"la autofagia en la degradacion de antigenos" trabajo recepcional

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE BIOANALISIS
REGION XALAPA
"LA AUTOFAGIA EN LA
DEGRADACION DE ANTIGENOS"
TRABAJO RECEPCIONAL
MODALIDAD
MONOGRAFIA
PRESENTA:
KARIS CRISTINA LLERA GUEVARA
DIRECTOR:
DR. H&CTOR VIVANCO CID
ASESOR TECNICO:
DR. ENRIQUE JUAREZ AGUILAR
XALAPA, VER.
ENERO DE 2008
INDICE
PAGINA
RESUMEN
1
INTR0DUCCI6N
2
OBJETIVO GENERAL Y OBJETIVOS ESPECIFICOS
3
CAPI'TULO I
SISTEMAINMUNEINNATO Y ADQUIRIDO.
1.1 Inmunidad Innata
1.2 Inmunidad Adquirida
1.3 Internalizaci6n y procesamiento de antfgenos para su presentaci6n a trav6s de
MHC Clase II.
1.4 Procesamiento de antfgenos para su presentacidn a trav6s de MHC Clase I.
1.5 Procesamiento de antfgenos para su presentaci6n a trav£s de Mol6culas CD1.
9
10
14
CAPfTULO II
ASPECTOS GENERALES DEL FEN&MENO DE AUTOFAGIA
2.1 Definici6n de Autofagia.
2.2 Importancia biol6gica en diferentes tipos celulares.
2.3 Tipos de Autofagia.
23
23
24
24
CAPiTULO III
LA AUTOFAGIA Y SU IMPORTANCIA EN LA GENERACI6N DE RESPUESTA
INMUNE
3.1 Papel de la Autofagia en la Inmunidad Innata.
3.1.1 Autofagia en la defensa inmune innata a virus y del mecanismo de Autofagia.
3.2 Papel de la Autofagia en la Inmunidad Especffica.
3.2.1 Entendiendo el principio de compartimentalizacibn durante el procesamiento y
presentacidn de antfgenos.
3.2.2 Autofagia como mecanismo celular que provee antfgenos citosdlicos para su
presentacidn no ctesica por mol6culas del MHC clase II.
3.2.3 Mecanismos de seftalizaci6n que regulan el mecanismo de Autofagia.
4
4
6
32
32
36
38
38
40
42
CONCLUSIONES
44
GLOSARIO
45
REFERENCES BIBLIOGRAFICAS
50
RESUMEN
El termino "Autofagia" define al proceso celular que se lieva a cabo en
diferentes pobtaciones celulares y en donde componentes citos6licos son
degradados hasta sus constituyentes primarios mediante enzimas lisosomales.
La Autofagia incluye la degradaci6n de las protefnas solubles en el citosol, pero
tambi6n de organelos tales como mitocondrias o peroxisomas. La Autofagia
tambi6n se relaciona como una funcidn protectora. Cuando hay un dafio
celular, se activa este proceso eliminando la c6lula dafiada del tejido o los
componentes celulares defectuosos.
En la actualidad se ha resaltado el rol que desempefta la Autofagia y su
relacibn con la defensa inmunol6gica ya que participa en la defensa contra los
patdgenos intra y extracelulares llevando a cabo el secuestro, la degradaci6n y
eliminaci6n de patbgenos bacterianos y protozoarios. En algunos casos, el
mecanismo de Autofagia es utilizado por patdgenos para infectar y crecer
dentro de las c6lulas hu6sped, pero en otros casos la Autofagia puede
funcionar como mecanismo de protecci6n contra la infecci6n. En el caso
particular de las infecciones virales, se ha comenzado a conocer mds acerca
de c6mo el mecanismo de autofagia contribuye a potenciar la respuesta
inmune a este particular grupo de agentes pat6genos ya que el mecanismo de
autofagia, es responsable de preparar el compartimento citos6lico y de esta
forma componentes virales, tales como RNA de cadena sencilla o cadena
dobie, DNA viral o proteinas virales, son atrapados y dirigidos hacia
compartimentos endociticos de la cglula hu6sped.
Oiversos estudios han demostrado que la Autofagia potencia la
inmunidad innata y las respuestas adaptativas, en paralelo, algunas mol6culas
efectoras del sistema inmune tales como citocinas, receptores y f us ligandos
celulares que participan en la inmunidad innata y adaptativa, tambten regulan el
proceso de autofagia en un mecanismo de retroalimentacidn. En general, existe
una correlacidn entre la activaci6n de autofagia por mediadores inmunol6gicos
y el control de la infieccton con pat6genos intracelulares.
INTR0DUCCI6N
La Autofagia o autofagocitosis es un proceso celular natural que tiene
lugar en el interior de las c£lulas de manera normal. Consiste en la digestibn y
degradacibn de aquellas partes de la c6lula que ya estdn envejecidas, y que
han de ser sustituidas por otras nuevas. La Autofagia tiene lugar en las c6lulas
de cualquier organismo vivo, cuando la c6lula carece de nutrientes o bien es
sujeta a condiciones de "estrGs" celular, aumenta la tasa de Autofagia y la
c6lula obtiene energia de si misma. La Autofagia es un mecanismo involucrado
en diferentes tipos celulares en eucariontes.
El estudio de este proceso celular ha cobrado gran interns en los Oltimos
aftos, al demostrarse que su participaci6n o bien la carencia de esta, impacta
en la homeostasis celular, incluyendo otros procesos tales como muerte celular
programada, en el desarrollo y la diferenciacidn celular, as! como en la
senectud celular. Oe la misma forma, se ha estudiado y caracterizado la
participaci6n del fendmeno de autofagia en patologlas severas como el cancer,
enfermedades neurodegenerativas y miopatfas.
Una de las areas que esten siendo exploradas en la actualidad con gran
auge, es la
participaci6n de la Autofagia en el contexto de defensa
inmunoi6gica. En el presente trabajo se abordan los aspectos mds relevantes
del fen6meno de autofagia, incluyendo aspectos generales del fendmeno y
enfocando la participacidn de este proceso celular dentro del sistema
inmunoldgico de un hospedero, principalmente en el procesamiento y la
presentaci6n de antlgenos.
OBJETIVO GENERAL
El presente trabajo tiene como finalidad exponer la importancia sobre el
fendmeno de Autofagia y su relaci6n especifica con el sistema inmunoldgico.
OBJETIVOS ESPECiFICOS
•
Resaltar el papel que desempefla la autofagia en la defensa de un
hospedero.
•
Resumir la relaci6n de este proceso celular con el procesamiento y
presentacidn de antfgenos que llevan a cabo c6iulas del sistema
inmunol6gico.
•
Abordar los mecanismos de supresi6n de la Autofagia que emplean
ciertos microorganismos para favorecer la infecci6n viral o la
supervivencia bacteriana en eventos de infeccidn.
•
Aportar material bibiiogrdfico de consulta sobre el tema para la
actualizaci6n de profesionales relacionados al campo de la salud, asf
como catedr£ticos relacionados con las materias de Inmunologfa,
biologfa celular y molecular.
CAPlTULO I
SISTEMA INMUNE INNATO Y ADQUIRIDO
1.1 INMUNIDAD INNATA
El sistema inmune innato participa de manera relevante durante los
primeros momentos de exposici6n a un antfgeno, a trav6s de la inducci6n de
una respuesta inflamatoria, proceso que se genera principalmente a trav6s de
la participaci6n coordinada de los siguientes componentes:
1) Barreras ffsicas y qufmicas, (epitelios) y las sustancias antimicrobianas
sintetizadas en estas superficies.
