Ver/Abrir - Repositorio Institucional de la Universidad de La Habana
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UNIVERSIDAD DE LA HABANA INSTITUTO DE FARMACIA Y ALIMENTOS TESIS EN OPCIÓN AL TÍTULO DE MÁSTER EN QUÍMICA FARMACÉUTICA EVALUACIÓN FARMACOGNÓSTICA, FITOQUÍMICA Y BIOLÓGICA DE Piper aduncum subsp. ossanum Trel. Autora: Ing. Camilla Angelevna Jiménez Jiménez La Habana 2016 UNIVERSIDAD DE LA HABANA INSTITUTO DE FARMACIA Y ALIMENTOS Tesis en opción al título de Máster en Química Farmacéutica EVALUACIÓN FARMACOGNÓSTICA, FITOQUÍMICA Y BIOLÓGICA DE Piper aduncum subsp. ossanum Trel. Autor: Ing. Camilla Angelevna Jiménez Jiménez Tutores: Dra. C. Yamilet I. Gutiérrez Gaitén MC. Ramón Scull Lizama Dra. C. Lianet Monzote Fidalgo Asesor: MC. Gastón García Simón Lic. Arturo Sánchez Fariñas La Habana 2016 A mi hijo Ernesto Makcim que es mi razón de ser, A mi familia y a mis amigos Yeised y Ernesto, ya que sin ellos no lo hubiera podido lograr. A mis tutores Yamilet, Scull y Lianet y asesores Arturo y Gastón por su apoyo y dedicación. En fin, a todos que de una forma u otra han colaborado en mi superación profesional. Resumen RESUMEN Piper aduncum subsp. ossanum Trel. es endémica de Cuba, ha sido utilizada tradicionalmente por su amplia gama de propiedades medicinales, destacándose como hemostático, diurético, antiséptico y antirreumático. El trabajo presenta el estudio farmacognóstico, fitoquímico y biológico de la especie en función de dos sitios de colecta (Bauta y Ceiba del Agua). Se realizó la evaluación macroscópica y microscópica, se determinaron parámetros físico-químicos a la droga cruda, contenido de aceite esencial y su análisis por CG-EM. Se estimó el perfil químico de los extractos hidroalcohólicos, donde se consideró el análisis por cromatografía en capa delgada, CLAR y cuantificación de fenoles totales por el método de FolinCiocalteu. Se evaluó la actividad antimicrobiana del aceite esencial frente a un panel de protozoos, bacterias y hongos de importancia médica y actividad analgésica de los extractos hidroalcohólicos por el ensayo de contorsiones en ratones. El estudio farmacognóstico permitió establecer las especificaciones de calidad de las hojas, siendo trascendental sus características micromorfológicas y sus parámetros físico-químicos. Los métodos de análisis empleados para establecer el perfil químico de los extractos permitió observar una similitud entre los dos sitios de colecta, excepto en el contenido de fenoles totales, asimismo permitieron sugerir la presencia de flavonoides y fenoles en general, entre otros compuestos. El porcentaje de aceite esencial fue mayor para la muestra procedente de Bauta. El análisis por CG-EM permitió establecer algunas diferencias según el lugar de colecta e identificar la piperitona, alcanfor y viridiflorol como mayoritarios y otros no informados con anterioridad para la especie, como el silvestreno, calareno y nerolidiol. El aceite esencial de ambas procedencias mostró evidencias como antimicrobiano, en particular frente a protozoos parásitos, principalmente, contra Plasmodium falciparum. Los extractos hidroalcohólicos manifestaron propiedad analgésica bajo las condiciones ensayadas. Índice ÍNDICE Pág. INTRODUCCIÓN………………………………………………………………….... 1 CAPÍTULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA……………………………………... 4 I.1. Familia Piperácea. Generalidades…….…………………..……………….. 4 I.2. Género Piper…………………………...………………………………………. 4 I.2.1. Hábitat y distribución………………………….………………………... 4 I.2.2. Usos tradicionales...……………………………………………………. 5 I.2.3. Composición química y actividad biológica…………..……………… 6 I.3. P. aduncum subsp. ossanum Trel........................................................... 10 I.3.1. Descripción botánica de la especie…………………………………… 10 I.3.2. Hábitat y distribución. Situación en Cuba……………………………. 11 I.3.3. Usos tradicionales………………………………………………………. 12 I.3.4. Composición química y actividad biológica………………………….. 12 I.4. Aceites esenciales. Generalidades………………………………………… 14 I.5. Compuestos fenólicos. Generalidades…………………………………… 16 CAPÍTULO II. MATERIALES Y MÉTODOS…………………………………….. 19 II.1. Recolección, selección y procesamiento del material vegetal.……… 19 II.2. Parámetros farmacognósticos de la especie P. aduncum subsp. ossanum………………………....………………………………………………….. 19 II.2.1. Caracterización botánica de la especie…..…..……………………… 19 II.2.1.1. Evaluación macromorfológica de las hojas…………………… 19 II.2.1.2. Evaluación micromorfológica de las hojas……………………. 19 II.2.2. Estudio de secado…………………………...…….…………………… 20 II.2.3. Parámetros físico - químicos del material vegetal………………….. 20 II.2.3.1. Humedad residual…...…………………………………………… 20 II.2.3.2. Sustancias solubles o extraíbles……………………………….. 21 II.2.3.3. Cenizas totales, cenizas solubles en agua y cenizas insolubles en ácido clorhídrico al 10%.................................................. 21 Índice II.3. Identificación de metabolitos secundarios por tamizaje fitoquímico. 23 II.4. Obtención de los extractos……………………………………………....… 24 II.5. Parámetros físico - químicos de calidad de los extractos………….... 24 II.5.1. Requisitos organolépticos……………………………………………. 24 II.5.2. pH………………………………………………………………………... 25 II.5.3. Sólidos totales………………………………………………………….. 25 II.5.4. Densidad relativa………………………………………………………. 25 II.5.5. Índice de refracción……………………………………………………. 26 II.6. Obtención del aceite esencial y caracterización físico - química…… 26 II.7. Análisis del aceite esencial por cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masas (CG-EM)……………………………..……………… 27 II.8. Perfil fitoquímico de los extractos hidroalcohólicos de P. aduncum subsp. ossanum…………………………………………………………………… 28 II.8.1. Cromatografía en capa delgada……………………………………… 28 II.8.2. Análisis por cromatografía líquida de alta resolución (CLAR)……. 28 II.8.3. Determinación del contenido de fenoles totales……………………. 29 II.9. Actividad biológica de P. aduncum subsp. ossanum…………………. 30 II.9.1. Determinación de la actividad antimicrobiana de los aceites esenciales……………………………………………………………………… 30 II.9.2. Determinación de la actividad analgésica de los extractos hidroalcohólicos………………………………………………………………. 32 II.10. Análisis estadístico………………………………………………………… 33 CAPÍTULO III: RESULTADOS Y DISCUSIÓN………………………………….. 35 III.1. Parámetros farmacognósticos de la especie P. aduncum subsp. ossanum……………………………………………………………………...……... 35 III.1.1. Caracterización botánica..……..…………………………………...... 35 III.1.1.1. Evaluación macromorfológica……………..………….……….. 35 III.1.1.2. Evaluación micromorfológica de las hojas…………………… 37 III.1.2. Estudio de secado…………………………………………………….. 39 III.1.3. Parámetros físico.-.químicos de la droga cruda…………………… 41 Índice III.2. Identificación de metabolitos secundarios por tamizaje fitoquímico………………………………………………………………………..… 43 III.3. Obtención de los extractos………………………………………………... 46 III.4. Parámetros físico - químicos de calidad de los extractos………….... 47 III.5. Obtención del aceite esencial y caracterización físico - química…... 48 III.6. Análisis del aceite esencial por cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masas (CG-EM)…………………………………...………... 49 III.7. Perfil fitoquímico de los extractos hidroalcohólicos de P. aduncum subsp. ossanum…………………………………………………………………… 58 III.7.1. Cromatografía en capa delgada…………………………………….. 58 III.7.2. Análisis por cromatografía líquida de alta resolución (CLAR)…... 60 III.7.3. Determinación del contenido de fenoles totales…………………… 61 III.8. Actividad biológica de P. aduncum subsp. ossanum………………… 62 III.8.1. Determinación de la actividad antimicrobiana del aceite esencial………………………………………………………………………… 62 III.8.2. Determinación de la actividad analgésica de los extractos hidroalcohólicos………………………………………………………………. 66 III.9. Discusión general…………………………………………………………… 68 CONCLUSIONES…………………………………………………………………… 71 RECOMENDACIONES……………………………………………………….……. 72 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEXOS INTRODUCCIÓN Introducción INTRODUCCIÓN Desde los tiempos ancestrales las especies vegetales han sido utilizadas como fuente primaria para la elaboración de medicamentos con el propósito de prevenir y tratar diversas enfermedades, contribuyendo a la mejora de la calidad de vida del hombre. En muchos casos por razones económicas se ha visto un incremento del interés científico sobre las plantas medicinales en especial de la fitoterapia, así como la disminución de efectos tóxicos crónicos muy frecuentes en sustancias químicas puras, existiendo una tendencia en los países desarrollados al retorno del empleo de productos naturales (Morón, 2002). Independientemente de la importancia y amplio uso de las plantas medicinales en muchos países iberoamericanos, todavía se realizan estudios con poca profundidad requeridos para la aplicación médica, con carencia de metodologías que garanticen la calidad, que limitan el desarrollo, producción y comercialización de fitofármacos, tanto en los mercados nacionales como internacionales. Por tal motivo, es vital la determinación de parámetros farmacognósticos, que constituyen una garantía de que la materia prima proveniente de los campos de cultivo ha sido procesada adecuadamente (Acosta y Rodríguez, 2006). Se encuentran dentro de las especies utilizadas con fines terapéuticos las pertenecientes a la familia Piperaceae cuya distribución es pantropical y subtropical, con mayor concentración y centros de diversidad en el norte de América del Sur, América Central, y en el Viejo Mundo Malasia. Se compone de unos 10 géneros y unas 2000 especies, incluidas fundamentalmente en los géneros Peperomia y Piper (Saralegui, 2004a; 2004b). El género Piper tiene una gran importancia comercial y económica, para la industria de condimentos, farmacéutica y como insecticida. También se ha reportado un amplio uso tradicional en la alimentación y en el tratamiento de diversas enfermedades (Albiero y col., 2005). En nuestro país existen 17 especies correspondientes a este género en su mayoría endémicas, una de ellas es 1 Piper aduncum L, empleada Introducción tradicionalmente por la población cubana por sus propiedades diuréticas, hemostáticas, astringentes, antiulcerosas y antiinflamatorias, entre otras. Es conocida como Platanillo de Cuba, canilla de muerto o cayuyo; planta muy común que crece silvestre en los bordes de la vegetación boscosa, los bordes de caminos y cerca de corrientes de agua; prefiere las faldas de colinas calcáreas y los terrenos húmedos, llanos o de poca elevación (Roig, 1988; Saralegui, 2004a; 2004b). Estudios taxonómicos de esta especie en nuestro país, han permitido concluir que existen dos subespecies, Piper aduncum subsp. ossanum (C.CD) Trel. que es endémica y se encuentra distribuida en la región occidental y central de Cuba hasta la provincia de Camagüey e incluida la Isla de la Juventud y Piper aduncum subsp. aduncum distribuida en la región oriental (Abreu y col., 2012). Los estudios químicos sobre especies de este género han permitido el aislamiento de varios productos naturales biológicamente activos y sus aceites esenciales han sido caracterizados farmacológicamente, evaluando sus propiedades bioactivas como actividad antimicrobiana, antimutagénica, antioxidante y larvicida (Facundo y Morais, 2005; Delgado y Cuca, 2007; Morais y col., 2007; Guerrini y col., 2009; Ordaz, y col., 2011). En la literatura científica existen escasos reportes de investigaciones farmacognósticas, fitoquímicas y biológicas para la subespecie ossanum. Tomando en consideración los elementos expuestos, se establece como problema científico para esta investigación: ¿Cómo desarrollar estudios farmacognósticos, fitoquímicos y biológicos que permitan la adecuada validación de la especie Piper aduncum subsp. ossanum, que es endémica de Cuba? 2 Introducción En tal sentido, se establece como hipótesis del trabajo: El estudio farmacognóstico, fitoquímico y biológico de P. aduncum subsp. ossanum, permite una adecuada caracterización de la especie, el establecimiento de las especificaciones de calidad de la droga, la identificación de los principales metabolitos secundarios presentes y la valoración farmacológica de la misma. Para el desarrollo del estudio se propone como objetivo general: Evaluar desde el punto de vista farmacognóstico, fitoquímico y biológico a la especie P. aduncum subsp. ossanum. Para lo cual se trazan los objetivos específicos siguientes: Determinar los principales parámetros farmacognósticos del material vegetal y de sus extractos hidroalcohólicos. Identificar los principales componentes químicos de los aceites esenciales por Cromatografía Gaseosa acoplada a Espectrometría de Masas. Estimar el perfil químico de los extractos hidroalcohólicos mediante dos técnicas cromatográficas y el método de Folin-Ciocalteu. Evaluar la actividad antimicrobiana de los aceites esenciales frente a microorganismos de importancia médica mediante ensayos biológicos. Determinar la actividad analgésica de los extractos hidroalcohólicos por el ensayo de contorsiones en ratones. 3 CAPÍTULO I REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Revisión Bibliográfica CAPÍTULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA I.1. FAMILIA PIPERÁCEA. GENERALIDADES Las piperáceas (Piperaceae) son una familia de Angiospermas del orden Piperales. Se distribuye en las regiones tropicales y subtropicales del mundo (Missouri Botanical Garden, 2011). Comprende de 10 a 12 géneros, entre ellos predominan el género Piper, Peperomia, Pothomarphe, Ottonia, Sarchorhachis y Trianaeopiper (Calle, 1999; López y col., 2010; Giraldo, 2012). Son hierbas, raramente bejucos o árboles pequeños, hermafroditas, monoicos, polígamos o dioicos. Los tallos presentan nudos abultados y flores en espigas flexibles. Las hojas contienen las células secretoras, visibles como puntos glandulares, ricas en aceites esenciales. Las flores son diminutas, bracteadas; el ovario unicelular posee un único óvulo que al desarrollarse da un fruto en baya. El fruto es pequeño, indehiscente. Las semillas contienen abundante endospermo y perispermo (Jaramillo y Manos, 2001; Saralegui, 2004a; 2004b). I.2. GÉNERO Piper I.2.1. HÁBITAT Y DISTRIBUCIÓN El género Piper compren de aproximadamente 2000 especies. Se encuentra ampliamente distribuida en regiones tropicales y subtropicales del mundo. En los trópicos de América se han encontrado la gran mayoría (alrededor de 700 especies) distribuidas en América Central, la región del Choco, los Andes, la Amazonia y el Atlántico. Su distribución también se relaciona a sitios con mayor precipitación y humedad relativa por lo que la cantidad de especies es más baja en los bosques hacia el atlántico, aunque su riqueza por área es mayor (Bezerra y col., 2008; Martínez, 2009; Ordaz y col., 2011). 