaduras se pueden observar mas adelante. Por tanto, la selección de la cepa adecuada para cada tipo de fermentación es una estrategia muy importante para garantizar por un lado una fermentación correcta, así como para mejorar las características del producto final, ya que las levaduras pueden producir compuestos que den un toque de distinción al producto obtenido, tales como el glicerol, ésteres, alcoholes superiores, etc. NOMBREMOS ALGUNAS LEVADURAS * Derbayomyces spp * Pichia spp * Hanseniasporas spp * Candida spp * Brettanomyces spp * Schizosaccharomyces spp * Schwanniomyces spp * Saccharomycodes spp * Zygosaccharomyces spp * Saccharomyces spp Saccharomyces spp. POSICION TAXONOMICA * Phylum: Ascomycota * Clase: Hemiascomycetes * Orden: Saccharomycetales * Familia: Saccharomycetaceae Página 8 Uso de levaduras como productores de proteinas de interés farmacéutico DESCRIPCION MORFOLOGICA * Hongo levaduriforme * Presenta células alargadas, globosas a elipsoidales con gemaciones o blastoconidios multilaterales * Mide (de 3-10 x 4,5-1 μm) * Presenta una pared lisa * Las colonias en agar Sabouraud son cremosas, blandas y blancas. PRODUCCION DE LEVADURAS Y SUB-PRODUCTOS Saccharomyces cerevisiae Panificacion, cerveza, vinos, bebidas destiladas, etanol, sidra, levadura para alimentacion humana y animal, sub-productos de levadura (autolisados, hidrolizados, proteinas, componentes: aa, vitaminas, invertasa, etc) Saccharomyces uvarum: cerveza Saccharomyces sake sake (Vino oriental) Página 9 Uso de levaduras como productores de proteinas de interés farmacéutico Saccharomyces bayanus Vinos burbujeantes Saccharomyces lactis lactasa Saccharomyces fragilis Alimentos, suplementos animales, etanol Saccharomyces cerevisiae Una de las levaduras más conocidas es la especie (Saccharomyces cerevisiae). Esta levadura tiene la facultad de crecer en forma anaerobia realizando fermentación alcohólica. Por esta razón se emplea en muchos procesos de fermentación industrial, de forma similar a la levadura química, por ejemplo en la producción de cerveza, vino, pan, producción de antibióticos, etc. La levadura de cerveza (Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E.C.Hansen) es un hongo unicelular, un tipo de levadura utilizado industrialmente en la fabricación de pan, cerveza y vino. El ciclo de vida de las levaduras alterna dos formas, una haploide y otra diploide. Ambas formas se reproducen de forma asexual por gemación. En condiciones muy determinadas la forma diploide es capaz de Página 10 Uso de levaduras como productores de proteinas de interés farmacéutico reproducirse sexualmente. En estos casos se produce la meiosis en la célula formándose un asca que contiene cuatro ascosporas haploides. S. cerevisiae es uno de los modelos más adecuados para el estudio de problemas biológicos. Es un sistema eucariota, con una complejidad sólo ligeramente superior a la de la bacteria pero que comparte con ella muchas de sus ventajas técnicas. Además de su rápido crecimiento, la dispersión de las células y la facilidad con que se replican cultivos y aíslan mutantes, destaca por un sencillo y versátil sistema de transformación de ADN. Por otro lado, la ausencia de patogenicidad permite su manipulación con las mínimas precauciones. S. cerevisiae es un sistema genético que, a diferencia de la mayoría de los otros microorganismos, presenta dos fases biológicas estables: haploide y diploide. La fase haploide permite generar, aislar y caracterizar mutantes con mucha facilidad, mientras que en la diploide se pueden realizar estudios de complementación. Una levadura haploide contiene 16 cromosomas que varían en tamaño de 200 a 2200 kilobases (kb). Ventaja Una ventaja adicional de este microorganismo consiste en que se conoce la secuencia completa de su genoma y se mantiene en constante revisión. Ello ha permitido la manipulación genética de los casi 6600 genes que codifica el genoma de levadura, el uso extensivo de micromatrices de ADN para investigar el transcriptoma y estudios a escala genómica de, entre otros muchos aspectos, la expresión génica, localización de proteínas y la organización funcional del genoma y el