2) C6lulas fagocfticas como Neutr6filos y Macr6fagos.
3) C6lulas no fagocfticas como c6lulas asesinas naturales (C6lulas NK),
C6lulas cebadas (o mastocitos) y eosinbfilos.
4) Protefnas presentes en la sangre, que incluyen componentes del sistema del
Complemento y otros mediadores de la inflamaci6n que son producidos al inicio
de un evento de infecci6n (protefnas de fase aguda).
5) Protefnas que son producidas por c£lulas del sistema innato que reciben el
nombre gen£rico de citocinas, las cuales regulan y coordinan numerosas
actividades de las c6lulas de la inmunidad innata e influyen de manera
determinante sobre c6lulas del sistema inmune adquirido.
La visidn modema, considera a este sistema no s6lo como un conjunto
de mecanismos inespecfficos de defensa, sino como el elemento crftico para el
inicio de una respuesta inmune especflica e incluso como elemento clave que
influencfa el tipo de respuesta adquirida que se general durante una infecci6n
o bien durante la exposici6n a un antfgeno de naturaleza no infecciosa.
1,2
El primer reto del sistema inmune innato es discriminar entre un gran numero
de molgculas presentes en patbgenos potenciales y componentes propios del
hospedero, usando para este fin, receptores celulares o protefnas solubles
denominados receptores de reconocimiento de patrones (PRRs). Existen
protefnas con caracterfsticas de PRRs, involucradas en diferentes procesos
tales como endocitosis mediada por receptor, fagocitosis, activacibn y sfntesis
de mediadores inflamatorios, como lo son: Lectinas tipo C (tales como lectina
que une manosa o MBL, DEC-205, receptor de manosa), receptores para
detritus celulares o "scavenger", Pentrexinas (protefna C reactiva y protefna
s&ica amiloide, tambi6n conocidas como protefnas de fase aguda), tranferasas
de Ifpidos: como la protelna que une al lipopolisacdrido (LBP), protefna
bactericida potenciadora de la permeabilidad (BPIP), integrinas (CD11b,
CD11c, CD18), CD14 y una de las familias de receptores m£s estudiada y de
mayor importancia en los ultimos afios: la familia de los receptores hom6logos
a Toll (TLRs). Estos receptores se localizan en la superficie de las c6lulas del
sistema inmune del hospedero y reconocen en los microorganismos patdgenos,
una serie de mol6culas de naturaleza piincipalmente lipopolisacarfdica o
protefca las cuales se denominan "Patrones Moleculares Asociados a
Pat6genos" (PAMPs). Estos PAMPs son estructuras sujetas a poca variabilidad
y ser diferentes a los componentes propios, con lo cual se constituyen como
excelentes blancos de la respuesta inmune, como lo son el lipopolisaccirido
(LPS) de las bacterias Gram-negativas, los gcidos lipoteicoicos (LT) y
peptidoglicana (PGN) de bacterias Gram-positivas, lipoarabinomananas de
Mycobacterias (LAM), Lipopeptidofosfoglicana (LPG) de Entamoeba histolytica
entre otros.
Los PAMPs al ser reconocidos por los PRRs expresados en las c6lulas
efectoras, inducer) mecanismos que llevan a la respuesta inmune innata a
poner en alerta al hospedero con respecto a la presencia de agentes
pat6genos, induciendo la expresi6n de una serie de citocinas de tipo
proinflamatorio, como lnterleucina-1J3 (IL-1(3), Interleucina 6 (IL-6), Factor
Estimulante de Colonias de Granulocitos-Macr6fagos (GM-CSF), Factor de
Necrosis Tumoral-a (TNF-a)(11) e lnterleucina-12 (IL-12), asf como quimiocinas
tales como IL-8, Rantes, MIP-1a y MIPip y mol6culas de adhesi6n celular. La
producci6n de estos mediadores inflamatorios es de vital importancia para el
reclutamiento de m&s c6lulas al sitio de infecci6n (piincipalmente neutrdfilos y
macr6fagos), asf como para dar inicio a una respuesta inmune de tipo
especffico.1,2
Interrelacidn de la respuesta inmune innata y especffica ante un evento de
infeccidn
Muchos microorganismos pat6genos han evolucionado de tal forma que
logran
resistir los mecanismos de la inmunidad innata, de modo que su
eliminacidn requiere los potentes mecanismos de la inmunidad adquirida. Las
respuestas inmunitarias adquiridas utilizan muchos de los mecanismos
efectores de la inmunidad innata para eliminar los microorganismos y suelen
actuar aumentando la actividad antimicrobiana de los mecanismos de defensa
de la inmunidad innata. El inicio y desarrollo de las respuestas inmunitarias
adquiridas requieren que los antfgenos sean capturados, degradados
(procesados) y expuestos a linfocitos especfficos, siendo este proceso
conocido como
P R O C E S A M I E N T O Y P R E S E N T A C I O N D E ANTLGENOS. ES
aquf en donde el presente trabajo pretende enfocarse a mayor detalle y
ligar este concepto con el proceso de
AUTOFAGIA.
Las c6lulas especializadas que desempeftan la funci6n de procesar y
presentar antfgenos, reciben el nombre de C6lulas Presentadoras de Antfgenos
(CPAs que son C6lulas Dendrfticas, macr6fagos y linfocitos B). Las C6lulas
Dendriticas, resultan ser las mds eficientes CPAs que capturan los antfgenos
microbianos y los transportan a los 6rganos linfeticos, en donde los presentan a
los linfocitos T. Ademds de que son la unica poblaci6n celular capaz de
estimular la respuesta de linfocitos T que nunca han visto el antfgeno para el
cual son especfficos, es decir a los linfocitos T vfrgenes (del t6rmino en ingl6s
Naive).SA
1.2 INMUNIDAD ADQUIRIDA
El sistema inmune adquirido es capaz de reconocer y reaccionar frente a
un gran numero de sustancias microbianas y no microbianas. Ademds tiene
una
extraordinaria
capacidad
para
distinguir
entre
moteculas
y
microorganismos diferentes, incluso muy relacionados y, por esta raz6n,
tambi£n se denomina inmunidad especffica. Existen dos tipos de respuestas
inmunitarias adquiridas, denominadas inmunidad humoral e inmunidad celular,
cuya funcibn es eliminar distintos tipos de antfgenos.
Tipo celular
C6lulas
Dendrfticas (CD)
Macrbfagos
Linfocitos B
Mol6culas de
clase I de MHC
Expresi6n
constitutiva.
Aumenta en
forma marcada
en CD maduras.
Moteculas
coestimulatorias
Expresi6n
constitutiva (baja).
Aumenta en forma
marcada en CD
maduras.
Expresidn
constitutiva
(baja).
Aumenta en
macr6fagos
activados.
Expresi6n
constitutiva
(baja).
Aumenta en
linfocitos B
activados.
Expresidn
constitutiva (muy
baja).
Aumenta en
macrdfagos
activados.
Expresidn
constitutiva (baja).
Aumenta en
linfocitos B
activados.