4 Revisión Bibliográfica I.2.2. USOS TRADICIONALES Se le atribuye una gran importancia comercial y económica, para la industria de condimentos, farmacéutica e insecticida; reportándose un amplio uso tradicional en la alimentación y en el tratamiento de diversas enfermedades (Albiero y col., 2005). En la medicina tradicional el género Piper tiene un gran uso para tratar enfermedades como la malaria, anemia, cólera, diabetes, asma, bronquitis, neumonía, gripe, reumatismo y artritis (D´Angelo y col., 1997). En Guatemala el cocimiento de las hojas de la especie P. peltatum alivia la inflamación y enfermedades de la piel y actúa como estomáquico y diurético (Cleaves, 2001). Las hojas, tallos y raíces de la especie P. hispidum se utilizan en afecciones respiratorias, contusiones, luxaciones, conjuntivitis, trastornos digestivos, como carminativo, antiinflamatorio ocular y bucal, antitusígeno, expectorante, antidiabético, sedante, antihemorroidal, cicatrizante, anti-ulceroso, en insomnio, malaria, afecciones de la piel y mucosas, para controlar las hemorragias y diarreas sanguinolentas (Villar y Villavicencio, 2001). Las raíces maceradas de las especies P. darienense y P. phytolaccifolium, son utilizadas en Colombia como anestésico en afecciones dentales. El jugo obtenido de las hojas de P. umbellatum se usa para eliminar las garrapatas, también estas hojas en forma de cataplasma se utilizan para disminuir la hinchazón. Las hojas cocinadas de P. auritum son usadas como diurético (Grijalva, 2006). En África la especie P. guineense es usada para tratar dolores estomacales (Moreno, 2011). Otra especie como P. sanctum se utiliza como analgésico y la infusión de la planta entera se usa contra el asma y la bronquitis (Grijalva, 2006). La decocción de las raíces de P. angustifolium y P. marginatum se utilizan para aliviar los dolores menstruales y contra el paludismo, respectivamente. La especie P. cubeba es empleada como diurético y antiséptico de las vías urinarias. P. 5 Revisión Bibliográfica sylvaticum es usada como antídoto contra la picadura de serpiente y las hojas secas y trituradas de P. tuberculatum se usan para eliminar los piojos (Scott, 2008). En Bolivia, algunas etnias utilizan plantas del género Piper como antiparasitario y contra la malaria, las especies P. aduncum, P. leavilimbum y P. rusbyi presentan actividad leishmanicida y tripanocida con especies como Leishmania amazonensis, Leishmania sp y Trypanosoma cruzi. Otras especies como P. lanceolatum y P. callosum se usan en casos de viruela. Las hojas de P. peltatum se aplican en forma de cataplasma para aliviar la inflamación (Flores, 2006). En las islas del pacífico se utilizan las raíces de P. methysticum (Kava), en forma de bebida tranquilizante para combatir la ansiedad. Las raíces y frutos de P. chava son útiles para tratar el asma, bronquitis, dolor abdominal y curar afecciones hemorroidales. La especie P. brachystachyum presenta propiedades insecticidas. En China los tallos de P. futukadsura sirven para tratar el asma y la artritis (Flores, 2006). Adicionalmente, P. erithroxyloides es empleada como estimulante (Plazas y col., 2008). I.2.3. COMPOSICIÓN QUÍMICA Y ACTIVIDAD BIOLÓGICA Estudios químicos sobre las especies del género Piper han permitido el aislamiento de varios productos naturales biológicamente activos y sus aceites esenciales propiedades han sido caracterizados bioactivas como farmacológicamente, actividad antimicrobiana, evaluando sus antimutagénica, antioxidante y larvicida (Facundo y Morais, 2005; Delgado y Cuca, 2007; Morais y col., 2007; Guerrini y col., 2009; Ordaz y col., 2011). Según la composición química, los constituyentes más comunes de este género son: ácidos benzoicos prenilados, propenilfenoles, lignanos, neolignanos, terpenoides, flavonoides, kawalactonas, 6 epóxidos y alcaloides como la Revisión Bibliográfica isobutilamina, piperidina y pirrolidina, entre otros (Parmar y col., 1997; Lago y col., 2009; Mesa y col., 2012). Estudios efectuados por Soto (2015) mediante tamizaje fitoquímico revelan, además de los metabolitos antes señalados, la presencia de quinonas y resinas en las especies P. peltatum y P. aduncum L. procedentes de la región Amazonas. En Brasil se estudiaron agentes fungicidas en hojas de P. crassinervium para el control de Cladosporium cladosporioides y C. sphaerospermum, encontrando por primera vez la presencia de derivados prenilados de hidroquinona en especies de Piperaceae (Danelutte y col., 2003). La primera amida aislada de una especie de Piper fue la piperina (Figura 1). Otra amida encontrada resultó ser la pipernonalina (Figura 1), aislada del fruto de P. longum y que tiene actividad coronaria vaso relajante (Parmar y col., 1997). Figura 1. Amidas aisladas de especies de Piper Del extrato diclorometano-metanol obtenido de las semillas de P. tuberculatum, han sido aisladas e identificadas siete amidas, de las cuales dos resultaron amidas isobutílicas y cinco piperidínicas, las que mostraron una fuerte actividad contra Cladosporium sphaerospermum y Cladosporium cladosporioides (Soberón y col., 2006). 7 Revisión Bibliográfica Estudios fitoquímicos y farmacológicos de la especie P. tricuspe en el sur de Colombia, demuestran la existencia de metabolitos con actividad antimalárica in vitro (Sáez y col., 2008). Se han reportado de las especies P. arieianum, P. tabogatum y P. dilatatum la existencia de ácidos benzoicos prenilados con actividad fungicida (Green y col., 1991; Roussis y col., 1990; Terreaux y col., 1998). En las hojas de P. heterophyllum y P. aduncum se encontraron tres nuevos derivados de ácidos prenilados, derivados del ácido benzoico, como posibles agentes antiparasitarios de leishmaniasis, tripanozomiasis y actividad antiplasmodial (Flores y col., 2009). Propenilfenoles con significativa actividad fungicida y antimicrobiana han sido aislados de P. betle y P. sarmentosum. El compuesto dillapiol aislado de la especie P. aduncum presenta actividad contra Biomphalaria glabrata. Otros compuestos encontrados son el estragol de P. marginatum y el safrol, identificado en varias especies del género (Parmar y col., 1997). El primer lignano aislado de la especie P. peepuloides fue la sesamina. Otros compuestos fueron: andamancina y fargesina, obtenidos de especies P. sumatranum y P. austrosinense, respectivamente. También se han encontrado neolignanos tales como kadsurenona de P. futokadsura y puberulinas A, B y C de los tallos de P. puberulum (Parmar y col., 1997). Se han Identificados terpenoides (Figura 2) como el transfitol extraído de P. decurrens, P.methysticum, P. auritum y P. aduncum. Otro compuesto aislado es el limoneno, de las especies P. betle, P. nigrum, P. futokadsura y P. guineense, así como el β- selineno de P. gaudichanum que presenta actividad insecticida contra Aedes aegypti (Parmar y col., 1997). 8 Revisión Bibliográfica CH3 H3C H3 C CH3 CH3 Transfitol CH3 H3C CH3 OH H3 C CH2 Limoneno H CH2 CH3 β- selineno Figura 2. Terpenoides identificados en especies de Piper El sitosterol y el ácido ursólico fueron aislado de especies como P. betle, P. aduncum y P. longum; estos compuestos inhiben el ácido araquidónico en la agregación plaquetaria. Otros esteroles, comúnmente, encontrados en especies del genero Piper son el campesterol y estigmasterol (Parmar y col., 1997). En la figura 3 se muestran las estructuras de dichos compuestos. Figura 3. Esteroles encontrados en especies del género Piper En el grupo de los flavonoides (Figura 4) se han encontrado pocas flavonas, la mayoría son tri o tetra-oxigenadas y han sido extraídas de P. brachystachyum. También la isoquercitrina aislada de P. betle (Parmar y col., 1997). Otros flavonoides como pinostrobina y sakuranetina han sido encontrados en las especies P. aduncum y P. crassinervium, con actividad frente a Trypanosoma cruzi (Giraldo, 2012). 9 Revisión Bibliográfica Figura 4. Flavonoides identificados en especies de Piper Otros compuestos del género que presentan actividad antibacterial contra Salmonella typhii son las dihidrochalconas, favokawaina y las adunctinas A-D, aisladas de P. methysticum y P. aduncum, respectivamente (Parmar y col., 1997). I.3. P. aduncum subsp. ossanum Trel I.3.1. DESCRIPCIÓN BOTÁNICA DE LA ESPECIE La especie P. aduncum subsp. ossanum Trel., conocida comúnmente como platanillo de Cuba, es un arbusto de 2 a 6 m de altura, de color verde amarillento ligeramente en zigzag con pelos finos y con articulaciones (nudos) anilladas, recrecidas. Las hojas (Figura 5) son alternas, sencillas, enteras, con el limbo oblongo-elíptico, con puntos translúcidos, cartáceo, de 12 a 21 cm de largo y 3 a 8 cm de ancho, la base es inequilátera. Las Flores son diminutas en espigas amentiformes, opuestas a las hojas, encorvadas y verdosas; pedúnculos puberulentos. Baya subtetragona, finalmente lampiña. La planta presenta un sabor y olor a pimienta (Roig, 1988; Saralegui, 2004a; 2004b; Abreu y col. 2012). 10 Revisión Bibliográfica Figura 5. Detalles morfológicos de las hojas de P. aduncum subsp. ossanum I.3.2. HÁBITAT Y DISTRIBUCIÓN. SITUACIÓN EN CUBA En nuestro país esta especie es muy común, crece silvestre en los bordes de la vegetación boscosa, las áreas perturbadas abiertas, los bordes de caminos y cerca de corrientes de agua; prefiere las faldas de colinas calcáreas y los terrenos húmedos, llanos o de poca elevación (Saralegui, 2004a; 2004b; Roig, 2014). Se distribuye en toda la Isla, desde Pinar del Río hasta Camagüey. En la zona oriental hay una especie similar, conocida como P. aduncum L. En la Flora Sinántropa de Cuba se ha clasificado como una intrapófita colonizadora, oriunda de América Tropical, o sea, entre las especies que no exceden su hábitat, pero se incrementan en número explosivamente, luego de cualquier alteración ecológica por impacto antrópico o no (Ricardo, 1995). La especie ha sido descrita botánicamente en el neotrópico por varios autores en diferentes momentos y lugares por distintas causas. En Cuba han existido también diferentes puntos de vista respecto a su identidad taxonómica, quedando establecida la presencia de dos subespecies. Esta situación puede generar dificultades a la hora de ser nombrada correctamente, en la búsqueda bibliográfica o en la colecta del material que se desea. Estudios taxonómicos de esta especie en nuestro país, han permitido concluir que existen dos subespecies: Piper aduncum subsp. ossanum (C.CD) Trel. que es endémica y se encuentra distribuida en la región occidental y central del país hasta la provincia de 11 Revisión Bibliográfica Camagüey e incluida la Isla de la Juventud y Piper aduncum subsp. aduncum, distribuida en la región oriental. La localización geográfica puede ser clave para discernir su identidad taxonómica. Por tanto, si la colecta de la especie es referida a la zona occidental o central del país, es de la subespecie endémica; mientras que en los trabajos en que haya sido colectada en el oriente se trata de la que se comparte con la América Central y del Sur (Ricardo, 1995; Abreu y col., 2012). I.3.3. USOS TRADICIONALES En Brasil, el platanillo de Cuba es conocido como apertaruao, matico y falso matico. Se usan la raíz, las hojas y los frutos como astringente, diurético, estimulante. Se emplean en la leucorrea, blenorragia, cistitis, en el prolapso uterino, para tratar problemas del hígado y del estómago. Es usado en infusión y en baños para curar las úlceras crónicas. Como muchas especies de la familia, este arbusto tiene el característico olor a pimienta y los frutos se utilizan como condimento (Roig, 1988). En Cuba P. aduncum subsp. ossanum se usa como planta medicinal. Sus hojas que se caracterizan por ser muy aromáticas son empleadas en baños contra el reumatismo, como astringentes y hemostático. Otras propiedades también atribuidas son: diurética, anti-blenorrágica, anti-disentérica, antiséptica, cicatrizante, antihemorroidal, antivenérea y anti-ulcerosa (Roig, 1988; 2014). Al platanillo de Cuba, también se le ha atribuido en nuestro país, el nombre científico de P. angustifolium R., que corresponde al famoso hemostático llamado “matico” en el Perú, empleado en la leucorrea, cistitis, impotencia, hemoptisis, menorragias, epistasis, etc. (Roig, 1988). I.3.4. COMPOSICIÓN QUÍMICA Y ACTIVIDAD BIOLÓGICA La composición química de P. aduncum subsp. ossanum, ha sido poco estudiada. Los reportes en la literatura desde el punto de vista fitoquímico son escasos y principalmente centrados en el aceite esencial de la planta. 12 Revisión Bibliográfica Estudios en nuestro país sobre la especie, reflejan que los componentes mayoritarios presentes en el aceite esencial son: el canfeno, alcanfor, piperitona y el viridiflorol (Figura 6); demostrándose que dicho aceite es un candidato promisorio para el desarrollo de un acaricida botánico y podría ser utilizado en un futuro en el contexto de un manejo integrado de la varrosis de las abejas, que constituye uno de los mayores problemas de la apicultura tanto en Cuba como a nivel mundial (Pino y col., 2011). OH O O Piperitona Canfeno Alcanfor Viridiflorol Figura 6. Estructuras de los principales componentes del aceite esencial de las hojas de P. aduncum subsp. ossanum. Diversas son las investigaciones asociadas al manejo de enfermedades en los cultivos en la actualidad nacional, cuyos resultados sugieren las potencialidades de diversos aceites esenciales. El aceite de platanillo de Cuba mostró elevado poder fungistático sobre Fusarium redolens y F. solani, produciéndose solo un ligero crecimiento de estos hongos (Duarte y col., 2013). Otros estudios del aceite esencial de la especie, reportan que produce inhibición del crecimiento de Trichoderma asperellum entre un 88 y 100 %; evidenciándose su acción antifúngica y el uso como plaguicida (Infante y col., 2013). Se ha demostrado además que el mismo aceite produce inhibición del crecimiento en un 100 % de Bipolaris oryzae, Cochliobolus lunatus y Sitophilus oryzae, hongos asociados al manchado del arroz (Duarte y col., 2013). En el laboratorio de Medicina Herbaria del Hospital Militar Central "Dr. Luis Díaz Soto", se estudiaron las propiedades farmacológicas del flavonoide 13 (2"-0- Revisión Bibliográfica ramnosil 4"-0- metilvitexina), aislado de las hojas de esta planta; se ha encontrado que el mismo posee un efecto anti-ulceroso similar al sucralfato y actividad antiinflamatoria similar al piroxican, en ratas (Martínez y col., 2004; Larionova y col., 2010). I.4. ACEITES ESENCIALES. GENERALIDADES Los aceites esenciales o esencias vegetales (principios olorosos), están constituidos por monoterpenoides, sesquiterpenoides y fenilpropanos; entre los componentes volátiles también se encuentran ácidos libres, aldehídos, cetonas, compuestos azufrados, isotiocianato de alilo, etc. Son volátiles, arrastrables por vapor por tener una alta tensión de vapor y a ello se debe su aroma. Son insolubles en agua y solubles en disolventes orgánicos. Generalmente son Iíquidos, pero en algunos casos se solidifica una parte por enfriamiento (Miranda y Cuéllar, 2001). Tanto el rendimiento de aceite esencial como la composición química varía de acuerdo a diferentes factores tales como: edad de la planta, lugar geográfico y condiciones ecológicas geográficas (Miranda y Cuéllar, 2001). Existen varios métodos de extracción para su obtención (Miranda y Cuéllar, 2001), entre ellos, la expresión (método mecánico), destilación en corriente de vapor, la extracción por medio de disolventes volátiles y la absorción en grasas purificadas (enfleurage). Como los aceites esenciales son moléculas complejas, es necesario, posterior a su obtención, realizar algunos métodos de separación que permitan el aislamiento de sus componentes para proceder a su identificación. Se pueden citar entre ellos, la destilación fraccionada, la cromatografía de columna, métodos químicos y la cromatografía gaseosa (analítica y preparativa); esta última es la más empleada, aunque su empleo es más eficiente cuando se usa en conjunción con los otros métodos de separación, siendo particularmente útil el acoplamiento 14 Revisión Bibliográfica cromatografía gaseosa-espectrometría de masas (CG-EM) (Miranda y Cuéllar, 2001). Los aceites esenciales presentan diferentes utilidades: en la industria alimenticia, se emplean como saborizante en bebidas, licores y confituras. En la industria química se emplean en perfumería, fundamentalmente, los compuestos oxigenados. También se realizan transformaciones químicas de algunos compuestos terpénicos, para la obtención de otros de mayor poder aromatizante y/o acción farmacológica. En la industria farmacéutica son empleados por sus propiedades antisépticas, desinfectantes, antihelmínticas, diuréticas, expectorantes, etc. (Miranda y Cuéllar, 2001). Los aceites esenciales son los más potentes antimicrobianos debido a que sus componentes orgánicos son de tipo fenol, alcohol, cetona, éter, utilizándolo como antiséptico y bactericida frente a bacterias y hongos patógenos, inhibiendo con facilidad las bacterias Gram (+). Algunos componentes fenólicos como el timol, carvacrol y eugenol, poseen actividad significativa frente a Gram (-); destacan los derivados terpénicos oxidados que se unen a los grupos aminos e hidroxilaminos de las proteínas de la membrana bacteriana, lo que conduce a la modificación de su permeabilidad y actúan a nivel de la pared celular de la bacteria, alterando el peptidoglicano y ocasionando la lisis bacteriana. También han demostrado excelente efecto contra los ectoparásitos (pulgas, piojos, garrapata, aradores de la sarna, hematófagos, etc.) y endoparásitos (leishmaniosis, ascariasis, tripanosomiasis, etc.) que parasitan al hombre y animales, por ejemplo: el ascaridiol, presenta acción frente a la ascariasis producido por Ascaris lumbricoides (Carhuapoma, 2011). Los derivados alcohólicos (linalol, geraniol, mentol, terpineol, etc.), cetónicos (alcanfor, pulegona, tuyona, carvona, etc.), o de tipo aldehído (geranial o citral, citronelal, anisaldehido, vainillina, aldehído cumínico, etc.), poseen igualmente propiedades antibacteriana, pero menos marcado que los fenólicos y alcohólicos (Carhuapoma, 2011). 