CAMBIOS MACROSCOPICOS Y MICROSCOPICOS PRODUCIDOS
Anuncio
CAMBIOS PATOLÓGICOS PRODUCIDOS POR LA INOCULACIÓN DE UNA CEPA PATÓGENA DE Clostridium chauvoei EN COBAYOS (Cavia porcellus) MARITZA AMPARO CÁRDENAS FIGUEROA UNIVERSIDAD DE LA SALLE FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Bogotá D.C. 2006 CAMBIOS PATOLÓGICOS PRODUCIDOS POR LA INOCULACIÓN DE UNA CEPA PATÓGENA DE Clostridium chauvoei EN COBAYOS (Cavia porcellus) MARITZA AMPARO CÁRDENAS FIGUEROA Código: 14961037 Trabajo de grado presentado como requisito para optar por el título de MÉDICO VETERINARIO Director Dr. DIEGO ORTÍZ ORTEGA. MV Codirector Dr. JORGE HUMBERTO OSSA ARISTIZABAL. MV UNIVERSIDAD DE LA SALLE FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA BOGOTÁ 2006 UNIVERSIDAD DE LA SALLE DIRECTIVOS RECTOR Hno. FABIO GALLEGO ARIAS Vice-Rector Académico Hno. CARLOS GABRIEL GÓMEZ RESTREPO Vice- Rector de Promoción y Hno. EDGAR FIGUEROA ABRAJIM Desarrollo Humano Vice –Rector Administrativo Dr. MAURICIO FERNÁNDEZ FERNÁNDEZ Decano de la Facultad Dr. PEDRO PABLO MARTÍNEZ MÉNDEZ Secretaria Académica Dra. MARÍA TERESA URIBE MALLARINO Director Clínica Veterinaria Dr. HUMBERTO VASQUÉZ ROMERO APROBACIÓN DIRECTOR ____________________________________ Dr. DIEGO ORTÍZ ORTEGA CODIRECTOR _____________________________________ Dr. JORGE HUMBERTO OSSA ARISTIZABAL JURADO _____________________________________ Dr. CÉSAR AUGUSTO DÍAZ ROJAS JURADO _____________________________________ Dra. IOVANNA CASTELLANOS LONDOÑO SECRETARIA ACADÉMICA ____________________________________ Dra. MARÍA TERESA URIBE MALLARINO COMPROMISO Los trabajos de grado no deben contener ideas que sean contrarias a la doctrina de la iglesia católica en asuntos de dogma y moral. Ni la universidad, ni el asesor, ni el jurado calificador son responsables de las ideas expuestas por el graduando. AGRADECIMIENTOS Al Dr. Diego Ortiz Ortega por su apoyo y paciencia incondicional, mil agradecimientos; al Dr. Jorge Humberto Ossa Aristizabal, quien aporto su conocimiento durante el desarrollo de este estudio. Un agradecimiento muy especial a César Díaz quien fue mi bastón durante estos años en la universidad, a la Dra. Iovanna Castellanos le agradezco el valioso tiempo que me dedicó durante la realización de esta investigación A la Universidad de La Salle, Corpoica CEISA y a la Empresa Colombiana de Productos Veterinarios (VECOL S.A.) por su aporte financiero para la elaboración de esta investigación. A todas las personas que me brindaron su apoyo en las diferentes etapas de la carrera y a todas aquellas personas que directa o indirectamente brindaron su ayuda para la culminación de este trabajo. DEDICATORIA Con todo cariño a mi mami Amparo Figueroa por apoyarme en cada uno de los pasos que he dado en la vida para lograr cada una de mis metas. A mi papi Alfredo Cárdenas quien anhelaba estar junto a mi en este momento de mi vida. TABLA DE CONTENIDO Pág GLOSARIO RESUMEN ABSTRACT INTRODUCCIÓN 1 1. REVISIÓN LITERARIA 3 1.1. HISTORIA 3 1.1.1. Uso del cobayo (Cavia porcellus) en el laboratorio 5 1.1.2. Sangre 7 1.1.2.1. Morfología e índices de las células sanguíneas periféricas 7 1.1.2.1.1 Eritrocitos 7 1.1.2.1.2. Trombocitos 9 1.1.2.1.3. Leucocitos 9 1.2. ETIOLOGÍA 11 1.2.1. Tamaño y estructura 11 1.2.2. Estabilidad a la temperatura y pH 11 1.2.3. Relación con el oxígeno 12 1.2.4. Caracterización del Clostridium 12 1.2.5. Toxinas 13 1.2.5.1. Exotoxinas 14 1.3. EPIDEMIOLOGÍA 16 1.4. RESERVORIO 18 1.5. PATOGENIA 19 1.6. SIGNOS CLÍNICOS 21 1.7. LESIONES 22 i Pág 1.8. NECROPSIA 23 1.9. DIAGNÓSTICO 24 1.10. TRATAMIENTO 26 1.11. PREVENCIÓN Y CONTROL 26 1.11.1 Estudios realizados con la producción de vacunas 27 2. MATERIALES Y MÉTODOS 29 2.1. POBLACIÓN 29 2.2. DISEÑO EXPERIMENTAL 30 2.3. PROCESAMIENTO DE MUESTRAS 31 2.3.1. Muestras de sangre 31 2.3.1.1. Examen cuantitativo 33 2.3.1.1.1. Recuento de eritrocitos 33 2.3.1.1.2. Índices eritrocitarios 34 2.3.1.1.3. Volumen corpuscular media (VCM) 34 2.3.1.1.4. Hemoglobina corpuscular media (HCM) 34 2.3.1.1.5. Concentración corpuscular media de hemoglobina (CCMH) 34 2.3.1.1.6. Recuento diferencial de leucocitos 35 2.4. ANÁLISIS ESTADÍSTICO 35 2.5. EXAMEN MACROSCÓPICO 36 2.6. Inclusión de parafina, coloración hematoxilina y eosina 37 2.7. EXAMEN MICROSCÓPICO 38 2.8. DESECHO DE MATERIAL 38 3. RESULTADOS Y CONCLUSIONES 40 3.1. Muestra de sangre 40 3.1.1. Hematocrito 40 3.1.2. Hemoglobina 42 3.1.3. Hemoglobina corpuscular media 43 3.1.4. Concentración media de hemoglobina 44 ii Pág 3.1.5. Eritrocitos 45 3.1.6. Proteína plasmática 46 3.1.7. Proteína Sérica 47 3.1.8. Creatinin kinasa 48 3.1.9. Leucocitos 49 3.1.10. Neutrófilos 50 3.1.11. Linfocitos 52 3.1.12. Eosinófilos 54 3.1.13. Monocitos 56 3.1.14. Células Foa – Kurloff 58 3.2. TEMPERATURA 59 3.3. OBSERVACIÓN MACROSCÓPICA DE LESIONES 60 3.4. OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE LESIONES 62 4. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 68 5. BIBLIOGRAFÍA 71 6. ANEXOS 80 iii INDICE DE TABLAS Pág Tabla 1. Parámetros hematológicos de cobayos (Cavia porcellus). 8 Tabla 2. Muestras tomadas en necropsia de los cobayos (Cavia porcellus). 31 Tabla 3. Escala subjetiva del grado de lesión producida por Clostridium chauvoei en cobayos (Cavia porcellus) inoculados experimentalmente. 39 Tabla 4. Resultados de Hematología, promedio de datos grupos A, B, C, D, E, F y G, de cobayos (Cavia porcellus). 41 Tabla 5. Resultados estadísticos de la calificación de lesiones histopatológicas en tejidos de cobayos (Cavia porcellus) inoculados con cepa patógena de Clostridium chauvoei. 64 iv INDICEDE FIGURAS Pág Figura 1. Enrejado del hematocitómetro. 33 Figura 2. Clostridiosis. Lesiones en cavidad toráxica y peritoneal de cobayos (Cavia porcellus). 61 Figura 3. Clostridiosis. 18 horas post inoculación. 61 Figura 4. Clostridiosis. Bacilos de Clostridium chauvoei en músculo estriado esquelético de cobayo (Cavia porcellus). 65 Figura 5. Clostridiosis. Músculo estriado esquelético de cobayo (Cavia porcellus). Infiltración polimorfonucleares y necrosis de coagulación. 65 Figura 6. Clostridiosis. A) Presencia de bacilos de Clostridium chauvoei, leucocitos polimorfonucleares y neutrófilos en músculo estriado esquelético. B) Corte longitudinal de músculo estriado esquelético animal testigo, el cual no presenta cambios patológicos aparentes. 66 v INDICE DE GRÁFICAS Pág Gráfica 1. Valor promedio inoculación. del hematocrito post 40 Gráfica 2. Valor promedio de la hemoglobina por horas post inoculación. 42 Gráfica 3. Valor promedio de la hemoglobina corpuscular media por horas post inoculación. 43 Gráfica 4. Valor promedio la concentración media de hemoglobina por horas post inoculación. 44 Gráfica 5. Valor promedio de eritrocitos por horas post inoculación. 45 Gráfica 6. Valor promedio de proteína plasmática por horas post inoculación. 46 Gráfica 7. Valor promedio de proteína sérica por horas post inoculación. 47 Gráfica 8. Valor promedio de creatinin kinasa por horas post inoculación. 48 Gráfica 9. Valor promedio de leucocitos por horas post inoculación. 49 Gráfica 10. Valor promedio de neutrófilos (valor absoluto) por horas post inoculación. 50 Gráfica 11. Valor promedio de neutrófilos (valor relativo) por horas post inoculación. 51 Gráfica 12. Valor promedio de linfocitos (valor absoluto) por horas post inoculación. 52 Gráfica 13. Valor promedio de linfocitos (valor relativo) por horas post inoculación. 53 Gráfica 14. Valor promedio de eosinófilos (valor absoluto) por horas post inoculación. 54 vi por horas Pág Gráfica 15. Valor promedio de eosinófilos (valor relativo) por horas post inoculación. 55 Gráfica 16. Valor promedio de monocitos (valor absoluto) por horas post inoculación. 56 Gráfica 17. Valor promedio de monocitos (valor relativo) por horas post inoculación. 57 Gráfica 18. Valor promedio de células Foa – Kurloff (valor absoluto) por horas post inoculación. 58 Gráfica 19. Valor promedio inoculación. 59 de temperatura vii por horas post INDICE DE ANEXOS Pág Anexo 1. Resultados de Hematología, grupo A (3 horas post inoculación con Clostridium chauvoei), cobayos (Cavia porcellus). 80 Anexo 2. Resultados de Hematología, grupo B (6 horas post inoculación con Clostridium chauvoei), cobayos (Cavia porcellus). 81 Anexo 3. Resultados de Hematología, grupo C (9 horas post inoculación con Clostridium chauvoei), cobayos (Cavia porcellus). 82 Anexo 4. Resultados de Hematología, grupo D (12 horas post inoculación con Clostridium chauvoei), cobayos (Cavia porcellus). 83 Anexo 5. Resultados de Hematología, grupo E (15 horas post inoculación con Clostridium chauvoei), cobayos (Cavia porcellus). 84 Anexo 6. Resultados de Hematología, grupo F (18 horas post inoculación con Clostridium chauvoei), cobayos (Cavia porcellus). 85 Anexo 7. Resultados de Hematología, grupo G (Control), cobayos (Cavia porcellus). 86 Anexo 8. Resultados estadísticos de la Temperatura de los cobayos (Cavia porcellus), inoculados con la cepa patógena de Clostridium chauvoei. 87 Anexo 9. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus). 88 Anexo 10. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus). 89 viii Pág Anexo 11. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus). 90 Anexo 12. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus). 91 Anexo 13. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus). Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus). 92 Anexo 15. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus). 94 Anexo 16. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus). 95 Anexo 17. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus). 96 Anexo 18. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus). 97 Anexo 19. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus). 98 Anexo 20. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus). 99 Anexo 21. Resultados estadísticos de la calificación de lesiones histopatológicas en tejido de Cavia porcellus inoculados con la cepa patógena de Clostridium chauvoei 100 Anexo 14. ix 93 GLOSARIO AGENTE INFECCIOSO: Organismo capaz de producir una infección o enfermedad infecciosa. ANTICUERPOS: Compuesto proteico producido en el organismo, que pertenece al grupo de las globulinas, se origina por exposición a un antígeno que se ha introducido en el organismo y que es extraño a él. BACTERIA: Microorganismo del grupo de los protistas inferiores caracterizado por presentar organización celular procariótica. Pueden ser inmóviles ó móviles para lo cual necesitan flagelos. EDEMA: Aumento anormal de la cantidad de líquido intersticial situado en el interior de los tejidos y en la acumulación de líquido trasudado en las diversas cavidades serosas del organismo. ENZOÓTICO: Peculiar de una localización, o presente constantemente en ella. EPIZOÓTICO: Que ataca a muchos animales en cualquier región al tiempo; de amplia difusión y rápida extensión. INFECCIÓN: Penetración y desarrollo en un ser vivo de microbios patógenos, que invaden al organismo por vía sanguínea vertiendo sus toxinas y causando enfermedad. INOCULACIÓN: Introducción de microorganismos patógenos, material infectado, suero u otras sustancias en tejidos de organismos vivos o en medios x de cultivo, introducción de un productor de enfermedad en un animal sano, para producir una forma suave de la enfermedad, seguida por inmunidad. TOXINA: Sustancias venenosas de tipo diverso que tienen un efecto activo sobre el organismo animal y que en cantidades moderadas pueden provocar su muerte o la presentación de cuadros patológicos mas o menos graves. TOXOIDE: Toxina que ha perdido sus propiedades deletéreas por un tratamiento con calor o con un agente químico pero que conserva su capacidad para estimular la formación de anticuerpos (antitoxinas) y para unirse a ellos. xi RESUMEN El Clostridium chauvoei causa Pierna Negra ó carbón sintomático, una enfermedad fatal en bovinos y ovinos. Se presenta en forma esporádica en áreas donde el microorganismo esta presente en el suelo. Los animales presentan toxemia, tumefacciones crepitantes en la musculatura y muerte. Los síntomas son confundidos con edema maligno causado por Clostridium chauvoei, Clostridium septicum, Clostridium novyi o Clostridium perfringes. Este estudio describe hallazgos histopatológicos en tejidos de cobayos (Cavia porcellus) inoculados con Clostridium chauvoei. Los cobayos fueron inoculados vía intramuscular con 0.5 mililitros de una solución de cloruro de calcio (CaCl2) al 5% conteniendo 100 dosis infectantes de Clostridium chauvoei; y se sacrificaron cada tres horas. Los tejidos fijados en formaldehído se procesaron por la técnica de inclusión en parafina, coloreados con Hematoxilina y Eosina. Los cambios severos se observaron en animales de 18 horas post inoculación, las lesiones fueron tumefacciones crepitantes en musculatura estriada esquelética, tejidos color rojo, marrón oscuro, con estrías negras; algunas áreas aparecieron húmedas, desprendieron exudado oscuro mezclado con gases. Se encontró marcada infiltración de neutrófilos polimorfonucleares y se observó necrosis de coagulación. La muerte de los cobayos comienza a presentarse entre las 15 y 18 horas post inoculación. La técnica de inclusión en parafina, coloreado con Hematoxilina y Eosina permite ver el agente causal y relacionarlo con lesiones anatomopatológicas, su uso permite un diagnóstico económico para ésta enfermedad. Palabras clave: Clostridium chauvoei; Pierna Negra; Carbón sintomático; Histopatología. xii ABSTRACT Clostridium chauvoei causes Blackleg, a fatal disease of bovine and ovine species. It appears in a sporadic form in areas where the microorganism is present in the soil. The animals present toxemia, crepitant swellings in the muscle and died. The symptoms are confused with malignant edema caused by Clostridium chauvoei, Clostridium septicum, Clostridium novyi o Clostridium perfringes. The present study describes histopathologic findings in Guinea pigs (Cavia porcellus) tissues inoculated with the bacterium Clostridium chauvoei. The Guinea pigs were inoculated intramuscular with 0.05 millilitres of solution of calcium Chloride (CaCl2) to 5% content 100 infecting doses of Clostridium chauvoei followed by sacrifice every three hours. The tissues were fixed in formaldehyde and processed by the paraffin inclusion technique, colored with Eosin and Hematoxylyn. Severe changes were observed in animals after 18 hours post inoculation, the lesions were crepitant swellings in skeletal muscle, coloured spotted tissues from dark red to brown along with black grooves; a dark exudation mixed with gas was also released in some areas. Neutrophilic infiltration was marked. And coagulation necrosis was observed. The death of the Guinea pigs begins to appear between the 15 and 18 hours post inoculation. The paraffin inclusion technique, colored with Eosin and Hematoxylyn allows to see the causal agent and to relate it to anatomopathologycs, injuries, its use allows an economic diagnostic for this one disease. Keys words: Clostridium chauvoei, black leg, gas gangrene, histopathology. xiii INTRODUCCIÓN Esta investigación se realizó con el fin de describir los cambios secuénciales hematológicos, anatomopatológicos e histopatológicos producidos por la inoculación experimental en cobayos (Cavia porcellus) por la cepa de Clostridium chauvoei (ATCC), para determinar que tipo de tejido es el más afectado y relacionar dichos hallazgos con los valores hematológicos correspondientes, para clasificar que tipos de tejidos se podrían utilizar en otras técnicas diagnósticas. En 1865 Feser observó el germen por primera vez en el tejido conjuntivo subcutáneo de un bóvido enfermo. Lo describió con el nombre Bacillus sarcophysematos. El carbunco sintomático fue separado por vez primera etiológicamente por Bollinger (1875) y Feser (1876) del carbunco bacteridiano, constituyendo una enfermedad independiente. Arloing y col. aclararon la etiología de manera incontrovertible en los años 1879 – 1884, desarrollando ya un procedimiento de vacunación preventiva. Roux (1887) cultivó el bacilo sobre medios nutricios artificiales. Entre el gran número de científicos que estudiaron el germen y la enfermedad hay que mencionar en especial a Foth, Kitasato, Kilt y Zeissler 1 . El Clostridium chauvoei es una bacteria anaerobia esporulada, que produce una enfermedad fatal en rumiantes y es conocida como carbunco sintomático o 1 BEER, Joachim. 1981. Enfermedades infecciosas de los animales domésticos. Tomo II. Enfermedades producidas por bacterias y hongos e intoxicaciones. p. 194. 1 “pierna negra 2 ”; es de distribución mundial, ataca con preferencia a bóvidos jóvenes menores de 3 años y bien alimentados 3 . Se considera que esta enfermedad genera un desequilibrio económico al ganadero y por consiguiente al país 4 , debido al costo de los tratamientos que se deben instaurar para su control y finalmente con la pérdida de los animales 5 , por esta razón lo que se desea es que el ganadero y las personas que estén directamente relacionadas con bovinos, ovinos y cerdos conozcan los síntomas, los cambios macroscópicos y microscópicos que presentan los animales afectados con esta patología. 