Funcibn como CPA
Activaci6n de c£lulas T
Naive e inicio de la
respuesta inmune
primaria. Activaci6n de
c6luias T efectoras y de
memoria e induccibn de
la respuesta inmune
secundaria.
Activaci6n de c^lulas T
efectoras y de memoria
e induccibn de la
respuesta inmune
secundaria.
Activaci6n de c£lulas T
efectoras y de memoria
e induccibn de la
respuesta inmune
secundaria.
Tabla N° 1: Propiedades de las CPAs profesionales. (Reguelro-Gonzdlez, 2004)
Inmunidad Humoral
Estd mediada por anticuerpos presentes en la sangre y las secreciones
mucosas, que son producidas por linfocitos B, los cuales, reconocen los
antfgenos extracelulares (incluidos los de la superficie celular) y se diferencian
en c£lulas productoras de anticuerpos denominadas c6lulas plasmdticas.4,6
Inmunidad Celular
Este mediada por los linfocitos T, favorece la destrucci6n de los
microorganismos que residen y proliferan en los fagocitos o de las c6lulas
infectadas con el fin de eliminar los reservorios de la infeccidn. Los linfocitos T
se dividen en linfocitos T cooperadores (CD4) y linfocitos T citot6xicos (CD8).
En respuesta a la estimulacidn antigGnica, los linfocitos T cooperadores
sintetizan protefnas denominadas citocinas, cuya funci6n es estimular la
proliferacidn, activacidn y la diferenciaci6n de los linfocitos T y de otras c6lulas.
Los Linfocitos T citot6xicos destruyen las c6lulas que producen antfgenos
extrafios, (como virus y otros microorganismos intracelulares), asf como c6lulas
tumorales. Los linfocitos T s6lo reconocen antfgenos que se unen a protefnas
del hu6sped que est£n codificadas por genes del Complejo Principal de
Histocompatibilidad (MHC por sus siglas en ingles), que se expresan en la
superficie de las CPAs iniciando una respuesta celular.
En la actualidad, ademds de conocer los mecanismos para la
presentacibn y generaci6n de respuestas a pgptidos, conocemos tambten la
participaci6n de un tercer sistema de presentacidn antig6nica, el cual permite la
respuesta de linfocitos T y de otras poblaciones tales como c6lulas NKT y
c6lulas T y8 (los cuales reconocen y lisan c6lulas infectadas por virus de
manera adaptativa) no s6lo para antlgenos de naturaleza proteica, sino
tambidn para el reconocimiento especlfico de Ifpidos y glucolfpidos en el
contexto de molgculas CD1 (Cluster o grupo de diferenciacibn 1). Las
molGculas del MHC clase II son capaces de unir y presenter antfgenos de
naturaleza polisacarfdica para la inducci6n de respuestas celulares a este tipo
de mol6culas; descubrimiento que rompi6 con el dogma de que sdlo
fragmentos de protefnas (p6ptidos) pueden ser presentados a trav6s de
moteculas del MHC clase II. 4'6
En lo que se refiere al sistema de presentaci6n a trav6s de C01,
actualmente se conoce que constituye en si una familia de mol6culas cuyos
genes esten localizados fuera de la regi6n que codifica para las mol6culas del
MHC. En el humano existen 5 genes que codifican para diferentes isoformas de
CD1. Estos genes, se iocalizan en el cromosoma 1 y no presentan gran
polimorfismo. De los 5 genes CD1 en el humano, cuatro de ellos se expresan
como protefnas funcionales y son designados como CD1a, CD1b, CD1c y
CD1d. En el caso de CD1 existen mOltiples formas alternativas que se generan
por un mecanismo de "splicing" alternativo del RNA y que se Iocalizan
intracelularmente. Este grupo de genes surgi6 de la duplicacibn de un locus
ancestral que dio oiigen ademds de esta familia, a las mol6culas del MHC
clase I.
1.3 INTERNALIZACI6N Y PROCESAMIENTO DE ANTfGENOS PARA SU
PRESENTACI6N A TRAVltS DEL MHC CLASE II
Existen protefnas que son parte de un microorganismo o de algun
antfgeno de naturaleza no infecciosa que pueden ser engullidas mediante un
mecanismo de internalizaci6n celular, esto sucede con veslculas endosomales
membranosas, donde posteriormente serdn degradadas gradualmente al ser
expuestas a un pH dcido y enzfmas proteollticas celulares. Aun cuando la
estructura completa de cada protefna finalmente se destruye, se producen
muchos pSptidos cuyas longitudes y secuencias varfan de acuerdo con la
secuencia de la protelna original, la especificidad de la rotura de los enlaces
determinada por las proteinasas que actuan sobre ellos, su conformati6n
plegada y su accesibilidad para ser degradados, entre otros factores.
La gran mayorfa de las moteculas de clase II se asocia en el retfculo
endopldsmico con una tercera protefna conocida como cadena invariante (no
presenta polimorfismo), la cual acompaffard a las moteculas de clase II con una
doble misi6n: bloquear el sitio de uni6n del p6ptido y retener el complejo dentro
de la c6lula, desviSndolo hacia la ruta endocftica.6 A continuaci6n en la figura
ntimero 1, se ilustra las diferentes regiones de la mol6cula del MHC clase II.
Figura N° 1: Las mol6culas de clase II estdn compuestas de una cadena alfa polimorfa y una
cadena (3. (Abbas ,2004).
En la ruta endocftica las moteculas de clase II aparecen en
compartimentos celulares especiales denominados MIIC (compartment peptide
loading o compartimento de carga de p6ptido) los cuales contienen protefnas
extracelulares y presenta un pH dcido con alta actividad proteolftica. En estos
compartimentos la mayoria de la cadena invariante esta ya degradada y
solamente permanece unido a las mol6culas de clase II un segmento de
cadena invariante, un pequefto p£ptido denominado CLIP (por p6ptido de
cadena invariable relacionado con la clase II) y que ocupa precisamente la
hendidura de uni6n del pgptido. Este p6ptido es extraldo de esa hendidura para
ser reemplazado por los distintos p6ptidos endosomales que serdn
transportados por las moteculas del MHC de clase II al exterior de la c£lula.
Para este intercambio de CLIP por otros p6ptidos se requiere la acci6n de la
motecula HLA-DM, un heterodfmero
formado por dos cadenas a y p. Su
funcidn es la Iiberaci6n de CLIP de las mol6culas MHC de clase II cuando
6stas se Iocalizan en el endosoma actuando como una enzima que cataliza
esta reacci6n. Los complejos de clase II forman entonces agregados y estdn
listos para recibir pgptidos. Algunos p6ptidos generados en el citoplasma
pueden unirse a las moteculas de dase II en el CPL. El mecanismo por el cual
estos pgptidos llegan hasta el compartimento MHC II es desconocido, aunque y
a la inversa: de manera excepcional (y s6lo en macr6fagos y c6lulas
dendrfticas) los endosomas dejan escapar pgptidos al citoplasma, desde donde
pueden llegar a la ruta de MHC clase I. A esta presentacidn por la ruta de clase
I de pGptidos adquiridos extracelularmente se le llama presentacidn cruzada.6,7
1.3 PROCESAMIENTO DE ANTfGENOS PARA SU PRESENTACI6N A
TRAVIS DE MHC CLASE I
Las protefnas antig6nicas tambi6n pueden derivar de patdgenos
intracelulares como los virus, y algunas bacterias (Chlamydia, Shigella,
Rickettsia y Listeria) y par&sitos (Toxoplasma). Los antfgenos provenientes de
6stos se procesan mediante una secuencia de eventos que participan en el
metabolismo normal de las protefnas. La degradaci6n protefnica es en el citosol
dentro de grandes complejos de multisubunidades enzimdticas (proteasomas)
los cuales llevan a cabo la degradaci6n de protefnas citos6licas que se
encuentran dafiadas, que fueron plegadas de manera incorrecta, o bien,
marcadas para su destruccibn o reciclaje rdpido POR UBIQUITINAClON y
tambidn protefnas derivadas de pat6genos intracelulares. Algunos de 6stos
pgptidos despu6s se relacionan con protefnas del MHC clase I y son liberados
a la superficie celular para presentarse ante los linfocitos T CD8.