proteoma. La maquinaria molecular de muchos procesos celulares se encuentra conservada tanto en levaduras como en plantas y en mamíferos. Esto se ilustra con el hecho Página 11 Uso de levaduras como productores de proteinas de interés farmacéutico de que rutinariamente se han introducido genes de eucariotas superiores en levaduras para el análisis sistemático de su función. Por estas razones, S. cerevisiae se ha convertido en una importante herramienta a gran escala de análisis de genómica funcional, proporcionando un punto de partida para el análisis de organismos eucariotas más complejos. Al ser un organismo unicelular con una tasa de crecimiento rápida, la levadura se puede utilizar para los estudios de células que resultarían muy complicados o costosos en organismos multicelulares. Las utilidades industriales más importantes de esta levadura son la producción de cerveza, pan y vino, gracias a su capacidad de generar dióxido de carbono y etanol durante el proceso de fermentación. Básicamente este proceso se lleva a cabo cuando esta levadura se encuentra en un medio muy rico en azúcares (como la D-glucosa). En condiciones de escasez de nutrientes, la levadura utiliza otras rutas metabólicas que le permiten obtener un mayor rendimiento energético, y por tanto no realiza la fermentación. Desde el punto de vista científico, este microorganismo se ha empleado como modelo simple de la célula eucariota. Esto se debe a una serie de ventajas como su facilidad de cultivo y su velocidad de división celular (aproximadamente dos horas). Nutrición de S. cerevisiae Las fuentes de carbono utilizadas por las levaduras varían desde los carbohidratos hasta los aminoácidos. Además, la capacidad de utilizar ciertos tipos de azúcares ha sido tradicionalmente empleada para la caracterización de las distintas razas que esta especie presenta. Entre los azúcares que puede utilizar están monosacaridos como la glucosa, fructosa, manosa y galactosa, entre otros. También son capaces de utilizar disacáridos como la maltosa y la sacarosa y trisacáridos como la rafinosa. Uno de los azúcares que no puede metabolizar es la Página 12 Uso de levaduras como productores de proteinas de interés farmacéutico lactosa, utilizándose este azúcar para distinguir esta especie de Kluyveromyces lactis . También es capaz de utilizar otras fuentes de carbono distintas a carbohidratos y aminoácidos. Entre las más destacadas se encuentra la capacidad de utilizar tanto etanol como glicerol. Por norma general, las levaduras mantienen dos tipos de metabolismo muy bien diferenciados. Por una parte, en condiciones en las que existen altas concentraciones de glucosa, fructosa o maltosa, la tendencia es a realizar una fermentación alcohólica de estos, es decir, se realiza la glucólisis y posteriormente se forma etanol. Una vez que estos azúcares escasean, se produce la respiración del etanol, vía ciclo de Krebs. Evolutivamente esto es un proceso que, a priori, no es ventajoso por ser energéticamente desfavorable para la reproducción del organismo, dado que se obtiene mucha menos energía en el primer proceso que en el segundo. No obstante, la gran mayoría de los organismos son muy sensibles al etanol, por lo que se ha entendido como un proceso de competencia por sustrato. Las levaduras, además de necesitar una fuente de carbono, necesitan tanto fuentes de nitrógeno —como podrían ser el amonio, la urea o distintos tipos de aminoácidos— como fuentes de fósforo. Además, son necesarias vitaminas como la Biotina, también llamada Vitamina H, y distintos elementos traza Página 13 Uso de levaduras como productores de proteinas de interés farmacéutico Las levaduras pueden ser haploides o diploides según el estadio del ciclo. No obstante, ambos tipos celulares son estables y se pueden reproducir de forma asexual mediante mitosis. La división es por gemación, es decir, las células hijas son de tamaño inferior al de las células madre. Como ya se ha comentado antes, sólo las células haploides se pueden reproducir sexualmente, por lo que si una célula de tipo a se encuentra con una célula de tipo α se fusionarán en una sola célula, la cual también sufrirá