2 CHANDLER, H.M. HAMILTON, R.C. 1975. Protective antigenicity of protoplasts and sphaeroplasts of a highly protective strain of Clostridium chauvoei. Journal of General Microbiology. p. 179. 3 BIBERSTEIN, E. 1994. Tratado de microbiología veterinaria. p. 345. 4 CARABALLO, Luis Carlos. 1973. Identificación y clasificación de cepas de Clostridium. p. 46. 5 PORTILLA, Guillermo; FRANCO, Orlando. Carbón sintomático ¡una enfermedad que mata!. ICA Instituto Colombiano Agropecuario. p. 2. 2 1. MARCO TEÓRICO 1.1. HISTORIA El Clostridium comienza a estudiarse cuando Koch, le demuestra a los amigos de Davaine, los errores en las experiencias de Jaillard y Leplat, quienes en realidad habrían inoculado conejos "con otro virus", arremete contra Signol, asfixiando caballos sanos y recuperando de sus cadáveres ese "otro virus", largo, translúcido, flexuoso y móvil, era un "vibrión séptico", probablemente el Clostridium septicum o el Clostridium chauvoei 6 . Feser observó en 1865 el germen por primera vez en el tejido conjuntivo subcutáneo de un bóvido enfermo. Lo describió con el nombre Bacillus sarcophysematos 7 . El carbunco sintomático fue diferenciado del bacteridiano por Charbert a base de síntomas y lesiones. Bollinger (1875), fue el primero en demostrar que el carbunco bacteridiano y el sintomático tenían agentes etiológicos distintos. Está conclusión fue confirmada por Feser en 1876. Arloing, Cornevin y Thomas, en 1887, realizaron aportaciones interesantes sobre el carbunco sintomático, lo que explica que con frecuencia hayan sido considerados como los descubridores del germen. Aunque han contribuido considerablemente al conocimiento de la enfermedad, su causa e inmunidad, el primero en cultivar el germen en medios artificiales fue Roux, en 1887. Kitasato aportó nuevos perfeccionamientos a la técnica del cultivo de Clostridium chauvoei en 1889 8 . 6 BULLOCH, W. 1930. Bacillus anthracis. I: 6 BEER, Joachim. Op. cit., p. 194. 8 MERCHANT, I; PACKER, R. 1980. Bacteriología y virología veterinaria. p. 411. 7 3 A partir de 1885, empiezan las clases del doctor Claude Vericel. Entre los alumnos que conformarían la primera promoción de egresados con el título de Maestro en veterinaria, se cuenta a Federico Lleras Acosta, quien fue su discípulo preferido y a su lado vio los primeros microbios. Lleras Acosta, se dedicó a la práctica de laboratorio aplicado a la clínica y fundó el primer laboratorio de diagnóstico privado en Bogotá 9 . En 1905, aparece en el país el carbón sintomático. El doctor Claude Vericel hace el estudio clínico y anatomopatológico y su discípulo Federico Lleras Acosta aísla el agente causal y prepara la primera vacuna contra la enfermedad 10 . El diagnóstico bacteriológico de los Clostridium se estableció teniendo en cuenta: forma de crecimiento y aspecto de las colonias según Zeissler, reacción bioquímica sobre azúcares, acción proteolítica en la leche, inoculación en curí y observación de lesiones diferenciales. Las especies caracterizadas fueron los Clostridium chauvoei, septicum, perfringens, novyi, y haemolyticum 11 . Históricamente, la inoculación en animales de laboratorio se ha empleado como ayuda diagnóstica en muchas enfermedades causadas por Clostridios. La tipificación de las toxinas que dichas bacterias producen producto de su metabolismo se realiza mediante neutralización de los efectos letales de la toxina en cobayos y ratones utilizando antisueros específicos para cada tipo de clostridio. Este método no es aceptado ya en muchos países por bioética y 9 GARCÍA, Henry; PARRA, Luis Guillermo. 2002. Medicina veterinaria y zootecnia en Colombia. Trayectoria durante el siglo XX y perspectivas para el siglo XXI. p. 256. 10 En: www.veterinaria.unal.edu.co/historia_mv.html 11 GARCÍA, Henry; PARRA, Luis Guillermo. Op. cit., p. 255. 4 no todos los laboratorios de diagnóstico están equipados o preparados para realizar estas pruebas 12 . 1.1.1. Uso del cobayo (Cavia porcellus) en el laboratorio Los aspectos más importantes de uso que se le da a este animal en el laboratorio dada su economía, sensibilidad y fácil manejo son: En la preparación de sueros hiperinmunes. En la preparación de reactivos para serología. En el diagnóstico de enfermedades (infecciones virales, infecciones bacteriales o por protozoarios). En el control de calidad de productos biológicos de uso humano y veterinario 13 . Kerrin (1934) comprobó que el Clostridium chauvoei en condiciones adecuadas puede producir toxina que, a dosis de 0.025 – 0.5 ml intravenosa, al ratón le produce síntomas respiratorios y la muerte en unos minutos. La inyección subcutánea de la toxina a cobayos y ratones no es mortal, pero produce edema. Es bastante admisible la producción de exotoxina por este germen, aunque no sea tan potente como la de otras especies del grupo del edema gaseoso, como Clostridium septicum, Clostridium perfringens y Clostridium novyi 14 . Ryff y Lee observaron que el hámster es más receptivo al Clostridium chauvoei que el cobayo y muere con la quinta parte de la dosis mortal precisada por éste. La inoculación de cultivos puros a los animales de laboratorio produce la 12 RASDOSTITS, O; et al. 2002. Medicina Veterinaria, Tratado de las enfermedades del Ganado bovino, ovino, porcino, caprino y equino. Vol I. p. 894. 13 PARRA, Danilo; CORREDOR, Hugo. 1970. Estudio del curí (Cavia cobaya). Contribución al estudio del curí como animal de laboratorio en Colombia. p. 16. 14 MERCHANT, I; PACKER, R. Op cit., p. 412. 5 muerte con muchos de los síntomas característicos del carbunco sintomático. Los cobayos, conejos, ratones blancos y ratas albinas pueden ser infectados, siendo el cobayo el animal más susceptible, empleándose corrientemente como animal de experimentación para este germen 15 . Entre otros estudios encontramos las observaciones halladas por Ernesto Sáenz, en el cual realiza inoculaciones para hallar diagnósticos sospechosos de carbón sintomático; por ejemplo, un curí recibe 1 centímetro cúbico de cultivo Tarozzi de 24 horas por vía intramuscular, y muere en 24 horas. Al realizar la necropsia se observa un extenso edema sero-hemorrágico de pierna y abdomen. Los órganos internos permanecen normales. Los frotis de la superficie de hígado muestran un bacilo corto y delgado, gram positivo, sin esporos. El agente se recupera del hígado y de la sangre del corazón, reproduciendo en la superficie de agar sangre los mismos caracteres culturales de los cultivos primitivos. Después otros dos curies, con inoculaciones de 0.5 cc IM y de 1 centímetro cúbico (la mitad por vía IM y la mitad por vía intraperitoneal) reaccionan de idéntica manera al anterior, recobrándose de su sangre cardíaca y del hígado el mismo bacilo 16 . Aparte de la diferenciación del Clostridium septicum con las reacciones de los azúcares, la inoculación del Clostridium chauvoei en el cobayo no muestra largos filamentos en la superficie del peritoneo o el hígado, que es una prueba diagnóstica cuando se inocula con Clostridium septicum 17 . En la superficie del hígado de cobayas que murieron tras el contagio con Clostridium chauvoei, el germen aparece por lo regular aislado y en cadenas cortas 18 . 15 Ibid., p. 413. SÁENZ, Ernesto. 1944. Consideraciones e identificación de los principales anaerobios del género Clostridium patógenos para los animales domésticos. Tesis, Universidad Nacional de Colombia. p. 66. 17 BAKER, F.J.; BREACH, M.R. 1990. Manual de técnicas de microbiología medica. p. 214. 18 BEER, Joachim. Op. cit., p. 195. 16 6 Aunque en muchos casos la identificación final de los clostridios patógenos no recae en la inoculación de animales es, sin embargo, imprescindible para otros tales como el Clostridium botulinum. Se efectúa la inoculación de los cultivos líquidos en los cobayos uno de los cuales se ha protegido con la antitoxina específica. Se aconseja la adición de cloruro cálcico al cultivo antes de la inyección para que actúe como agente necrosante, de esta manera se facilita la multiplicación de los gérmenes y la subsiguiente producción de toxina. Método: inocular por vía IM 0.2 ml de un cultivo en caldo glucosado del día anterior en los cobayos, uno protegido por antitoxina. La muerte del no protegido tiene lugar en uno o dos días 19 . 1.1.2. Sangre 1.1.2.1. Morfología e índices de las células sanguíneas periféricas Los valores hematológicos de cobayos (Cavia porcellus) reportados, se encuentran en la tabla 1. 1.1.2.1.1. Eritrocitos Los eritrocitos del Cavia porcellus, tienen una moderada anisocitosis, con un diámetro entre los 6.6 – 7.9 µm 20 , algunos microcitos, cuando están presentes pueden tener un diámetro de 3.5 µm, los eritrocitos de los cobayos son células sanguíneas rojas largas, comparadas con otras especies comunes de laboratorio 21 , los eritrocitos policromáticos pueden estar alrededor del 25% de 19 BAKER, F.J.; BREACH, M.R. Op. cit., p. 214. SCHERMER, S. 1967. The blood morphology of laboratory animals. p. 23 21 JAIN, N.C. 1986. Schalm´s veterinary hematology. 4 ed. Philadelphia: Lea de Febiger. p. 18. 20 7 los eritrocitos circulantes en neonatos, 4.5% en los jóvenes, y 1.5% en adultos 22 . Los índices eritrocitarios en los cobayos (i.e, número de eritrocitos, hemoglobina y volumen de células empaquetadas. Tabla 1), son relativamente mas bajas comparados con valores observados en otras especies de roedores de laboratorio 23 . Tabla 1. Parámetros hematológicos de cobayos (Cavia porcellus) 1 1 2 3 RBC (x 106/mm3) Rango 4,2 - 7,0 4,5 - 7,0 3,2 - 8,0 PCV (%) Rango 37 - 48 37 - 48 32 - 50 Hb (g/dL) Rango 11 - 15 11 - 15 10 - 17,2 MCV (µ3) Rango - - 71 - 96 MCH (µµg) Rango - - 23 - 27 MCHC (%) Rango - - 26 - 39 WBC (x 103/mm3) Rango 7 - 18 7 - 18 5.5 – 17.5 Neutrófilos (%) Rango 28 - 44 28 - 44 22 – 48 Linfocitos (%) Rango 39 - 72 39 - 72 39 - 72 Eosinófilos (%) Rango 1-5 1-5 0–7 Basofilos (%) Rango 0-3 0-3 0 – 2.7 Monocitos (%) Rango 3 - 12 3 - 12 1 - 10 Harkness, J.E.1995. 2 Johnson – Delaney, C.A. 1996. 3 Hillyer, E.V.1996. 22 ALBRITTON, A.B. 1958. Standard values in blood. p. 30. MANNING, P.J; WAGNER, J.E; HARNESS, J.E. 1984. Biology and diseases of guinea pigs. p. 54 23 8 1.1.2.1.2. Trombocitos Las plaquetas de los cobayos tienen una forma ovalada irregular (2 – 3 µm de longitud), y la periferia del citoplasma es pálida en comparación con la coloración intensa dentro de la célula Los rangos numéricos observados de plaquetas circulantes reportadas en algunas referencias: 120 – 132 x103 /mm3 24 , 161 – 368 x103 /mm3 25 , 530 +/- 149 x103 /mm3 26 , 250 – 850 x103 /mm3 27 , 250 – 850 x103 /mm3 28 , y 260 – 740 x103 /mm3 29 . 1.1.2.1.3. Leucocitos Los neutrófilos de los cobayos tienen aproximadamente de 10 – 12 µm de diámetro, son picnóticos, tienen un núcleo segmentado (con un numero de 5 ó mas segmentos), los gránulos eosinofilicos dentro del citoplasma, pareciendo en algunos casos seudoesinofilia un “Drumstick” lóbulo de cromatina sexual puede estar presente en el núcleo de los neutrófilos de los cobayos hembras, los eosinófilos son mas largos que los neutrófilos (alrededor de 10 – 15 µm en diámetro). Los basófilos son raramente encontrados, son del mismo tamaño de losa neutrófilos o ser más largos, el núcleo tiene una coloración púrpura, y en el citoplasma se encuentran gránulos violetas de diferentes tamaños 30 . Los linfocitos son los leucocitos predominantes (Tabla 1), y los linfocitos pequeños están presentes en mayor cantidad, tienen forma alargada, no son más largos 24 SCHERMER, S. Op. cit., p. 24. MITRUKA, B.J; RAWNSLEY, H.M. 1977. Clinical biochemical and haematological reference values in normal experimental animals and normal humans. p. 33. 26 BENIRSCHKE, K; GARNER, F.M; JONES, T.C. 1978. pathology of laboratory animals. New York: Springer – Verlag. Nº 1. p. 45. 27 HARKNESS, J.E; WAGNER, J.E. Op. cit., p. 89 28 JOHNSON – DELANEY C.A. 1996. Exotic companion medicine handbook. Lake Worth, FL: Wingers Publishing. P. 43 29 HILLYER, E.V; QUESENBERRY, K.E; DONNELLY, T.M. 1996. Biology, husbandry, and clinical techniques (of guinea pigs and chinchillas). In: Hillyer E.V., Quesenberry K.E, eds. Ferrets, rabbits, and rodents clinical medicine and surgery. Philadelphia: WB Saunders. p. 58 30 SCHERMER, S. Op. cit., p. 25 25 9 que los eritrocitos. Los linfocitos pequeños de los cobayos son redondos, de núcleo picnótico, rodeado por una banda en el citoplasma. Los linfocitos pueden ser dos veces mas largos con menos picnosis, con un núcleo mas ovalado y brillante y una zona extensa del citoplasma que en algunos casos puede contener pequeños y largos gránulos azurofílicos, los monocitos de los cobayos son usualmente mas largos que los linfocitos, tienen un núcleo ovalado con una pequeña cantidad de cromatina y tiene un citoplasma azulgrisáceo. Ocasionalmente las células Foa-Kurloff (KC cells), las cuales son especificas de los cobayos, pueden ser observadas en la circulación en una proporción mayor del 3 – 4% del conteo diferencial de los leucocitos 31 . No hay una diferencia significativa en el número de KC en machos y hembras después de los 2 a 3 meses de edad. Las células KC, son leucocitos especializados y contienen un cuerpo de inclusión intracitoplasmático formado por un mucopolisacárido, este tipo de células pueden ser encontradas en sangre periférica y en la glándula del timo, se encuentran en mayor proporción en pulmón, bazo y placenta bajo estimulación estrogénica y preñez 32 . El origen exacto y función de estas células es desconocida, sin embargo se especula que pueden tener una función de células asesinas en la circulación general o como protector de antígenos fetales en la placenta 33 . 31 JAIN, N.C. 1986. Op. cit., p. 1110. IZARD, J; BARRELLIER, M.T; QUILLEC, M. 1976. The Kurloff cell – its differentiation in the blood and lymphatic system. Cell Tissue Res 173: p 237. 33 MARSHALL, A.H.E; SWETTENHAM, K.V; VERNON – ROBERTS, B; REVELL, P.A. 1971. Studies on the function of de Kurloff cell. Int Arch Allergy Appl Immunol. 40: p. 137. 32 10 1.2. ETIOLOGÍA El Clostridium chauvoei es una bacteria anaerobia en forma de bacilo, móvil gram positivo, agente causal del carbón sintomático 34 . 1.2.1. Tamaño y estructura Esta bacteria es encapsulada (cápsula de ácido D poliglutámico), tiene un diámetro de 1 µm y de 3 a 6 µm de largo, se encuentra en forma de esporas en el suelo, siendo muy resistente. La presentación de la enfermedad, se produce por la toxina 35 . Necesita medios ricos en cisteina y en vitaminas hidrosolubles. Sus colonias son redondas con contorno liso y en dos días alcanzan un tamaño de incluso de 4 >m. La hemólisis es variable. A diferencia de Clostridium septicum, fermenta la sacarosa, pero no la salicina y no crece a 44 ºC 36 . 1.2.2. Estabilidad a la temperatura y pH Son microorganismos mesófilos su intervalo de crecimiento esta comprendido entre 15 y 45ºC, aproximadamente, y su temperatura óptima de crecimiento entre 25 y 40ºC. 34 KOJIMA, A. et al. 2000. Clonación y expresión de un gen que codifica la flagelina de Clostridium chauvoei. Veterinary Microbiology. 76, p. 359. 35 DI GENARO, M. et al. Clostridium chauvoei: Inmunological characterization of antigenic preparations. Anaerobe. 5, 1999. p. 301. 36 BIBERSTEIN, E. Op. cit., p. 345. 11 El pH del medio afecta al crecimiento microbiano; por tanto, cada organismo tiene un rango de pH que hace posible su crecimiento. Este intervalo, para la mayoría de las bacterias, está entre 4 y 9, y el pH óptimo alrededor de 7 37 . 1.2.3. Relación con el oxígeno Los microorganismos varían en cuanto a sus necesidades o tolerancia al oxígeno libre. Entre los microorganismos que no toleran en absoluto el oxígeno e incluso mueren en su presencia se encuentra el género Clostridium. La razón de la anaerobiosis estricta es la carencia, por parte de esos microorganismos, de enzimas como la superóxido dismutasa y catalasa, que están implicadas en la destrucción de los radicales tóxicos, derivados de la reducción metabólica del oxígeno (radicales superóxido, hidrófilo y peróxido de hidrogeno) 38 . 1.2.4. Caracterización del Clostridium En 1880, Prazmowski agrupó las bacterias anaerobias capaces de producir fermentación y esporular en el género Clostridium, Actualmente en el género Clostridium se agrupan más de 100 especies, de las cuales aproximadamente 20 son patógenas y se asocian a infecciones en el hombre y en los animales. El resto de las especies son inocuas, y algunas presentan aplicaciones de interés en la industria. La clasificación de los microorganismos pertenecientes a este género se ha establecido, tradicionalmente, de acuerdo con las características morfológicas, culturales y bioquímicas, asociación a determinadas enfermedades, patogenicidad, toxigenicidad y propiedades serológicas. En los últimos tiempos esta clasificación se basa en las homologías existentes en la secuencia del ADN y 37 38 VADILLO, S; PINZ, S; MATEOS, S. 2002. Manual de microbiología veterinaria. p. 75. Ibid., p. 76. 