Caracterfstlca
Vfa endocftica
Vfa citosdlica
Protefnas extracelulares
sometidas a endocitosis
(del hospedero y
extraftas). Protefnas de
membrana (del
hospedero y extraftas).
Protefnas citos6licas del
hospedero o de
pat6genos intracelulares
(virales, bacterianas,
parasitarias).
P6ptidos de seftal (del
hospedero y extrafios).
Maquinaria para
procesamiento
Enzimas lisosomales.
Proteasomas (incluyendo
protefnas de bajo peso
molecular).
Tipos celulares donde
se activa.
CPA profesionales.
Todas las c£lulas
nucleadas.
Sitio de unidn antigenoMHC.
Vesfculas, lisosomas
COMPARTIMENTOS
endocfticos TARDfOS.
Retfculo endopldsmico
rugoso.
MHC utilizado.
Clase II
Clase 1
Presenta a
C6lulas T CD4
(cooperadoras)
C6lulas T CD 8
(citotdxicas).
Fuentes principales de
antfgenos.
Tabla N° 2: Resumen de las Vfas de procesamiento de antigenos. (Goldsby RA, 2006).
Aunque
las vlas
de degradaci6n
citos6lica
y
endocftica
son
independientes, algunos pat6genos se procesan a trav6s de ambas; por
ejemplo, el contenido de las vesfculas endocfticas pocas veces se libera hacia
el citosol (quizes por medio de la lisis de la membrana de las veslculas) en un
fen6meno denominado presentacidn cruzada del termino "Cross Priming", el
cual transfiere antfgenos potenciales de la vfa endocftica a la citos6lica. Por el
contrario, las protefnas codificadas a partir del genoma viral que se integran a
membranas celulares (por ejemplo; las glucoprotelnas de superficie de virus
con envoltura) son canalizadas a las membranas de las veslculas endocfticas y
consignadas a la vfa endocftica. En el presents trabajo se aborda a
profundidad el mecanismo de autofagia, en el cual material citos6lico
puede ser dirigido a la via endocftica, para la generacidn de respuestas
mediadas a trav6s del MHC clase II. Esta via se describird a detalle en el
capitulo 3.
Las moldculas de clase I son "cargadas" con pgptidos en el retlculo
endopl£smico, justo despubs de su biosfntesis. Para introducirse en el retlculo
endoptesmico necesitan de las protefnas TAP (transportadores asociados con
el procesamiento de antfgenos). Estas son codificadas por dos genes
localizados dentro de la regidn del MHC de clase II (TAP 1 y TAP 2), son
miembros de la familia de protefnas transportadoras, las cuales son capaces de
transportar activamente mol6culas, incluidos pequeflos p6ptidos, a trav6s de
las membranas del retfculo endoptesmico. TAP 1 y TAP 2 se asocian para
formar dimeros cuya funci6n consiste en transportar los pgptidos generados en
el citosol hacia el interior del retfculo endoplasmic*).
Tapasina es una tercera motecula que actua de puente uniendo el
heterodfmero TAP a las moteculas de clase I, para facilitar la carga de
pgptidos. Cuando el p6ptido entra en el retfculo endopldsmico los dfmeros de
clase I "vacfos" reci6n formados permanecen unidos al complejo TAP, el
p6ptido se fija a los sitios de la mol6cula de clase I. A continuaci6n el complejo
P6ptido-clase I se libera de la tapasina y puede salir del retfculo endopldsmico
y transportarse a la superficie celular.
Los genes LMP2 y LMP7 (large multifunctional proteasome o gran
proteasoma multifuncional), que estan tambten localizados en la regi6n de
clase II, codifican sendas protefnas que, a su vez, forman parte de un gran
complejo polipeptldico denominado proteasoma. Este complejo es el
responsable de llevar a cabo la mayor parte de toda la actividad proteolftica
que se detecta en el citoplasma. Se cree que gran parte de los p6ptidos que
mets tarde se unirdn a las molbculas de dase I, son generados predsamente
por la actividad de este proteasoma.6,7
Como se observa en la figura numero dos las mol6culas de clase I
constan de dos cadenas polipeptfdicas unidas de forma no covalente: una
cadena alfa codificada por el MHC de 44 kD y una subunidad no codificada la
p-2 microglobulina para fijarse a p6ptidos de 8-11 aminodddos con
conformaddn extendida y flexible.
Las molGculas de clase I que no se plieguen adecuadamente, que no
sean capaces de interaccionar de forma correcta con 0-2microglobulina o que
no lleven su cargamento correspondiente de pdptido, son retenidas dentro del
retlculo endoptesmico por la acci6n de la calnexina, y, posteriormente,
degradadas. Estos procesos de degradaci6n, transporte y carga de p6ptidos en
las moteculas de clase I se estdn produciendo de forma constante durante la
vida de una c6lula. La funci6n de las mol6culas del MHC de clase I es pues
mostrar o sacar hasta la membrana celular una seleccidn suficientemente
amplia de p6ptidos de todas las protefnas que estcin siendo sintetizadas por
una determinada celula para que los linfocitos T puedan detectar antfgenos de
patdgenos o antfgenos tumorales que se generan en forma intracelular. **10
i
i
1.5 PROCESAMIENTO DE ANTFGENOS PARA SU PRESENTACI6N A
TRAVIS DE MOL£CULAS CD1
En el humano las isoformas de CD1 se dividen en 2 grupos en base a su
homologla a nivel de amino£cidos. El grupo I incluye a CD1a, CD1b, CD1c; el
grupo II incluye a CD1d, mientras que CD1e no ha sido clasificado a la fecha.
Especies tales como el rat6n y rata, carecen de los genes del grupo I y
presentan dos genes CD1 con una homologla entre si del 90 al 95%, siendo
clasificados como homdlogos de CD1D humano y reciben el nombre de CD1.1
y CD1.2 11'14. Estudios de estructura cristalogr£fica han sido reportados para
las mol£culas CD1d del ratdn, as! como las isoformas CD1a y CD1b en el
humano.16"18
Estas
mol6culas,
son
en
general,
glucoprotelnas
transmembranales tipo I y esten constituidas por una cadena alfa, que se
divide en tres dominios extracetulares (a1, a2 y a3), asociada a (3-2
microglobulina de manera no covalente, presentando gran similitud con las
molGculas de clase I del MHC.