15 Revisión Bibliográfica I.5. COMPUESTOS FENÓLICOS. GENERALIDADES Los compuestos fenólicos o polifenoles constituyen un amplio grupo de sustancias químicas, considerados metabolitos secundarios de las plantas, con diferentes estructuras químicas y actividad. Poseen un anillo aromático, con uno o más grupos hidróxidos, incluyendo derivados funcionales (ésteres, metil ésteres, glicósidos, etc.). La naturaleza de los polifenoles varía desde moléculas simples como los ácidos fenólicos hasta compuestos altamente polimerizados, como los taninos. Se presentan en las plantas en forma conjugada con uno o más residuos de azúcar unidos a los grupos hidroxilos, aunque en algunos casos se pueden producir uniones directas entre una molécula de azúcar y un carbono aromático. Por ello, la forma más común de encontrarlos en la naturaleza es en forma de glicósidos, siendo solubles en agua y disolventes orgánicos (Martínez y col., 2000; Ali y col., 2013). Dependiendo de su estructura química básica, los compuestos fenólicos se pueden clasificar en (Martínez y col., 2000; Ali y col., 2013): fenoles, ácidos fenólicos y ácidos fenil acéticos; ácidos cinámicos, cumarinas, isocumarinas y cromonoles; lignanos y neolignanos; flavonoides y taninos. Estos compuestos tradicionalmente han sido considerados como anti-nutrientes, debido al efecto adverso de uno de sus componentes mayoritarios, los taninos, sobre la digestibilidad de la proteína. Sin embargo, actualmente se ha despertado un reciente interés por estos compuestos debido a sus propiedades antioxidantes y sus posibles implicaciones beneficiosas en la salud humana, tales como en el tratamiento y prevención del cáncer, enfermedad cardiovascular y otras patologías de carácter inflamatorio; también reducen el riesgo de diabetes, otros son antifúngicos, antivirales, antimutagénicos, etc. (Jin y col., 2006; Hoye y col., 2008; Wijngaard y col., 2009; Jin y Mumper, 2010; Zhang y col., 2011; Castellano y col., 2012; Mohanlal y col., 2012; Sawadogo y col., 2012). 16 Revisión Bibliográfica La extracción de los compuestos fenólicos depende principalmente de la naturaleza y propiedades químicas de estos compuestos, incluyendo la estructura molecular, la polaridad, la concentración, el número de anillos aromáticos y grupos hidroxilos. Se emplean diversos disolventes, entre los que se encuentran, el agua, acetona, el acetato del etilo, alcoholes (metanol, etanol y propanol) y sus mezclas, entre otros (Ali y col., 2013). La gran diversidad de compuestos fenólicos dispersos en los tejidos vegetales, así como sus diferentes estructuras químicas, ha traído consigo la necesidad de desarrollar un gran número de técnicas analíticas para su identificación y cuantificación. Las primeras técnicas desarrolladas fueron espectrofotométricas, las cuales tienen interés desde el punto de vista del control de calidad, entre los métodos usados, comúnmente, destacan el ensayo de la vainillina, los ensayos de Folin-Denis y Folin-Ciocalteu (Singleton y col., 1999; Martínez, 2000). Numerosos estudios han desarrollado técnicas rápidas de cuantificación de compuestos fenólicos mediante ensayos ultravioletas. Cada grupo de compuestos fenólicos se caracteriza por tener una o varias absorbancias máximas a distintas longitudes de onda dentro del espectro ultravioleta. Así, los fenoles simples tienen una absorbancia máxima entre 220 y 280 nm, mientras que los compuestos fenólicos relacionados presentan una amplia variación en la longitud de onda a la cual presentan una absorbancia máxima (Martínez, 2000). Las técnicas cromatográficas han permitido la separación, aislamiento, purificación e identificación de compuestos fenólicos. La cromatografía en papel y en capa fina, son utilizadas para la purificación y aislamiento de estos compuestos. La cromatografía líquida de alta resolución (CLAR) es la más empleada para la separación y cuantificación de fenoles. Existen distintos soportes y fases móviles que permiten el análisis de antocianinas, procianidinas, flavonas y ácidos fenólicos. La utilización del detector de arreglo de diodo facilita la detección de estos compuestos, al utilizar de forma conjunta el tiempo de retención y el espectro ultravioleta para la identificación de los picos. La utilización de CLAR 17 Revisión Bibliográfica acoplada a un detector de masas es muy útil para la cuantificación de flavonoides; en esta técnica, las áreas del pico de cada uno de los compuestos a investigar se emplean para la cuantificación, mientras que el detector de masas se utiliza para incrementar la especificidad del método (Justesen y col., 1998; Martínez, 2000). 18 CAPÍTULO II MATERIALES Y MÉTODOS Materiales y Métodos CAPÍTULO II. MATERIALES Y MÉTODOS II.1. RECOLECCIÓN, SELECCIÓN Y PROCESAMIENTO DEL MATERIAL VEGETAL La especie vegetal utilizada fue Piper aduncum subsp. ossanum Trel., correspondiente a dos lugares de colecta: Municipio Bauta y localidad Ceiba del Agua, municipio Caimito del Guayabal, ambas de la provincia Artemisa. Las plantas se recolectaron en el mes de Septiembre de 2012, se encontraron en estado fenológico vegetativo, fueron herborizadas en el Instituto de Farmacia y Alimentos y registradas por el MC. Reinier Morejón Hernández en el Jardín Botánico Nacional con el código de identificación: HFC-87641 (HAJB). De las colectas realizadas solo se emplearon las hojas, previamente lavadas con agua potable, las cuales fueron cortadas en trozos pequeños con ayuda de tijeras para facilitar el proceso de secado. II.2. PARÁMETROS FARMACOGNÓSTICOS DE LA ESPECIE P. aduncum subsp. ossanum II.2.1. CARACTERIZACIÓN BOTÁNICA II.2.1.1. EVALUACIÓN MACROMORFOLÓGICA DE LAS HOJAS La descripción macromorfológica se realizó a simple vista y con ayuda de una lupa, según metodología descrita por Miranda y Cuéllar (2000). Se evaluaron 100 hojas, a las cuales se les determinó la forma del limbo, borde, ápice, base, peciolo, venación y color. También se efectuaron mediciones de largo y ancho de las hojas con ayuda de un pie de rey. Se calcularon los valores promedios y la desviación estándar. II.2.1.2. EVALUACIÓN MICROMORFOLÓGICA DE LAS HOJAS Para el análisis histológico se realizaron cortes trasversales de las hojas en estado fresco, por el método manual, los que fueron hidratados y aclarados con hipoclorito de sodio. Los mismos se colorearon con safranina al 1 %, se fijaron con 19 Materiales y Métodos gelatina glicerinada, según los procedimientos descritos por Arnol (1973) y Gattuso M. y Gattuso S. (1999). Sobre los cortes se realizó la determinación de aceite esencial empleando una solución de sudam III al 5 % en etanol al 70 % (Gattuso M y Gattuso S. 1999; Miranda y Cuéllar, 2000). Para visualizar los diferentes caracteres anatómicos internos del vegetal se empleó un microscopio Nikon Alphaphot-2 con cámara de video a color TK-C1380 JVC modelo TK-C1380U. II.2.2. ESTUDIO DE SECADO El secado se realizó a 35 ºC, en estufa con recirculación de aire, marca AISET, modelo YLD-6000 de fabricación China. En el estudio se utilizaron 200 g de muestra por cada réplica. Se tuvo en cuenta el número de días que demoraba la droga en alcanzar peso constante (tiempo de secado) y el porcentaje de la pérdida en peso de agua (con una frecuencia de 12 h) (NRSP 309, 1992; Miranda y Cuéllar, 2000). II.2.3. PARÁMETROS FÍSICO-QUÍMICOS DEL MATERIAL VEGETAL Los diferentes ensayos se realizaron a las muestras de los dos lugares de colecta (Ceiba del Agua y Bauta), según la metodología descrita por la NRSP 309 (1992) y Miranda y Cuéllar (2000). II.2.3.1. HUMEDAD RESIDUAL Se empleó el método azeotrópico, por triplicado a partir de 10 g de muestra previamente secada en estufa, se utilizó tolueno como disolvente, un equipo Dean Star, una plancha de calentamiento eléctrica marca MLW VEB y para las pesadas una balanza analítica marca Sartorius. Los resultados se obtuvieron a partir de la expresión: Hr = Vf - Vi M x 100 20 Materiales y Métodos Donde: Hr: humedad residual (%) Vf: volumen final de agua (mL) Vi: volumen inicial de agua (mL) M: masa de la muestra (g) 100: factor matemático para el cálculo. II.2.3.2. SUSTANCIAS SOLUBLES O EXTRAÍBLES Este ensayo se llevó a cabo por triplicado, a partir de 5 g de droga seca. Los menstruos utilizados fueron agua, etanol al 50 y 90 %. Las muestras se agitaron en una zaranda modelo BIOZARD - 2013 por un tiempo de 6 horas. Los cálculos se realizaron según: Ss = R.500.100 M (100-H) Donde: Ss: sustancias solubles (%) R: residuo de la muestra (g) M: masa de la muestra (g) H: humedad residual (%) 500 y 100: factores matemáticos para el cálculo. II.2.3.3. CENIZAS TOTALES, CENIZAS SOLUBLES EN AGUA Y CENIZAS INSOLUBLES EN ÁCIDO CLORHÍDRICO AL 10 % Para las determinaciones se empleó una mufla modelo MLW VEB ELEKTROBAD FRANKENHAUSEN. Las pesadas se realizaron en balanza analítica marca SARTORIUS. Cada determinación se efectuó 6 veces a partir de 2 g de material vegetal seco. Cenizas totales Los cálculos se efectuaron por la siguiente expresión: CT = M2 - M x 100 M1 - M 21 Materiales y Métodos Donde: CT: cenizas totales (%) M: masa del crisol vacío (g) M1: masa del crisol con la muestra (g) M2: masa del crisol con la ceniza (g) 100: factor matemático para el cálculo. Cenizas solubles en agua Las determinaciones se llevaron a cabo a partir de las cenizas totales, luego de disolver las mismas con agua destilada. Los cálculos se realizaron por la siguiente expresión: M2 - Ma Ca = x 100 M1 - M Donde: Ca: cenizas solubles en agua en base hidratada (%) M2: masa del crisol con las cenizas totales (g) Ma: masa del crisol con las cenizas insolubles en agua (g) M1: masa del crisol con la muestra de ensayo (g) M: masa del crisol vacío (g) 100: factor matemático para el cálculo. Cenizas insolubles en ácido clorhídrico al 10 % Se determinaron a partir de las cenizas totales, después de tratar las mismas con ácido clorhídrico al 10 %. Los resultados se obtuvieron por la siguiente expresión: M2 - M B= x 100 M1 - M Donde: B: cenizas insolubles en ácido clorhídrico en base hidratada (%) M2: masa del crisol con la ceniza (g) M: masa del crisol vacío (g) M1: masa del crisol con la porción de ensayo (g) 100: factor matemático para el cálculo. 22 Materiales y Métodos II.3. IDENTIFICACIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS POR TAMIZAJE FITOQUÍMICO El tamizaje fitoquímico se le realizó a la droga cruda procedente de los dos lugares de colecta, según procedimiento descrito por Miranda y Cuéllar (2000). Se utilizó un sistema de extracción con una batería de disolventes, de menor a mayor polaridad, sobre el mismo material vegetal, para lograr que cada metabolito fuera extraído adecuadamente según su selectividad por el disolvente empleado. La droga cruda se extrajo sucesivamente con éter de petróleo (30-40 ºC), etanol y agua, para obtener los extractos correspondientes, los que fueron sometidos a los diferentes ensayos. En las figuras 7 y 8 se muestran el esquema general de extracción y los diferentes ensayos a realizar en cada extracto obtenido, respectivamente. 10g DE MATERIAL VEGETAL EXTRAER CON 30 mL DE ÉTER DE PETRÓLEO (30-40 DURANTE 48h A TEMPERATURA AMBIENTE 0C) FILTRAR EXTRACTO ETÉREO RESIDUO SÓLIDO EXTRAER CON ETANOL POR MACERACIÓN DURANTE 48h FILTRAR RESIDUO SÓLIDO EXTRACTO ALCOHÓLICO EXTRAER CON AGUA POR MACERACIÓN DURANTE 24h FILTRAR EXTRACTO ACUOSO RESIDUO SÓLIDO Desechar Figura 7. Esquema de extracción sucesiva del material vegetal para la aplicación de técnicas de Tamizaje fitoquímico. 23 Materiales y Métodos EXTRACTO ETÉREO EXTRACTO ALCOHÓLICO EXTRACTO ACUOSO SUDÁN (COMPUESTOS GRASOS) DRAGENDORFF, MAYER Y WAGNER (ALCALOIDES) BALJET (LACTONAS Y COUMARINAS) LIEBERMANN-BUCHARD (TRITERPENOS Y/O ESTEROIDES) RESINAS FEHLING (SUSTANCIAS REDUCTORAS) TRICLORURO FÉRRICO (COMPUESTOS FENÓLICOS) BALJET (LACTONAS Y COUMARINAS) ESPUMA (SAPONINAS) LIEBERMANN-BUCHARD (TRITERPENOS Y/O ESTEROIDES) DRAGENDORFF, MAYER Y WAGNER (ALCALOIDES) NINHIDRINA (AMINOÁCIDOS) BONTRAGUER (QUINONAS) SHINODA (FLAVONOIDES) KEDDE (CARDIOTÓNICOS) ANTOCIANIDINAS FEHLING (SUSTANCIAS REDUCTORAS) TRICLORURO FÉRRICO (FENOLES) ESPUMA (SAPONINAS) DRAGENDORFF, MAYER Y WAGNER (ALCALOIDES) SHINODA (FLAVONOIDES) MUCÍLAGOS Figura 8. Esquema de las reacciones de tamizaje fitoquímico a realizar a los extractos obtenidos. II.4. OBTENCIÓN DE LOS EXTRACTOS A partir del material vegetal se elaboraron extractos hidroalcohólico al 20 %, por el método de maceración, durante un periodo de siete días, a una temperatura de 30 °C ± 2 °C, utilizando como disolvente una mezcla hidroalcohólica al 50 %. Se siguió el procedimiento descrito en la norma cubana NRSP 312 (1992) y por Miranda y Cuéllar (2000). II.5. PARÁMETROS FÍSICO-QUÍMICOS DE CALIDAD DE LOS EXTRACTOS Las determinaciones de calidad se llevaron a cabo mediante el procedimiento descrito en la NRSP 312 (1992) y por Miranda y Cuéllar (2000), se realizaron cinco réplicas para cada experimento, siendo evaluados los parámetros siguientes: II.5.1. REQUISITOS ORGANOLÉPTICOS Determinación del olor: Se toma una tira de papel secante de aproximadamente 1 cm de ancho por 10 cm de longitud y se introduce un extremo en la muestra de ensayo. Se huele y se determina si corresponde con la característica del producto. 24 Materiales y Métodos Determinación del color: Se toma un tubo para ensayos, bien limpio y seco, se llena hasta las tres cuartas partes con la muestra de ensayo y se observa el color, la transparencia, la presencia de partículas y la separación en capas. Se informa el resultado. II.5.2. pH Para la determinación del pH se utilizó un pH-metro modelo Basic 20 Crizon, previamente ajustado con soluciones buffer a pH = 4,01 y 7. II.5.3. SÓLIDOS TOTALES Se empleó una balanza de peso seco marca Sartorious. Los sólidos totales St (%) se calcularon mediante la fórmula siguiente: St = Pr − P × 100 V Donde: Pr = masa de la cápsula más el residuo (g) P = masa de la cápsula vacía (g) V = volumen de la porción de ensayo (mL) 100 = factor matemático II.5.4. DENSIDAD RELATIVA Se realizó por picnometría y se utilizó una balanza analítica monoplato marca Metttler H10T. De la muestra de ensayo se tomó la cantidad necesaria de acuerdo con la capacidad del picnómetro y se enfrió a 25 °C. La densidad relativa a 25 °C se calculó mediante la fórmula siguiente: D25 = M1 - M M2 - M 25 Materiales y Métodos Donde: M = masa del picnómetro vacío (g) M1= masa del picnómetro con la muestra de ensayo (g) M2= masa del picnómetro con agua (g) D= densidad relativa (g/mL) II.5.5. ÍNDICE DE REFRACCIÓN Se utilizó un refractómetro ABBE de la marca Carlzeiss Jena. II.6. OBTENCIÓN DEL ACEITE ESENCIAL Y CARACTERIZACIÓN FÍSICOQUÍMICA El material vegetal fresco (hojas) procedente de Bauta y Ceiba del Agua, fue fragmentado con ayuda de tijeras para favorecer la extracción de los aceites, una vez pesado, se introdujo en un balón de 2 litros, el cual fue llenado con agua destilada, en cantidades suficientes para cubrir toda el área que ocupó el material vegetal empleado. Posteriormente, el balón fue ubicado en un equipo de hidrodestilación con un colector tipo clevenger, durante tres horas, aproximadamente, hasta que el volumen del aceite obtenido permaneciera constante. Se determinó el rendimiento por la expresión siguiente: % A.E = Pa - Pv M x 100 Donde: % A.E: rendimiento de aceite esencial (%) Pa: masa del recipiente con aceite (g) Pv: masa del recipiente vacío (g) M: masa del material vegetal (g) 100: factor matemático para el cálculo La caracterización físico-química del aceite esencial se realizó a través de las determinaciones de su olor, color e índice de refracción, este último ensayo se efectuó en un refractómetro de tipo ABBE digital, a una temperatura de 20 °C. 26 Materiales y Métodos II.7. ANÁLISIS DEL ACEITE ESENCIAL POR CROMATOGRAFÍA GASEOSA ACOPLADA A ESPECTROMETRÍA DE MASAS (CG-EM) Dicho estudio se le realizó a los aceites esenciales correspondientes a los dos lugares antes mencionados. Se utilizó un Cromatógrafo de Gases Agilent serie 6890N acoplado a un detector selectivo de masas serie 5975, bajo las condiciones de trabajo siguientes: Columna: columna capilar HP5-MS (30 m x 0,25 mm x 0,25 μm Df, Agilent, USA). Volumen de inyección: 1µL, modo “split” con una relación de 1:10 Temperaturas del Inyector, la interfase, fuente de ionización y el cuadrupolo: 250, 250, 230 y 150 ºC, respectivamente. Gas portador y flujo: se utilizó Helio como gas portador a un flujo de 1 mL/min. Rampa de temperatura: la temperatura inicial del horno se programó a 40 ºC (2 min), aumentando 6 ºC por cada minuto hasta 250 ºC. Posteriormente, la temperatura final a 250 ºC se mantuvo durante 30 minutos. El espectrómetro de masas operó en el modo de impacto electrónico (IE) a 70 eV a 230 ºC. La detección se realizó en el modo de barrido desde 40300 uma. La asignación de las estructuras se efectuó por comparación de los espectros de masas de los compuestos con los de la base de datos del equipo (NIST 21, NIST 107, 2009) seleccionando aquellos que sobrepasaban el 90 % de confiabilidad, y con los datos ofrecidos por la literatura. 