12 del ARN ribosómico 16 S. La amplia diversidad en el porcentaje de guanina, citosina (G+C) de las especies del género Clostridium sugiere que éste podría dividirse al menos en dos géneros: las especies con un contenido en G+C del 22 al 34 %, en un género, y las especies que tienen de un 40 a un 55 %, en otro. Recientemente, el género Clostridium ha sido incluido en la sección XX, del volumen 3 (bacterias grampositivas con bajo contenido en G+C), de la 2ª edición del Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, dentro de la familia Clostridiaceae 39 . Estas secuencias también pueden servir para: ∗ Averiguar condiciones de cultivos de los organismos, ∗ Síntesis de oligonucleótidos para la identificación de su crecimiento en lugares donde no están aislados o para monitorizar su distribución en la naturaleza, ∗ Identificar los orígenes de esos genes, ∗ Comprender la diversidad y la filogenia de manera rápida y fácil. La mayoría de los Clostridium son saprofitos inocuos, pero algunos tienen carácter patógeno para el hombre y los animales causando patologías muy graves 40 . 1.2.5. Toxinas Las toxinas son quienes invaden e ingieren el tejido 41 . El Clostridium chauvoei produce cuatro toxinas: 39 VADILLO, S; PINZ, S; MATEOS, S. Op. cit., p. 467. JOHNSON, J.L; and FRANCIS, B.S. 1974. Taxonomy of the Clostridia: Ribosomal Ribonucleic Acid Homologies among the Species. Journal of General Microbiology. p. 229. 41 GARCIA, Antonio. 2005. MV. Bogotá D.C. Comunicación personal. 40 13 • α hemolisina necrotoxina • β desoxirribonucleasa • γ hialorunidasa • δ hemolisina De estas 4 toxinas la más letal es la α y de ahí radica su poder patógeno. Esta bacteria resiste a los desinfectantes tipo amonio cuaternario pero no es resistente a la formalina ni al hipoclorito de sodio, es por eso que la vacuna para "la pierna negra" se inactiva a base de formol 42 . El peso molecular de estas toxinas oscila entre 22 y 600 kDA. Desde el punto de vista médico es importante la determinación de la capacidad de producir toxinas de un clostridio aislado de una muestra clínica, así como la caracterización de las toxinas producidas. Las pruebas clásicas que ponen de manifiesto e identifican las toxinas son la prueba de letalidad en el ratón y la neutralización con sueros específicos. Actualmente, se han desarrollado pruebas inmunoenzimáticas (ELISA, látex, etc.) y genéticas (hibridación ADN/ADN, amplificación de ADN por PCR) que resultan mas rápidas y eficaces para la identificación de dichas toxinas 43 . 1.2.5.1 Exotoxinas Los clostridios invasores producen durante su multiplicación activa exotoxinas con propiedades necrosantes (histolíticas), hemolíticas o letales. Además, enzimas tales como la colagenasa, proteinasa, desoxirribonucleasa y 42 VEGA, Marco. Carbunco sintomático. 2000. En: <http//www.portalveterinaria.com/sections.php?op=viewarticle&artid=8>. 43 JOHNSON, J.L; and FRANCIS, B.S. Op cit., p. 243. 14 hialuronidasa, elaboradas por microorganismos en crecimiento, causan una acumulación de productos de degradación toxica en los tejidos 44 . Las exotoxinas son proteínas que se secretan al medio exterior durante el crecimiento del microorganismo o la lisis de la bacteria. En general, las exotoxinas son producidas tanto por bacterias grampositivas como gramnegativas. Por su naturaleza proteica, son muy inmunógenas e inducen la formación de anticuerpos específicos capaces de neutralizar su efecto. La mayoría de las exotoxinas son muy sensibles al calor, a las condiciones ácidas y a las enzimas proteolíticas. En algunas ocasiones, la pérdida de su actividad tóxica por acción del calor, formol, etc; proporciona una proteína que mantiene intactas las propiedades antigénicas de la toxina, que se denomina toxoide. Este hecho permite la utilización del toxoide en la inmunización contra las enfermedades cuya sintomatología se basa en la acción de la exotoxina 45 . La acción producida por las exotoxinas es muy específica a nivel celular, pudiendo actuar, sin embargo, sobre varios tipos de células (citotoxinas), o producir un efecto en un determinado sistema, órgano o tipo celular, como, por ejemplo, el sistema nervioso (neurotoxinas), el tracto gastrointestinal (enterotoxinas), las células hepáticas (hepatotoxinas), etc. Una clasificación más completa resulta difícil, ya que dentro de las exotoxinas se agrupan un conjunto muy heterogéneo de proteínas con diferente actividad biológica en las células. No obstante, en función de su estructura molecular y su mecanismo de acción, se distinguen varios tipos distintos de exoproteínas, entre los que destacan: las toxinas A-B, las toxinas que disgregan la membrana celular, las neurotoxinas y los superantígenos 46 . 44 DAVIS, Bernard; DULBECCO, Renato; EISEN, Hermar; GINSBERG, Harold. 1984. Tratado de microbiología. p. 584. 45 VADILLO, S. PINZ, S. MATEOS, S. Op. cit., p. 225. 46 Ibid., p. 225. 15 1.3. EPIDEMIOLOGÍA El carbón sintomático es casi siempre mortal, con 1 a 3 días de duración, infeccioso pero no contagioso; de presentación enzoótica o epizoótica 47 , como en zonas de inundación 48 . Todavía se debate la puerta de entrada por la que penetra la bacteria al organismo. Se supone, sin embargo, que dicha puerta de entrada se encuentra en la mucosa del aparato digestivo después de la ingestión de alimento contaminado a partir de heces infectadas y de cadáveres descompuestos de animales muertos por la enfermedad. Aparece carbunco sintomático verdadero cuando las esporas que no se alojan en los tejidos proliferan por mecanismos que no han sido todavía identificados 49 En el campo aparece esta enfermedad con más frecuencia en bóvidos que crecen con rapidez por estar sometidos a un plan intensivo de nutrición. La mejoría del estado nutricional de las ovejas al aumentar la ingestión de proteínas en su alimentación incrementa también su susceptibilidad a esta enfermedad. En ovejas no se observa restricción en cuanto a edad. Se sospecha que los esfuerzos, magulladuras o las indigestiones agudas desencadenan los hechos 50 . El Clostridium chauvoei habita en el intestino, en el hígado de perros y bóvidos aparentemente sanos y en otros tejidos normales de las distintas especies en el animal adulto, tanto sensibles como resistentes. Se encontró Clostridium 47 BLAHA, Thomas. 1995. Epidemiología especial veterinaria. p. 483. VEGA, Marco. Op. cit. 49 Ibid. 50 JUBB, K; KENNEDY, P; PALMER. 1985. Patología de los animales domésticos. Tomo I. p. 223. 48 16 chauvoei, en el bazo e hígado del 20% de vacunos normales. No se conocen las vías de infección; se admite la infección endógena y la infección adquirida a partir del suelo por ingestión o a través de heridas. El microorganismo del carbunco sintomático vive en el suelo donde puede permanecer viable durante muchos años, siendo este el reservorio del agente causal, pero no se sabe si allí se multiplica o sólo vive en la forma esporulada y se multiplica en el tubo intestinal de los animales 51 La eliminación de la bacteria es constante por la vía digestiva de animales infectados, que por ser un anaerobio estricto esporula para mantenerse vigente en el medio ambiente, es una infección transmitida por el suelo, pudiendo infectar el agua de los bebederos y los pastos 52 . La multiplicación de las bacterias y la producción de toxinas, provocan la formación de lesiones que se caracterizan por edema, hemorragia, y necrosis de las miofibrillas musculares. También puede llegar a la sangre a través de algunas heridas en la mucosa de los animales y de allí diseminarse por vía hematógena a distintos tejidos del cuerpo, y causar la muerte rápidamente 53 . El carbunco sintomático de los bóvidos tiene incidencia estacional y se registra el mayor número de casos durante los meses cálidos del año 54 . En ovejas, la enfermedad depende casi siempre de la infección de una herida. En efecto, la infección de las heridas cutáneas durante el esquileo, castración o amputación del rabo o del ombligo al nacimiento puede propiciar la aparición de lesiones locales. A veces, es causa de brotes graves, la infección de la vulva y de la vagina en la oveja durante el parto; la enfermedad puede aparecer en 51 VEGA, Marco. Op.cit. WALTER, Wiliam; McBEE, Richard; TEMPLE, Kenneth. 1980. microbiología. p. 323. 53 VEGA, Marco. Op. cit. 54 JUBB, K; KENNEDY, P; PALMER. Op.cit., p. 223. 52 17 Introducción a la grupos de corderos y carneros jóvenes hasta de un año de edad, casi siempre como consecuencia de infección de las heridas cutáneas que se producen entre ellos al pelear 55 . 1.4. RESERVORIO Los clostridios patógenos habitualmente están presentes en suelos ricos en humus y pueden multiplicarse en el suelo en épocas cálidas, después de períodos de lluvias intensas 56 . Las esporas pueden vivir en el suelo por mucho tiempo y se han visto rebrotes de la enfermedad en terrenos donde la tierra fue removida recientemente 57 . También se localizan en el contenido intestinal de animales sanos y solo causan enfermedad en circunstancias especiales. El carácter ubicuo de estos microorganismos hace que la erradicación de las enfermedades por clostridios sea prácticamente imposible y necesite un control mediante medidas profilácticas 58 ; en el perro se puede ver Clostridium chauvoei en el hígado, músculos e intestinos de este animal sin causar alteraciones aparentes. Se han visto casos de Clostridium chauvoei en combinación Clostridium septicum o Clostridium novyi, pero para que clasifique como pierna negra propiamente dicha debe estar presente únicamente el Clostridium chauvoei; sino clasifica como un caso de edema maligno 59 . 55 OCÁDIZ, J. 1990. Epidemiología en animales domésticos. Control de enfermedades. p. 107. DAVIES, R; WRAY, C. 1996. Clostridium chauvoei. Journal Veterinary Medicine. 43, p. 119. 57 VEGA, Marco. Op. cit. 58 DAVIES, R; WRAY, C. Op.cit., p. 119. 59 VEGA, Marco. Op. cit. 56 18 1.5. PATOGENIA Entre los estudios de laboratorio realizados por Antonio García en el Zooprofiláctico de la ciudad de Bogotá y en el Colegio Mayor de Cundinamarca, encontramos que utilizaba cobayos (Cavia porcellus) a los cuales inoculaba con cepas de Clostridium chauvoei para observar los cambios que producía la bacteria en los diferentes órganos del animal. La dosis del inóculo variaba entre medio centímetro y un centímetro, debido a la virulencia de la cepa, en estos estudios no se utilizaba ninguna clase de potencializador. En el proceso se les tomaba la temperatura, frecuencia cardiaca, frecuencia respiratoria y pulso. Los cobayos morían entre las 10 a las 18 horas post-inoculación, esto dependía de la susceptibilidad y edad del animal, como también de la virulencia de la cepa que se utilizaba 60 . Esta enfermedad ataca a los rumiantes, aunque se ha reportado casos en cerdos 61 . En los vacunos, la bacteria puede ser endógena y provocar la enfermedad de esta manera, pero en los ovinos la infección siempre es exógena y la espora es llevada al organismo por inyección o infección de una herida previa. La eliminación de la bacteria es constante por la vía digestiva de animales infectados y esta al salir, por ser un anaerobio estricto esporula para mantenerse vigente en el medio ambiente, se queda en la tierra y el suelo pudiendo infectar el agua de los bebederos y los pastos 62 . También puede llegar a la sangre a través de algunas heridas predispuestas en la mucosa de los animales por ejemplo en la época de la dentición de los 60 GARCÍA, Antonio. 2005. MV. Bogotá D.C. Comunicación personal. OCÁDIZ, J. Op. cit., p. 107. 62 JUBB, K; KENNEDY, P; PALMER. Op. cit., p. 221. 61 19 terneros y de allí diseminarse por vía hematógena a distintos tejidos del cuerpo 63 . Para que se produzca la enfermedad tiene que existir un ambiente propicio para el desarrollo de la bacteria en el organismo, este ambiente propicio que desencadena la enfermedad se da por magulladura del músculo, ejercicio excesivo, indigestión aguda o cualquier proceso que desvitalice al tejido. La bacteria necesita de un medio rico en glucógeno como fuente de su energía, esto con una previa glucólisis anaeróbica producida en el músculo. Esto además tiene que estar acompañado de anaerobiosis y pH alcalino; este ambiente perfecto para el desarrollo de la bacteria determina primariamente la forma vegetativa de este germen donde por actuación de toxinas que ya se están produciendo, propician el desarrollo de la enfermedad y sus consecuencias 64 . Una vez que el ambiente es adecuado para el desarrollo de la bacteria, se comienzan a producir toxinas y enzimas, cada una con un fin específico, por ejemplo la β (beta) que atacan exclusivamente al ADN celular y, las γ (gamma) que se encargan de separar el intersticio celular. Estas toxinas provocan una reacción tisular y se desencadena una inflamación del músculo comprometido, hemorragia y edemas gaseosos que es útil para hacer el diagnóstico de esta enfermedad, el área es crepitante, y finalmente ocasiona necrosis del músculo comprometido, además de presentar fiebre entre 40ºC por que las toxinas liberadas por las bacterias son inductoras de liberación de linfoquinas que elevan la temperatura 65 . 63 Ibid., p. 222. Ibid., p. 223. 65 VEGA, Marco. Op. cit. 64 20 Finalmente hay una bacteriemia que se da únicamente en la fase final de la enfermedad y que conlleva a la muerte del animal por intoxicación sistémica. La muerte se da 1 a 3 días desde que aparecen los signos clínicos. En ovinos, la espora ingresa conjuntamente con otros Clostridium en heridas abiertas, esto lleva a una necrosis del tejido afectado produciendo el cuadro de gangrena enfisematosa 66 . En un estudio realizado se encontraron los valores de las concentraciones de enzimas plasmáticas (Aldosa, deshidrogenasa láctica (LHD), glutamil oxalacético transaminasa (GOT), glutamil piruvato transaminasa (GPT)) asociadas con el músculo esquelético incrementadas en el ganado infectado de Clostridium chauvoei y la concentración de enzimas (LDH y GOT) asociadas al daño cardiáco también aumentadas. Los valores del potasio del ganado que murió aumentó, pero el valor de sodio fue normal. Los datos indicaron que el volumen sanguíneo disminuyó en los animales que murieron. En resumen hubo cambios en enzimas plasmáticas, valores químicos de sangre y valores hematológicos 67 . 1.6. SIGNOS CLÍNICOS Normalmente la afección comienza súbitamente pudiendo encontrarse algunos animales muertos sin haberse observado signos clínicos, como cuando las lesiones ocurren solamente en el miocardio y el diafragma. 66 Ibid. PEMBERTON, J. et al. 1974. Changes in clinical values of cattle infected with Clostridium chauvoei: Clinical relationships during infection. Am. J. Vet. Res, Vol 35, Nº 98. p. 1043. 67 21 Es común la cojera aguda y la depresión notable, inicialmente hay fiebre (hasta 42ºC) pero cuando los signos clínicos se hacen obvios, la temperatura puede ser normal o subnormal 68 . Aparecen tumefacciones edematosas y crepitantes características en la cadera hombro, pecho, lomo, cuello o en otros sitios muy musculares del cuerpo. Inicialmente, la tumefacción es pequeña, caliente y dolorosa. Conforme la enfermedad progresa rápidamente, la tumefacción crece, hay crepitación a la palpación y la piel está seca, agrietada, fría e insensible a medida que el abastecimiento sanguíneo local disminuye. Los signos generales incluyen postración y temblores. La muerte ocurre en 12 a 48 horas si el animal no ha sido tratado; llama la atención el olor a ácido butírico 69 . En los bóvidos se presenta éxtasis del rumen y de 100 - 120 pulsaciones minuto. En las ovejas hay una marcha rígida (pierna). No es frecuente el edema subcutáneo; la lesión es local, donde la infección penetró 70 . 1.7. LESIONES Las lesiones se caracterizan por edema, hemorragia y necrosis de las miofibrillas musculares. La parte central de las lesiones se seca, se oscurece y se convierte en enfisematosa como consecuencia de la fermentación bacteriana, mientras que su periferia es edematosa y hemorrágica. Los animales afectados presentan inflamaciones crepitantes en la musculatura, 68 RASDOSTITS, O. et al. Op. cit., p. 902. Ibid., p. 903. 70 Ibid., p. 903. 69 22 particularmente en las extremidades, con una extensión rígida característica de los miembros 71 . Dependiendo del momento de la muerte del animal y de la temperatura ambiental, las tumefacciones pueden estar muy distendidas y con gas. Los músculos afectados aparecen de marrón o rojo obscuro, con rayas negras. Con frecuencia se encuentran lesiones similares en el corazón y ocasionalmente en la lengua. Los tejidos subcutáneos de la zona infectada presentan un exudado teñido de sangre que contiene grandes depósitos de burbujas de gas 72 . 