La asociaci6n de la cadena a, con p-2
microglobulina es necesaria para la expresi6n en superficie de CD1, influyendo
en su correcto plegamiento y por lo tanto estabilizando la estructura para su
adecuada funcidn. Los dominios a1 y a2 forman un surco en donde se aloja el
antlgeno; este surco es mds estrecho y m^s profundo que el presente en las
molgculas de clase I. El surco este constitui'do principalmente por amino£cidos
no cargados, de naturaleza altamente hidrofdbica. CD1d en el rat6n y CD 1a en
el humano, presentan dos sitios de uni6n (pockets) denominados A' y F',
mientras que la isoforma CD1b humana, presenta 4
(figura numero 3)
(pockets A', C', F' y T'). El sitio de uni6n para antlgeno es incapaz de formar
puentes de hidrdgeno con su ligando (como en el caso de moteculas del MHC
clase I), debido a la naturaleza del mismo, que s6lo permite interacciones de
tipo hidrof6bico. La presencia de cadenas de dcidos grasos en antlgenos de
naturaleza glucolipldica favorece su uni6n al surco altamente hidrof6bico de las
moteculas CD1, especlficamente a los sitios de uni6n A' y F', en tanto que la
porcidn hidrofflica del antlgeno se proyecta hacia el exterior, para ser
reconocida por el receptor de la c£lula T.
CDld
(RAT6N)
CDla
(HUMANO)
«1
tt 2
V
A
i
CDlb
(HUMANO)
Figura N° 3:
Estructura de las isoformas: CD1d (murino). (Zeng Z, et al.1997). CD1a ( Z a j o n c
et al. 2003).
y CD1 b humanas(Batuwangala T et al, 2004).
Distribuci6n celular e intracelular de las isoformas de CD1
Las mol6culas CD1a y CD1b, se expresan en C6lulas Dendrfticas, asi
como en timocitos corticales19'20. CD1c se expresa en c6lulas de Langerhans,
asi como en un subgrupo de linfocitos B. CD1d se expresa en c6lulas
epiteliales, timocitos corticales, hepatocitos, Celulas Dendrfticas, macrofagos y
c^lulas B, CD1e se expresa en c6lulas dendrfticas inmaduras, aunque su
localizaci6n es intracelular y no se ha detectado asociada a membrana. La
estimulacibn de monocitos humanos con GM-CSF e IL-4 induce la expresi6n de
las diferentes isoformas de CD1 al diferenciarse a dendrfticas con fenotipo
inmaduro21-24
Las isoformas de CD1 en humano, se distribuyen de manera
heteroggnea en diferentes compartimentos del interior celular, sitios donde
cargan antfgenos. CD1a presenta un patr6n de distribucidn parecido a las
mol6culas clase I del MHC, es decir, se localiza en superficie celular, asf como
en vesfculas endosomales. CD1b y c se Iocalizan principalmente en membrana
plasm£tica asf como en endosomas tardfos y lisosomas, siendo menos
evidente su presencia en endosomas tempranos. CD1d se localiza, al igual que
CD1b,
en
endosomas
tardfos
principalmente.
CD1e
se
localiza
intracelularmente en aparato de Golgi y retfculo endopldsmico en cgiulas
dendrfticas inmaduras, mientras que en cdlulas dendrfticas maduras sufre una
redistribuci6n, localizSndose en endosomas tardfos.
La heterogeneidad en la localizaci6n y el tr&fico intracelular de las
mol6culas CD1 se explica por la presencia de una secuencia de localizacidn
endosomal YXXZ presente en la porcidn citopldsmica, donde Y es tirosina, X
cualquier aminodcido y Z un aminodcido con cadena lateral hidrofdbica tal
como valina o isoleucina. Esta secuencia permite la asociaci6n de moteculas
de CD1 con protefnas adaptadoras (AP) para su correcto tr^fico intracelular
hacia endosomas tardfos y compartimento MHC. Dicha secuencia esta
presente en CD1b, CD1c y CD1d, pero no en CD1a lo cual explica la exclusi6n
de esta ultima de endosomas tardfos 2M®.
La eliminacidn de esta secuencia de localizacidn en CD1b en modelos
experimentales, resulta en la redistribucibn de la motecula en superficie celular
y en la ausencia de presentacidn de antfgenos restringidos por esta isoforma
de CD1. Asf pues, para la presentaci6n de llpidos y glucollpidos por moldculas
CD1b y CD1d se requiere de transpose del antfgeno hacia endosomas tardfos,
mientras que para CD1a no se requiere.27
y
I '•'•>•
i
COA
I
AV 1
cote
^icrgod
CO TB
C
OD
'
MM
Figura N° 4: Tr£fico y distribuci6n intracelular de isoformas de CD1 de humano. (Sugita M et
at,1999).
Mecanismos de internalizacidn para antfgenos que son presentados
A traves de CD1
Los principales mecanismos que contribuyen a la captaci6n de antfgenos
en las CPAs, lo constituyen la endocitosis mediada por receptor, la fagocitosis y
la macropinocitosis. Los macr6fagos y las C6lulas Dendriticas capturan
antlgeno vfa vesfculas cubiertas de clatrina, a travbs de los receptores para Fc,
complemento o receptores para ligandos especfficos. Existe evidencia de la
participaci6n de receptores de superficie celular que favorecen la captura y la
internalizacibn de glucolfpidos hacia compartimentos especiales en donde
pueden ser cargados por moteculas CD1. Hasta el momenta, s6lo para la
motecula LAM se tiene bien caracterizado como ocurre la captura, transporte y
presentacibn de este antfgeno. 28'29
El receptor de manosa (RM) presente en la superficie de CPAs, es el
responsable de la captura de LAM, asi como de su internalizaci6n y transporte
hacia la vfa endosomal. Empleando estudios de microscopia confocal y
microscopia electrbnica, se ha demostrado la presencia del RM en
compartimentos
intracelulares,
de
manera
abundante
en
endosomas
tempranos, en menor proporci6n en endosomas tardfos, en donde colocaliza
con C063, marcador especffico de este tipo de endosomas y en ei interior del
compartimento MIIC. El RM colocaliza con la motecula de CD1b en endosomas
tardfos. La LAM internalizada a trav6s del RM es llevada a endosomas
tempranos en donde puede ser liberada debido al pH gcido, para
posteriormente transportarse a endosomas tardfos, donde es cargada por
CD1b y es presentada a linfocitos T especfficos.
Antagonistas como las a-mananas, las cuales se unen al receptor y
compiten con la LAM, inhiben la intemalizaci6n y la presentaci6n de este
glucolfpido a c6lulas T reactivas, lo cual resalta la importancia de este receptor
en la captura del antfgeno. Inhibidores de la acidificacidn endosomal tales
como concanamicina A, inhiben la presentaci6n de LAM, lo cual demuestra que
la captaci6n de antfgenos por CD1b requiere de acidificaci6n endosomal30
Otro receptor tipo PRR involucrado en la captura de glucolfpidos, es
CD14, el cual participa en la captaci6n e internalizacidn de LPS de bacterias
Gram negativas, aun cuando no se ha demostrado que la internalizaci6n
finalice con la presentacibn de este glucolfpido. Otros mecanismos descritos
para la internalizaci6n de glucollpidos, es la integraci6n directa de este tipo de
antfgenos en la membrana celular de algunas poblaciones del hospedero,
proceso facilitado por la presencia de anclas de glucosilfosfatidilinositol (GPI) y
su migraci6n hacia diferentes compartimentos, como lo ejemplifica el caso de
LAM y de LPS 31,32.