27 Materiales y Métodos II.8. PERFIL FITOQUÍMICO DE LOS EXTRACTOS HIDROALCOHÓLICOS DE P. aduncum subsp. ossanum II.8.1. CROMATOGRAFÍA EN PLACA DELGADA Con el propósito de conocer la composición química preliminar de los extractos hidroalcohólicos, fue desarrollada una cromatografía en placa delgada. Se utilizaron placas de gel de sílice F 254 nm de la Merck, sobre soporte de aluminio. El desarrollo cromatográfico fue de forma ascendente, utilizando como fase móvil: n-butanol: ácido acético: agua (65:25:10) Para el revelado de las placas, fueron empleadas las condiciones siguientes: Luz ultravioleta de longitud de onda 254 nm Rociado con tricloruro de aluminio (AlCl3) al 5 % en metanol Rociado con H2SO4 al 5 % en etanol y calor: se calentó a una temperatura de 105 o C aproximadamente hasta la aparición de manchas o modificación de la apariencia de las ya existentes II.8.2. ANÁLISIS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (CLAR) Para el estudio se diluyó 1 mL de los extractos en 10 mL de metanol grado CLAR (Merk). Las muestras fueron filtradas por membrana de teflón y se introdujeron directamente en el equipo. Se utilizó un cromatógrafo líquido SHIMADZU y las condiciones cromatográficas más adecuadas de trabajo fueron las siguientes: Fase móvil: acetonitrilo: buffer fosfato pH 2,4 (70:30) Temperatura del horno: 25 °C Detector: por arreglo de diodo, 370 nm (200-400). Flujo a 0,9 ml/min. Presión: 14,1 µPa. Volumen de inyección: 20 µL. 28 Materiales y Métodos Columna: Uptisphere 5 0DB 708965 (RP-18) II.8.3 DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE FENOLES TOTALES El contenido de fenoles totales se determinó por el método de Folin-Ciocalteu (Singleton y col., 1999; McDonald y col., 2001; Pourmorad y col., 2006; Memnune y col., 2009; Chlopicka y col., 2012). Procedimiento: Solución diluida de Folin - Ciocalteu: Tomar 10 mL del reactivo FolinCiocalteu y diluir a 100 mL con agua destilada. Solución de carbonato de sodio 7,5 %: Pesar 75 g de Na2CO3 anhidro y disolver en un litro de agua destilada. En tubos de ensayos de aproximadamente 50 mL de capacidad se adicionaron: 200 µL de extracto de la muestra o de la solución diluida de ácido gálico. 10 mL de solución diluida de Folin-Ciocalteu 1,8 mL de agua destilada Agitar y esperar cinco minutos Adicionar 8 mL de solución 7,5 % de Na2CO3. Agitar nuevamente. Dejar en reposo durante dos horas Leer la absorbancia a 765 nm El blanco es agua destilada Se pesó 500 mg de ácido gálico y se disolvió en 20 mL de etanol al 96 %. Se transfirió cuantitativamente a matraz aforado de 50 mL y enrasó con agua destilada. De esta solución concentrada de ácido gálico se tomaron alícuotas de 1, 2, 3, 4 y 5 mL y se diluyeron a 100 mL. Estas diluciones correspondieron a las concentraciones de 10, 20, 30, 40 y 50 mg/100 mL de ácido gálico. El contenido de fenoles totales se expresó en mg/mL. 29 Materiales y Métodos II.9. ACTIVIDAD BIOLÓGICA DE P. aduncum subsp. ossanum II.9.1. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS ACEITES ESENCIALES Microorganismos ensayados: Los microorganismos evaluados fueron: Trypanosoma cruzi Tulahuen CL2, Trypanosoma brucei Squib-427, Plasmodium falciparum K1, Leishmania infantum MHOM/MA(BE)/67, Leishmania amazonensis MHOM/77BR/LTB0016, Escherichia coli ATCC8739, Staphylococcus aureus ATCC6538 y Candida albicans B59630. Fármacos de referencia: Como drogas de referencia se utilizaron: cloranfenicol y eritromicina (SigmaAldrich, Bornem, Belgium), flucitosina (Janssen Pharmaceuticals, Beerse, Belgium), benznidazol, cloroquina, miltefosina, pentamidina y suramina (World Health Organization-Special Programme for Research and Training in Tropical Diseases (WHO-TDR, siglas en inglés) y pentamidina. Ensayos biológicos: Para la selección del panel de microorganismos y los ensayos biológicos, se siguió la metodología descrita por Cos y col. (2006). Las pruebas para los experimentos se realizaron en placas de 96 pocillos (Greiner, Alemania) a diluciones cuádruples en un rango de ajuste de la dosis 0,25-64 µg/mL. Las diluciones se llevaron a cabo por una estación robótica de precisión programable (2000 BIOMEK, Beckman, EE.UU). Cada placa contenía: un pozo control con medio de cultivo (blancos: 0 % de crecimiento), controles de crecimiento de cada microorganismo sin tratamiento (control negativo: crecimiento del 100 %) y controles de los microorganismos tratados con el fármaco de referencia (control positivo). Todas las pruebas se llevaron a cabo por duplicado. Actividad antibacteriana: S. aureus y E. coli fueron cultivados a 37 °C en un medio MHB (caldo de Mueller Hinton), adicionando 5 x 103 CFU/pocillo. Después de 17 horas de incubación, la viabilidad bacteriana se evaluó 30 Materiales y Métodos después de la adición de resazurina durante 30 min a 37 °C (Räz y col., 1997) y se midió la fluorescencia. Actividad antifúngica: C. albicans fue cultivada en medio RPMI a 27 °C, adicionando 5 x 103 CFU/pocillo, después de una incubación de 24 horas para C. albicans a la placa con el aceite esencial. La viabilidad se determinó fluorimétricamente por resazurina después de 24 horas a 37 °C. Actividad antiplasmodial: los parásitos fueron cultivados en eritrocitos humanos A+ a 37 oC bajo una atmósfera de gases (3 % O2, 4 % CO2 y 93 % N2) (Trager y Jensen, 1976) en un medio de cultivo RPMI-1640, 0,5 % (g/v) AlbumaxTM. Se adicionó 200 µL de suspensión de célula de sangre humana en cada pozo y fueron incubados por 72 horas. La multiplicación del parásito fue determinada por el método de Malstat (Makler y col., 1993). Se transfirieron 100 µL del reactivo de MalstatTM en una nueva placa y se mezcló con 20 µL de una suspensión de hemolizado del parásito por 15 min. Después de la adición de 20 µL de una solución de azul de nitro tetrazolio (2 mg/mL)/sulfato de fenacina (0,1 mg/mL) y 2 horas de incubación, se leyó la absorbancia a 655 nm (Biorad 3550-UV microplate reader) y se calculó el porcentaje de inhibición respecto al blanco. Actividad antitripanosomal: Tripomastigotes de T. Brucei fueron cultivados en un medio Hirumi-9 a 37 ºC y 5 % CO2 (Hirumi H. e Hirumi, K., 1989). Después de las 72 horas de incubación, se evaluó el crecimiento del parásito fluorimétricamente agregando resazurina (Räz y col., 1997), durante 24 a 37 ºC. Amastigotes de T. cruzi fueron cultivados en un medio MEM y se incubó a 37 °C por 7 días. El crecimiento del parásito se determinó por adición de β-galactosidasa, utilizando como sustrato rojo de clorofenol β-D-galactopiranósido (Buckner y col., 1996) por 4 horas a 37 °C. El color de la reacción fue medido a 540 nm y se calculó el porcentaje de inhibición respecto al blanco. 31 Materiales y Métodos Actividad antileishmanial: Amastigotes de L. infantum fueron colectados de un hamster previamente infectado. Para determinar la actividad antileishmanial in vitro, 3 x 104 macrófagos fueron sembrados e incubados a 37 ºC and 5 % CO2 durante 48 horas. Posteriormente, las células fueron lavadas e infectadas con L. infantum a un radio de 15 parásitos por macrófago y fueron incubados bajo las mismas condiciones. Dos horas después, los aceites esenciales fue adicionados y se realizó una nueva incubación de 120 horas a 37 ºC y 5 % CO2. Para L. amazonensis, se llevo a cabo una metodología similar, pero la infección de los macrófagos se realizó a un radio de 10 promastigotes en fase estacionaria por macrófago y se incubaron durante 4 horas. Posteriormente, se añadieron las muestras de aceite y se incubaron bajo las mismas condiciones durante 48 horas. Las células fueron fijadas en metanol, teñidas con Giemsa y examinadas bajo aceite de inmersión en un microscopio a 1000x. Se determinó el porciento de macrófagos infectados y el promedio de amastigotes por macrófago infectado comparado con los cultivos controles que no recibieron ningún tratamiento. II.9.2. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD EXTRACTOS HIDROALCOHÓLICOS ANALGÉSICA DE LOS El efecto analgésico se determinó por el ensayo de contorsiones en ratones inducido por ácido acético, vía intraperitoneal, según la metodología descrita en la norma CYTED (1996). Se emplearon ratones de la línea OF1, machos, procedentes del CENPALAB (Centro para la Producción de Animales de Laboratorio), con un peso promedio de 30 g. La comida y el acceso al agua fue "ad libitum”, las condiciones de luz y humedad fueron las descritas en la norma CYTED (1996). Para el estudio se confeccionaron tres grupos de cinco animales cada uno según se muestra en la tabla I. 32 Materiales y Métodos Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Tabla I. Grupos que se sometieron al ensayo de analgesia Agente algésico: solución de ácido acético al 3 % (0,25 mL, vía intraperitoneal) Ácido acetil salicílico (ASA fármaco patrón) 200 mg/Kg vía oral en un volumen de 0,33 mL/30 g + Agente algésico (0,25 mL, vía intraperitoneal) Extractos de P. aduncum subsp. ossanum (400 mg/Kg por vía oral en un volumen de 0,33 mL/30 g) + Agente algésico (0,25 mL, vía intraperitoneal) La sustancia de referencia (ASA) y la objeto de estudio se suministraron por vía oral una hora antes de la administración por vía intraperitoneal del ácido acético. Después que se inyectó el agente algésico, se observó el número de contorsiones y estiramientos que realizaron los animales durante 20 minutos. Los resultados se expresaron como la media del número de contorsiones obtenidas en cada grupo y el efecto analgésico se expresó en términos de porcentaje de inhibición de las contorsiones abdominales inducidas químicamente, calculado por medio de la expresión siguiente: % Inhibición = [(control – tratado) / control] × 100 Donde: % Inhibición: porciento de inhibición de las contorsiones abdominales inducidas químicamente (%). control: número de contorsiones para el grupo control experimental: número de contorsiones para el grupo tratado con la sustancia en estudio y la de referencia. II.10. ANÁLISIS ESTADÍSTICO Los resultados correspondientes al control de calidad de las muestras pertenecientes a las diferentes colectas de P. aduncum subsp. ossanum, así como los obtenidos en la cuantificación de fenoles totales y contenido de aceite esencial, fueron procesados por el programa Statgraphics®Plus, versión 5.0, llevándose a cabo un análisis de varianza de clasificación simple a través de ANOVA-1, para un nivel de confianza del 95 %, y para la comparación de las 33 Materiales y Métodos medias se utilizó el test de Rangos Múltiples de Duncan. El análisis estadístico de los resultados de la actividad antimicrobiana se llevó a cabo mediante la determinación de la concentración mínima inhibitoria (CI50) para cada microorganismo ensayado, a través de una curva lineal de concentraciónrespuesta. Los resultados fueron expresados en media/desviación estándar. 34 CAPÍTULO III RESULTADOS Y DISCUSIÓN Resultados y discusión CAPÍTULO III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN III.1. PARÁMETROS FARMACOGNÓSTICOS DE LA ESPECIE P. aduncum subsp. ossanum III.1.1. CARACTERIZACIÓN BOTÁNICA La caracterización botánica de una especie, incluye la descripción macromorfológica y micromorfológica del material vegetal, las cuales se consideran análisis farmacognósticos imprescindibles con vistas a la estandarización de las drogas y establecer su identidad y pureza, principalmente, cuando en el comercio o la producción no se cuente con un botánico experimentado. III.1.1.1. EVALUACIÓN MACROMORFOLÓGICA Con el objetivo de determinar las características externas de la especie objeto de estudio e interpretar adecuadamente la monografía que sobre la misma se establecen en los compendios oficiales, se decidió efectuar un estudio macromorfológico de las hojas, por ser las más utilizadas tradicionalmente. Al realizar una diagnosis taxonómica de la planta se pudo constatar que es un arbusto perenne con hábito de crecimiento erecto (Dionel y col., 2000), es ramificado, nudoso, y las hojas tienen una disposición alterna sobre el tallo. En la figura 9 se representan algunos detalles morfológicos de la especie y en la tabla II se detallan las características de la lámina foliar de los dos sitios de colecta. A B C D Figura 9. Detalles macromorfológicos de P. aduncum subsp. ossanum A: arbusto, B: disposición alterna de las hojas sobre el tallo, C: haz, D: envés 35 Resultados y discusión Tabla II. Características macromorfológicas de las hojas de P. aduncum subsp. ossanum procedentes de Bauta, Ceiba del agua y las referidas en la literatura. Resultados Parámetros Ceiba del Bauta ( Roig, 1988; Saralegui, 2004a) agua Condición Fresca de la pieza Lámina foliar elíptico-lanceolada, Lámina foliar elíptico-lanceolada o de peciolo corto, borde entero, aovado-elíptica, de peciolo corto, Forma base cordada, ápice acuminado, borde entero, base cordada, ápice nervadura pinnada acuminado, nervadura pinnada Escamosa o escariosa escariosa Textura Superficie Vellosa o pubescente Vellosa o pubescente Color Verde oscuro por el haz y más claro por el envés verde por el haz, verde claro por el envés Olor Aromático (pimienta) Aromático (pimienta, mentolado) Largo (cm) _ X / S Ancho (cm) _ X / S 17,67/2,04a 6,22/0,78c Leyenda: 18,73/1,89b 12 - 21 7,54/0,11d 3–8 _ X / S: valor promedio/ desviación estándar Letras iguales muestran que no existen diferencias significativas y letras diferentes que si existen diferencias significativas para un 95 % de confianza. Los resultados del estudio macromorfológico realizado a las hojas de los dos lugares de colectadas, en cuanto a las características y dimensiones, concuerdan en términos generales con la descripción reflejada en la literatura (Roig, 1988; Saralegui, 2004a; Abreu y col., 2012). No obstante, se pudo constatar que existen diferencias estadísticamente significativas al aplicar ANOVA-1 para un 95 % de confianza, entre las dimensiones de largo y ancho de las muestras de Bauta y Ceiba del agua, lo que sugiere que el lugar de colecta tiene aparente influencia sobre el tamaño de las hojas cuando la planta se encuentra en estado adulto. 36 Resultados y discusión III.1.1.2. EVALUACIÓN MICROMORFOLÓGICA DE LAS HOJAS En los estudios farmacognósticos, resulta imprescindible determinar las características anatómica - morfológicas de las especies, con vistas a establecer su identidad. Para P. aduncum subsp. ossanum la información es escasa. El análisis micromorfológico de las hojas permitió observar en las muestras de los dos lugares de colecta características muy similares. En la epidermis abaxial se observó gran cantidad de estomas del tipo anomocítico (donde las células epidérmicas que rodean el par de células oclusivas no difieren morfológicamente del resto de las células epidérmicas) y bolsas de aceites esenciales, las cuales se observaron de color rojo frente al reactivo de sudam (figura 10A y 10B). Imágenes más ampliadas del mismo tejido permitió visualizar un pelo pluricelular conformado por tres segmentos de células (figura 10C) y un pelo del tipo glandular (figura 10D) cuyo extremo es redondeado, así como una nervadura prominente del tipo helicoidal (figura 10E). Las epidermis adaxial y abaxial (figura 10F y 10G) estuvieron conformadas por células de forma y tamaño variable, en la última se constataron bolsas de aceite esencial. Figura 10. Detalles micromorfológicos a nivel de la epidermis de la hoja de P. aduncum subsp. ossanum A y B: epidermis abaxial (AE: bolsa de aceite esencial, E: estomas) C: PL: pelo pluricelular, D: PG: pelo glandular de la epidermis abaxial, E: NE: nervadura helicoidal, F: ED: epidermis adaxial, G: EB: epidermis abaxial, AE: bolsas de aceite esencial. 