1.8. NECROPSIA Al realizar las necropsias de los cobayos (Cavia porcellus) inoculados con cepa de Clostridium chauvoei por García, presentaban exudado desde el miembro posterior hasta la zona pectoral, inflamación desde el muslo hasta la parte anterior del cuerpo (axila), se observaba una sustancia gelatinosa y solo se hallaba necrosis en el sitio vecino a la inoculación 73 . En el cadáver de un bovino se encuentra al animal con el miembro afectado extendido y rígido, se produce putrefacción y meteorismo post mortem rápidamente y se puede ver un exudado espumoso que sale del ano y la nariz, los músculos afectados se ven edematosos y con el centro ennegrecido por la destrucción, degeneración y necrosis del tejido. En las cavidades se encuentra siempre abundante líquido que coagula con facilidad por la gran presencia de fibrina, además se nota un olor rancio como de ácido butírico y se puede notar la producción de gas en el hígado. Cuando un feto es afectado se puede notar 71 GÁZQUEZ, Antonio. 1991. Patología veterinaria. p. 358. Ibid., p. 359. 73 GARCIA, Antonio. 2005. MV. Bogotá D.C. 72 23 la distensión del abdomen de la madre posiblemente por la edematización del feto, el feto puede o no presentar las lesiones típicas de la infección 74 Microscópicamente, se encuentran cambios degenerativos en las fibras musculares se observan rotas por el edema, enfisema y hemorragia. La infiltración de leucocitos es poco importante 75 . 1.9. DIAGNÓSTICO En casos típicos puede formularse un diagnóstico basándose en los signos clínicos y en los hallazgos de necropsia. Es dudoso por no encontrarse lesiones típicas en ocasiones 76 . En los frotis de tejidos infectados se pueden descubrir bacilos grampositivos, esporulados e identificarlos con reactivos inmunofluorescentes (wellcome) 77 . Cuando se sospecha de muerte por Clostridiosis, se debe confirmar el diagnóstico por medio de muestras de los tejidos mas afectados para histopatología, esto debe hacerse en la mayor brevedad, para así evitar una contaminación con otras bacterias que normalmente están presentes en el animal 78 . 74 RASDOSTITS, O. et al. Op. cit., p. 906. BIBERSTEIN, E. Op. cit., p. 345. 76 OCÁDIZ, J. Op. cit., p. 108. 77 BIBERSTEIN, E. Op. cit., p. 346. 78 JUBB, K; KENNEDY, P; PALMER. Op. cit., p. 223. 75 24 Diagnóstico diferencial: por electrocución por rayo (causa dolor), carbunco bacteriano (diferencia la lesión esplénica), saturnismo agudo y tetania de la lactación, este último produce muerte súbita 79 . Entre los diferentes trabajos realizados con la bacteria Clostridium chauvoei encontramos un estudio donde se examinaron 238 muestras de material patológico de Clostridium, procedente de animales de diferentes especies y por cada caso se procede a la clasificación del clostridio responsable, por medio del estudio de sus caracteres morfológicos, culturales, bioquímicos y biológicos. El Clostridium chauvoei es el tercero mas frecuente después del Clostridium perfringes y el Clostridium septicum, se encontraron únicamente en los bóvidos, mostrando su máxima incidencia en los terneros, este clostridio fue encontrado únicamente en músculo y médula ósea 80 . La Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR) detectó específicamente secuencias de DNA de Clostridium chauvoei en muestras de músculo y exudado obtenidos de ratones luego de 12 horas post-inoculación. En pruebas usando muestras de músculo e hígado, el límite de detección fue cerca de 200 organismos por reacción. Estos resultados sugieren que el sistema de un paso de PCR puede ser útil para la detección e identificación directa de Clostridium chauvoei en especímenes clínicos 81 . 79 VEGA, Marco. Op. cit. SÁENZ, Ernesto. Op. cit., p. 2. 81 KOJIMA, A. et al. 2001. Op. cit., 78. p. 363. 80 25 1.10. TRATAMIENTO La administración de penicilina a los animales afectados se considera la terapéutica lógica, si el animal no está moribundo, pero los resultados suelen ser mediocres dada la gran extensión de las lesiones. Deben administrarse grandes dosis (10.000 unidades/kg de peso corporal), comenzando con penicilina cristalina por vía intravenosa para administrar después preparados de acción prolongada, algunos de los cuales se administrarán en los mismos tejidos afectados, si estos son accesibles. Es probable que el antisuero del carbunco sintomático no posea gran valor, a menos que se administren dosis masivas 82 . Otras medidas son separar los animales enfermos y movilizar el resto del lote fuera de los potreros contaminados; enterrar los cadáveres 83 . 1.11. PREVENCIÓN Y CONTROL En zonas donde la enfermedad es endémica, debe hacerse vacunaciones anuales 84 . Los bóvidos se vacunan de 3 a 6 meses de edad y después cada año. La vacunación se debe realizar por lo menos dos semanas antes de que tenga lugar la exposición. Durante un brote de enfermedad, se vacuna a todos lo bóvidos y se les administra penicilina de acción retardada. Cuando se presenta la infección, las ovejas preñadas se vacunan tres semanas antes del parto. Es posible que los corderos tengan que ser vacunados durante su 82 VEGA, Marco. Op. cit. QUIROS, Joaquín; LÓPEZ, Gustavo. 1991. Curso sobre sanidad animal. p. 127. 84 URBINA, Mairo; RODRIGUEZ, Germán. 1978. sistema de vigilancia epidemiológica de enfermedades transmisibles. ICA. p. 53. 83 26 primer año de vida. Cuando se observan animales enfermos, es aconsejable cambiarles de pastos 85 . 1.11.1. Estudios realizados con la producción de vacunas El flagelo de Clostridium chauvoei presenta un antígeno protectivo 86 , este antígeno protector es termolábil, el cual estimula la protección de no aglutinación de anticuerpos 87 . Se ha demostrado previamente que la proteína del flagelo de Clostridium chauvoei es importante para el desarrollo de inmunidad protectiva en ratón: flagelos purificados provocan un efecto protectivo, mientras mutantes de la bacteria sin flagelo causan una inmunidad 100 veces menor que la de una cepa madre que sí posee flagelo 88 . Una variedad de exámenes de laboratorio diagnóstico y pruebas realizados con especimenes de ganado vacunado con bacterinas de Clostridium chauvoei y expuestos luego a inóculos del mismo, muestran que si hubo cambios, Barnes 1974, reporta que hubo algunos pequeños cambios en los valores clínicos, una parte de la investigación fue experimental y se realizó para evaluar la inmunidad eficaz en un experimento severo que contuviera la bacteria de Clostridium chauvoei. El ganado se vacunó con seis diferentes potencias que fueron determinadas con cobayos. A este ganado se le consideró que tenía una resistencia variable a la infección con el Clostridium chauvoei, y que presentaba una respuesta similar a la expuesta por los cobayos. Como mayor logro se podría decir que la prueba clínica fue determinada cuando el ganado 85 BIBERSTEIN, E. op. cit., p. 347. TAMURA, Y; MINAMOTO, N; TANAKA, S. 1984. Demonstration of protective antigen carried by flagella of Clostridium chauvoei. p. 1325. 87 CHANDLER, H.M. HAMILTON, R.C. 1975. The preparation of inmunogenic cell walls from a highly protective strain of Clostridium chauvoei. Journal of General Microbiology 88. p. 27 88 KOJIMA, A. et al. 2000. Op. cit., 76, p. 359. 86 27 reacciono a los cambios expuestos y esto se define como interrelaciones y cambios de varios valores clínicos durante la infección 89 . Los anticuerpos monoclonales fueron obtenidos del flagelo del Clostridium chauvoei por la fusión de células mieloma de roedores y de las células del bazo de ratones inmunizados con un flagelo purificado parcial que fueron estudiados y analizados, mostraron que el flagelo de Clostridium chauvoei tiene tres epitopes. Los tres anticuerpos monoclonales flagelares (1 inmunoglobulina G y 2 M) demostraron los efectos pasivos protectores en ratones. Estos resultados sugieren que el flagelo de Clostridium chauvoei es importante para la inmunidad protectora en ratones 90 . Se observó una clara relación entre la disminución de inmunogenicidad y la pérdida total de la capacidad protectora de células en la fase estacionaria tardía 91 . Evidencias sugieren que el flagelo de Clostridium chauvoei es altamente inmunogénico, la cepa CH3, puede ser importante para estimular la inmunidad protectiva, fue estudiada preparando una suspensión flagelar pura de un organismo y comparando su antigenicidad protectiva de la suspensión flagelar y las células desflageladas. La antigenicidad protectiva de la cepa CH3 no fue de origen flagelar, pero si debido a la termolabilidad, pH sensitivo, y antígenos somáticos no aglutinogénicos 92 . 89 PEMBERTON, John. BATES, Fern. et al. 1974. a. Changes in clinical values of cattle infected with Clostridium chauvoei. p. 1037. 90 TANAKA, M. HIRAYAMA, N. TAMURA, Y. 1987. Production, characterization, and protective effect of monoclonal antibodies to Clostridium chauvoei flagella. Infection ans Inmunity. Aug. Vol. 55, Nº 8. p. 1779 91 MATTAR, M.A. CORTIÑAS, T.I. STEFANINI, A.M. 2002. Inmunogenic protein variations of Clostridium chauvoei cellular antigens associated with the culture growth phase. Vol. 33. Issue 1, 25 march p. 9. 92 CHANDLER, H.M. and GULASEKHARAM, J. 1974. The protective antigen a highly inmunogenic strain of Clostridium chauovoei including an evaluation of its flagella as a protective antigen. Journal of General Microbiology. 84. p. 128. 28 2. 2.1. MATERIALES Y MÉTODOS POBLACIÓN Las muestras utilizadas en el presente estudio provienen de tejidos de cobayos (Cavia porcellus), por ser este animal el modelo biológico mas empleado en el mundo para trabajar con bacterias del género Clostridium spp 93 . El criterio de selección de los animales fue definido como hembras en una edad promedio de 40 días, en buena condición corporal, que no presentó cuadros febriles o alteraciones clínico patológicas; estos animales provenían del bioterio de la Empresa Colombiana de Productos Veterinarios (VECOL S.A.) Para el estudio se seleccionaron 18 cobayos (Cavia porcellus) los cuales se mantuvieron en observación durante un mes, en las unidades de aislamiento del Programa de Investigación en Salud Animal de la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria Corpoica CEISA de Bogotá, para una mejor adaptación se dispusieron dos jaulas donde se ubicaron 9 animales en cada una de ellas, y así minimizar conductas de estrés o tensión, el ambiente se adecuo para los animales, teniendo en cuenta el control del ruido siendo considerado como un plan de bienestar para los animales 94 asimismo se manejo la luz 95 ya que podía afectar la fisiología 96 , morfología 97 , y conducta de 93 RAMIREZ, Sergio. 2002. En: http://www.tdx.cesca.es/TESIS_UAB/AVAILABLE/TDX0613101-121559//mgp4de5.pdf 94 PEKRUL, D. 1991. Handbook of Facilities Planning. Laboratory Animal Facilities. p. 166. 95 BRAINARD; VAUGHAN, and REITER. 1986. Effect of light irradiance and wavelength on the Syrian hamster reproductive system. Endocrinol. 119(2):648. 96 ERKERT, and GROBER. 1986. Direct modulation of activity and body temperature of owl monkeys by low light intensities. Folia Primatol. 47(4):171. 97 NEWBOLD; CHAPIN; ZINN, and TUCKER. 1991. Effects of photoperiod on mammary development and concentration of hormones in serum of pregnant dairy heifers. J. Dairy Sci. 74(1):100. 29 varios animales 98 . Diariamente se le llevaba a cada animal la historia clínica, donde se monitoreaba frecuencia cardiaca, frecuencia respiratoria, peso y temperatura corporal. A la unidad de aislamiento donde se encontraban los animales se le realizaba dos veces al día, manejo de excrementos, limpieza y desinfección, además, los animales se beneficiaban de un fácil acceso a la comida y el agua, la temperatura de la unidad se regulaba con calentadores. 2.2. DISEÑO EXPERIMENTAL Los 18 cobayos (Cavia porcellus) se distribuyeron al azar en seis grupos de tres animales. Doce de estos animales se inocularon con la cepa de Clostridium chauvoei 4408, suministrada por el laboratorio Vecol S.A. los animales se inocularon vía intramuscular con 0.5 mililitros de una solución de cloruro de calcio (CaCl2) al 5% conteniendo 100 dosis infectantes de Clostridium chauvoei, y los 6 animales restantes se inocularon solamente con CaCl2; En cada grupo habían dos animales inoculados con la cepa de Clostridium chauvoei, y un animal como testigo el cual fue inoculado solamente con CaCl2; Cada tres horas se sacrificaba un grupo de animales. Antes de realizar el sacrificio de cada animal, se les tomó una muestra de sangre por el método de punción de la vena cava anterior con vacutainer 99 . La eutanasia se realizó de acuerdo con los protocolos de bioética vigentes en la legislación colombiana (LEY 84 de 1989), utilizando anestésicos volátiles para 98 TUCKER; PETITCLERC, and ZINN. 1984. The influence of photoperiod on body weight gain, body composition, nutrient intake and hormone secretion. J. Anim. Sci. 59(6):1610. 99 En: http://www.proclave.com/servet/tomamuestras/agujas.htm 30 evitar el dolor 100 . Una vez sacrificados los cobayos se realizaban las necropsias donde se obtenían muestras de diferentes tejidos 101 (ver tabla 2) Tabla 2. Muestras tomadas en necropsia de los cobayos (Cavia porcellus). MUESTRAS Bazo Músculo estriado cardiaco Músculo estriado esquelético Duodeno Hígado Páncreas Pulmón Riñón Cerebro Adrenal 2.3. PROCESAMIENTO DE MUESTRAS 2.3.1. Muestras De Sangre Al realizar la recolección de sangre del Cavia porcellus, se tuvo en cuenta el volumen de sangre para el análisis, la selección del vaso sanguíneo y el método requerido para que no afecte el bienestar del animal. Siempre se obtuvo sangre por punción del corazón 102 . 100 1986. Report of the AVMA panel de euthanasia. JAVMA, vol 188, Nº 3, February 1, p. 253. ALUJA, Aline; CONSTANTINO, Fernando. 2002. Técnicas de necropsia en animales domésticos. p. 21. 102 DESJARDINS, C. 1986. Indwelling vascular cannulas for remote blood sampling, infusión, and long-term instrumentation of small laboratory animals. p. 32. 101 31 El volumen de sangre de un cobayo adulto es aproximadamente de 69 – 75 ml/kg de peso corporal 103 , y aproximadamente el 7 al 10% del volumen de sangre (0.5 – 0.7 ml por cada 100 gr de peso corporal), pueden ser extraídos con seguridad, sin provocar anemia 104 . A cada cobayo (Cavia porcellus) se le tomó una muestra de sangre obtenida por el método de punción del corazón con vacutainer, la sangre se recogió en un tubo de EDTA y en un tubo sin anticoagulante. Las muestras se procesaron de inmediato y se les realizó un cuadro hemático compuesto por 105 : Un examen cuantitativo, que incluye el valor hematocrito, hemoglobina, el recuento total de eritrocitos, el recuento total de leucocitos, el recuento diferencial de leucocitos, el recuento de plaquetas, el volumen corpuscular medio (VCM), la hemoglobina corpuscular media (HCM), la concentración corpuscular media de hemoglobina (CCMH) y la concentración plasmática de proteínas totales. Un examen cualitativo de los frotis sanguíneos para detectar alteraciones en la morfología celular 106 . Luego se realizó la química sanguínea (Creatinin kinasa CK 107 ). 103 HARKNESS, J.E; WAGNER, J.E. 1995. The biology and medicine of rabbits and rodents. p. 68 104 HILLYER, E.V; QUESENBERRY, K.E; DONNELLY, T.M. 1996. Op. cit., p. 102 BENJAMIN, Maxine M. 1991. Manual de patología clínica en veterinaria. p. 33. 106 DAVIDSON, Malcom. 2000. Manual patología clínica en pequeños animales p. 46. 107 Auto-Creatinin kinasa liquicolor. Reacción de Jaffé. Prueba fotométrica para mediciones cinéticas de creatinin kinasa. Germany. Human. 105 32 2.3.1.1. Examen Cuantitativo La sangre con anticoagulante se centrifugó en tubos capilares (tubos de microhematócrito) durante 5 minutos a (12.500 – 15.000 rpm). Los eritrocitos se concentraron en el fondo del tubo. Los leucocitos forman una capa gris crema por encima de los eritrocitos. Las plaquetas quedan en la parte alta distinguiéndose como una capa delgada de color crema, y el plasma aparece por encima de aquellas. El valor de hematocrito se calculó dividiendo la longitud de la capa de eritrocitos entre la longitud total, que esta constituida por la capa de eritrocitos, el buffy coat y el plasma. Un examen superficial del plasma permite detectar la existencia de ictericia, hemólisis y lipemia 108 . 2.3.1.1.1. Recuento de eritrocitos. Los recuentos celulares se realizaron utilizando un hematocitómetro de Neubauer, ver figura 1. Figura 1. Enrejado del hematocitómetro. Los cuadros marcados con una W se utilizan para estimar el número total de leucocitos; los marcados con una R se usan para los recuentos de eritrocitos. 108 DAVIDSON, Malcom. Op. cit., p. 47. 33 2.3.1.1.2. Índices eritrocitarios Se determinaron, la hemoglobina corpuscular media (HCM) y la concentración corpuscular media de hemoglobina (CCMH) para evaluar si los animales presentaban anemia 109 . 