Recientemente se ha descrito que las propiedades intrfnsecas de las
mol6culas lipfdicas, tales como la longitud y el grado de saturacidn de las
cadenas de gcidos grasos determinan su tr£fico intracelular. Lfpidos con
cadenas de £cidos grasos de cadena larga y saturadas, son dirigidos hacfa
endosomas tardfos y lisosomas, mientras que llpidos de cadena corta y no
saturados, son reciclados a la membrana plasmdtica33.
Procesamiento de antfgenos que son presentados a trav6s de CD1
En lo que se refiere a procesamiento antiggnico, se ha sugerido el
requerimiento de procesamiento enzimdtico para algunos glucolfpidos mientras
que para otros no se ha demostrado. El antfgeno de Mycobacterium
tuberculosis denominado trealosa dimicolato es procesado a glucosa
monomicolato, siendo necesario dicho procesamiento para lograr la activacidn
de ceiulas T especfficas para este Oltimo antfgeno. De la misma forma la
mol6cula a-Digalactosil ceramida, tiene que ser procesada con la ayuda de una
alfa-galactosidasa lisosomal para generar
a-Galactosil ceramida, para ser
reconocida y llevar a la activacidn a cdlulas NKT en el contexto de la isoforma
CD1d. 38,36
Estos antecedentes refuerzan la idea de que la modificaci6n enzimStica
de los motivos de carbohidratos puede producir diferentes determinantes
antig6nicos a cdlulas T y diferentes especificidades, igual a lo que ocurre con
los peptidos que son generados como producto del procesamiento de
protefnas. El procesamiento a nivel de los dcidos grasos puede ser necesario
para el correcto acomodo del glucolfpido en el surco de las moldculas CD1.
Recientemente se ha descrito la participacidn de protefnas activadoras
de esfingolfpidos denominadas saposinas, como mol6culas que intervienen
durante el proceso de carga antigdnica para las isoformas CD1b y CD1d
humanas. En particular la moldcula SAP-C favorece el acomodo de moteculas
llpicas derivadas de mycobacterias en la isorforma CDtb, proceso que realiza
en el interior de compartimentos lisosomales. Para la presentacidn del antfgeno
alfa-galactosil ceramida, se requiere de la actividad de saposinas, las cuales
favorecen la presentacidn de este antfgeno en el contexto de CD1d. La
participacidn de estas moteculas ha comenzado un nuevo campo en la
investigacidn de protefnas chaperonas que facilitan la presentaci6n de
antfgenos de naturaleza glucolpfdica en el contexto de CD1 37,38
Antfgenos presentados por isoformas de CD1 y respuesta celular
La primera evidencia que involucr6 a moteculas CD1 como mol6culas
presentadoras de antfgenos derivados de pat6genos, foe cuando se demostrd
y aisl6 una Ifnea de cglulas T CD4" CD8\ que prolifera en respuesta a
antfgenos
purificados
de
Mycobacterium tuberculosis. La
posterior
caracterizaci6n de ia naturaleza del antfgeno revel6 que 6ste correspondfa a
Scido mic6lico, el cual es cargado y presentado en el contexto de CD1b.39,40
La isoforma CDlb presenta adem£s de dcidos micdlicos,
LAM, glucosa
monomicolato (GMM), ceramidas end6genas asf como gangli6sidos propios del
hospedero. La caracterfstica estructural que comparten estos ligandos es la
presencia de una regidn hidrofflica y dos cadenas de dcidos grasos. Un
requisite para que estos antfgenos puedan cargarse en CD 1b es que se
requiere de acidificaci6n endosomal. CD1c presenta el antfgeno aislado de
mycobacterias denominado Hexosa-1-fosfoisoprenoide, asf como el antfgeno
sintetico Manosilfosfodolicol.41,42
Para moteculas del grupo II de CD1, el antfgeno mejor caracterizado y
estudiado es una galactosilceramida derivada de una esponja marina (Agelas
mauritanius), la cual es presentada a trav6s de CD1d tanto en humano, como
en rat6n, favoreciendo la activacitin de cglulas NKT, especfficas para este
antfgeno y restringidas por CD1d, ejerciendo de esta manera una potente
funcibn efectora y reguladora.43-48
El principal grupo de cglulas restringidas por CD1 lo constituyen el
subgrupo denominado c6lulas NKT el cual expresa un TCR particular e
invariante que en el rat6n es Va14-Ja281 asociado con la cadena V(38
principalmente y en el humano es Va24-J aQ asociado con la cadena Vpi1. 8 0
Estas c6lulas NKT son restringidas especfficamente por la molecula CD1d en
humano y su homdlogo en el rat6n. Esta poblaci6n expresa marcadores en
superficie celular asociados a cblulas NK como: NKR-P1 (NK1.1), CD16, y
receptores inhibidores que se unen a las moteculas de clase I como Ly49C (en
rat6n) y CD94 (en humano). Todas las c6lulas NKT tanto de ratdn, como de
humano, reconocen al antfgeno a-Galactosilceramida en el contexto de CD1d.
Estas c6lulas pueden reconocer tambi6n antfgenos de naturaleza lipldica
propios del hospedero tales como fosfatidilinositol y fosfatidilglicerol.61 La
activaci6n de cblulas NKT induce una serie de eventos que lleva a la
producci6n de IL-4 e INF-7. Mediante la sfntesis y liberacibn de estas citocinas
las cglulas NKT participan tambi6n en la inmunidad antimicrobiana
influenciando la polarizaci6n de respuestas hacia un perfil TH1 o TH2. De
manera relevante, el perfil de citocinas secretado por esta poblaci6n ha sido
implicado en la regulaci6n de diferentes tipos de respuesta inmune, incluyendo
la respuesta a Mycobacterium
bovis
y Plasmodium
falciparum.***6
En
pacientes con tuberculosis, la participaci6n de linfocitos T citotdxicos (CD8+) y
linfocitos T dobles negativos (CD4"y CDS') con capacidad citolftica que
reconocen glucolfpidos tales como dcidos micblicos y LAM de Mycobacterium
tuberculosis en el contexto de CD1b. En lesiones de piel de pacientes con lepra
que siguen un curso benigno de la enfermedad (lepra tuberculoide), se han
identificado c6lulas T restringidas por CD1b, especificas contra Mycobacterium
leprae capaces de producir gran cantidad de INF-y, asf como c6lulas
dendrfticas que expresan gran densidad de mol6culas CD1. 66,67
Otro subgrupo importante de c6lulas que reconocen isoformas de CD1 lo
constituye las cblulas yS citollticas presentes en intestino, que expresan un TCR
caracterfstico V51. Este subgrupo en particular reconoce a la motecula CD1c.
Aun cuando mucho se ha avanzado en el entendimiento de la naturaleza de los
antfgenos que son presentados por CD1, la mayorfa de los trabajos se han
enfocado
sobre
mol6culas
presentes
en
miembros
del
genero
Mycobacterium.M
Respuesta inmune a pardsitos a trav6s de la presentacidn de CD1
En lo que se refiere a molbculas presentes en pardsitos que son
presentadas a traves del sistema CD1, se conoce que glicoconjugados
(glicollpidos y glucoprotefnas) del helminto Schistosoma mansoni presentes
durante la fase de eclosi6n del pardsito (durante la deposici6n de huevos de
helmintos en hlgado), son capaces de inducir una respuesta inmune celular
polarizada al perfil de citocinas TH2 al ser presentados a trav6s de la isoforma
CD1d en un modelo de estudio murino. La enfermedad inicialmente genera un
perfil de respuesta de citocinas TH1, pero el pardsito al invadir hfgado y
depositar los huevecillos en este sitio,
genera una potente activacidn de
c6lulas NKT, ya que antfgenos presentes en la superficie de esta fase
parasitaria, pueden a trav6s de su presentacidn en el contexto de CD1d, lleva a
la activacidn de esta poblaci6n celular.