una fusión de núcleos, formándose un diploide estable que también es capaz de reproducirse de forma asexual. Cuando las condiciones exteriores son desfavorables para las células diploides, sobreviene la meiosis, que provocará la aparición de cuatro esporas haploides, dos de las cuales serán de tipo sexual a y las otras dos de tipo sexual α. Diferencias entre células a y α Las células a producen el "Factor a", que es una feromona peptídica que indica la presencia de células de ese mismo tipo a células del sexo opuesto. Las células a no responderán en ningún caso al factor a, pero sí lo harán si en las inmediaciones existe Factor α. Este tipo de respuesta desencadena la formación de una protuberancia en las células hacia la fuente de las feromonas de sexo Página 14 Uso de levaduras como productores de proteinas de interés farmacéutico contrario y es recíproco. En la actualidad se conocen las bases moleculares que rigen este comportamiento, el cual se debe a la transcripción o represión de genes en los dos tipos sexuales de levaduras. Las células a transcriben los genes que producirán el factor a, además de un receptor de membrana que se conoce con el nombre de Ste2p. Dicho receptor es capaz de unirse al factor α y desencadenar una serie de señales intracelulares mediadas por la proteína G. Además, las células a reprimen la expresión de los genes que formarán las proteínas necesarias para la síntesis del factor α y el receptor de membrana Ste3p. En las células α ocurre exactamente lo contrario a lo descrito. Todas estas diferencias entre activación y represión transcripcional son causadas por la presencia de uno de los dos alelos de un locus denominado MAT: MATa o Matα. El alelo Mata codifica para una única proteína denominada a1. El alelo Matα codifica para α1 y α2, que en los haploides dirigen la transcripción del programa específico de las células α. Diferencias entre células haploides y diploides Las células haploides de cualquiera de los sexos responde a la feromona producida por el sexo contrario. Las células de sexo opuesto podrán fusionarse, formando una célula diploide. Las células haploides nunca podrán realizar la meiosis en condiciones normales. Por el contrario, las células diploides no producen ni responden a ninguno de los dos tipos de feromonas, pero sí pueden realizar meiosis bajo condiciones ambientales muy determinadas. Al igual que existen patrones de expresión génica entre células a y α, también existen diferencias entre la expresión génica entre células haploides y diploides. Un ejemplo de esto último es el caso de la endonucleasa HO, que es expresada en las células haploides, o el caso de IME1, cuya expresión está reprimida en los diploides. Las diferencias entre los patrones de expresión entre haploides y diploides son producidas por el locus MAT. Las células haploides sólo contienen una copia del locus MAT, en cualquiera de sus varientes alélicas, y esta determinará el sexo de la célula. Los diploides resultan de la fusión celular entre células de distinto sexo, por lo que presentan los dos loci. La combinación en la Página 15 Uso de levaduras como productores de proteinas de interés farmacéutico información contenida en ambos loci genera el programa transcripcional, es decir, la combinación entre las proteínas a1, α1 y α2. Productos de la fermentación :El interés alimentario de Saccharomyces cerevisiae se debe a la capacidad de dicho organismo de esponjar el pan y por otra parte por el producto final que se obtiene de la fermentación alcohólica (la cerveza y el vino). Estos procesos ocurren debido a la metabolización de los azúcares de la masa o el mosto (esencialmente glucosa, fructosa, sacarosa o maltosa) para generar dióxido de carbono y alcohol etílico o etanol. El primero es un gas que provoca que la masa del pan suba (y las burbujas del cava), mientras que el segundo es el origen de las bebidas alcohólicas. La fermentación proporciona energía a la levadura independientemente de la presencia o no de oxígeno siendo una reacción endógena de oxidación-reducción (redox), durante la cual la mitad de la molécula de azúcar hace de donadora de electrones a la otra