2.3.1.1.3. Volumen corpuscular medio (VCM) Indicó el tamaño medio de los glóbulos rojos. Las células normocíticas se determinaron con un VCM normal, las macrocíticas tenían un VCM elevado, y las microcíticas lo tenían bajo. El VCM se calculó de la siguiente forma Hematocrito % VCM = ------------------------------ x 10 = fentolitros Nº de eritrocitos (>) 2.3.1.1.4. Hemoglobina corpuscular media (HCM) Indicó la cantidad (en peso) de hemoglobina que había en un eritrocito medio. Dependió del tamaño de los eritrocitos y de su concentración media de hemoglobina. Una disminución en la HCM indicó deficiencia de hierro. La HCM se calculó de la siguiente manera 110 . Hemoglobina gr/dl HCM = ------------------------------ x 107 = picogramos Nº de eritrocitos (>) 2.3.1.1.5. Concentración corpuscular media de hemoglobina (CCMH) Indico la concentración media de hemoglobina que había en cada eritrocito. La hipocromasia nos indicó que la CCMH es baja. Se calculó de la siguiente manera 111 109 DAVIDSON, Malcom. Op. cit., p. 47. Ibid., p. 48. 111 Ibid., p. 49. 110 34 Hemoglobina gr/dl CCMH = ----------------------------- x 100 = % porcentaje Hematocrito % 2.3.1.1.6. Recuento diferencial de leucocitos Se realizó contando 200 leucocitos en un frotis sanguíneo. 2.4. ANÁLISIS ESTADÍSTICO El análisis de la información recolectada en los hemogramas consistió en categorizar las variables (Hematocrito; recuento total de glóbulos rojos, glóbulos blancos, recuento absoluto y recuentos relativos entre otros), los cuales se analizaron por medio de listados, frecuencias y tablas estadísticas. Los listados se utilizaron para depurar inicialmente la información. Una vez se obtuvo la base de datos depurada se realizó un análisis de frecuencia en el cual se contó cada categoría para una variable especificada y se obtuvieron los resultados absolutos y frecuencias relativas para cada una. Se presenta también la suma, promedio y desviación estándar. Con los resultados obtenidos se realizaron las tablas y los gráficos 112 . Las variables cuantitativas se evaluaron con la prueba de Barlett para determinar si las varianzas eran homogéneas. Si esto era cierto, se procedía a realizar el análisis de varianza paramétrico tradicional (prueba f de Fisher); utilizando una prueba de t de Student para comparar promedios adyacentes. En el caso de que no existiera homogeneidad entre las varianzas, se utilizó la 112 DEAN, A.; DEAN, J.; BURTON, A. & DICKER, R. 1992. Epi Info, versión 5. Epidemiología con microordenadores. p. 243. 35 prueba de Kruskal-Wallis (prueba no paramétrica), comparando en este caso no los promedios, sino las medianas de cada grupo. Posteriormente se utilizó la prueba de Mann-Whitney/Wilcoxon (prueba de Kruskal-Wallis para dos grupos), para determinar la diferencia entre medianas adyacentes 113 . Se le realizó estadística descriptiva basada en promedio y desviación estándar a cada una de estas variables hematocrito, hemoglobina, hemoglobina corpuscular media, concentración media de hemoglobina, eritrocitos, proteína plasmática, proteína sérica, creatinin kinasa, leucocitos, neutrófilos, linfocitos, eosinófilos, monocitos, células Foa – Kurloff y de la temperatura de los grupos experimentales (A, B, C, D, E, F, G). Los tiempos de análisis incluyen, el grupo A animales sacrificados a las 3 horas post inoculación, el grupo B animales sacrificados a las 6 horas post inoculación, el grupo C animales sacrificados a las 9 horas post inoculación, el grupo D animales sacrificados a las 12 horas post inoculación, el grupo E animales sacrificados a las 15 horas post inoculación, el grupo F animales sacrificados a las 18 horas post inoculación, y el grupo G es el grupo de animales control, cada uno de los seis animales que pertenece a este grupo va a hacer parte de los grupos anteriormente descritos. 2.5. EXAMEN MACROSCÓPICO Primero se revisó la historia clínica de cada cobayo, la cual incluía variables como especie, edad, grupo, nº de animal, sexo, peso, hora de inoculación, hora del sacrificio y los síntomas que presentó antes de morir; se continuó con un examen externo (pelaje, uñas, ojos, orejas, piel, etc) 114 luego se prosiguió con una descripción concisa, ordenada y precisa de la necropsia describiendo profundamente las lesiones. Se llevó una secuencia sobre los diferentes 113 MARTÍNEZ, R; MARTÍNEZ, N. 1997. Diseño de experimentos. Análisis de datos estándar y no estándar. p. 13. 114 ALUJA, Aline; CONSTANTINO, Fernando. 2002. Técnicas de necropsia en animales domésticos. p. 23. 36 sistemas del cuerpo y se hizo la descripción en el sitio correspondiente, las necropsias se comenzaron realizando una incisión longitudinal ventromedial desde el extremo anterior de la mandíbula hasta el ano, en el siguiente orden (se removió la lengua, laringe, traquea, esófago y vísceras, se desprendió el bazo, se examinó el páncreas, se hizo una incisión en el estómago a lo largo de la curvatura menor, se desprendió el hígado, los riñones y las glándulas adrenales, por último se realizó la extracción del sistema nervioso central) 115 . Los tejidos obtenidos en necropsia se fijaron en solución de formaldehído (Formaldehyde solución al 37% (CH2O). SIGMA®, Chemical Company, St. Louis, U.S.A.) tamponado al 3.7% para histopatología 116 . 2.6. Inclusión de parafina, coloración hematoxilina y eosina Los tejidos se sometieron al proceso de deshidratación con alcohol etílico (Alcohol Etílico. SIGMA®, Chemical Company, St. Louis, U.S.A.) en concentraciones crecientes y se aclararon con xilol (Xylenes. C6H4(CH3)2) Fischer Scientific Company, New Jersey, U.S.A.) Posteriormente se incluyeron en parafina a una temperatura de 60ºC. Los cortes se realizaron en micrótomo de rotación con un espesor de 4 >m. Se montaron en láminas portaobjeto y se desparafinaron se realizó luego el proceso inverso y se coloreó con hematoxilina (Hematoxylyn (C16H14O6). SIGMA®, Chemical Company, St. Louis, U.S.A.) y eosina 117 (Eosin (C20H6N2O9Br2Na2). SIGMA®, Chemical Company, St. Louis, U.S.A.). Este proceso se realizó en el laboratorio del Centro de Investigación en Salud Animal, Corpoica CEISA, de la ciudad de Bogotá. 115 VILLAFAÑE, Fdo; PEÑA Néstor. 1978. Manual de técnicas del program patología – toxicología. p. 5. 116 LUNA, L. 1968. Manual of histologic stainig methods of the armed forces institute of pathology. p. 258. 117 BANKS, William J. 1996. Histología veterinaria aplicada. p. 6. 37 2.7. EXAMEN MICROSCÓPICO Los tejidos coloreados con hematoxilina y eosina se estudiaron en detalle para detectar lesiones que pudieran relacionarse con la presencia de Clostridium chauvoei, para facilitar el análisis de los hallazgos, se diseño una escala subjetiva del grado de lesión, dependiendo de la severidad de la misma. La escala incluyó (ver tabla 3). 2.8. DESECHO DE MATERIAL Al terminar el trabajo con los cobayos, se utilizaron bolsas rojas para el desecho de residuos patológicos, entendiéndose por esto a todo elemento o material en estado sólido, semisólido, líquido o gaseoso que presente características de toxicidad y actividad biológica que puedan afectar directa o indirectamente a los seres vivos. Estas bolsas se incineraron en el horno crematorio de la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria Corpoica CEISA; donde se realizó el protocolo vigente de las normas de bioseguridad 118 . Tabla 3. Escala subjetiva del grado de lesión producida por Clostridium chauvoei en cobayos (Cavia porcellus) inoculados experimentalmente. 118 http://www.icronline.com/sitio/pacientes/seguridad.asp 38 VALOR CARACTERÍSTICA DE LA LESIÓN 0 Sin Cambios Patológicos Aparentes, No se encontraron cambios patológicos aparentes, el tejido es normal 1 Lesiones Leves, Lesiones ligeras que incluyen cambios congestivos, hemorrágicos, depleción linfoidea, edema ligero 2 Lesiones Moderadas, Incluyen cambios congestivos, hemorrágicos, depleción linfoidea, edema moderado, infiltrados inflamatorios. 3 Lesiones Severas, Incluyen daños tisulares como necrosis de coagulación, infiltrado inflamatorio polimorfonuclear y mononuclear, zonas de hemorragia y congestión con edema abundante. 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 39 3.1. Muestra de sangre Los resultados del hemograma se indican a continuación, analizando cada variable en forma independiente y finalmente correlacionando los valores. 3.1.1. Hematocrito El hematocrito de los grupos experimentales tuvo un promedio de 43.64% (LC 95% 41,40 – 45,88) ver tabla 4. No se encontraron diferencias significativas entre las horas (p = 0.20). Valores similares son referenciados por Harkness, 1995; quien reporta para esta especie un valor de (37 – 48% 119 ). Todos los grupos se encontraron entre los parámetros de referencia. 60 50 40 30 20 10 0 1 Co 8 nt ro l 15 12 9 6 b 3 % HEMATOCRITO HORAS Gráfica 1. Valor promedio del hematocrito por horas post inoculación. 119 MOORE, David. 2000. Hematology of the Guinea pig (Cavia porcellus) In: Schalm`s Veterinary hematology. p. 1108. 40 Tabla 4. Resultados de Hematología, valor promedio por horas 3, 6, 9, 12, 15 y G (grupo control) de cobayos (Cavia porcellus). n Hto % Hb g/dL HCM Picogramos CCMH % Eritrocitos μL Proteína Plasmática Proteína Sérica g/dL CK (UI/L) Leucocitos x mm3 Neutrófilos B. Relativo Neutrófilos B. Absoluto Neutrófilos S. Relativo Neutrófilos S. Absoluto Linfocitos Relativo Linfocitos Absoluto Eosinófilos Relativo Eosinófilos Absoluto Monocitos Relativo Monocitos Absoluto KC cells Relativo KC cells Absoluto 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 Promedio Desv. estándar 43,64 4,85 13,94 2,41 25,97 11,32 32,04 4,68 5958611 1722810 5,33 0,62 4,96 0,45 4014,14 1114,36 6985 3775 3,11 4,23 264,83 441,98 51,06 14,49 3798,87 3039,87 41,22 14,61 2667,77 1329,4 1,22 1,22 94,2 158,72 2,94 2,9 222,47 260,82 0,33 0,97 21,58 70,57 41 Mediana 43,75 14,3 20,73 33,06 6270000 5,25 4,9 4323,52 5425 1 61,5 51 2512 41 2270,5 1 48,75 2 115,45 0 0 EE 1,14 0,57 2,67 1,1 406070 0,15 0,11 262,66 890 1 104,18 3,42 716,5 3,44 313,34 0,29 37,41 0,68 61,47 0,23 16,63 LCI 95% 41,4 12,83 20,74 29,88 5162713 5,05 4,75 3499,33 5241 1,16 60,65 44,36 2394,52 34,47 2053,62 0,66 20,88 1,6 101,98 -0,11 -11,02 LCS 95% 45,88 15,06 31,2 34,2 6754509 5,62 25,75 4528,95 8729 5,06 469,02 57,75 5203,22 47,97 3281,92 1,78 167,52 4,28 342,96 0,78 54,18 P 0,2 0,2 0,31 0,65 0,06 0,8 0,23 0,12 0,15 0,02 0,24 0,32 0,33 0,25 0,02 0,36 0,07 0,1 0,29 0,26 3.1.2. Hemoglobina La hemoglobina de los grupos experimentales tuvo un promedio de 13.94 g/dL (LC 95% 13.83 – 15.06) de acuerdo a la tabla 4, no se encontraron diferencias significativas entre las horas (p = 0.20). Comparativamente estos resultados son normales, según referencia dada por Wagner, 1995; quien reporta para esta especie un valor de (11 – 15g/dL 120 ). Todos los grupos se encontraron entre los parámetros de referencia. 17,55 15 13,95 15,4 12,9 12,1 12,87 18 C on tr ol 15 12 9 b 6 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 3 g/dL HEMOGLOBINA HORAS Gráfica 2. Valor promedio de la hemoglobina por horas post inoculación. 120 MOORE, David. 2000. Op. cit., citado por Wagner J.E. p. 1110. 42 3.1.3. Hemoglobina corpuscular media La hemoglobina corpuscular media de los grupos experimentales tuvo un promedio de 25.97 µg (LC 95% 20.74 – 31.20) De acuerdo a la tabla 4, no se encontraron diferencias significativas entre las horas de exposición (p = 0.31). Al comparar los resultados con los referenciados por Hillyer, 1996; quien reporta para esta especie un valor de (23 – 27 µg 121 ), se encuentran entre los valores normales. Sin embargo al evaluar las horas individualmente se encontró que a las 3, 9 y 18 horas se presentaron valores por debajo de los límites inferiores, a pesar de no existir diferencias significativas entre las horas, clínicamente el descenso de este valor indica deficiencia de hierro en los animales ó posiblemente estrés post inoculación. 50 40 30 20 10 0 Co 18 nt ro l 15 12 9 6 b 3 PICOGRAMOS HEMOGLOBINA CORPUSCULAR MEDIA HORAS Gráfica 3. Valor promedio de la hemoglobina corpuscular media por horas post inoculación. 121 MOORE, David. 2000. Op. cit., p. 1108. 43 3.1.4. Concentración media de hemoglobina La concentración media de hemoglobina de los grupos experimentales tuvo un promedio de 32.04% (LC 95% 29.88 – 34.20) De acuerdo a la tabla 4 no se encontraron diferencias significativas entre las horas de exposición (p = 0.65). Comparativamente estos resultados son normales, según referencia dada por Hillyer, 1996; quien reporta para esta especie un valor de (26 – 39% 122 ). Todos los grupos se encontraron entre los parámetros de referencia. C 18 on tr ol 15 12 9 6 40 35 30 25 20 15 10 5 0 3 % CONCENTRACIÓN MEDIA DE HEMOGLOBINA HORAS Gráfica 4. Valor promedio la concentración media de hemoglobina por horas post inoculación. 122 Ibid., p. 1108. 44 3.1.5. Eritrocitos Los eritrocitos de los grupos experimentales tuvo un promedio de 5`9 x106/mm3 (LC 95% 5`1 – 6`7) De acuerdo a la tabla 4 no se encontraron diferencias significativas entre las horas (p = 0.06). Comparativamente estos resultados son normales, según referencia dada por Quesenberry, 1996; quien reporta para esta especie un valor de (3`2 – 8`0 x106/mm3 123 ). Todos los grupos se encontraron entre los parámetros de referencia. 10000000 8000000 6000000 4000000 2000000 0 C 18 on tr ol 12 15 9 6 b 3 mm3 ERITROCITOS HORAS Gráfica 5. Valor promedio de eritrocitos por horas post inoculación. 123 MOORE, David. 2000. Op. cit., citado por Quesenberry. p. 1108. 45 3.1.6. Proteína plasmática La proteína plasmática de los grupos experimentales tuvo un promedio de 5.33 g/dL (LC 95% 5.05 – 5.82) De acuerdo a la tabla 4 no se encontraron diferencias significativas entre los grupos (p = 0.80). Comparativamente estos resultados son normales, según referencia dada por Rawnsley, 2004; quien reporta para esta especie un valor de (4.6 – 6.2 g/dL 124 ). Todos los grupos se encontraron entre los parámetros de referencia. 6 4 2 0 1 Co 8 nt ro l 15 12 9 6 b 3 g/dL PROTEÍNA PLASMÁTICA HORAS Gráfica 6. Valor promedio de proteína plasmática por horas post inoculación. 124 RAWNSLEY H.M. En: http://academic.csupomona.edu/research/pdfDocuments/acuHandbook_rev02final.pdf 46 3.1.7. Proteína Sérica La proteína sérica de los grupos experimentales tuvo un promedio de 4.96 g/dL (LC 95% 4.75 – 5.17) De acuerdo a la tabla 4 no se encontraron diferencias significativas entre los grupos (p = 0.23). Comparativamente estos resultados son normales, según referencia dada por Rawnsley, 2004; quien reporta para esta especie un valor de (4.6 – 6.2 g/dL 125 ). Todos los grupos se encontraron entre los parámetro de referencia. 5,5 5 4,5 4 3,5 C 18 on tr ol 15 12 9 6 b 3 g/dL PROTEÍNA SÉRICA HORAS Gráfica 7. Valor promedio de proteína sérica por horas post inoculación. 125 Op. cit.., En: http://academic.csupomona.edu/research/pdfDocuments/acuHandbook_rev02final.pdf 47 3.1.8. Creatinin kinasa En química sanguínea, la creatinin kinasa de los grupos experimentales tuvo un promedio de 4014.14 UI/L (LC 95% 3499.33 – 4528.95) Al observar la tabla 4. No se encontraron diferencias significativas entre los grupos (p = 0.12). Comparativamente estos resultados no se encuentran entre los rangos de referencia dados por Kaspareit, 2004; quien reporta (48 – 340 U/L 126 ). El valor de todas las muestras extraídas de CK, presentaron niveles elevados, debido a la inflamación muscular causada por el trauma de la inoculación. 5000 4000 3000 2000 1000 0 ro l Co nt 18 15 12 9 6 b 3 UI/L CREATININ KINASA HORAS Gráfica 8. Valor promedio de creatinin kinasa por horas post inoculación. 126 KASPAREIT, J. 2004. En: http://cvm.es/analitica/vetscan/rangos.htm 48 3.1.9. Leucocitos Los leucocitos de los grupos experimentales tuvo un promedio de 6.9 x103/mm3 (LC 95% 5.2 – 8.7) Al estudiar la tabla 4 no se encontraron diferencias significativas entre los grupos (p = 0.15). Comparativamente estos resultados no se encuentra entre los parámetros normales, según referencia dada por Donnelly, 1996; quien reporta para esta especie un valor de (5.5 – 17.5 x103/mm3 127 ). Al evaluar los grupos individualmente se encontró que a las 12 y 18 horas se presentaron valores por debajo de los límites inferiores, a pesar de no existir diferencias significativas entre las horas; clínicamente el descenso de estos valores indican leucopenia, es decir que uno o la totalidad de los tipos de células blancas, puede estar afectado, debido a las fases iniciales de infecciones agudas. 15000 10000 5000 0 C 18 on tr ol 15 12 9 6 b 3 mm3 LEUCOCITOS HORAS Gráfica 9. Valor promedio de leucocitos por horas post inoculación. 127 MOORE, David. Op. cit., p. 1109. 49 3.1.10. Neutrófilos El valor absoluto de los neutrófilos de los grupos experimentales tuvo un promedio de 3798.87 (LC 95% 2394.52 – 5203.22) estudiando la tabla 4 no se encontraron diferencias significativas entre las horas de exposición (p = 0.33). Comparativamente estos resultados se encuentran entre los parámetros normales, según referencia dada por Quesenberry, 1996; quien reporta para esta especie un valor de (1210 – 8400 128 ), Al evaluar las horas individualmente se encontró que a las 3 horas se presenta el valor por encima de los límites superiores, a pesar de no existir diferencias significativas entre los grupos, clínicamente el ascenso de estos valores indican que los animales a las 3 primeras horas de inoculación presentaban neutrofilia, debido al estrés. 