ANTIGENO
Mrcoljtas
ORIGEN RESTRICCION
OH
OCHs
A
frVVNAAAAAAAAA^NAAA^AA/SAAA/
ov/s^^^^/vs/vvvyv
acidos micolicos
OH
Mycobacterium
Glucosa monomicolato
GDI T
CC'lt,
GlyrcKpfliKiolpas
Gal —GaMftc Cvl — Gcl
s
iW'j
^ ^ ^ ^ s a ^ ^ v ^ ^ /
Gangliosido GM1
(ii-iai
alfa-galactosilceramida
antfgeno
propio
Esponja Marina
COH
CD1fl
Pnwptioipias
ManV
myeiieltci-O ^
r.fai"'
o
°
O
fosfatidilinositolmanosidos
9"
(30-32)
u „p fi
hesoxil-l-fosfoisoprenoides
Mycobacterium
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Mycobacterium
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Mycobacterium
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f»-55)
Manosil-l-Fosfodolicol
NH,
OMS„
O- B — M a n — Man-C4rM»c-nric«ic=<lo»-0 - f - O
0>
Fig. N
0
M&n
O
Glicosilfosfatidilinositol (GPI)
antfgeno
propio/microbiano
CD1<1
5: Estructura de los principales antfgenos que son presentados por las diferentes
isoformas de C01 para la inducci6n de una respuesta celular especffica. (Matsuda JL and
Kronenberg M, 2001).
CAPfTULO II
ASPECTOS GENERALES DEL FEN6MENO DE AUTOFAGIA
2.1 DEFINICI6N DE AUTOFAGIA
La homeostasis celular es mantenida por la regulation exacta del equilibrio
entre la slntesis y la degradaci6n de componentes celulares. Las cOlulas
pueden detectar cambios en el microambiente y responder a estos mediante
una variedad de respuestas anabOlicas o catabOlicas.
Dos son las principales
vias implicadas
en la degradation
de
macromolOculas en cblulas eucariotas: la via de ubiquitina / proteasoma y la
via de autofagia. La primera participa en la degradation de protelnas de vida
corta, manteniendo un volumen controlado de protelnas en la cOlula. Por otra
parte autofagia es un proceso celular involucrado en la degradation y en la
elimination de proteinas de larga vida y organelos, el cual puede ser objeto de
represiOn o induction en respuesta a diferentes estlmulos.
Autofagia, literalmente significa "comerse a si mismo", y se define como un
proceso mediante el cual, una cOlula es capaz de consumir componentes
propios en su interior con diversos fines. Este proceso celular involucra la
participation de enzimas lisosomales, proteinas solubles en el citosol,
mitocondrias y peroxisomas, las cuales en conjunto llevan a cabo la
degradation y la conversion de componentes citosOlicos.60
Este fenOmeno celular puede llevarse a cabo en las siguientes dos etapas:
la primera en la cual una cOlula secuestra componentes de su citoplasma en
veslculas llamadas autofagosomas. En una segunda etapa, estas vesiculas
llegan a fusionarse con compartimentos celulares que son sitios de
degradation, conotidos como lisosomas. La vacuola autofdgica es un organelo
generable que posee el ambiente apropiado para la actividad catalltica con la
cooperation de enzimas hidrollticas, esta caracterlstica la hace capaz de
degradar casi cualquier clase de componente celular incluyendo organelos
enteros.
La autofagia se caracteriza por una morfologla esencialmente id6ntica en
piantas, cbluias de ievaduras y en mamiferos.
La estructura de una vesicula autotegica consta de una doble membrana y
cuando se fusiona con el lisosoma, tanto la membrana interna del
autofagosoma, como sus protelnas y el contenido del organelo es degradado
por enzimas hidroliticas, pudiendo los productos de degradation ser reticlados.
61
2.2
IMPORTANCIA BIOL6GICA EN DIFERENTES TIPOS CELULARES
Autofagia se ha relacionado con proliferation, diferentiaciOn, cdncer,
apoptosis y recientemente se ha propuesto como una herramienta que permite
a la cOlula obtener energla, £cidos grasos y aminodcidos permitiendo su
supervivencia en condiciones adversas. Un mecanismo de autofagia defitiente
es tambiOn causante de distintas enfermedades. De acuerdo con su papel
esencial en la homeostasis celular, el mecanismo de autofagia ha sido
implicado en varias patologias tales como el cdncer, enfermedades
neurodegeneratives y miopatlas.92
2.3 TIPOS DE AUTOFAGIA
Existen tres tipos de autofagia: la microautofagia, la macroautofagia
(referida a partir de aqul como autofagia) y la autofagia mediada por protelnas
chaperonas (AMC). A continuaciOn se describen a detalle cada una de
estas:
MACROAUTOFAGIA
La macroautofagia es el proceso donde algunos componentes del citosol
son secuestrados primariamente en una estructura denominada preautofagosoma, para conformar despuOs un autofagosoma. El autofagosoma se
fusiona entonces con un lisosoma, cuyo contenido rico en enzimas proteollticas
e hidrolasas puede tener acceso a la vesicula interior, el llamado cuerpo
autotegico. El compartimento que se ha generado y su contenido se llama
autofagolisosoma o autolisosoma (Figura ntimero 6). Tras la degradation del
contenido, el resultado son macromolgculas que son liberadas de regreso hacia
el citosol a trav6s de permeasas para su reutilizaci6n en procesos metab6licos.
Alternativamente, la carga puede ser inactivada o digerida cuando la
macroautofagia actua como parte de la respuesta inmune para eliminar
pat6genos microbianos, punto que sera abordado con mds detalle en el
capltulo 3.
Figura N° 6: Figura esquemdtica de la generaci6n de macroautofagia. (Rubinsztein DC et al.,
2007)
La macroautofagia es un proceso altamente regulado principalmente en
los pasos de secuestro del contenido citos6lico y progresi6n. La privaci6n de
nutrientes es el estlmulo m£s comun para la induccidn del fen6meno de
macroautofagia, pero la disminucibn de amino£cidos especlficos reguladores y
el aumento de los niveles de glucocorticoesteroides y hormona tiroidea tambign
la estimulan. La activaci6n independiente de nutrientes de este tipo de
autofagia, es tambign inducida durante un estlmulo apopt6tico.
Algunos de los inhibidores fisiol6gicos reconocidos son: la insulina,
algunos factores de crecimiento, AMPc y GMPc y condiciones que llevan a la
disminucidn de niveles intracelulares de ATP debido a que los pasos de
secuestro, fusidn del fagosoma con lisosomas y degradaci6n durante la
macroautofagia, son mecanismos dependientes de
energla. El efecto de
algunos reguladores ftsiol6gicos tambign depende del tejido analizado, por
ejemplo, el glucag6n y los agonistas beta-adrengrgicos, que m£s que estimular
la macroautofagia, la inhiben en el musculo cardiaco y esquelgtico, mientras
que el cldsico efecto inhibitorio de algunos aminodcidos no es visto en cOlulas
pancre&ticas.