mitad. Vida microscópica : Saccharomyces cerevisiae es un organismo unicelular. De forma más o menos redondeada, la célula presenta un núcleo diferenciado, siendo por lo tanto un organismo eucariota (en griego, eu- verdadero; carion- núcleo), como lo son también las plantas o los animales. Las células de la levadura se multiplican rápidamente por gemación, una forma asimétrica de reproducción asexual: a partir de una célula se origina una protuberancia que va creciendo y acaba dando lugar a otra célula, más pequeña (al principio) que la célula inicial y diferenciada genéticamente de la célula original. En condiciones óptimas, este tipo de reproducción dura unas dos horas y permite la colonización total de los mostos en cuestión de horas o días. Esto es muy importante en las fermentaciones vínicas, donde hay la competencia por parte de otros hongos, levaduras y bacterias que pueden dañar el vino, por lo que hay que controlar bien las condiciones y duración del proceso para evitar la proliferación de éstos. El rápido crecimiento ha sido clave a la hora de elegir esta levadura como herramienta para la investigación y las aplicaciones biotecnológicas. Página 16 Uso de levaduras como productores de proteinas de interés farmacéutico Estrategias vitales: La buena vida no dura siempre, tampoco para la levadura; esto condiciona su ciclo vital y estrategia reproductiva. En condiciones óptimas, la fermentación explosiva y la reproducción asexual por gemación representan ventajas evolutivas, pero cuando el alimento (o sea, los azúcares) se agota, la estrategia debe cambiar. La primera adaptación es pasar de un metabolismo fermentativo a uno respiratorio, en el que los azúcares y el etanol producido a partir de éstos son metabolizados completamente a dióxido de carbono con consumo de oxígeno, un proceso mucho más eficaz que la fermentación, pero también más lento. Este metabolismo oxidativo de la levadura es el principal causante de la maduración ("solera") de los vinos de Jerez. La sexualidad de las levaduras El ciclo vital de los eucariotas que se reproducen sexualmente alterna células diploides (con dos copias de cada cromosoma, 2n) y haploides (una única copia de cada cromosoma, n). En los animales, por ejemplo, la forma somática (el animal tal como lo vemos) es diploide (2n) mientras que las células sexuales, los gametos, son haploides (n), producto de la meiosis. Durante la fecundación, los gametos se fusionan y dan un cigoto diploide sumándose sus respectivas dotaciones cromosómicas. En Saccharomyces cerevisiae existen las cepas heterotálicas, que presentan formas vegetativas tanto haploides como diploides, ambas capaces de reproducirse asexualmente y formar colonias. Proteínas Obtenidas Proteína quinasa codificada por el gen CDC28 del Saccharomyces cerevisiae y necesaria para la progresión desde la FASE G1 a la FASE S del CICLO CELULAR. Miembro de la familia Rho de PROTEINAS DE UNIÓN AL GTP MONOMÉRICAS, de SACCHAROMYCES CEREVISIAE. Interviene en acontecimientos morfológicos relacionados con el ciclo celular. Página 17 Uso de levaduras como productores de proteinas de interés farmacéutico Proteína de secuencia específica de unión al ADN que tienen un importante papel como regulador general del control del ciclo celular de las levaduras. Contiene un dominio MADS-box en los 56 aminoácidos N-terminal. Se trata de una de las cuatro principales proteínas que definen estructuralmente la superfamilia de PROTEÍNAS DE DOMINIO MADS. Conjunto de proteínas nucleares de SACCHAROMYCIES CEREVISIAE requeridas para la represión transcripcional de los locus silentes de tipo apareamiento. Median en la formación de CROMATINA silenciada y además reprimen la transcripción y la recombinación en otros locus. Están compuestas de 4 proteínas interactuantes no homólogas, Sir1p, Sir2p, Sir3p y Sir4p. La Sir2, HISTONA DESACETILASA NAD-dependiente, es el miembro fundador de la familia de SIRTUINAS SACCHAROMYCES LACTIS Origen: Levaduras (Saccharomyces lactis, S. fragilis, Torula cremoris) y Fúngico (Aspergillus niger, Streptomyces coelicor, más termorresistente). Acción: Cataliza la hidrólisis de la lactosa en glucosa y