10000 8000 6000 4000 2000 0 tr ol C on 18 15 12 9 6 b 3 mm3 NEUTRÓFILOS (Valor Absoluto) HORAS Gráfica 10. inoculación. 128 Valor promedio de neutrófilos (valor absoluto) por horas post Ibid., p. 1109. 50 El valor relativo de los neutrófilos de los grupos experimentales tuvo un promedio de 51.06% (LC 95% 44.36 – 57.75) de acuerdo a la tabla 4 no se encontraron diferencias significativas entre las horas (p = 0.32). Comparativamente estos resultados no se encuentran entre los parámetros normales, según referencia dada por Quesenberry, 1996; quien reporta para esta especie un valor de (22 – 48% 129 ), Al evaluar los grupos individualmente se encontró que a las 3, 6, 12, 15 y 18 horas se presentaron valores por encima de los límites superiores, a pesar de no existir diferencias significativas entre los grupos, clínicamente el ascenso de estos valores indican proceso bacteriano debido al avance progresivo de la infección. 80 60 40 20 0 18 C on tr ol 15 12 9 6 b 3 % NEUTRÓFILOS (Valor Relativo) HORAS Gráfica 11. inoculación. 129 Valor promedio de neutrófilos (valor relativo) por horas post Ibid., p. 1109. 51 3.1.11. Linfocitos El valor absoluto de los linfocitos de los grupos experimentales tuvo un promedio de 2667.77 (LC 95% 2053.62 – 3281.92) en la tabla 4 observamos que se encontraron diferencias significativas entre los grupos (p = 0.02). Comparando los resultados que se encontraron, frente a la referencia dada por Johnson, 1996; quien reporta para esta especie un valor de (2145 – 12600 130 ). A las 12, 15 y 18 horas se presentaron valores por debajo de los límites inferiores, esto indica linfopenia producida por el estrés de los animales. 6000 4000 2000 0 Co 18 nt ro l 15 12 9 6 b 3 mm3 LINFOCITOS (Valor Absoluto) HORAS Gráfica 12. inoculación. 130 Valor promedio de linfocitos (valor absoluto) por horas post Ibid., p. 1109. 52 El valor relativo de los linfocitos de los grupos experimentales tuvo un promedio de 41.22% (LC 95% 34.47 – 47.97) de acuerdo a la tabla 4 no presentaron diferencias significativas entre las horas de exposición (p = 0.25). Comparativamente estos resultados son normales, según referencia dada por Johnson, 1996; quien reporta para esta especie un valor de (39 – 72% 131 ). Sin embargo al evaluar los grupos individualmente se encontró que a las 3, 15 y 18 horas se presentaron valores por debajo de los límites inferiores, a pesar de no existir diferencias significativas entre los grupos, clínicamente el descenso de estos valores indican linfopenia, producida a las 3 primeras horas por estrés de los animales. 60 50 40 30 20 10 0 18 C on tr ol 15 12 9 6 b 3 % LINFOCITOS (Valor Relativo) HORAS Gráfica 13. inoculación. Valor promedio de linfocitos (valor relativo) por horas post 3.1.12. Eosinófilos 131 Ibid., p. 1109. 53 El valor absoluto de los eosinófilos de los grupos experimentales tuvo un promedio de 94.20 (LC 95% 20.88 – 167.52) al observar la tabla 4 no se encontraron diferencias significativas entre las horas de exposición (p = 0.07). Comparativamente estos resultados son normales, según referencia dada por Delaney, 1996; quien reporta para esta especie un valor de (0 – 1225 132 ). Todos los grupos se encontraron entre los parámetros de referencia. 500 400 300 200 100 0 C 18 on tr ol 15 12 9 6 b 3 mm3 EOSINÓFILOS (Valor Absoluto) HORAS Gráfica 14. inoculación. 132 Valor promedio de eosinófilos (valor absoluto) por horas post Ibid., p. 1109. 54 El valor relativo de los eosinófilos de los grupos experimentales tuvo un promedio de 1.22% (LC 95% 0.66 – 1.78) en la tabla 4 no se encontraron diferencias significativas entre las horas de exposición (p = 0.36). Comparativamente estos resultados son normales, según referencia dada por Delaney, 1996; quien reporta para esta especie un valor de (0 – 7% 133 ). Todos los grupos se encontraron entre los parámetros de referencia. 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 1 Co 8 nt ro l 15 12 9 6 b 3 % EOSINÓFILOS (Valor Relativo) HORAS Gráfica 15. inoculación. 133 Valor promedio de eosinófilos (valor relativo) por horas post Ibid., p. 1109. 55 3.1.13. Monocitos El valor absoluto de los monocitos de los grupos experimentales tuvo un promedio de 222.47 (LC 95% 101.98 – 342.96) ver tabla 4. No se encontraron diferencias significativas entre los grupos (p = 0.10). Comparando los resultados que se encontraron, frente a la referencia dada por Hillyer, 1996; quien reporta para esta especie un valor de (55 – 1750 134 ). A las 18 horas post inoculación se presentaron valores por debajo de los límites inferiores. 1000 800 600 400 200 0 C 18 on tr ol 15 12 9 6 b 3 mm3 MONOCITOS (Valor Absoluto) HORAS Gráfica 16. inoculación. 134 Valor promedio de monocitos (valor absoluto) por horas post Ibid., p. 1109. 56 El valor relativo de los monocitos de los grupos experimentales tuvo un promedio de 2.94% (LC 95% 1.60 – 4.28) ver tabla 4. No se encontraron diferencias significativas entre los grupos (p = 0.10). Comparativamente estos resultados son normales, según referencia dada por Hillyer, 1996; quien reporta para esta especie un valor de (1 – 10% 135 ). Todos los grupos se encontraron entre los parámetros de referencia. 10 8 6 4 2 0 18 C on tr ol 15 12 9 6 b 3 % MONOCITOS (Valor Relativo) HORAS Gráfica 17. inoculación. 135 Valor promedio de monocitos (valor relativo) por horas post Ibid., p. 1109. 57 3.1.14. Células Foa – Kurloff El valor absoluto de las células Foa – Kurloff (KC cells) de los grupos experimentales tuvo un promedio de 21.58 (LC 95% -11.02 – 54.18) ver tabla 4. No se encontraron diferencias significativas entre los grupos (p = 0.26). El valor relativo de las células Foa – Kurloff (KC cells) de los grupos experimentales tuvo un promedio de 0,33% (LC 95%- 0,11 – 0,78) ver tabla 4. No se encontraron diferencias significativas entre los grupos (p = 0,29). Comparativamente estos resultados son normales, según referencia dada por Jain, 1986; quien reporta para esta especie un valor de (3 – 4% 136 ), en animales con una edad aproximada hasta de 4 meses. 200 150 100 50 0 Co 18 nt ro l 15 12 9 6 b 3 mm3 Células Foa - Kurloff (Valor Absoluto) HORAS Gráfica 18. Valor promedio de células Foa – Kurloff (valor absoluto) por horas post inoculación. 136 Ibid., p. 1109. 58 Correlacionando los valores hematológicos de los cobayos (Cavia porcellus) inoculados con una cepa de Clostridium chauvoei podemos observar que la mayoría de los cambios hematológicos se hicieron evidentes a partir de las 9 horas post inoculación, el hematocrito indica un leve aumento de las tres primeras horas a las 12 horas, observándose un descenso de este entre las 15 y 18 horas, igualmente la hemoglobina comienza un ascenso de las 3 a las 12 horas para disminuir de las 15 a las 18 horas, estos cambios encontrados están entre los parámetros de referencia. Al evaluar por horas la hemoglobina corpuscular media se encuentra que a las 3, 9 y 18 horas post inoculación los valores disminuyeron, a causa del estrés que presentaban los animales al ser manipulados. La concentración media de hemoglobina, los eritrocitos, la proteína plasmática y la proteína sérica se mantuvieron estables durante las horas de exposición a la cepa patógena. Aunque no se encontraron diferencias significativas en los resultados de creatinin kinasa, se observó que los niveles son elevados obviamente a causa del trauma de la inoculación. Los leucocitos presentaron a las 12 y 18 horas un descenso en los valores, esto indica leucopenia, queriendo decir que una clase de células blancas esta afectada debido a la fase inicial de una infección aguda. El valor de las células Foa – Kurloff se encontró bajo en comparación con lo referenciado por Jain, 1986 quien reporta un parámetro de (3 – 4%) del conteo diferencial de leucocitos y en el estudio nos dio un promedio de (0.33%), claro que estas células son especificas de los cobayos menores de 2 a 3 meses de edad. 59 3.2. TEMPERATURA La temperatura de los grupos experimentales tuvo un promedio de 35,54ºC (LC 95% 32,42 – 38,66) Al evaluar la temperatura de los cobayos en el anexo 8 se encontraron diferencias significativas entre las horas de exposición (p = 0,0008). Al comparar los resultados con los referenciados por Rawnsley, 2004; quien reporta para esta especie una temperatura de (37.2 – 39.5ºC 137 ), los grupos se encontraron fuera de los parámetros de referencia. Al observar los tiempos individualmente vemos que a las 3, 6 y 9 horas post inoculación los cobayos encontraban entre el rango normal de temperatura, a las 12 horas tuvo un valor superior, debido al proceso bacteriano que presentaron los animales; a las 15 y 18 horas mostraron valores por debajo de los limites inferiores. 50 40 30 20 10 0 18 C on tr ol 15 12 9 6 b 3 ºC TEMPERATURA HORAS Gráfica 19. Valor promedio de temperatura por horas post inoculación. 137 RAWNSLEY H.M. Op. cit., En: http://academic.csupomona.edu/research/pdfDocuments/acuHandbook_rev02final.pdf 60 3.3. OBSERVACIÓN MACROSCÓPICA DE LESIONES Los cobayos presentaron lesiones aparentes a partir de las 6 horas postinoculación; se observó ligera tumefacción del área inoculada, lesión que no se presentó en los animales testigos. Después de las 9 horas se acentúa la tumefacción del miembro posterior con crepitación a la palpación e hinchazón moderada, que produce en los animales cojera inicial y después de las 15 horas por la severidad, postración; uno de los animales inoculados murió entre las 15 y 18 horas con lesiones anteriormente descritas pero más severas en el músculo afectado y en la región inguinal. Los hallazgos de necropsia permitieron observar cambios discretos en las primeras horas, donde se observó ligero edema en la zona de inoculación; después de las 6 horas esta lesión comenzó a ser mas notoria, con presencia de áreas oscuras (rojo – negruzco) y de un líquido sanguinolento que paso de ligero a severo después de las 15 horas y continuó hasta las 18 horas postinoculación, presentándose en estos últimos casos un aspecto mucoide, que se distribuía por todo el miembro y el tejido subcutáneo del abdomen en su región inguinal. A nivel general se observó congestión ligera desde las 3 horas de inoculación en órganos como pulmón, cerebro, bazo, hígado y riñón, pasando a moderada después de las 6 horas y severa a partir de las 15 horas, cuando el animal presentaba las lesiones vasculares más severas. La crepitación y la presencia de gas fueron notorias a partir de las 12 horas (Figura 2) en todos los animales inoculados. Las lesiones principales en los animales de 18 horas fueron tumefacciones crepitantes en la musculatura estriada esquelética, tejidos de color rojo o marrón oscuro con estrías negras; algunas áreas aparecían húmedas y 61 desprendían exudado oscuro mezclado con gases que le daban un particular olor dulzón (Figura 2 y 3). a Figura 2. Clostridiosis. Lesiones en cavidad toráxica y peritoneal de cobayos (Cavia porcellus) a. Abundante producción de gases en intestino, cuadro congestivo y hemorrágico, 15 horas post inoculación. b a Figura 3. Clostridiosis. 18 horas post inoculación. a. Tumefacciones crepitantes en la musculatura estriada esquelética, tejidos de color rojo o marrón oscuro con estrías negras; b. Algunas áreas aparecen húmedas y desprenden exudado oscuro mezclado con gases. 62 3.4. OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE LESIONES En la tabla 4, se muestra que las lesiones más importantes ocurrieron en el músculo estriado esquelético (MEE), única variable que resultó significativa (p = 0,0005) demostrando que si hay diferencia entre los grupos experimentales. En los grupos control se inyectó únicamente con cloruro de calcio (CaCl2). Estos animales presentaron un ligero edema, el cual se evidenció por la separación de las fibras musculares, las lesiones se valoraron entre 0 y 1(Tabla 3); A este grupo se le inyectó solamente cloruro de calcio presentando ligero edema, el cual se evidenció por la separación de las fibras musculares. Los cobayos después de 3 a 15 horas de la inoculación con Clostridium chauvoei y luego sacrificados mostraron lesiones leves a moderadas como sigue: A partir de las 3 horas se encontró una ligera necrosis coagulativa, infiltrado de neutrófilos polimorfonucleares y ligero edema; después de las 6 horas se hizo notoria la separación de fibras musculares, congestión con hemorragias ligeras y se observa infiltración polimorfonuclear, se presentó una variación moderada; a las 9 y 12 horas se observó necrosis de coagulación. La necrosis y el infiltrado polimorfonuclear fueron más severos a las 18 horas, al igual que la presencia de formas bacilares en cantidades abundantes (Figura 4). El grupo que demostró los cambios severos fue el grupo experimental de 18 horas de inoculadas y no fue necesario sacrificar algunos cobayos, sino que murieron por sí solos. Las lesiones principales fueron gangrena gaseosa con marcada necrosis de coagulación y de licuefacción con olor fétido. Se encontró una marcada infiltración polimorfonuclear de tipo neutrófilo (Figura 5 y 6). En órganos como el bazo se observó deplesión linfoide desde las primeras 3 horas de inoculación en todos los cobayos, al igual que congestión desde las 9 horas sin tener una tendencia específica, sin embargo en el cobayo que murió repentinamente, fue severa la congestión con hemorragias. 63 Se observaron cambios vasculares como congestión en: pulmón, hígado, músculo estriado, músculo cardiaco y riñón (corteza y médula), desde las 3 horas de inoculación con Clostridium chauvoei. En el cobayo que murió entre las 15 y 18 horas post inoculación, se observó hemorragia muy severa. Las láminas de tejidos coloreadas con hematoxilina y eosina permiten observar lesiones anatomopatológicas generales que hacen pensar en una clostridiosis. 64 Tabla 5. Resultados estadísticos de la calificación de lesiones histopatológicas en tejidos de cobayos (Cavia porcellus) inoculados con cepa patógena de Clostridium chauvoei. No. 01/01/2004 01/02/2004 01/03/2004© 02/01/2004 02/02/2004 02/03/2004 © 03/01/2004 Hora sacrificio BAZO MEC MEE DUODENO HIGADO PANCREAS PULMON RIÑON CEREBRO ADRENAL 3 1 0 1ab 0 0 0 2 1 1 0 0 1ab 0 0 0 2 0 0 0 0 1a 0 0 0 1 0 0 0 1 1abc 2 1 0 2 2 2 0 1 2abc 2 1 0 1 1 1 0 1 1a 0 2 0 1 1 1 0 1 2abc 2 2 0 3 1 1 0 0 1 0 2 1 1 0 3 3 6 6 6 9 1 1 1 0 1 3 03/02/2004 9 1 1 2abc 03/03/2004 © 9 1 2 1a 1 1 0 3 2 0 0 04/01/2004 12 1 1 2bc 1 1 0 3 1 1 0 04/02/2004 12 0 1 3bc 1 2 0 2 3 1 0 04/03/2004 © 12 1 1 1a 1 1 0 3 0 1 0 05/01/2004 15 1 2 2abc 1 2 0 2 2 1 0 05/02/2004 15 1 1 2abc 1 1 0 2 1 1 2 05/03/2004 © 15 1 0 0a 1 1 0 2 1 1 0 2 3c 2 1 0 2 2 1 0 2 3c 1 1 0 2 1 1 0 0 1a 0 1 0 0,0945 0,0005 0,0769 0,1876 06/01/2004 06/02/2004 06/03/2004 © p 18 18 18 2 2 1 0,059 1 1 | 0 0,8084 0,4803 0,4038 0,2284 MEC: Músculo estriado cardiaco; MEE: Músculo estriado esquelético ©= Grupos control inoculados con Cloruro de Calcio p= nivel de significancia 65 A B a Figura 4. Clostridiosis. a. Bacilos de Clostridium chauvoei en músculo estriado esquelético de cobayo (Cavia porcellus) después de 18 horas de inoculación. H.E. 100X (A) y 400X (B). A B Figura 5. Clostridiosis. Músculo estriado esquelético de cobayo (Cavia porcellus), 18 horas post inoculación. Se observa infiltración polimorfonucleares y necrosis de coagulación. H.E. 100X (A) 400X (B). 66 A B Figura 6. Clostridiosis. A) Presencia de bacilos de Clostridium chauvoei y leucocitos polimorfonucleares neutrófilos en músculo estriado esquelético, 18 horas post inoculación. H.E. 1000X). B) Corte longitudinal de músculo estriado esquelético de cobayo (Cavia porcellus) testigo, el cual no presenta cambios patológicos aparentes. H.E. 400X). Los cambios patológicos mas importantes se observaron en el músculo estriado esquelético, y se encontraron alteraciones a partir de 3 horas post inoculación que incluyen desde ligero edema hasta gangrena gaseosa severa que se produce después de las 15 horas, por la acción de las toxinas alfa y gamma, necrotizante e hidrolizante respectivamente que destruyen la matriz del tejido conectivo, resultados que concuerdan con lo encontrado por Hateway, 1990 y Titball et al. 2003. esto indica que el músculo estriado esquelético resulta ser el adecuado para el diagnostico de carbón sintomático. 67 4. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES La temperatura se incrementó levemente a las 12 horas post inoculación con Clostridium chauvoei, a las 15 horas disminuyó a 28.8ºC, para continuar bajando a las 18 horas a 21ºC, como lo referencia Pemberton, 1974. La proteína sérica y plasmática se encontró entre los valores normales, en el animal que murió no se encontraron diferencias significativas. No se encontró cambios hematológicos significativos en los cobayos, tan solo algunos grupos presentaron en las primeras horas post inoculación una leucopenia, debido a las fases iniciales de infección aguda. La neutrofilia se observó en todos los grupos inoculados con Clostridium chauvoei, su valor nunca retorno al normal, debido a la agudeza de la infección. No se hallaron diferencias significativas en sangre debido a la rapidez con la cual se desarrolla la enfermedad. La enzima asociada con el daño de músculo esquelético Creatinin Kinasa, incrementó su valor por encima de los límites superiores, debido a la inflamación muscular causada por el trauma de la inoculación. La actividad de Gamma glutamil transferasa GGT; Alanina aminotransferasa ALAT - GPT; Aspartato aminotransferasa AST – GOT, no se determinó ya que los datos fueron insuficientes para dar conclusiones validas. Los cambios patológicos mas importantes se observaron en el músculo estriado esquelético y se encontraron alteraciones leves a partir de las 3 horas post - inoculación 68 El músculo esquelético estriado es el único tejido que presento cambios significativos en esta investigación, debido a que la bacteria de Clostridium chauvoei afecta específicamente a este tejido. El tejido muscular estriado esquelético resulta ser el adecuado para el diagnóstico de carbón sintomático, este resultado concuerda con Assis et al. (2005). Los cobayos inoculados con Clostridium chauvoei mueren entre las 15 y 18 horas post inoculación, presentando las lesiones mas severas. Importante tomar muestras del animal recién muerto, teniendo en cuenta el protocolo de recolección de tejidos para histopatología y así evitar que estos tejidos sean contaminados con otras bacterias que normalmente están presentes en el animal y no poder hallar un diagnóstico certero. La fijación del tejido en formaldehído permitió su uso posterior a la toma de la muestra, sin presentar cambios que alteren el diagnóstico. La utilización de tejidos fijados en formol bufferado al 10%, es una buena opción ya que se pueden enviar muestras desde áreas remotas del país y también estas muestras pueden ser almacenadas por el tiempo necesario sin alterar los resultados de la técnica. De acuerdo con los resultados obtenidos, la técnica de hematoxilina y eosina permite observar lesiones anatomopatológicas generales que nos hacen pensar en una clostridiosis, pero no permiten confirmar el tipo de Clostridium involucrado tal como lo indicaron Ortiz y Benavides (2002) 69 Evitar enterrar animales presuntamente muertos por Clostridiosis, para evitar que las esporas del Clostridium después salgan al medio ambiente y contamine agua, pienso ó a otros animales. Darle a conocer al ganadero la importancia de enviar muestras de los animales muertos para tener un diagnóstico real del agente causal de la enfermedad. Este trabajo es importante como soporte para nuevos estudios en el área de bacterias anaerobias en Colombia 70 5. BIBLIOGRAFÍA ALBRITTON, A.B. 1958. Standard values in blood. Philadelphia: WB Saunders. p. 30. ALUJA, Aline; CONSTANTINO, Fernando. 2002. Técnicas de necropsia en animales domésticos. 2º edición. Manual moderno. JGH editores. México D.F. p. 21 – 49. BAKER, F.J.; BREACH, M.R. 1990. Manual de técnicas de microbiología medica. Editorial Acribia. Zaragoza España. p. 214 – 215. BANKS, William J. 1996. Histología veterinaria aplicada. 2º edición. Editorial El Manual Moderno S.A. p. 6 - 9. BEER, Joachim. 1981. Enfermedades infecciosas de los animales domésticos. Tomo II. Enfermedades producidas por bacterias y hongos e intoxicaciones. Editorial Acribia Zaragoza España. p. 194 -196. BENIRSCHKE, K; GARNER, F.M; JONES, T.C. 1978. pathology of laboratory animals. New York: Springer – Verlag. Nº 1. BENJAMIN, Maxine M. 1991. Manual de patología clínica en veterinaria. 1º edición. Editorial Limusa. México D.F. P.33 – 87. BIBERSTEIN, Ernst. 1994. Tratado de microbiología veterinaria. Editorial Acribia. España. p. 344 – 347. 71 BLAHA, Thomas. 1995. Epidemiología especial veterinaria. Editorial Acribia S.A. Zaragoza España. p. 482 - 486. BRAINARD, G. C., M. K. VAUGHAN, and R. J. REITER. 1986. Effect of light irradiance and wavelength on the Syrian hamster reproductive system. Endocrinol. 119(2):648-654. BULLOCH, W. 1930. Bacillus anthracis. En: Medical Research Council. A system of Bacteriology in relation to Medicine. His Majesty's Stationery Office, London; I: 6. CARABALLO, Luis Carlos. 1973. Identificación y clasificación de cepas de Clostridium. Bogotá, Tesis, M.S. Microb. Vet. Universidad Nacional de Colombia, Instituto Colombiano Agropecuario, p. 46. CHANDLER, H. M., and GULASEKHARAM, J. 1974. The protective antigen of a highly inmunogenic strain of Clostridium chauvoei including an evaluation of its flagella as a protective antigen. Journal of General Microbiology. 84. p. 128 – 134. CHANDLER, H. M; HAMILTON, R.C. 1975. a. Protective antigenicity of protoplasts and sphaeroplasts of a highly protective strain of Clostridium chauvoei. Journal of General Microbiology. p. 179 -183. CHANDLER, H. M; and HAMILTON, R.C. 1975. b. The preparation of immunogenic cell walls from a highly protective strain of Clostridium chauvoei. Journal of General Microbiology. 88. p. 27 - 35. DAVIDSON, Malcom. 2000. Manual patología clínica en pequeños animales p. 49. 72 DAVIES, R. H; and WRAY, C. 1996. Journal Veterinary Medicine. 43, p. 119. DAVIS, Bernard; DULBECCO, Renato; EISEN, Hermar; GINSBERG, Harold. 1984. Tratado de microbiología. Salvat editotores. 3ª edición. P. 584 -587. DEAN, A.; DEAN, J.; BURTON, A. & DICKER, R. (1992). Epi Info, versión 5. Surveillance Center for Epidemiología and con microordenadores. Epidemiology. Disease Control. Epidemiology Atlanta, Georgia Division of Program Office. 30333. U.S.A. Traducido por: Fernández M., J.C. Departamento de Evaluación de la Salud, Sevilla (España).p. 243. DESJARDINS, C. 1986. Indwelling vascular cannulas for remote blood sampling, infusion, and long-term instrumentation of small laboratory animals. In: Gay WI, ed. Methods of animal experimentation. Orlando: Academia Press. DI GENARO, María Silvia; MICALIZZI, Blas; and DE GUZMAN, Ana María. 1999. Clostridium chauvoei: Inmunological characterization of antigenic preparations. Anaerobe. 5, p. 301 - 303 ERKERT, H. G., and J. GROBER. 1986. Direct modulation of activity and body temperature of owl monkeys (Aotus lemurinus griseimembra) by low light intensities. Folia Primatol. 47(4):171-188. GARCIA, Antonio. 2005. MV. Bogotá D.C. Comunicación personal. GARCÍA, Henry; PARRA, Luis Guillermo. 2002. Medicina veterinaria y zootecnia en Colombia. Trayectoria durante el siglo XX y perspectivas para el siglo XXI. Bogotá. Fundación Edivez. p. 255 – 256. 73 GÁZQUEZ O, Antonio. 1991. Patología veterinaria. Interamericana Mc GrawHill España. p. 35, 358 – 360. HARKNESS, J.E; WAGNER, J.E. 1995. The biology and medicine of rabbits and rodents, 4th ed. Baltimore: Williams & Wilkins. p. 68. HILLYER, E.V; QUESENBERRY, K.E; DONNELLY, T.M. 1996. Biology, husbandry, and clinical techniques (of guinea pigs and chinchillas). In: Hillyer E.V., Quesenberry K.E, eds. Ferrets, rabbits, and rodents clinical medicine and surgery. Philadelphia: WB Saunders. p. 102. IZARD, J; BARRELLIER, M.T; QUILLEC, M. 1976. The Kurloff cell – its differentiation in the blood and lymphatic system. Cell Tissue Res 173: p 237 – 259. JAIN, N.C. 1986. Schalm´s veterinary hematology. 4th ed. Philadelphia: Lea de Febiger. p. 18 JOHNSON, J.L; and FRANCIS, B.S. 1974. Taxonomy of the Clostridia: Ribosomal Ribonucleic Acid Homologies among the Species. Journal of General Microbiology. p. 229 - 242. JOHNSON – DELANEY C.A. 1996. Exotic companion medicine handbook. Lake Worth, FL: Wingers Publishing. p. 43. JUBB, K.V.F; KENNEDY, Peter; and PALMER, Nigel. 1985. Patología de los animales domésticos. Tomo I. Hemisferio Sur. AEDOS. MUNDI-PRENSA. España. p. 218 – 223. 74 KASPAREIT, J. 2004. En: http://cvm.es/analitica/vetscan/rangos.htm KOJIMA, A; ANIMOTO, K; OHGITANI, T; TAMURA, Y. 1999. Characterization of flagellin from Clostridium chauvoei. Veterinary Microbiology. 67 March, p. 231 – 237. KOJIMA, A; UCHIDA, I; SEKIZAKI, T; SASAKI, Y; OGIKUBO, Y; and TAMURA, Y. 2001. Rapid detection and identification of Clostridium chauvoei by PCR based on flagellin gene sequence. Veterinary Microbiology 78. p. 363 – 371. KOJIMA, A; UCHIDA, I; SEKIZAKI, T; SASAKI, Y; OGIKUBO, Y; KIJIMA, M; and TAMURA, Y. 2000. Clonación y expresión de un gen que codifica la flagelina de Clostridium chauvoei. Veterinary Microbiology. 76, p. 359 - 372. LUNA, L. 1968. Manual of histologic staining methods of the Airmed Forces Institute of Pathology. 3ª edition. McGraw-Hill Book Company. New York. p. 258. MANNING, P.J; WAGNER, J.E; HARNESS, J.E. 1984. Biology and diseases of guinea pigs. In: Fox JG, et al., eds. Laboratory animal medicine. Orlando: Academic Press. MARSHALL, A.H.E; SWETTENHAM, K.V; VERNON – ROBERTS, B; REVELL, P.A. 1971. Studies on the function of de Kurloff cell. Int Arch Allergy Appl Immunol. 40: p. 137 – 152. MARTÍNEZ, Ricardo; MARTÍNEZ, Nhora. 1997. Diseño de experimentos. Análisis de datos estándar y no estándar. 1ª edición. Fondo Nacional Universitario. Editorial Guadalupe Ltda. Bogotá (Colombia), p. 479. 75 MATTAR, M.A; CORTIÑAS, T.I; and STEFANINI DE GUZMAN, A.M. 2002. Inmunogenic protein variations of Clostridium chauvoei cellular antigens associated with the culture growth phase. FEMS Imnunology and medical microbiology. 33. p. 9 - 14. MERCHANT, I; PACKER, R. 1980. Bacteriología y virología veterinaria. 3º edición, 2ª reimpresión. Acribia Zaragoza España. p. 411 -413. MITRUKA, B.J; RAWNSLEY, H.M. 1977. Clinical biochemical and haematological reference values in normal experimental animals and normal humans. 1st ed. New York: Masson. p. 33 MOORE, D.M. 2000. Hematology of the Guinea pig (Cavia porcellus) In: Schalm`s Veterinary hematology. Editors FELDMAN, B; ZINKL, J; JAIN, N. editorial Lippicun William. New York. p. 1107 - 1110. NEWBOLD, J. A., L. T. CHAPIN, S. A. ZINN, and H. A. TUCKER. 1991. Effects of photoperiod on mammary development and concentration of hormones in serum of pregnant dairy heifers. J. Dairy Sci. 74(1):100-108. OCÁDIZ, G, Javier. 1990. Epidemiología en animales domésticos. Control de enfermedades. 2º edición. Editorial Trillas. México. p. 107 – 108. PARRA, Danilo; CORREDOR, Hugo. 1970. Tesis, Estudio del curí (Cavia cobaya). Contribución al estudio del curí como animal de laboratorio en Colombia. Universidad Nacional de Colombia. p. 2 - 20. PEKRUL, D. 1991. Noise control. Handbook of Facilities Planning. Vol. 2: Laboratory Animal Facilities, T. Ruys, ed. New York: Van Nostrand Reinhold. p. 422. 76 PEMBERTON, John; BATES, Fern; MATSON, Ruth; MACHEAK, M; HIGBE, John. 1974. a. Changes in clinical values of cattle infected with Clostridium chauvoei: Preliminary report. Am J Vet Res, vol 35, Nº 98. p. 1037 – 1040. PEMBERTON, John; BATES, Fern; MATSON, Ruth; MACHEAK, M; HIGBE, John. 1974. b. Changes in clinical values of cattle infected with Clostridium chauvoei: Clinical relationships during infection. Am J Vet Res, vol 35, Nº 98. p. 1041 – 1044. PORTILLA, Guillermo; FRANCO, Orlando. Carbón sintomático ¡Una enfermedad que mata! Edición Fernando Acevedo S. Coordinador pecuario Regional 7. ICA. PNR. p. 2. QUIROS, Joaquín E; LÓPEZ, Gustavo. 1991. Curso sobre sanidad animal. ICA 1811. Compendio Nº 47. Medellín. P. 125 – 127. RAMIREZ SILVA, Sergio. 2002. Criterios de selección para animales de laboratorio: una guía practica para investigadores. Rev Sanid Milit 2002, 56 (1): 46 – 52. En: http://www.tdx.cesca.es/TESIS_UAB/AVAILABLE/TDX-0613101121559//mgp4de5.pdf RASDOSTITS, O; BLOOD, D; CLIVE, G; and HINCHCLIFF, K.W. 2002. Medicina Veterinaria, Tratado de las enfermedades del Ganado bovino, ovino, porcino, caprino y equino. 9º edición Mc Graw-Hill, Vol I, p. 893 – 907. RAWNSLEY H.M. En: http://academic.csupomona.edu/research/pdfDocuments/acuHandbook_rev02fi nal.pdf 77 Report of the AVMA panel de euthanasia. JAVMA, vol 188, Nº 3, February 1, p. 253. 1986 SÁENZ, Ernesto. 1944. Consideraciones e identificación de los principales anaerobios del género Clostridium patógenos para los animales domésticos. Tesis, Universidad Nacional de Colombia. p. 2 – 6 y 66 – 69. SCHERMER, S. 1967. The blood morphology of laboratory animals. Philadelphia: FA Davis. p. 25. TAMURA, Yutama; MINAMOTO, Nobuyuki; and TANAKA, Shozo. 1984. Demonstration of protective antigen carried by flagella of Clostridium chauvoei. Microbiol. Inmunol. Vol. 28 (12), p. 1325 – 1332. TANAKA, M; HIRAYAMA, N; and TAMURA, Y. 1987. Production, Characterization, and Protective effect of Monoclonal Antibodies to Clostridium chauvoei flagella. Infection And Inmunity. Aug. Vol. 55, Nº 8. p. 1779 – 1783. TUCKER, H. A., D. PETITCLERC, and S. A. ZINN. 1984. The influence of photoperiod on body weight gain, body composition, nutrient intake and hormone secretion. J. Anim. Sci. 59(6):1610-1620. URBINA, Mairo; epidemiológica RODRIGUEZ, de Germán. enfermedades 1978. transmisibles. Sistema Instituto de vigilancia Colombiano Agropecuario. p. 53 - 55. VADILLO, S; PINZ, S; MATEOS, E. 2002. Manual de microbiología veterinaria. Mc Graw-Hill, España. p. 224 – 227. 78 VEGA, Marco. Carbunco sintomático. 2000. En: www.portalveterinaria.com/sections.php?op=viewarticle&artid=8 VILLAFAÑE, Fernando; PEÑA Néstor. 1978. Manual de técnicas del programa patología – toxicología. Ministerio de agricultura I.C.A. Boletin técnico nº 51. Bogotá. p. 5. WALTER, Wiliam; McBEE, Richard; TEMPLE, Kenneth. 1980. Introducción a la microbiología. Compañía editora continental. México. p. 323. Febrero 22 de 2004. En: www.veterinaria.unal.edu.co/historia_mv.html Enero 2 de 2004. En: http://www.icronline.com/sitio/pacientes/seguridad.asp Report of the AVMA panel de euthanasia. 1986. JAVMA, vol 188, Nº 3, February 1, p. 253. En: http://www.proclave.com/servet/tomamuestras/agujas.htm 79 6. ANEXOS Anexo 1. Resultados de Hematología, grupo A (3 horas post inoculación con Clostridium chauvoei), cobayos (Cavia porcellus). n Hto % Hb g/dL HCM Picogramos CCMH % Eritrocitos μL Proteína Plasmática Proteína Sérica g/dL CK (UI/L) Leucocitos x mm3 Neutrófilos B. Relativo Neutrófilos B. Absoluto Neutrófilos S. Relativo Neutrófilos S. Absoluto Linfocitos Relativo Linfocitos Absoluto Eosinófilos Relativo Eosinófilos Absoluto Monocitos Relativo Monocitos Absoluto KC cells Relativo KC cells Absoluto 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 Promedio 40,5 13,95 18,75 34,37 7475000 5,45 5,1 4293,31 12975 1 895 64,5 8791,5 29 3279,75 3 429,5 2,5 384,75 0 0 des. estándar 3,54 1,91 0,94 1,71 1393000 0,35 0,57 880,25 5692 1,41 1265,72 14,85 5598,16 16,97 551,19 1,41 354,26 2,12 417,55 0 0 80 Mediana 40,5 13,95 18,75 34,37 7475000 5,45 5,1 4293,31 12975 1 895 64,5 8791,5 29 3279,75 3 429,5 2,5 384,75 0 0 EE 2,5 1,35 0,66 1,21 985000 0,25 0,4 622,43 4025 1 895 10,5 3958,5 12 389,75 1 250,5 1,5 295,25 0 0 LCI 95% 35,6 11,3 17,45 31,99 5544400 4,96 4,32 3073,35 5086 -0,96 -859,2 43,92 1032,84 5,48 2515,84 1,04 -61,48 -0,44 -193,94 0 0 LCS 95% 45,4 16,6 20,05 36,74 9405600 5,94 5,88 5513,27 20864 2,96 2649,2 85,08 16550,16 52,52 4043,66 4,96 920,48 5,44 963,44 0 0 Anexo 2. Resultados de Hematología, grupo B (6 horas post inoculación con Clostridium chauvoei), cobayos (Cavia porcellus). n Hto % Hb g/dL HCM Picogramos CCMH % Eritrocitos μL Proteína Plasmática Proteína Sérica g/dL CK (UI/L) Leucocitos x mm3 Neutrófilos B. Relativo Neutrófilos B. Absoluto Neutrófilos S. Relativo Neutrófilos S. Absoluto Linfocitos Relativo Linfocitos Absoluto Eosinófilos Relativo Eosinófilos Absoluto Monocitos Relativo Monocitos Absoluto KC cells Relativo KC cells Absoluto 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 Promedio 45,25 15 25,9 33,23 6075000 5,65 4,65 4727,29 5900 2 110,5 55,5 3330,75 39 2263,5 0,5 33,25 3 162 0 0 des. estándar 5,3 1,13 8,89 1,39 1647559 1,2 0,21 500,41 1061 1,41 62,23 10,61 1214,46 7,07 3,54 0,71 47,02 2,83 135,06 0 0 81 Mediana 45,25 15 25,9 33,23 6075000 5,65 4,65 4727,29 5900 2 110,5 55,5 3330,75 39 2263,5 0,5 33,25 3 162 0 0 EE 3,75 0,8 6,28 0,99 1165000 0,85 0,15 353,84 750 1 44 7,5 858,75 5 2,5 0,5 33,25 2 95,5 0 0 LCI 95% 37,9 13,43 13,58 31,3 3791600 3,98 4,36 4033,76 4430 0,04 24,26 40,8 1647,6 29,2 2258,6 -0,48 -31,92 -0,92 -25,18 0 0 LCS 95% 52,6 16,57 38,21 35,16 8358400 7,32 4,94 5420,82 7370 3,96 196,74 70,2 2897,61 58,47 2268,4 1,48 98,42 6,92 349,18 0 0 Anexo 3. Resultados de Hematología, grupo C (9 horas post inoculación con Clostridium chauvoei), cobayos (Cavia porcellus). n Hto % Hb g/dL HCM Picogramos CCMH % Eritrocitos μL Proteína Plasmática Proteína Sérica g/dL CK (UI/L) Leucocitos x mm3 Neutrófilos B. Relativo Neutrófilos B. Absoluto Neutrófilos S. Relativo Neutrófilos S. Absoluto Linfocitos Relativo Linfocitos Absoluto Eosinófilos Relativo Eosinófilos Absoluto Monocitos Relativo Monocitos Absoluto KC cells Relativo KC cells Absoluto 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 Promedio 46 15,4 19,29 33,45 8000000 5,55 5,05 4139,05 9750 1 96 33,5 3282 55,5 5398,5 0,5 49,5 8 780 1,50 144 des. estándar 1,41 1,41 2,45 2,05 282843 0,21 0,07 366,84 212,13 1,41 