37 Resultados y discusión A nivel del nervio central (figura 11A) la superficie adaxial es totalmente cóncava mientras que la abaxial es ligeramente convexa con algunos pelos pluricelulares. La epidermis de ambas caras es muy delgada. A continuación se muestra el colénquima conformado por células alargadas. Imágenes ampliadas de la parte más interna del nervio central (figuras 11B y 11C) permitió observar el sistema vascular de forma helicoidal. En la estructura de los “brazos laterales” o mesófilo (figuras 11D y 11E), se pudo observar el tejido epidérmico conformado por un estrato de células alargadas horizontalmente. Seguidamente y por debajo de esta epidermis se encuentra el esclerénquima conformado por células columnares muy unidas. Esta distribución topográfica de tejidos se complementa con una zona más densa correspondiente al parénquima esponjoso. Finalmente se presenta la epidermis abaxial con un pelo pluricelular. Otros pelos pluricelular y glandular se aprecian en la figura 11E. Figura 11. Detalles micromorfológicos del corte tranversal de la hoja a nivel del nervio central A: nervio central (ED: epidermis adaxial, C: colénquima, EB: epidermis abaxial, PU: pelo unicelular); B y C: ampliación del sistema vascular helicoidal (SVE); D: mesófilo (E: epidermis, EC: esclerénquima, PE: parénquima esponjoso, EB: epidermis abaxial, PL: pelo pluricelular), E: PU: pelo pluricelular, PG: pelo glandular. 38 Resultados y discusión Los estudios encontrados sobre los caracteres micromorfológicos de especies pertenecientes al género Piper son escasos, solo los realizados por Pradhan y col. (2013) en la India a P. betle L. El análisis a nivel del corte transversal de esta especie permitió observar las epidermis adaxial y abaxial con presencia de cutícula (no está presente en P. ossanum), se observa un tejido de empalizada formado por dos capas de células (en la especie objeto de estudio se observa una capa de células). Los haces conductores xilema y floema se presentan en forma de paquetes bien definidos mientras que en P. ossanum estas estructuras se encuentran dispersas y tienen forma helicoidal. Como se puede constatar, existen diferencias microscópicas notables entre P. betle y la subespecie ossanum. Lo anterior ratifica lo señalado por Esau (1972) y Cronquist (1986), quienes plantean que los caracteres micromorfológicos distinguen a una especie en particular, y por dicha razón los resultados obtenidos hacen un aporte interesante para la especie y el género. III.1.2. ESTUDIO DE SECADO El secado es un aspecto fundamental dentro de los estudios farmacognósticos encaminados a establecer la calidad de una droga, por lo que aplicar un método de secado apropiado evita que se activen procesos enzimáticos (fermentativos) que modifiquen la estructura de los posibles principios activos (Miranda y Cuéllar, 2001; Acosta y Rodríguez, 2006). Se conoce que el secado artificial es el más recomendado en todos los casos. Se empleó la estufa porque, para la mayoría de las especies vegetales, es el método más eficiente y rápido para eliminar el alto contenido de agua que se acumula en los materiales naturales. En este sentido, resulta conveniente estudiar el tiempo que demora en secar el material bajo esas condiciones y la pérdida en peso de agua del material vegetal, aspectos imprescindibles a la hora de definir las condiciones de secado de la planta. 39 Resultados y discusión Con relación a la temperatura de secado hay que señalar que su control es fundamental y constituye una seria limitante en el proceso; temperaturas demasiado altas descomponen los metabolitos responsables de la acción terapéutica de las plantas medicinales y muy bajas hacen más largo y costoso el proceso, además de ocasionar daños en el material por el desarrollo de hongos. Por regla general la temperatura de secado no debe exceder los 40 oC (Acosta y Rodríguez, 2006). En cuanto al tiempo de secado influyen numerosos factores, entre ellos están la consistencia de la planta o del órgano vegetal cosechado, donde la relación masa fresca/masa seca es sumamente variable (pérdida en peso de agua), la humedad relativa, la cantidad de agua acumulada en la planta antes del proceso de colecta, entre otros factores. Al someter las muestras a un secado en estufa (con recirculación de aire a temperatura de 35 o C) se pudo constatar que el material vegetal secó completamente entre las 96 y 108 horas, para las colectas de Bauta y Ceiba del Agua, respectivamente. En la tabla III se muestran los resultados del estudio. Tabla III. Resultados del estudio de secado de P. aduncum subsp. ossanum correspondiente a los dos lugares de colecta Pérdida por desecación (%) Tiempo de secado (horas) Muestras _ _ X / S X / S Bauta 54,78/1,23 a 96/1,13 c Ceiba del Agua 67,97/3,16 b 108/1,02 d _ Leyenda: X / S : valor medio de las determinaciones/desviación estándar Letras iguales muestran que no existen diferencias significativas y letras diferentes que si existen diferencias significativas para un 95 % de confianza Al comparar los resultados entre las muestras de los dos sitios de colecta, se demostró que existían diferencias significativas, entre los valores de pérdida en peso de agua y en el tiempo de secado, lo cual pudo deberse a las condiciones climáticas (humedad relativa) durante los días en que se realizó el estudio, así como a la cantidad de agua acumulada en la planta antes del proceso de colecta. 40 Resultados y discusión III.1.3. PARÁMETROS FÍSICO-QUÍMICOS DE LA DROGA CRUDA Dentro del estudio farmacognóstico de una droga se encuentra la determinación de un conjunto de parámetros físico-químicos, los cuales son indispensables para garantizar su calidad y pureza, lo que se traduce en el valor intrínseco de la misma. A continuación se muestran en la tabla IV algunos de los parámetros que le fueron evaluados al material vegetal. Tabla IV. Parámetros físico-químicos de la droga cruda de P. aduncum subsp. ossanum Resultados _ X/ S Parámetros (%) Bauta 12,32/ 0,10a 19,31/0,02c 20,12/0,09e 13,65/0,04g 10,11 / 0,19i 2,78 / 0,38k 1,72/0,01m Humedad residual Sustancias solubles en agua Sustancias solubles en etanol 50% Sustancias solubles en etanol 90% Cenizas totales Cenizas solubles en agua Cenizas insolubles en HCL al 10% Ceiba del Agua 13,65/0,09b 16,87 /0,34d 18,24/ 0,19f 11,15/ 0,09h 9,47/0,34j 1,26/0,12l 0,56/0,02n _ Leyenda: X / S : valor medio de las determinaciones/desviación estándar Letras iguales muestran que no existen diferencias significativas y letras diferentes que si existen diferencias significativas para un 95 % de confianza El primer parámetro evaluado fue el contenido de humedad residual. Un exceso de agua en la droga puede ocasionar la proliferación de microorganismos e insectos, seguido de la hidrólisis de principios activos, especialmente de metabolitos glicosilados y por consiguiente, el deterioro del material vegetal. (Miranda y Cuéllar, 2001). En la literatura se describen diversos métodos para determinar el contenido de humedad, pero el seleccionado en nuestra experiencia fue el método azeotrópico por contener la planta aceite esencial. Generalmente, las normas y farmacopeas establecen un contenido de humedad residual entre el 8 % y el 14 %, en dependencia del material vegetal (Lou-Zhi-cen, 1980; WHO, 1998; Miranda y Cuéllar, 2001). En el estudio efectuado a la planta, el promedio de las determinaciones estuvo dentro del intervalo exigido para las 41 Resultados y discusión muestras de Bauta y Ceiba del Agua, lo que demostró la eficiencia del proceso de secado (estufa de recirculación de aire a 35 ºC). La determinación de sustancias extraíbles o solubles es uno de los índices numéricos más importantes para seleccionar los mejores disolventes en el proceso de extracción. Se utilizaron diferentes menstruos y los resultados revelaron (tabla IV) que se obtiene mayor rendimiento de sustancias extraíbles de manera general con la mezcla hidroalcohólica al 50 %, siendo más elevadas en la muestra procedente de Bauta. El análisis estadístico de los resultados mostró con un nivel de confianza del 95 %, que existen diferencias significativas entre los extractos evaluados y entre los dos sitios de colecta. Las cenizas totales se definen como residuos que se obtienen al incinerar una droga y su determinación está incluida dentro de los parámetros de calidad de interés a evaluar para el análisis de un material vegetal. Además, constituyen una base para juzgar la pureza e identidad de este, brindando información relativa a la posible adulteración con materias inorgánicas o cuerpos extraños que posea la misma, o la cantidad de estos en su contenido (Miranda y Cuéllar, 2001). Las Farmacopeas plantean un índice de cenizas totales hasta el 5 % (Lou-Zhi-cen, 1980; WHO, 1998), aunque los valores pueden variar significativamente en dependencia del material vegetal y lugar de colecta. El valor obtenido fue algo elevado, aunque puede ser característico de esta planta en dependencia de las condiciones del suelo donde se desarrolle la misma. La especie recolectada en Bauta creció sobre un suelo ferralítico rojo compacto, el mismo se caracteriza por ser arcilloso, muy plástico en estado húmedo y muy duro o compacto en estado seco, saturados por calcio (Jaimez y Gutiérrez, 1994). Estos elementos pudieran estar relacionados con el alto contenido de cenizas en la especie. Por su parte, la especie recolectada en Ceiba del Agua, también creció sobre un suelo ferralítico rojo, a diferencia del anterior, este tiene muy buena estructura para el laboreo agrícola, así como un buen drenaje superficial e interno (Jaimez y Gutiérrez, 1994). 42 Resultados y discusión La cantidad de cenizas solubles en agua y las insolubles en ácido clorhídrico al 10 %, son también parámetros que ayudan a evaluar la pureza de la droga. En ambas determinaciones los valores fueron pequeños y están dentro de los límites establecidos (alrededor del 2 % para plantas medicinales) (Lou- Zhi-cen, 1980; WHO, 1998). Se constataron algunas diferencias estadísticamente significativas entre las dos muestras, que pudieran ser atribuibles a las características del suelo en el que se desarrolló la planta, donde la disponibilidad de nutrientes puede variar de un lugar a otro. III.2. IDENTIFICACIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS POR TAMIZAJE FITOQUÍMICO Es considerado de interés en el estudio de una droga, conocer de forma preliminar su composición química general, la cual se obtiene mediante métodos de tamizaje fitoquímico. Al efectuar los análisis correspondientes al extracto etéreo (tabla V) se evidenciaron resultados positivos para núcleos triterpénicos y esteroidales, lactónicos y compuestos grasos. Tabla V. Resultados de los ensayos de tamizaje del extracto etéreo. Resultados Ensayos Metabolitos Sudam Dragendorff Mayer Wagner Baljet Lieberman-Burchard Compuestos grasos Alcaloides Alcaloides Alcaloides Lactonas y coumarinas Triterpenos y/o esteroides Bauta + ++ ++ Ceiba del Agua + + ++ Leyenda: + ensayo positivo; ++ ensayo muy positivo; - ensayo negativo El resultado positivo para compuestos grasos, incluyendo aceites esenciales, coincide con lo reportado para muchas especies de Piper, incluyendo la del presente estudio; estos compuestos tienen gran aplicación en las industrias 43 Resultados y discusión farmacéutica, cosmética y alimentaria (Miranda y Cuéllar, 2001; Aydin y col., 2013; Rufino y col., 2014). Los compuestos lactónicos, en especial coumarinas también fueron detectadas, Son considerados como estructuras privilegiadas debido a su amplia gama de propiedades biológicas, incluyendo antioxidante, anticancerígeno y anticoagulante, actividades anti-neurodegenerativa, antimicrobianas (Mirunalini y Krishnaveni, 2011; Torres y col., 2014). La presencia de triterpenoides y esteroides está en correspondencia con lo referido para el género Piper (Parmar y col., 1997). Se ha informado que los triterpenoides han mostrado varios efectos farmacológicos tales como antiinflamatorio, anti-ulceroso, antibacteriano, antiviral (incluyendo anti-VIH), hepatoprotector, inmunomodulador, hipolipidémico y para reducir el colesterol, anticoagulante, anticancerígeno, etc. (Szakiel y col., 2012). También se ha reportado actividad antitripanosomal (Hoet y col., 2007). Los esteroles se han investigado como uno de los posibles métodos alternativos seguros para reducir los niveles de colesterol en plasma y el colesterol LDL. Por otra parte, se ha discutido evidencia de los efectos beneficiosos de los esteroles vegetales en trastornos como xantomatosis cutánea, cáncer de colon y la hiperplasia de próstata (Moghadasian, 2000; Plösch y col., 2006). El extracto alcohólico (tabla VI) respondió positivo a sustancias reductoras, flavonoides, quinonas, taninos, triterpenoides y esteroides, aminoácidos, compuestos lactónicos y coumarinas. En el extracto hidroalcohólico fue notoria la presencia de compuestos fenólicos en general, entre ellos flavonoides y taninos mostraron resultados muy positivos para ambas colectas. Dichos compuestos también están reportados para el género y tienen demostrado actividad antioxidante, hepatoprotectora, son antiinflamatorios, antitumorales, antivirales, previenen la enfermedad cardíaca coronaria (Takuo y Hideyuki, 2011; Shashank y Pandey, 2013), presentan propiedades analgésicas 44 Resultados y discusión (Bittar y col., 2000; da Silva y col., 2001; Arunachalam y col., 2011), entre otras actividades. Tabla VI. Resultado de los ensayos de tamizaje del extracto alcohólico. Ensayos Metabolitos Espuma Resina Ninhidrina Fehling FeCl3 Lieberman-Burchard Borntrager Dragendorff Mayer Wagner Baljet Antocianidinas Shinoda Saponinas Resinas Aminoácidos Sustancias reductoras Fenoles y/o taninos Triterpenos y/o esteroides Quinonas Alcaloides Alcaloides Alcaloides Lactonas y coumarinas Antocianidinas Flavonoides Resultados Bauta Ceiba del Agua + + ++ ++ ++ ++ ++ + + + + + ++ ++ Leyenda: + ensayo positivo; ++ ensayo muy positivo; - ensayo negativo En el extracto acuoso (tabla VII) resultaron positivos los ensayos para flavonoides, taninos y sustancias reductoras. Tabla VII. Resultado de los ensayos de tamizaje al extracto acuoso Ensayos Metabolitos Dragendorff Mayer Wagner Shinoda FeCL3 Fehling Espuma Mucílagos Alcaloides Alcaloides Alcaloides Flavonoides Fenoles y taninos Sustancias reductoras Saponinas Mucílagos Resultados Bauta Ceiba del Agua + + ++ + + + - Leyenda: + ensayo positivo; ++ ensayo muy positivo; - ensayo negativo 45 Resultados y discusión Otros compuestos como quinonas y aminas fueron encontradas, lo cual está en concordancia con los reportes en la literatura para algunas especies del género Piper como P. peltatum y P. aduncum L (Soto, 2015). Atendiendo a los informes de la literatura, debió esperarse la presencia de alcaloides. Los resultados hasta el momento bajo las condiciones ensayadas no revelan la presencia de los mismos, lo que no quiere decir que estén ausentes en la especie. Importante destacar que el tamizaje fitoquímico aunque nos orienta hacia la composición química preliminar de una especie determinada, no deben considerarse concluyentes debido a múltiples factores que inciden sobre los resultados; como la época de recolección, el estado fenológico del vegetal, el límite de detección del ensayo, entre otros aspectos (Miranda y Cuéllar, 2001). Ante esta situación, se precisa de un estudio riguroso como una dinámica de acumulación de tales compuestos y un análisis más profundo de los diferentes extractos. Es importante destacar que no se apreciaron diferencias en la composición química determinada por tamizaje fitoquímico en los lotes evaluados, pero si en las intensidades de color para algunos ensayos, manifestándose de forma muy evidente la presencia de compuestos de naturaleza fenólica, sustancias reductoras, así como triterpenoides y esteroides. III.3. OBTENCIÓN DE LOS EXTRACTOS Considerando los resultados obtenidos en la determinación de sustancias extraíbles, donde el disolvente con mayor poder extractivo fue la mezcla hidroalcohólica al 50 %, se procedió a la obtención de extractos a partir del material vegetal correspondiente a los dos sitios de colecta (Bauta y Ceiba del Agua). El método de extracción utilizado fue la maceración (siete días), por ser uno de los más empleados para la elaboración de extractos y menos agresivo para el material vegetal. 