galactosa, desde los extremos de los restos de galactosa; siendo los dos monosacáridos resultantes más dulces y más fácilmente asimilables. pH óptimo: 4-7. Aplicaciones: Como la lactosa es de menor solubilidad que los otros azúcares, tiene tendencia a cristalizar en concentrados de leche y de suero lácteo. Esta cristalización va acompañada de una desestabilización del complejo de caseinato de calcio, lo que conduce fácilmente en el almacenamiento frío de leches condensadas, helados de leche y de crema y concentrados de suero lácteo a floculaciones, con formación de sedimentos granulosos o arenosos. Esto se puede evitar -obteniendo productos suaves al paladar- si se hidroliza por lo menos el Página 18 Uso de levaduras como productores de proteinas de interés farmacéutico 20% y hasta el 50% de la lactosa presente mediante la adición de lactasa. En condensados lácteos que se elaboran con adición de sacarosa conviene agregar ésta sólo después de su tratamiento con lactara, pues la presencia de sacarosa retarda considerablemente la velocidad de hidrólisis por la lactasa. Otra aplicación tecnológica de la lactasa es en la elaboración de leches delactosadas, destinadas a la alimentación infantil y de adultos que presentan una intolerancia a la lactosa por déficit de su lactasa intestinal. METODO DE PRODUCCIÓN DE LEVADURAS * Fed-batch (batch alimentado) * cultivo aerobico * generalmente a 30º C * Medio de cultivo: * Melazas de caña y/o remolacha diluidas (adicionadas durante el cultivo para minimizar la produccion de Alcohol) (1% de azucares fermentables) * corn steep liquor (optativo) * Generalmente se agrega un suplemento de amonio y fosfatos * El pH se mantiene entre 4 y 6 IDENTIFICACION BIOQUIMICA DE LEVADURAS * Ureasas (rojo purpura) * Nitrato-reductasa (rojo) Nota. Fenol oxidasa especifica OTRAS PRUEBAS * Asimilación de nutrientes * Enzimáticos * Sistemas semiautomáticos Página 19 Uso de levaduras como productores de proteinas de interés farmacéutico PROCESOS POSTERIORES A LA PRODUCCIÓN Levadura seca activa: Se somete a un proceso de secado con aire caliente durante un periodo de 6 horas. Se envasa a vacio o en ambiente de nitrógeno. El agregado de antioxidantes y surfactantes no iónicos permiten aumentar su estabilidad. Levadura cervecera: Las cepas de S. cerevisiae y S. carlbergensis (uvarum) se usan como cultivos puros que se propagan y luego se inoculan en el mosto de fermentación. Al cabo de la misma se recuperan y vuelven a utilizarse en un nuevo proceso (previo control) o se secan y disponen para alimentacion animal. Se recomiendan hasta 20 reciclados de un cultivo puro. Levadura de compresión: Centrifugación - Secado (por filtración, hasta 30 % de sólidos) - Mezclado (con agregado de emulsificantes y aceites vegetales)Extrusión- Envasado- Conservación en frío. METODOS MOLECULARES DE IDENTIFICACIÓN * Enzimas de restricción. * (PCR) para amplificar selectivamente fragmentos del ADN ribosomal ACTUALIDAD Las técnicas moleculares se aplican en algunos géneros concernientes a la industria, pero sobre todo en la identificación de levaduras de interés clínico, para lo cual se han desarrollado sondas genéticas y ensayos rápidos basados en la reacción en cadena de la polimerasa PCR. Página 20 Uso de levaduras como productores de proteinas de interés farmacéutico ESQUEMA DE UN PROCESO INDUSTRIAL * Propagación de cultivos: lo que se realiza en el laboratorio, que contiene un repique reciente del microorganismo previamente seleccionada. * Fermentación: siembra en el tanque de inoculo para la transformación de la materia prima * Operaciones: separacion que se da por decantación, y purificación: que se da por filtración. Página 21 Uso de levaduras como productores de proteinas de interés farmacéutico BIBLIOGRAFIA Monografía redactada por los doctores Rodolfo Ertola, Osvaldo Yantorno y Carlos Mignone, Programa Regional de Desarrollo Científico y Tecnológico de la OEA. www.google/La nueva biotecnología enológica.htm www.monografias/levaduras.htm www.google/Levaduras en crecimiento.htm Biotecnología, introducción con experimentos modelos. http://alezamora.galeon.com/aficiones1893538.html Página 22