135,76 14,85 1518,87 12,02 1054,3 0,71 70 0 16,97 2,12 203,65 82 Mediana 46 15,4 19,29 33,45 8000000 5,55 5,05 4139,05 9750 1 96 33,5 3282 55,5 5398,5 0,5 49,5 8 780 1,50 144 EE 1 1 1,73 1,45 200000 0,15 0,05 259,39 150 1 96 10,5 1074 8,5 745,5 0,5 49,5 0 12 LCI 95% 44,04 13,44 15,9 30,61 7608000 5,26 4,95 3630,63 9456 -0,96 -92,16 12,92 1176,96 38,84 3937,32 -0,48 -47,52 8 756,48 LCS 95% 47,96 17,36 22,69 36,28 8392000 5,84 5,15 4647,46 10044 2,96 284,16 54,08 5387,04 72,16 6859,68 1,48 146,52 8 803,52 144 -138,24 426,24 Anexo 4. Resultados de Hematología, grupo D (12 horas post inoculación con Clostridium chauvoei), cobayos (Cavia porcellus). n Hto % Hb g/dL HCM Picogramos CCMH % Eritrocitos μL Proteína Plasmática Proteína Sérica g/dL CK (UI/L) Leucocitos x mm3 Neutrófilos B. Relativo Neutrófilos B. Absoluto Neutrófilos S. Relativo Neutrófilos S. Absoluto Linfocitos Relativo Linfocitos Absoluto Eosinófilos Relativo Eosinófilos Absoluto Monocitos Relativo Monocitos Absoluto KC cells Relativo KC cells Absoluto 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 Promedio des. estándar 50,5 4,95 17,55 0,78 35,89 3,27 34,84 1,88 4920000 664680 5 0,28 4,4 0,14 4003,9 1767,15 3875 742 1 0 38,75 7,42 54,5 4,95 2130,25 596,44 42 4,24 1611,75 147,43 0,5 0,71 22 31,11 0,5 0,71 22 31,11 1,50 2,12 50,25 71,06 83 Mediana 50,5 17,55 35,89 34,84 4920000 5 4,4 4003,9 3875 1 38,75 54,5 2130,25 42 1611,75 0,5 22 0,5 22 1,50 50,25 EE 3,5 0,55 2,31 1,33 470000 0,2 0,1 1249,57 525 0 5,25 3,5 421,75 3 104,25 0,5 22 0,5 22 1,5 50,25 LCI 95% 43,64 16,47 31,36 32,25 3998800 4,61 4,2 1554,75 2846 1 28,46 47,64 1303,62 36,12 1407,42 -0,48 -21,12 -0,48 -21,12 -1,44 -48,24 LCS 95% 57,36 18,63 40,42 37,44 5841200 5,39 4,6 6453,04 4904 1 49,04 61,36 2956,88 47,88 1816,08 1,48 65,12 1,48 65,12 4,44 148,74 Anexo 5. Resultados de Hematología, grupo E (15 horas post inoculación con Clostridium chauvoei), cobayos (Cavia porcellus). n Hto % Hb g/dL HCM Picogramos CCMH % Eritrocitos μL Proteína Plasmática Proteína Sérica g/dL CK (UI/L) Leucocitos x mm3 Neutrófilos B. Relativo Neutrófilos B. Absoluto Neutrófilos S. Relativo Neutrófilos S. Absoluto Linfocitos Relativo Linfocitos Absoluto Eosinófilos Relativo Eosinófilos Absoluto Monocitos Relativo Monocitos Absoluto KC cells Relativo KC cells Absoluto 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 Promedio des. estándar 42,25 1,06 12,90 4,67 39,67 27,21 30,68 11,82 3725000 1378858 4,70 0,42 4,75 0,21 4473,55 1293,67 7850 3677 8,50 7,78 524,25 298,05 62,00 8,49 5023,00 2945,81 25,00 1,41 1988,50 1030,25 1,00 1,41 52,50 74,25 3,50 0,71 261,75 73,19 0 0 0 0 84 Mediana 42,25 12,9 39,67 30,68 3725000 4,7 4,75 4473,55 7850 8,5 524,25 62 5023 25 1988,5 1 52,5 3,5 261,75 0 0 EE 0,75 3,30 19,24 8,36 975000 0,30 0,15 914,76 2600 5,50 210,75 6,00 2083 1,00 728,50 1,00 52,50 0,5 51,75 0 0 LCI 95% 40,78 6,43 1,95 14,30 1814000 4,11 4,46 2680,62 2754 -2,28 111,18 50,24 940,32 23,04 560,64 -0,96 -50,40 2,52 160,32 0 0 LCS 95% 43,72 19,37 77,38 47,06 5636000 5,29 5,04 6266,48 15057 19,28 937,32 73,76 9105,68 26,96 3416,36 2,96 155,40 4,48 363,18 0 0 Anexo 6. Resultados de Hematología, grupo F (18 horas post inoculación con Clostridium chauvoei), cobayos (Cavia porcellus). n Hto % Hb g/dL HCM Picogramos CCMH % Eritrocitos μL Proteína Plasmática Proteína Sérica g/dL CK (UI/L) Leucocitos x mm3 Neutrófilos B. Relativo Neutrófilos B. Absoluto Neutrófilos S. Relativo Neutrófilos S. Absoluto Linfocitos Relativo Linfocitos Absoluto Eosinófilos Relativo Eosinófilos Absoluto Monocitos Relativo Monocitos Absoluto KC cells Relativo KC cells Absoluto 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 Promedio des. estándar 46 0 12,10 1,84 16,84 4,98 26,30 4,00 7345000 1081873 5,45 1,34 4,85 0,49 1821,28 87,43 5075 742 10,50 2,12 540,75 185,62 54,00 19,80 2814,00 1405,73 34,50 21,92 1669,50 856,31 1 0 50,75 7,42 0 0 0 0 0 0 0 0 85 Mediana 46 12,1 16,84 26,30 7345000 5,45 4,85 1821,28 5075 10,5 540,75 54 2814 34,5 1669,5 1 50,75 0 0 0 0 EE 0 1,30 3,52 2,83 765000 0,95 0,35 61,82 525 1,50 131,25 14,00 994 15,50 605,50 0 5,25 0 0 0 0 LCI 95% 46 9,55 9,93 20,77 5845600 3,59 4,16 1700,10 4046 7,56 283,5 26,56 865,76 4,12 482,72 1 40,46 0 0 0 0 LCS 95% 46 14,65 23,75 31,84 8844400 7,31 5,54 1942,45 6104 13,44 798 81,44 4762,24 64,88 2856,28 1 61,04 0 0 0 0 Anexo 7. Resultados de Hematología, grupo G (Control), cobayos (Cavia porcellus). n Hto % Hb g/dL HCM Picogramos CCMH % Eritrocitos μL Proteína Plasmática Proteína Sérica g/dL CK (UI/L) Leucocitos mm3 Neutrófilos B. Relativo Neutrófilos B. Absoluto Neutrófilos S. Relativo Neutrófilos S. Absoluto Linfocitos Relativo Linfocitos Absoluto Eosinófilos Relativo Eosinófilos Absoluto Monocitos Relativo Monocitos Absoluto KC cells Relativo KC cells Absoluto 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 Promedio des. estándar 40,75 5,21 12,87 1,89 25,80 8,75 31,82 4,50 5362500 1492427 5,40 0,55 5,28 0,48 4222,97 853,35 5813 3695 1,33 1,86 59,42 80,04 45,17 14,30 2939,45 3006,67 48,67 13,98 2599,47 1062,86 1,50 1,38 70,10 79,59 3,00 3,10 130,57 92,13 0 0 0 0 86 Mediana 42,75 13,05 22,11 32,80 5710000 5,35 5,3 4469,86 4750 1 42,5 42 1816,25 51 2601,65 1 47,5 2 115,45 0 0 EE 2,13 0,77 3,57 1,84 609281 0,23 0,20 348,38 1509 0,76 32,67 5,84 1227,47 5,71 433,91 0,56 32,49 1,26 37,61 0 0 LCI 95% 36,58 11,36 18,80 28,22 4168310 4,96 4,90 3540,15 2857 -0,16 -4,62 33,72 533,61 37,48 1749,00 0,40 6,42 0,52 56,85 0 0 LCS 95% 44,92 14,38 32,81 35,43 6556690 5,84 5,67 4905,79 8770 2,82 123,46 56,61 5345,29 59,85 3449,93 2,60 133,78 5,48 204,29 0 0 Anexo 8. Resultados estadísticos de la Temperatura de los cobayos (Cavia porcellus), inoculados con la cepa patógena de Clostridium chauvoei. Temperatura ºC n G A B C D E Control F 18 2 2 2 2 2 2 6 35,54 38 38,85 38,45 39,85 28,8 21 38,3 Des. estándar 6,75 0 0,35 0,78 0,21 11,03 1,41 0,58 Mediana 38,2 38 38,85 38,45 39,85 28,8 21 38,3 EE 1,59 0 0,25 0,55 0,15 7,8 1 0,24 LCI 95% 32,42 38 38,36 37,37 39,56 13,51 19,04 37,84 LCS 95% 38,66 38 39,34 39,53 40,14 44,09 22,96 38,76 Promedio p 0,0008 87 Anexo 9. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus). Marzo 11 de 2004 DENTIFICACIÓN Hora inóculo: Clostridium 8:00 a.m. chauvoei HORA DE SACRIFICIO MÚSCULO GRUPO BAZO DUODENO HÍGADO PÁNCREAS PULMÓN ESTRIADO CARDIACO Congestión, área de 01/01/2004 3 A Deplesión Infiltrado linfoide mononuclear consolidación con SCPA SCPA engrosamiento de septos alveolares. Neumonía Infiltrado mononuclear perivascular intersticial Infiltrado 01/02/2004 3 A Deplesión Infiltrado linfoide mononuclear Engrosamiento septos mononuclear periportal, SCPA degeneración Congestión, 3 G deplesión linfoidea Infiltrado mononuclear 88 Infiltrado mononuclear mononuclear, congestión, perivascular neumonía intersticial. centrolobulillar 01/03/2004 © alveolares, infiltrado Congestión, SCPA SCPA engrosamiento septos alveolares SCPA Anexo 10. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus). Marzo 11 de 2004 IDENTIFICACIÓN Hora inóculo: Clostridium 8:00 a.m. chauvoei HORA DE SACRIFICIO GRUPO MÚSCULO ESTRIADO ESQUELÉTICO A polimorfonuclear, separación fibras, Necrosis, congestión, infiltrado 01/01/2004 3 edema RIÑÓN CEREBRO ADRENAL Congestión cortical y Congestión, edema medular perivascular SCPA SCPA SCPA SCPA SCPA SCPA SCPA Necrosis de coagulación, infiltrado 01/02/2004 3 A polimorfonuclear, separación fibras, edema, hemorragia 01/03/2004 © 3 G Separación de fibras por edema 89 Anexo 11. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus). Marzo 11 de 2004 IDENTIFICACIÓN Hora inóculo: Clostridium 8:00 a.m. chauvoei HORA DE SACRIFICIO MÚSCULO GRUPO BAZO 6 B linfoide, congestión 02/02/2004 6 6 PÁNCREAS PULMÓN B SCPA G deplesión Engrosamiento Congestión, Infiltrado infiltrado mononuclear mononuclear septos SCPA alveolares, congestión, periportal hemorragia Congestión, Focos, Infiltrado infiltrado Engrosamiento eosinófilos mononuclear ESTRIADO SCPA de septos Congestión, infiltrado mononuclear perivascular Infiltrado mononuclear perivascular periportal alveolares Congestión Engrosamiento Congestión de septos moderada Focos, Congestión, 02/03/2004 © HÍGADO CARDIACO Deplesión 02/01/2004 DUODENO SCPA linfoidea ligera moderada SCPA alveolares, ligera 90 Anexo 12. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus). Marzo 11 de 2004 IDENTIFICACIÓN 02/01/2004 Hora inóculo: Clostridium 8:00 a.m. chauvoei HORA DE SACRIFICIO 6 GRUPO B MÚSCULO ESTRIADO ESQUELÉTICO RIÑÓN Hemorragia, separación de fibras por Congestión, edema, necrosis de coagulación, degeneración vacuolar infiltrado polimorfonuclear tubular CEREBRO ADRENAL Edema perivascular, infiltrado de mononucleares en SCPA meninges, congestión Congestión, separación de fibras por 02/02/2004 6 B edema, necrosis de coagulación, Congestión Congestión, edema hemorragia, infiltrado polimorfonuclear, corticomedular perivascular SCPA precipitación de calcio Separación de fibras por edema, 02/03/2004 © 6 G infiltrado polimorfonuclear ligero, precipitación de calcio 91 Congestión corticomedular ligera Congestión ligera SCPA Anexo 13. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus). Marzo 11 de 2004 IDENTIFICACIÓN 03/01/2004 Hora inóculo: Clostridium 8:00 a.m. chauvoei HORA DE SACRIFICIO 9 GRUPO C BAZO Congestión leve DUODENO Infiltrado mononucleares, leve HÍGADO PÁNCREAS PULMÓN 9 C Congestión moderada SCPA alveolares con infiltración Infiltrado mononuclear mononucleares, perivascular leve congestión Deplesión Infiltrado linfoidea leve mononuclear Congestión leve SCPA alveolares moderado con infiltrado mononuclear y congestión moderada 03/03/2004 © 9 G CARDIACO Engrosamiento septos Engrosamiento septos 03/02/2004 MÚSCULO ESTRIADO Congestión, Infiltrado deplesión mononuclear linfoidea ligera ligero infiltrado mononuclear periportal ligero 92 Engrosamiento Congestión ligera, SCPA generalizado de septos alveolares con focos de infiltrado mononuclear Congestión, infiltrado mononuclear perivascular, leve Congestión moderada e infiltrado perivascular mononuclear ligero Anexo 14. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus). Marzo 11 de 2004 IDENTIFICACIÓN Hora inóculo: Clostridium 8:00 a.m. chauvoei HORA DE SACRIFICIO GRUPO MÚSCULO ESTRIADO RIÑÓN CEREBRO necrosis coagulativa moderada, Congestión cortical y Edema perivascular, hemorragia leve, infiltrado medular leve congestión ESQUELÉTICO ADRENAL Separación de fibras por edema, 03/01/2004 9 C SCPA polimorfonuclear moderado Hemorragia, separación de fibras por 03/02/2004 9 C edema, necrosis de coagulación, infiltrado polimorfonuclear, presencia de bacterias bacilares basófilas Necrosis, congestión, infiltrado 03/03/2004 © 9 G polimorfonuclear, separación fibras, edema, ligero 93 Congestión corticomedular, foco de infiltrado mononuclear en médula Congestión cortical y medular moderada Congestión, edema perivascular ligero SCPA SCPA SCPA Anexo 15. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus). Marzo 11 de 2004 IDENTIFICACIÓN 04/01/2004 Hora inóculo: Clostridium 8:00 a.m. chauvoei HORA DE SACRIFICIO 12 GRUPO D BAZO Deplesión linfoidea ligera DUODENO Infiltrado mononucleares, leve 12 D SCPA PÁNCREAS infiltrado mononuclear mononuclear ligero Congestión moderada PULMÓN MÚSCULO ESTRIADO CARDIACO Congestión, área de Congestión ligera, consolidación con SCPA engrosamiento de septos Congestión leve alveolares. Neumonía periportal ligero Infiltrado 04/02/2004 HÍGADO intersticial Focos de consolidación , SCPA engrosamiento de septos Congestión ligera alveolares Engrosamiento 04/03/2004 © 12 G Deplesión Infiltrado linfoidea, mononuclear congestión ligero generalizado de septos Congestión leve SCPA alveolares con focos de infiltrado mononuclear, congestión moderada 94 Congestión leve Anexo 16. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus). Marzo 11 de 2004 IDENTIFICACIÓN Hora inóculo: Clostridium 8:00 a.m. chauvoei HORA DE SACRIFICIO GRUPO MÚSCULO ESTRIADO ESQUELÉTICO RIÑÓN CEREBRO ADRENAL Congestión ligera SCPA Separación de fibras por edema, 04/01/2004 12 D necrosis coagulativa moderada, Congestión cortical y congestión moderada, infiltrado medular leve, infiltrado polimorfonuclear severo con mononuclear subepitelial en presencia de abundantes bacterias y pelvis áreas de precipitados de calcio Congestión moderad y hemorragia ligera. Infiltrado polimorfonucleares 04/02/2004 12 D con presencia de bacterias, separación de fibras y necrosis Congestión corticomedular, severa Congestión moderada con edema SCPA perivascular ligero coagulativa Necrosis, congestión, infiltrado 04/03/2004 © 12 G polimorfonuclear, separación fibras, edema, ligero 95 SCPA Congestión ligera SCPA Anexo 17. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus). Marzo 11 de 2004 IDENTIFICACIÓN Hora inóculo: Clostridium 8:00 a.m. chauvoei HORA DE SACRIFICIO MÚSCULO GRUPO BAZO DUODENO HÍGADO PÁNCREAS PULMÓN ESTRIADO CARDIACO Congestión, área de Congestión ligera 05/01/2004 15 E y presencia de hemosiderófagos consolidación con Infiltrado Congestión mononuclear moderada SCPA Congestión moderada engrosamiento de e infiltrado septos alveolares. perivascular Neumonía intersticial, mononuclear ligero moderado Infiltrado 05/02/2004 15 E Congestión ligera Infiltrado y presencia de mononuclear hemosiderófagos ligero periportal mononuclear ligero y Congestión ligera SCPA engrosamiento de infiltrados septos alveolares mononucleares Congestión perivasculares ligeros ligera Engrosamiento Infiltrado 05/03/2004 © 15 G Deplesión mononuclear linfoidea en submucosa ligero generalizado de Infiltrado mononuclear periportal, ligero SCPA septos alveolares con focos de infiltrado mononuclear, congestión moderada 96 SCPA Anexo 18. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus). Marzo 11 de 2004 IDENTIFICACIÓN Hora inóculo: Clostridium 8:00 a.m. chauvoei HORA DE SACRIFICIO GRUPO MÚSCULO ESTRIADO ESQUELÉTICO Separación de fibras por edema, 05/01/2004 15 E necrosis de coagulación, infiltrado polimorfonuclear, mononucleares RIÑÓN 15 E medular moderada, Edema perivascular infiltrado mononuclear ligero, área gliosis 15 G polimorfonucleares con presencia Congestión corticomedular, de bacterias, separación de fibras y ligera Necrosis coagulación 97 SCPA perivascular necrosis coagulativa 05/03/2004 © ADRENAL Congestión cortical y Congestión modera, Infiltrado 05/02/2004 CEREBRO Congestión ligera Congestión ligera, edema perivascular ligero Congestión ligera Hemorragia severa SCPA Anexo 19. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus). Marzo 11 de 2004 IDENTIFICACIÓN Hora inóculo: Clostridium 8:00 a.m. chauvoei HORA DE SACRIFICIO MÚSCULO GRUPO BAZO DUODENO 18 F F 18 G infiltrado perivascular congestión ligera alveolares. Edema ligero mononuclear ligero Congestión, Congestión, área de mononuclear mononuclear periportal ligero y moderada, Infiltrado deplesión mononuclear y linfoide polimorfonuclear infiltrado mononuclear SCPA SCPA Infiltrado Infiltrado linfoidea ligera, mononuclear en mononuclear congestión submucosa periportal, ligera ligero congestión ligera consolidación con engrosamiento de septos alveolares. Edema ligero periportal Deplesión 98 Congestión ligera e consolidación con Infiltrado deplesión moderada 06/03/2004 © ESTRIADO engrosamiento de septos moderada, Congestión 18 PULMÓN Congestión, área de Infiltrado linfoide severa 06/02/2004 PÁNCREAS CARDIACO Congestión 06/01/2004 HÍGADO Congestión moderada e infiltrado perivascular mononuclear ligero Engrosamiento generalizado de septos SCPA alveolares con focos de infiltrado mononuclear, congestión moderada SCPA Anexo 20. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus). Marzo 11 de 2004 IDENTIFICACIÓN Hora inóculo: Clostridium 8:00 a.m. chauvoei HORA DE SACRIFICIO GRUPO MÚSCULO ESTRIADO ESQUELÉTICO Separación de fibras por edema, 06/01/2004 18 F RIÑÓN 18 F necrosis de coagulación, infiltrado medular moderada, polimorfonuclear, mononucleares, degeneración vacuolar de bacterias bacilares basófilas, severo túbulos ligera necrosis de coagulación, infiltrado Congestión cortical y polimorfonuclear, mononucleares, medular ligera bacterias bacilares basófilas, severo 06/03/2004 © 18 G Ligero infiltrado polimorfonuclear 99 ADRENAL Congestión SCPA Congestión cortical y Separación de fibras por edema, 06/02/2004 CEREBRO Congestión corticomedular ligera Congestión ligera, infiltrado mononuclear SCPA en meninges Congestión ligera SCPA Anexo 21. Resultados estadísticos de la calificación de lesiones histopatológicas en tejido de Cavia porcellus inoculados con la cepa patógena de Clostridium chauvoei Tejido Mean Std. dev. Min Max p Bazo 1,11 0,68 0 3 0,06 Duodeno 0,89 0,76 0 2 0,08 Hígado 1,06 0,64 0 2 0,19 Páncreas 0,00 0,00 Pulmón 2,00 0,69 1 3 0,81 MEC 0,94 0,73 0 2 0,09 MEE 1,61 0,85 0 3 0,00 Riñón 1,17 0,79 0 3 0,48 Cerebro 0,89 0,47 0 2 0,40 Adrenal 0,11 0,47 0 2 0,23 P = Nivel de significancía; MEC: Músculo estriado cardiaco; MEE: Músculo estriado esquelético; © = Grupos testigo inoculados con Cloruro de Calcio. 100