46 Resultados y discusión III.4. PARÁMETROS FÍSICO-QUÍMICOS DE CALIDAD DE LOS EXTRACTOS Con el propósito de determinar la calidad de los extractos hidroalcohólicos de los dos sitios de colectas evaluados, se procedió al análisis de los parámetros físicoquímicos. Fueron considerados los aspectos siguientes: propiedades organolépticas (olor y color), análisis del pH, sólidos totales, índice de refracción y densidad relativa. En la tabla VIII se presentan los resultados del estudio. Tabla VIII. Parámetros físico-químicos de los extractos de P. aduncum subsp. ossanum. Resultados obtenidos _ X/ S Parámetros pH Sólidos totales (%) Índice de refracción Densidad relativa (g/mL) Bauta 6,61/0,03a 2,07/0,05b 1,366/0,00d 0,854/0,00e Ceiba del Agua 6,53/0,01a 1,28/0,04c 1,362/0,00d 0,855/0,00e Leyenda: Letras iguales muestran que no existen diferencias significativas y letras diferentes que si existen diferencias significativas para un 95% de confianza. Desde el punto de vista organoléptico ambos extractos se presentaron como líquidos traslúcidos de color verde intenso y olor característico. La determinación del pH, brinda el grado de acidez o basicidad de una solución, en el caso particular de los extractos se obtuvo como resultado un pH ácido, lo cual indica la acidez de las preparaciones, que pudiera estar relacionada con la presencia de compuestos de naturaleza fenólica. El contenido de sólidos totales fue otro parámetro medido de gran importancia, pues brinda información relativa sobre la cantidad de constituyentes no volátiles presentes en el extracto, además de servir de base para el ajuste de dosis, en estudios farmacológicos y toxicológicos, cuando no se conoce la concentración del principio activo que ejerce la acción. Se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre las dos muestras evaluadas, para un 95 % de confianza y el mayor porcentaje fue para la colecta de Bauta, lo cual está en correspondencia 47 Resultados y discusión con los resultados obtenidos en la determinación de sustancias extraíbles. Las diferencias en los resultados pudieron estar condicionadas por la influencia de factores extrínsecos, especialmente por las características del ecosistema donde creció el vegetal, que propicia variaciones en el contenido de metabolitos y por ende en el contenido de sólidos totales. La densidad relativa y el índice de refracción también fueron medidos a los extractos; el primero nos da criterio del peso específico del mismo y el segundo parámetro es una constante característica de cada sustancia, que representa la relación entre el seno del ángulo de incidencia de la luz y el seno del ángulo de refracción cuando la luz pasa oblicuamente a través del medio. Los resultados no manifestaron diferencias significativas entre las muestras evaluadas. III.5. OBTENCIÓN DEL ACEITE ESENCIAL Y CARACTERIZACIÓN FÍSICOQUÍMICA En el proceso de extracción se obtuvo un aceite muy ligero. En la tabla IX se recogen los parámetros de calidad determinados al aceite de los dos lugares de colecta. Tabla IX. Parámetros de calidad determinados al aceite esencial de P. aduncum subsp. ossanum y los referidos en la literatura Resultados obtenidos Parámetros Olor Color Índice de refracción _ X / S Rendimiento (%) _ X / S Ceiba del Agua Fuertemente aromático Amarillo Amarillo intenso claro Bauta Pino y col., 2011 Aromático penetrante Amarillo claro 1,493/0,0a 1,484/ 0,0b 1,473/0,001c 0,48/0,01d 0,37/ 0,03e 0,56f Leyenda: Letras iguales muestran que no existen diferencias significativas y letras diferentes que si existen diferencias significativas para un 95 % de confianza 48 Resultados y discusión Como se puede apreciar en la tabla existen diferencias, principalmente, en dos de los parámetros evaluados (índice de refracción y rendimiento). Las diferencias pueden estar dadas, fundamentalmente, por el lugar de colecta de las muestras (Municipio San José de las Lajas, provincia Mayabeque (Pino y col., 2011) y municipio Bauta y Localidad Ceiba del Agua, provincia Artemisa), la edad de la planta y estado fenológico de las mismas, este último factor no se especifica por Pino y col. (2011). El método de extracción empleado por hidrodestilación y el tiempo de extracción (3 horas) fueron los mismos en ambos trabajos. III.6. ANÁLISIS DEL ACEITE ESENCIAL POR CROMATOGRAFÍA GASEOSA ACOPLADA A ESPECTROMETRÍA DE MASAS (CG-EM) La CG-EM da lugar a una técnica combinada que permite la separación e identificación de mezclas complejas. Cada uno de estos componentes se registran en forma de pico cromatográfico y se identifican mediante sus respectivos espectros de masas, proporcionando una información fiable para el análisis cualitativo de muestras complejas. Este acoplamiento ha sido muy utilizado en el análisis de fitoconstituyentes, otras fuentes naturales y sistemas biológicos (Gutiérrez y Droguet, 2002; Heravi y Sereshti, 2007; Binit y col., 2010; Kartik y col., 2010). La asignación de las estructuras se realizó por comparación de los espectros de masas de los compuestos con los de la biblioteca del equipo, seleccionando aquellos que sobrepasaban el 90 % de confiabilidad. En cuanto a la identificación de los componentes mayoritarios del aceite esencial de P. aduncum, recolectada en diferentes localizaciones geográficas; en la literatura se reporta que investigaciones realizadas en Islas Fiji, Brasil, Panamá, Colombia, Cuba, Costa Rica, Ecuador y Papua Nueva Guinea, coinciden en la identificación del dilapiol como componente mayoritario (Smith y col., 1979; Gottlieb y col., 1981; Gupta y col., 1983; Díaz y col., 1984; Cicció y Ballestero, 1997; Bottia y col., 2007; Rali y col., 2007; Rafael y col., 2008; Guerrini y col., 2009). Las variaciones en el contenido de este compuesto se informan entre 49 Resultados y discusión variedades y localidades de un mismo país, por ejemplo, entre las variedades brasileñas P. aduncum var. aduncum y P. aduncum var. cordulatum y P. aduncum recolectadas en dos localidades de Costa Rica. En contraste, Tirillini y col. (1996), analizaron por CG-EM el aceite esencial de P. aduncum, y el alcanfor y el canfeno fueron los principales constituyentes. Vila y col. (2005) informaron un alto contenido de sesquiterpenoides en muestras provenientes de Panamá, con α-cariofileno y aromadendreno como componentes mayoritarios, mientras que las muestras bolivianas estuvieron compuestas predominantemente por monoterpenoides, con el 1,8-cineol como componente principal. El análisis del aceite esencial procedente de Bauta evidenció un cromatograma conformado por gran cantidad de picos cromatográficos de diferentes intensidades, siendo más complejo a partir de los 15 minutos, aproximadamente. La figura 12 muestra el perfil cromatográfico obtenido por CG. Abundance TIC: BAUTA.D 3e+07 34 2 2.5e+07 16 11 20 2e+07 25 1.5e+07 43 38 37 33 27 30 18 39 35 40 42 29 31 32 36 28 22 19 41 24 17 21 26 23 1e+07 5000000 12 7 1 34 6 5 89 4.00 6.00 10 1315 14 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 Time--> Figura 12. Cromatogramas gaseosos del aceite esencial de P. aduncum subsp. ossanum procedente de Bauta El cromatograma reveló 43 picos, de los cuales solo pudieron ser identificados con ayuda de la base de datos del equipo 39 componentes que representan el 90,6 %. 50 Resultados y discusión En anexo 1 se muestran los espectros de masas de cada compuesto detectado y en la tabla X se refleja la composición química que se sugiere para dicho aceite. P Tabla X. Composición química del aceite esencial de las hojas de P. aduncum subsp. ossanum procedente de Bauta Tr Ar Tr Compuestos P Compuestos (min) (%) 1 2 3 4 5 6 7 3.18 3.51 4.03 4.39 4.68 5.20 5.35 α- pineno Canfeno β-pineno Mirceno α-felandreno p- cimeno Silvestreno 8 9 5.58 5.85 cis-ocimeno trans- β- ocimeno 10 7.47 11 (min) Ar (%) 23 24 25 26 27 28 29 16.19 16.28 16.63 16.68 16.82 17.07 17.13 α- humuleno β- santaleno Germacreno D β- selineno Calareno α- amorfeno No identificado 0,28 30 31 17.21 17.65 δ- cadineno Germacreno B Linalol 0,71 32 17.84 Nerolidol 0,36 8.77 Alcanfor 13,86 33 18.03 Óxido de cariofileno 1,6 12 9.12 Isoborneol 3,95 34 18.21 Viridiflorol 13,01 13 9.33 Borneol 0,85 35 18.33 Ledol 0,71 14 9.68 Terpinen-4-ol 36 18.40 Epóxido de humuleno 15 16 10.15 12.45 α- tepineol Piperitona 0,18 1,17 20,06 37 38 18.77 18.96 α- cadineno T- cadinol 0,6 2,82 17 14.85 α- copaeno 0,25 39 19.13 Calacoreno 1,72 18 15.19 β- elemeno 1,15 40 19.37 Espatulenol 0,8 19 15.45 α- gurjuneno 0,47 41 19.55 No identificado 2,98 20 15.66 β- cariofileno 4,42 42 25.12 No identificado 0,96 21 15.87 γ- elemeno 0,27 43 20.73 No identificado 0,42 22 15.93 Aromandreno 0,56 1,67 7,43 0,49 0,49 0,12 0,61 2,5 0,13 2,24 0,28 3,16 0,29 1,24 0,54 0,75 1,18 0,73 Leyenda: P: Picos, Tr:Tiempo de retención, Ar: Área relativa Compuestos mayoritarios Nuevos compuestos identificados en la especie Como se puede apreciar en la tabla, el componente mayoritario resultó ser la cetona monoterpénica piperitona con un 20,06 % de abundancia relativa, seguida del alcanfor y el sesquiterpenoide viridiflorol con valores de 13,86 y 13,01 % de abundancia relativa, respectivamente. 51 1,99 Resultados y discusión La piperitona con fórmula química C10H16O, es una cetona cíclica. Su espectro de masas (anexo 1.1) muestra un ion molecular [M+] prominente a m/z 152. Se presenta un pico a m/z 137 [M+-CH3] y el pico base del espectro se observa a m/z 82 en concordancia con la pérdida del grupo C5H10+ desde el ion molecular. Fragmentos de abundancia apreciable se observan a m/z 110 que corresponde a la pérdida de un fragmento que incluye la función oxigenada [M+- 42] y otro a m/z 95 (Erik, 1964; Benavides y col., 2010). En la figura 13 se muestra la ruta de fragmentación sugerida para el compuesto. 110 82 O M+ 152 Figura 13. Fragmentaciones sugeridas para la piperitona (Erik, 1964) La piperitona tiene un aroma similar a la menta, se ha aislado de los aceites de varias especies del género Piper y ha manifestado actividad antiinflamatoria (da Silveira y col., 2013). Se utiliza como la materia prima principal para la producción de mentol y timol sintético y su fuente principal es de Eucalyptus dives, producido principalmente en Sudáfrica (Boland y col., 1991). Por otra parte, ha mostrado efecto en la actividad antimicrobiana de la nitrofurantoina y en el metabolismo de nitrofurantoina por Enterobacter cloacae (Farid y col., 2007) y actividad frente a Staphylococcus aureus (Brazão y col., 2014). El alcanfor es una cetona cristalina que posee acción rubefaciente, antitusiva, expectorante, antiprurítica, antiséptica y ligeramente analgésica (Paolo, 2009). Se emplea en forma de linimentos, soluciones alcohólicas y pomadas, como revulsivo en dolores articulares, musculares, neuralgias y otras afecciones similares (Xu y col., 2005; Paolo, 2009). También se ha usado ampliamente como fragancia en los cosméticos, como condimento y en la síntesis de perfumes (Leikin y Paloucek, 2002; Akram y col., 2006). 52 Resultados y discusión El espectro de masas del alcanfor (anexo 1.2) está en plena correspondencia con el referido por Erik (1964) y Oliveira y col. (2015), se evidencia el ion molecular prominente a m/z 152 en correspondencia con la fórmula C10H16O; se observa el pico base a m/z 95 y otros fragmentos de intensidad apreciable a m/z 81 y m/z 108. Por su parte, el viridiflorol es un alcohol sesquiterpénico con propiedades inhibitorias sobre la enzima acetilcolinesterasa (Mitsuo y col., 1998) y actividad contra P. aeruginosa y S.aureus (Gilabert y col., 2015). El espectro de masas del compuesto (anexo 1.3) mostró un pico de baja intensidad a m/z 222 relacionado con el ion molecular y la fórmula C15H26O. También se evidencian otros fragmentos importantes característicos del compuesto a m/z 204, 189, 161, 147, 135 y 109 (Carbonell y col., 2000). El análisis del aceite esencial procedente de Ceiba del Agua evidenció un cromatograma conformado por gran cantidad de picos cromatográficos de diferentes intensidades, aunque menos complejo que el obtenido de la colecta de Bauta. La figura 14 muestra el perfil cromatográfico por CG. Abundance TIC: CEIBA.D 1.8e+07 33 1.6e+07 1.4e+07 1.2e+07 12 1e+07 2 8 8000000 39 35 36 6000000 22 9 16 6 4000000 37 34 38 27 32 24 29 31 30 19 26 28 25 14 23 21 18 17 20 15 13 1 2000000 5 34 4.00 7 6.00 8.00 10 11 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 Time--> Figura 14. Cromatogramas gaseosos del aceite esencial de P. aduncum subsp. ossanum procedente de Ceiba del Agua El cromatograma evidenció 39 picos, de los cuales fueron identificados con ayuda de la base de datos del equipo 36 componentes que representan el 92,3 %. El compuesto mayoritario también resultó ser la piperitona con 18,94 %, aunque el 53 Resultados y discusión porcentaje fue menor que en el aceite de Bauta, seguidamente le correspondió al viridiflorol con 18,73 % y el tercer compuesto en abundancia correspondió al alcanfor con un 9,00 %. En la tabla XI se refleja la composición química que se sugiere para dicho aceite. P Tabla XI. Composición química del aceite esencial de las hojas de P. aduncum subsp. ossanum procedente de Ceiba del Agua Área Tr. Tr. (%) P Compuestos Compuestos (min) (min) 1 2 3 4 5 6 7 3.17 3.46 4.03 4.40 4.68 5.30 7.40 α- pineno Canfeno β- pineno Mirceno α- felandreno β- felandreno Linalol 1,39 8 9 8.73 9,10 Alcanfor Isoborneol 9,00 10 11 9.30 10.13 Borneol α- terpineol 0,61 12 12.41 13 Área (%) 21 22 23 24 25 26 27 16.52 16.59 16.67 16.80 17.06 17.10 17.20 γ- muroleno β- cubebeno β- selineno Calareno α- amorfeno δ- cadineno (Isomero) δ- cadineno 0,45 28 29 17.64 17.80 Germacreno B Nerolidol 0,83 17.96 18.00 Desconocido Óxido de cariofileno 0,95 0,72 30 31 Piperitona 18,94 32 18.05 Globulol 1,53 14.85 α- copaeno 0,13 33 18.19 Viridiflorol 18,73 14 15.16 β- elemeno 0,62 34 18.30 Ledol 1,24 15 16 15.43 15.60 α- gurjuneno β- cariofileno 0,21 18.75 18.92 α- cadideno T- murolol 4,07 2,3 35 36 17 15.86 γ- elemeno 0,24 37 19.09 Desconocido 2,54 18 15.92 Aromandreno 0,32 38 19.34 Espatulenol 1,40 19 16.15 β- santaleno 1,39 39 25.09 Desconocido 4,25 20 16.27 Germacreno D 0,23 5,01 0,27 0,46 0,66 2,16 0,50 4,00 3,21 0,38 1,69 0,61 0,99 1,93 1,56 1,29 Leyenda: P: Picos, Tr:Tiempo de retención, Ar: Área relativa Compuestos mayoritarios Nuevos compuestos identificados en la especie En términos generales se observaron diferencias notables en las abundancias relativas de los compuestos mayoritarios y también en la composición de ambos aceites, por ejemplo, la presencia en la muestra de Bauta de p-cimeno, 54 3,19 Resultados y discusión silvestreno, cis-ocimeno, trans β-ocimeno, terpin-ol y calareno, los cuales no se encontraron en la muestra de Ceiba, sin embargo, en esta última, se detectaron como diferentes a la muestra anterior los compuestos β-felandreno, β- cubebeno, γ- muuruleno, globulol y T-muurolol. En la figura 15 se muestran las estructuras de los compuestos mayoritarios detectados en los dos aceites estudiados. OH O O Piperitona Alcanfor Viridiflorol Figura 15. Estructuras químicas de los componentes mayoritarios identificados en el aceite esencial de P. aduncum subsp. ossanum procedente de Bauta y Ceiba del Agua. Aunque la mayoría de las investigaciones relacionadas con la composición química del aceite esencial de P. aduncum coinciden con la presencia mayoritaria de dilapiol, este fenilpropanoide no se identificó entre los componentes con mayor abundancia relativa en el aceite de la subespecie ossanum estudiada por Pino y col. (2011) y en el aceite esencial de la misma especie de la presente investigación no fue detectado. En concordancia, los resultados obtenidos confirman los presentados por otros autores en cuanto a la presencia de piperitona (Smith y col., 1979; Díaz y col., 1984; Cicció y Ballestero, 1997; Rali y col., 2007; Pino y col., 2011) y alcanfor como componentes mayoritarios en el aceite esencial de P. aduncum (Tirillini y col., 1996; Pino y col., 2011). Algo notorio de nuestra investigación fue el hecho de encontrar el Silvestreno Calareno y Nerolidol (figura 16), pues aunque no fueron mayoritarios, no habían sido identificados con anterioridad para la especie endémica, aspecto que constituye un aporte importante al estudio de la composición química del aceite esencial de P. aduncum subsp. ossanum. 55 Resultados y discusión Silvestreno Calareno Nerolidol Figura 16. Estructuras químicas de los nuevos compuestos identificados en el aceite esencial de P. aduncum subsp. ossanum. El silvestreno es un monoterpenoide que no es común encontrarlo en especies de Piper, sin embargo, ha sido identificado en el aceite esencial de las especies Magnolia grandiflora y Chrysactinia mexicana como componente mayoritario. El aceite esencial de estas especies ha manifestado actividad antifúngica frente a dermatofitos y actividad antimicrobiana frente a Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes (Guerra-Boone y col., 2013). El silvestreno también se ha encontrado como componente del aceite esencial de la especie P. sammogeton canescens, el cual ha manifestado actividad frente a Candida albicans y Escherichia coli (Kazemi y Rostami, 2015). El espectro de masas del compuesto (anexo 1.4) muestra un fragmento prominente a m/z 136 en concordancia con su fórmula molecular C10H16; se aprecia un fragmento de menos intensidad a m/z 121 relacionada con la pérdida del grupo CH3 a partir del ion molecular, uno a m/z 93 (pico base del espectro), entre otros característicos del compuesto (Erick, 1964). El calareno es un sesquiterpenoide que se ha encontrado como componente del aceite esencial de la especie Piper porphyrophyllum, el cual ha manifestado actividad contra Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida y Escherichia coli (Wan y col., 2012). Este compuesto también ha manifestado efecto sedativo (Hiroaki y col., 2008). En el espectro de masas (anexo 1.5) se presenta su ion molecular a m/z 204 consecuente con la fórmula molecular C15H24. Se observan iones a m/z 189 [M+CH3], éste puede perder luego un grupo etilo (de la apertura del ciclopropano) para originar el ion a m/z 161, éste último pierde un grupo metilo para formar el ion 56 Resultados y discusión a m/z 147. Otros fragmentos característicos del compuesto se aprecian a m/z 121, 105 y 93, en correspondencia con lo referido en la literatura (Carbonell y col, 2000; Benavides y col., 2010; Oliveira y col., 2015). El nerolidol (C15H26O) es un alcohol sesquiterpénico que se encuentra en los aceites esenciales de muchos tipos de plantas y flores; está presente en el neroli, jengibre, jazmín, lavanda, árbol de té, Cannabis sativa y hierba de limón. El aroma de nerolidol es leñoso y con reminiscencias de corteza fresca. Se utiliza como un agente aromatizante y en perfumería. También se encuentra actualmente en pruebas como un potenciador de penetración en la piel para la administración transdérmica de fármacos terapéuticos (Moser y col., 2001). Otros estudios efectuados por Klopell y col. (2007), demostraron el efecto anti-ulcerativo de dicho compuesto a las dosis de 50, 250 y 500 mg/kg, las cuales disminuyeron las lesiones en 42,79; 45,70 y 61,61 %, respectivamente. En el espectro de masas del nerolidol (anexo 1.6) no es posible visualizar el ion molecular, lo cual está en correspondencia con el espectro de muchos alcoholes alifáticos (Silverstein y col., 1977). Se observa un pico de baja intensidad a m/z 204 producido por la pérdida de agua desde el ion molecular (m/z 222). También se localizaron picos a m/z 161, 136, 121, 107, 93, 81, 69 (muy intenso), característicos del compuesto (Restek Corporation, 2016). Las discrepancias relacionadas con la composición del aceite, cambios cualitativos y cuantitativos (cantidades relativas obtenidas de diferentes componentes), pueden ser consecuencia de variaciones en las condiciones ecológicas (clima, tipo de suelo, estación del año, lugar geográfico) en que se desarrolla la planta (Durán y col., 2007; Pino y col., 2011). En la mayoría de los trabajos no se especifica si se trata de una subespecie o variedad, los aceites estudiados en este trabajo, así como el evaluado por Pino y col. (2011) es obtenido de P. aduncum subsp. ossanum, una especie endémica de Cuba (Saralegui, 2004a; 2004b), y es probable que las causas de las diferencias en su composición química estén asociadas fundamentalmente a las características del ecosistema donde se 57 Resultados y discusión desarrolló la planta que pueden conllevar a variaciones en la biosíntesis de metabolitos secundarios en esta subespecie. III.7. PERFIL FITOQUÍMICO DE LOS EXTRACTOS HIDROALCOHÓLICOS DE P. aduncum subsp. ossanum En la estandarización de productos herbarios se integran un conjunto de técnicas analíticas modernas, con el objetivo de lograr una huella dactilar de ese preparado y poder identificar el o los marcadores químicos que están relacionados con el efecto terapéutico. En la investigación realizada se estimó el perfil fitoquímico de los extractos hidroalcohólico al 50 % obtenidos de P. aduncum subsp. ossanum de las colectas de Bauta y Ceiba del Agua, realizando un análisis por cromatografía en capa delgada, cromatografía líquida de alta resolución y determinación cuantitativa de fenoles. III.7.1. CROMATOGRAFÍA EN PLACA DELGADA La cromatografía en capa delgada es una técnica simple, económica y versátil para la identificación de los componentes químicos en productos herbarios, ya que suministra un perfil visible e intuitivo de los constituyentes (Mok y col., 2006; Jiang y col., 2010; Kartik y col., 2010; Neeraj y Bhupinder, 2011). Al visible se observó poca complejidad cromatográfica de los extractos, siendo evidente en las dos muestras evaluadas, dos manchas de color amarillo claro (1 y 2). La exposición a la luz ultravioleta (254 nm) permitió observar modificaciones en el color de las manchas (figura 17-I); este comportamiento es característico de grupos cromóforos. Al revelar con solución metanólica al 5 % de tricloruro de aluminio (figura 17-II), las dos manchas amarillas que se mostraron al visible (manchas 1 y 2) intensificaron su color, lo cual pudiera ser indicativo de la presencia de flavonoides en los extractos evaluados. Finalmente al revelar con ácido sulfúrico al 5 % en etanol y la posterior exposición al calor (figura 17-III), las manchas amarillas se tornaron amarilla-naranja (comportamiento característico de flavonoides). Las cercanas al frente del disolvente (mancha 3) tomaron coloración 58 Resultados y discusión rojiza, comportamiento característico de estructuras del tipo terpenoide. (Lock, 1988; Miranda y Cuéllar 2001). I II III Figura 17: Cromatogramas de los extractos de P. aduncum subsp. ossanum Soporte: Gel de sílice sobre soporte de aluminio, Fase móvil: n-butanol:ácido acético:agua (65:25:10). I: Luz UV 254 nm; II: Tricloruro de aluminio al 5 %; III: H2SO4 /calor Los extractos evaluados mostraron un comportamiento cromatográfico similar en cuanto al número de manchas y respuesta a los diferentes reveladores. La fase móvil empleada logró separar de alguna manera los componentes según su polaridad, pudiendo sugerir la presencia de compuestos de naturaleza fenólica, entre ellos, flavonoides y estructuras tipo terpenoides. Por otra parte, también se apreciaron otras manchas retenidas en el punto de aplicación, algo indicativo de compuestos polares. Es importante destacar que los extractos vegetales suelen ser muy complejos en cuanto a su composición química. Como consecuencia, los metabolitos presentes pueden solaparse entre si no logrando buenas resoluciones en muchas ocasiones, pues es común que una mancha esté compuesta por varios de ellos, por dichas razones se requieren otros métodos que permitan complementar el perfil fitoquímico de un extracto determinado. 59 Resultados y discusión III.7.2. ANÁLISIS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (CLAR) La cromatografía líquida de alta resolución es muy utilizada para determinar el perfil fitoquímico de muchos extractos debido a su alta resolución, sensibilidad y rápido tiempo analítico. Puede brindar mayores posibilidades de detección de los diferentes constituyentes, tanto de forma cualitativa como cuantitativa cuando se acopla con la espectroscopia ultravioleta con arreglo de diodos, espectrometría de masas, resonancia magnética nuclear, entre otras (Chimezie y col., 2008; Rao y Anna, 2009; Kartik y col., 2010; Saravanan y col., 2010; Neeraj y Bhupinder, 2011). Al realizar un análisis de los cromatogramas (figura 18) de los dos extractos evaluados, se pudo constatar que los mismos mantenían un perfil muy parecido. La diferencia fundamental estuvo en la intensidad de los picos, que varió indistintamente de un extracto a otro y en la presencia de un octavo pico de pequeña intensidad en el extracto procedente de Bauta. Figura 18. Cromatogramas por CLAR de los extractos hidroalcohólicos procedentes de Bauta y Ceiba del Agua En la mayoría de los flavonoides, el espectro de absorción UV, exhibe dos bandas en la región del ultravioleta/visible, la banda I, representativa del anillo A de estos compuestos que aparece en un rango de los 320 a 385 nm y la banda II 60 Resultados y discusión perteneciente al anillo B, ubicada entre los 250 y 285 nm (Lock, 1988; Markham, 1989). El análisis de los espectros de absorción ultravioleta-visible (anexo 2.1) obtenidos en el análisis por CLAR del extracto procedente de Bauta, permitió sugerir que los picos 1, 2, 4, 5, 6 y 7 están asociados con la presencia de compuestos fenólicos y flavonoides. En ellos se presenta un perfil de absorción semejante con una banda alrededor de los 250 nm y un hombro leve entre 320 y 350 nm (Lock, 1988; Markham, 1989; Martínez y col., 2012). El extracto procedente de la colecta de Ceiba del Agua también mostró espectros ultravioletas (anexo 2.2) con un comportamiento similar al del extracto de Bauta, pudiendo sugerir también la presencia de las estructuras anteriormente señaladas para los picos 1, 2, 4, 5 y 6. Los resultados sugirieron la presencia en los extractos de compuestos de esta naturaleza fenólica, especialmente flavonoides, aunque hubiera sido conveniente utilizar patrones de flavonoides y de ácidos fenólicos para identificar picos de buena abundancia relativa. Un análisis por CLAR acoplado a masas o el empleo de CLAR preparativo o semipreparativo con posterior análisis espectroscópico de los compuestos aislados, permitirían sugerir un determinado grupo de compuesto o propuesta estructural, lo cual no fue posible por su disponibilidad. III.7.3. DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE FENOLES TOTALES Como parte importante del control de la calidad de los extractos se cuantificó el contenido de fenoles totales, por ser metabolitos ampliamente distribuidos en el reino vegetal. También se consideraron los resultados obtenidos en el análisis por tamizaje fitoquímico, cromatografía en capa delgada y CLAR, así como los informes en la literatura sobre la composición química de la especie. El contenido de fenoles totales en los extractos fue determinado por el método de Folin-Ciocalteu, donde el reactivo utilizado es una mezcla de ácidos de coloración amarilla (fosfowolfrámico y fosfomolíbdico), que al reaccionar con los compuestos 61 Resultados y discusión fenólicos presentes en una preparación, dan lugar a óxidos de color azul (óxidos de wolframio y molibdeno) que exhiben un máximo de absorción a 765 nm, lo cual permite su cuantificación por espectroscopia de UV/VISIBLE. La intensidad de la absorción de luz a esa longitud de onda, es proporcional a la concentración de compuestos fenólicos, la cual se expresa en equivalentes de ácido gálico (Martínez, 2000). El contenido de fenoles totales varió significativamente de una muestra a otra, siendo mayor para la colecta de Bauta. Las diferencias pudieran estar asociadas a la procedencia del material vegetal de partida. Esta información no aparece reportada con anterioridad para la especie. En la tabla XII se muestran los resultados del estudio. Tabla XII. Contenido de fenoles totales en los extractos de P. aduncum subsp. ossanum Fenoles totales (mg/mL) Extractos _ X / S 62,15/0,24a 51,83/0,11b Bauta Ceiba del Agua _ Leyenda: X / S : valor medio de las determinaciones/desviación estándar Letras iguales muestran que no existen diferencias significativas y letras diferentes que si existen diferencias significativas para un 95 % de confianza III.8. ACTIVIDAD BIOLÓGICA DE P. aduncum subsp. ossanum III.8.1. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTI-MICROBIANA DEL ACEITE ESENCIAL Las enfermedades infecciosas son la segunda causa principal de muerte, a pesar de la introducción de muchos agentes antimicrobianos en el siglo XX (Taylor y Wright, 2008). La mayoría de estas alternativas terapéuticas se descubrieron a partir de fuentes naturales, lo que ha conllevado a un creciente interés de la industria farmacéutica y los investigadores en los productos de origen natural (Newmann y Cragg, 2007). 62 Resultados y discusión En este estudio se evaluó la actividad antimicrobiana del aceite esencial de P. aduncum subsp. ossanum de dos procedencias, con el propósito de brindar evidencias concretas sobre su actividad biológica y de esta manera buscar una alternativa de utilización sostenible de la especie. Por otra parte, se consideraron los antecedentes que existen sobre sus potencialidades como antimicótica, insecticida y bactericida. En particular, sus aceites esenciales han sido reportados como antivirales, antifúngicos y antibacterianos, debido a su capacidad de inhibir el crecimiento de un amplio grupo de microorganismos patógenos al hombre, plantas y animales (Delgado y Cuca, 2007; Sánchez y col., 2011). En la evaluación antimicrobiana de los dos aceites se pudo demostrar que los mismos presentan actividad contra protozoos, entre ellos, T. cruzi, agente etiológico de la enfermedad de Chagas (Burgos y col., 2005), T. brucei, parásito que causa la tripanosomiasis africana (o enfermedad del sueño) en humanos y animales (Gull, 1999) y contra Leishmania, distinguiéndose en este género a L. infantun y L. amazonensis. Las infecciones causadas por estos dos protozoos son del tipo cutáneas, mucocutáneas o viscerales. (Ryan y Ray, 2004; Aoun y Bouratbine, 2014). En este sentido, el aceite procedente de la colecta de Bauta fue el que mostró mayor actividad. Entre los parásitos, Plasmodium falciparum fue el más sensible, pues se logró efecto inhibitorio con una menor concentración del aceite, siendo mayor la actividad para la muestra procedente de la colecta de Ceiba del Agua. Este protozoo parásito produce la forma más peligrosa de malaria con los índices más altos de complicaciones y mortalidad. Actualmente, entre 300 a 500 millones de individuos se encuentran infectados con P. falciparum. Entre 1,5 a 2,7 millones de personas mueren anualmente por esta infección, siendo niños en su mayoría y el 90 % de los casos se encuentran en África. A pesar de numerosos esfuerzos, no se ha podido lograr la inmuno-protección a través de la vacunación y las medidas de control del vector son difíciles, siendo el tratamiento una de las opciones para combatir esta infección. Sin embargo, los fármacos que están disponibles en el mercado no son universalmente efectivos (García, 2010). 63 Resultados y discusión En los últimos años se ha incrementado el interés en el estudio de las plantas medicinales como una valiosa fuente en la búsqueda de agentes contra Plasmodium, teniendo en cuenta el éxito de la artemisina, una lactona sesquiterpénica aislada de Artemisia annua con potente actividad antimalarial (Christen y Veuthey, 2001; Rosenthal, 2003). Es de destacar que estudios previos de aceites esenciales de plantas cubanas también han demostrado potencialidades contra P. falciparum, en particular de la especie P. auritum (Monzote y col, 2012). Fue evaluada la actividad contra E. coli. y S. aureus. La primera es una enterobacteria Gram-negativa, que aunque pertenece a la microbiota normal del humano, puede causar infecciones intestinales y extra intestinales generalmente graves, tales como infecciones del aparato excretor, vías urinarias, cistitis, uretritis, meningitis, peritonitis, mastitis, septicemia y neumonía (Galli, 2012; Moredo, 2012). Por otra parte, S. aureus, es una bacteria anaerobia facultativa, Grampositiva que puede producir infecciones cutáneas y de las mucosas relativamente benignas (foliculitis, forunculosis o conjuntivitis), hasta enfermedades de riesgo vital (celulitis, abscesos profundos, osteomielitis, meningitis, sepsis, endocarditis o neumonía); también puede afectar al aparato gastrointestinal (Hurtado y col., 2002; Brooks y col., 2011). Como resultado del estudio se observó un bajo efecto de los aceite evaluados frente a estas dos bacterias, siendo menos activo contra E. coli. Finalmente, se evaluó la actividad contra el hongo C. albicans. La misma puede asumir patogeneidad provocando la candidiasis; en ese caso se presenta como una afección vaginal (vaginitis), de la cavidad oral (muguet), del intestino o de la piel e induce también una disminución de la absorción de las sustancias nutritivas pudiendo producir un estado de malnutrición (Jones y col., 2004; Ryan y Ray, 2004; Enfert y Hube, 2007). Los aceites manifestaron un bajo efecto sobre este microorganismo, con valores de concentración inhibitoria media superiores a 64 µg/mL. En la tabla XIII se muestran los resultados del estudio. 64 Resultados y discusión Tabla XIII. Resultados de la actividad antimicrobiana del aceite esencial de P. aduncum subsp. ossanum CI50 (µg/mL) Microorganimos Aceite esencial Fármacos de referencia Bauta Ceiba del Agua T. cruzi 8,0 8,6 2,2 (A) T. brucei L. infantum L. amazonensis P. falciparum S. aureus E. coli C. albicans 8,1 36,4 19,3 2,8 39,5 > 64 > 64 8,4 36,4 > 64 1,5 > 64 > 64 > 64 0,05 (B) 7,7 (D) 1,3 (E) 0,3 (C) 6,6 (F) 6,9 (G) 0,6 (H) Leyenda: CI50: Concentración inhibitoria media, A: Benznidazol, B: Suramina, C: Cloroquina, D: Miltefosina, E: Pentamidina, F: Eritromicina, G: Cloranfenicol, H: Flucitosina. La actividad antimicrobiana presentada por el aceite esencial de la especie en estudio, se debe en gran medida, a la presencia de terpenoides, tales como el carvacrol, linalool, α-pineno, β-pineno, silvestreno, calareno, viridiflorol, piperitona y alcanfor (estos tres últimos se presentaron como mayoritarios), los cuales poseen notables propiedades antimicrobianas en estudios realizados por varios autores (Juven y col., 1994; Nanasombat y Lohasupthawee, 2005; Mitiæ-Æulafiæ y col., 2005; López, 2006; Raybaudi-Massilia y col., 2006; Kotan y col., 2007; Wan y col., 2012; Guerra-Boone y col., 2013; Brazão y col., 2014; Gilabert y col., 2015; Kazemi y Rostami, 2015). Considerando la gran variedad de compuestos químicos presentes en los aceites esenciales, es muy probable que su actividad anti-microbiana no sea atribuible a un mecanismo específico, sino a la acción combinada de varios de ellos sobre distintos organelos de la célula (Fabio y col., 2007). El mecanismo de acción de estos compuestos aún no ha sido claramente caracterizado. Algunos autores plantean que su actividad bacteriostática y/o bactericida se debe, fundamentalmente, a la sobrecarga a la que es sometida la membrana celular de los microorganismos de forma tal que la hace perder el control y la integridad (Juven y col., 1994; Maguna y col., 2006). 65 Resultados y discusión En este estudio, el aceite esencial no mostró mayor actividad que los fármacos de referencia. Sin embargo, hay que tener en cuenta que los aceites esenciales son una mezcla compleja de sustancias, donde el o los principios activos, responsables de la actividad farmacológica es probable que se encuentren en un porciento minoritario, y la interacción entre ellos puede producir efectos sinérgicos o inhibitorios. La purificación de los mismos, o su obtención por síntesis química, podría traer como consecuencia el aumento de su actividad terapéutica. En cambio, los fármacos de referencia utilizados presentan un alto grado de pureza (>99%) y son considerados la principal alternativa de uso clínico en la actualidad. Teniendo en cuenta estos aspectos se puede considerar que el aceite esencial objeto de estudio, mostró evidencias como antimicrobiano bajo las condiciones ensayadas, siendo más activo frente a P. falciparum. Por otra parte, se requiere para futuras investigaciones, un estudio más profundo que permita determinar la citotoxicidad del aceite con la finalidad de relacionar las concentraciones inhibitorias medias (CI50) a las cuales se produce “in vitro” la actividad, con las concentraciones citotóxicas medias (CC50) del aceite evaluado frente a los diferentes microorganismos y calcular su índice de selectividad (IS). Los resultados de la evaluación antimicrobiana relacionados en la presente investigación no han sido descritos para la especie endémica cubana. III.8.2. DETERMINACIÓN DE LA EXTRACTOS HIDROALCOHÓLICOS ACTIVIDAD ANALGÉSICA DE LOS El dolor y la inflamación están asociados con la fisiopatología de varias condiciones clínicas, como la artritis y el cáncer, entre otras, y se utiliza una gran cantidad de productos naturales en la medicina popular para tratar el alivio de síntomas del dolor (Ahmed y col., 2005; Kaplan y col., 2007; Marrassini y col., 2010). En este trabajo se estudió la actividad antinociceptiva de dos extractos hidroalcohólicos de P. aduncum subsp. ossanum provenientes de los dos sitios 66 Resultados y discusión de colecta, tomando en consideración los antecedentes desde el punto de vista tradicional, sobre las propiedades analgésicas de la especie. Se utilizó el test de las contorsiones abdominales inducidas por el ácido acético, donde la administración intraperitoneal de este compuesto, en los ratones induce una irritación peritoneal que produce contorsiones en el tronco y la extensión de las patas traseras. El bloqueo de esta respuesta inducida químicamente sirve como método para la evaluación de drogas con potencial acción analgésica. En la tabla XIV se reflejan los resultados del estudio. Tabla XIV. Resultados del ensayo de analgesia realizado a los extractos de P. aduncum subsp. ossanum Total de Total de Porciento de contorsiones estiramientos Grupos inhibición de las _ _ contorsiones (%) X/S X/S Agente algésico (ácido acético al 3 %) ASA y Agente algésico EHB y Agente algésico EHCA y Agente algésico 99/4,08 69/3,77 - 4/1,1 10/1,0 95 30/1,0 48/1,82 69 38/1,5 55/2,3 61 _ Leyenda: Leyenda: X / S : valor medio de las determinaciones/desviación estándar ASA: ácido acetil salicílico, EHB: extracto hidroalcohólico procedente de Bauta, EHCA: extracto hidroalcohólico procedente de Ceiba del Agua. Como se puede apreciar en la tabla, el total de contorsiones y estiramientos que se obtuvo para la sustancia de referencia (ácido acetil salicílico) y los extractos estuvo por debajo de la del agente algésico, lo que quiere decir que hubo una inhibición en el número de contorsiones producidas por el agente químico (ácido acético al 3 %). Los mejores resultados del efecto analgésico se presentaron para los animales tratados con la sustancia de referencia (ASA con un 95 % de inhibición de las contorsiones), sin embargo, los dos extractos evaluados mostraron también evidencias como analgésicos bajo las condiciones ensayadas, con porcentajes de 67 Resultados y discusión inhibición de las contorsiones de 69 % y 61 % para los extractos de Bauta y Ceiba del Agua, respectivamente. Clásicamente se ha aceptado que la acción analgésica de los fármacos antiinflamatorios no esteroidales (AINEs) tiene lugar a nivel periférico, mediante la inhibición de la síntesis de las prostaglandinas (PGs) producidas en respuesta a una agresión o lesión tisular, e impiden, por tanto, que los eicosanoides contribuyan con su acción sensibilizadora sobre las terminaciones nerviosas nociceptivas, a incrementar la acción estimulante del dolor de otros mediadores allí liberados (histamina y bradicinina, entre otros) (Feria, 1998). La actividad analgésica de los extractos evaluados puede estar asociada probablemente a la presencia de compuestos fenólicos (Bittar y col., 2000; da Silva y col., 2001; Arunachalam y col., 2011), pues se ha referido que muchos de ellos pueden modular la síntesis de prostaglandinas, funcionando como inhibidores enzimáticos (Bauman y col., 1992; González y col., 2007). III.9. DISCUSIÓN GENERAL P. aduncum subsp. ossanum Trel es endémica de Cuba, ha sido utilizada tradicionalmente por su amplia gama de propiedades medicinales, destacándose como hemostático, diurético, antiséptico y antirreumático, pero carece de estudios que permitan establecer su calidad, por tal motivo se presenta el estudio farmacognóstico, fitoquímico y biológico en función de dos localidades (Bauta y Ceiba del Agua), con vistas a brindar evidencias científicas que contribuyan a la validación de la especie como una alternativa terapéutica viable a tener en cuenta por nuestra Medicina Natural y Tradicional. Dentro del estudio farmacognóstico, el primer paso es la clasificación taxonómica de la especie, la cual en el caso que nos ocupa, ya se encontraba clasificada y con algunas descripciones macromorfológicas, como lo exigen los estudios botánicos. Sin embargo, carecía de los estudios micromorfológicos indispensables para la norma de control de calidad y la propuesta de monografía farmacopeica. Al 68 Resultados y discusión comparar los resultados de la subespecie ossanum de los dos sitios de colecta estudiados, no se observaron diferencias notables. La composición química de una planta medicinal, puede estar influenciada por una serie de factores extrínsecos, intrínsecos y tecnológicos que determinan en ocasiones la presencia o ausencia de un metabolito en particular, que puede o no ser parte de los constituyentes de la planta. Es por ello que hay que realizar investigaciones que permitan conocer la influencia de estos factores, los cuales forman parte de los estudios farmacognósticos. Se evaluaron los principales parámetros físico-químicos del material vegetal y sus extractos hidroalcohólicos encontrando algunas diferencias. Se determinó el contenido de aceite esencial, mostrando valores entre 0,48 y 0,37 %, para las muestras de Bauta y Ceiba del Agua, respectivamente. El perfil cromatográfico obtenido por cromatografía gaseosa de los dos aceites evaluados, mostró diferencias importantes en la abundancia relativa de los compuestos mayoritarios (piperitina, alcanfor y viridiflorol) y en la composición general, siendo notoria la presencia de silvestreno, calareno y nerolidiol, no identificados con anterioridad para esta especie endémica de Cuba. En el estudio del perfil fitoquímico de los extractos hidroalcohólicos se pudo constar que los mismos mantenían un perfil similar por cromatografía en capa delgada y por CLAR, aunque la intensidad de los picos cromatográficos varió indistintamente de un extracto a otro. Sin embargo, la concentración de fenoles totales mostró diferencias significativas en función del lugar de recolección y la mayor cantidad de estos metabolitos aparecía en la muestra procedente de Bauta. Los aceites esenciales evaluados mostraron actividad antimicrobiana, aunque menor que las sustancias de referencia. El mayor efecto fue frente a P. falciparum, donde el aceite procedente de Ceiba del Agua fue más activo. En el estudio de la actividad analgésica, los dos extractos manifestaron un porcentaje de analgesia inferior a la sustancia de referencia ensayada, aunque los 69 Resultados y discusión mismos inhibieron significativamente el número de contorsiones producidas por el agente algésico. El extracto procedente de la colecta de Bauta fue el que mostró mayor actividad (69 %) lo cual está en correspondencia con el mayor contenido fenoles totales. Lo anterior sugiere, que dichos compuestos, están relacionados de manera muy directa con la actividad antes descrita, y en concordancia con reportes reflejados en la literatura. Los resultados obtenidos en esta experiencia sientan las bases para el establecimiento de futuras normas de control de la calidad de la especie P. aduncum subsp. ossanum y para su registro e introducción como medicamento herbario, como una posible alternativa en el campo de la medicina, aunque se precisan de otros estudios que permitan complementar evidencias sobre la efectividad terapéutica de la especie y la relación beneficio-riesgo. 70 CONCLUSIONES Conclusiones CONCLUSIONES El estudio farmacognóstico permitió establecer las especificaciones de calidad del material vegetal y sus extractos hidroalcohólicos, siendo trascendental las características micromorfológicas y sus parámetros físicoquímicos. El análisis por Cromatografía Gaseosa acoplada a Espectrometría de Masas de los dos aceites evaluados permitió establecer algunas diferencias según el lugar de colecta e identificar la piperitona, alcanfor y viridiflorol como mayoritarios y otros no informados con anterioridad para la especie, como el silvestreno, calareno y nerolidol. Los métodos de análisis empleados para establecer el perfil químico de los extractos permitió observar una similitud entre ellos, excepto en el contenido de fenoles totales. Asimismo permitieron sugerir la presencia de flavonoides y fenoles en general, entre otros compuestos. El aceite esencial de ambas procedencias mostró evidencias como antimicrobiano, en particular frente a protozoos parásitos, obteniéndose los mejores resultados contra Plasmodium falciparum. Los extractos hidroalcohólicos manifestaron propiedad analgésica bajo las condiciones ensayadas. 71 RECOMENDACIONES Recomendaciones RECOMENDACIONES Evaluar desde el punto de vista farmacognóstico otros lotes de droga seca de P. aduncum subsp. ossanum con el propósito de establecer los límites de calidad de la planta. Profundizar en el estudio químico de la especie, tanto del aceite esencial como de extractos obtenidos de la misma, incluyendo otras épocas de colecta del material vegetal. Evaluar otras potencialidades terapéuticas del aceite esencial de la especie, así como de sus extractos. 72 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Referencias bibliográficas REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Abreu OAG, Rodríguez AAT, Morgado MM, Cao LBV. Farmacognosia, farmacobotánica, farmacogeografía y farmacoetimología del platanillo de Cuba (Piper aduncum subespecie ossanum). Revista Cubana de Plantas Medicinales 2012;17(2):81-193. Acosta LL y Rodríguez CA. Plantas Medicinales. Bases para su producción sostenible. 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Abundance Abundance Scan 2721 (12.424 min): BAUTA.D 82 110 3500000 Scan 1842 (8.760 min): BAUTA.D 95 3000000 2800000 2600000 2400000 3000000 2200000 81 2000000 2500000 1800000 1600000 2000000 95 1400000 1500000 108 1200000 137 1000000 800000 152 54 152 69 55 1000000 600000 67 500000 0 45 74 124 103 117 400000 145 160167174181187194 200000 137 47 0 50 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 m/z--> 115 123130 62 60 70 80 144 159165 175 183 193199 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 m/z--> Anexo 1.1. Espectro de masas de la piperitona. Anexo 1.2. Espectro de masas del alcanfor. Abundance Scan 4109 (18.211 min): BAUTA.D 69 1600000 1500000 109 1400000 1300000 93 1200000 161 1100000 82 1000000 55 121 900000 800000 700000 189 204 600000 500000 133 147 400000 300000 200000 175 100000 45 0 222 213 236 252 50 60 70 80 90 100110120130140150160170180190200210220230240250 m/z--> Anexo 1.3. Espectro de masas del viridiflorol. Anexos Abundance Abundance Scan 3777 (16.827 min): BAUTA.D Scan 1019 (5.329 min): BAUTA.D 93 550000 161 500000 1600000 121 93 450000 1400000 400000 1200000 68 350000 1000000 79 300000 800000 250000 79 600000 400000 105 200000 136 53 107 55 67 133 150000 121 147 100000 200000 45 61 86 100 114 128 147154161168 177 189 199 0 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 m/z--> 189 204 179 50000 112 86 140 154 171 46 196 0 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 m/z--> Anexo 1.4. Espectro de masas del silvestreno Anexo 1.5. Espectro de masas del calareno. Abundance Scan 4023 (17.852 min): BAUTA.D 360000 69 340000 320000 300000 93 280000 260000 240000 220000 200000 107 180000 160000 140000 55 81 120000 136 100000 161 121 80000 60000 40000 46 0 50 189 148 20000 177 169 60 70 80 204 197 220 213 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 m/z--> Anexo 1.6. Espectro de masas del nerolidol. Anexos Anexo 2. Espectros ultravioletas de los picos detectados en los extractos hidroalcohólicos Anexo 2.1. Espectros ultravioleta de los picos detectados en el extracto procedente de Bauta Anexo 2.2. Espectros ultravioleta de los picos detectados en el extracto procedente de Ceiba del Agua