A nivel molecular, las vias de serialization que conectan los diferentes
reguladores con el proceso macroautof&gico aun no son tiaras. Las senates
intracelulares para esta via incluyen inflamaciOn celular, la movilizatidn de
reservas de caltio y la fosforilaciOn de protelnas e hidrOlisis de GTP. Algunas
protelnas altamente especializadas denominadas GTPasas participan en el
proceso autof&gico. Otras familias de protelna-tinasas teles como la PI3K
tambiOn han sido involucradas durante este proceso.
Un evento crltico para la induction de macroautofagia, es la activation de una
protefna conocida como TOR, la cual es una protelna-tinasa que actOa como
un sensor celular. Esta protefna TOR actua como un regulador negativo de la
macroautofagia. Cuando TOR no es estimulada por nutrientes o cuando
inhibidores especlficos teles como la Rapamicina, la inhiben, por lo tanto la
induction de macroautofagia es favoretida. La inactivaciOn de la via TOR
aumenta los niveles de la protelna autof&gica Atg8 y la actividad de tinasa de
ATG1; estos son puntos clave para initiar la autofagia.62,63
En la figura ntimero 7 se puede observar un esquema de la compleja
regulation del fenOmeno de macroautofagia, incluyendo la participation de la
protefna TOR como sensor maestro de esta vfa, as! como las protelnas que
han sido descritas, y su participation en los dos primeros pasos de
macroautofagia:
autofagosoma.
formation
del pre-autofagosoma, y la formation del
Figura N° 7: Papel de la protefna Tor como sensor celular y regulador del proceso de
macroautofagia. El ensamblaje en la fase de pre-autofagosoma de dos cascadas de
conjugaci6n
y los dos sistemas de fbsfbrilaci6n permiten la nucleaci6n/ek>ngaci6n de la
membrana de aislamiento. La progresi6n de esta membrana de aislamiento hacia la fbrmaci6n
de
vesfculas que llevan hidrolasas (cvt del ingles hydrolase carrying vesicle) o un
autofagosoma es regulado a trav6s de la cascada de seflalizaci6n de la protefna Tor.
Abreviaturas: PEA (fosfatidil-etanolamina); Tor (del ingtes: Target of Rapamycine)YCuervo AM
et al. 2004).
Gracias al gran esfuerzo de diferentes grupos cientfficos hoy en dfa se
sabe que existe un complejo grupo de genes implicados en el proceso
autofdgico, para los cuales se ha adoptado una nomenclatura en la cual cada
gen es designado con la abreviatura ATG (en mayusculas) para referirse a un
gen y a sus protelnas como Atg (minusculas). Cada una de las protefnas que
son codificadas por genes relacionados con autofagia ademds de
denominarse con las siglas Atg llevan un numero progresivo (Atg es la
abreviatura para el t6rmino en ingl6s: autophagy-related genes). Dicho
numero sirve para diferenciar entre diferentes genes y sus productos.
Muchos de los estudios y descubrimientos de genes y protefnas se han
realizado empleando sistemas experimentales que hacen uso del estudio
molecular en levaduras. La mayorfa de los genes identificados en levaduras
son conservados tambign en mamfferos e incluso en plantas. A continuacidn se
describen los genes identificados a la fecha en la tabla numero 3.
Gen
ATG1, ULK
ATG3
ATG4
ATG5
ATG6, Beclin
1
ATG7
ATG8, MAPI
LC3
ATG9
ATG10
ATG12
ATG16
Funcidn de la protefna
Atg1 es una serfna-treonina protefna-cinasa involucrada en la regulacton y
la formaci6n de la vesfcula autofdgica.
Atg3 funciona como una enzima de conjugaci6n similar a ubiquitina que
covalentemente ataca a Atg/LC3
Atg4 es una cistefna-proteasa que actCia sobre la porci6n carboxi-terminal
de Atg8/LC3 para exponer residuos de glicina para una conjugaci6n
subsecuente.
Atg5 es atacada covalentemente por Atg12 y se liga a Atg16 como parte
de un complejo tetramgrico de funcidn desconocida.
Atg6 es un componente del complejo fosfatidilinositol-3-clnasa (PIK-3) III
que es requerido para autofagia.
Atg7 es un homblogo de la enzima activadora de ubiquitina; ambas son
activadas por Atg8/LC3 y Atg12 antes de la conjugacidn.
Atg8/LC3 tiene estructura similar a ubiquitina, es conjugada a
fosfatidiletanolamina y es parte del autofagosoma, pero su funclbn no se
conoce.
Atg9 es una protefna transmembrane que quizd este involucrada liberando
la membrana durante la fbrmacidn del autofagosoma.
Atg10 funciona como una enzima conjugadora de ubiquitina que ataca
covalentemente a Atg12 y Atg5.
Atg12 tiene una estructura similar a ubiquitina; se conjuga a una lisina
interna de Atg5 por medio de una glicina C- Terminal.
Atg16 liga a Atg5 y homo-oligomeriza para formar un complejo
tetramgrico.
Tabla N° 3: Se describen los genes que participan en el proceso de autofagia, as! como la
funci6n de la protefna para la cual codifican en mamlferos. (Rubinsztein DC etal. 2007).
MICROAUTOFAGIA
La Microautofagia esta involucrada en la captura y degradacidn de
regiones completas del citosol por el sistema lisosomal, pero la principal
diferencia en comparaci6n con macroautofagia, es que la membrana de
captura en este caso es la membrana lisosomal por si misma. La formaci6n de
vesfculas intermedias (como por ejemplo el autofagosoma) no es requerida en
esta vfa. Como en la macroautofagia, la carga pueden ser protefnas solubles,
asl como organelos completes. La microautofagia fue morfol6gicamente
descrita en cOlulas de mamlferos como la presencia de organelos similares a
lisosomas con multiples veslculas atrapadas en su lumen (cuerpos
multivesiculares). Estos cuerpos multivesiculares difieren de los generados en
endocitosis, en el sentido de que contienen un lumen acldico y proteasas
activas. Recientes estudios han demostrado que la captura del citosol por
lisosomas/vacuolas
puede
adopter
formas
muy
diferentes,
desde
invaginaciones, formas tubulares, a otras estructuras intermedias.
El aislamiento de vacuolas de levaduras ha hecho posible el estudio In Vitro de
estas. Esto ha puesto de manifiesto que la vacuola microautof&gica genera
estructuras tubulares con multiples ramificaciones que rodean los materiales
intemalizados. Este proceso requiere un potencial de membrana intacta y la
participation de GTPasas, pero sorprendentemente, es independiente del
titoesqueleto y no requiere la presencia de protelnas que normalmente regulan
la fusi6n homotlpica de las membranas.63,64
RegulaciOn de Microautofagia
La microautofagia
es
un mecanismo
constitutivo
de
continua
degradation de protelnas de larga vida dentro de muchos tipos de cOlulas. Este
forma de proteOlisis lisosomal es indiferente de los estlmulos cldsicos que
activan la macroautofagia teles como la privation de nutrientes, la regulation
por hormonas teles como el glucagon o bien por aminodcidos regulatorios.
Recientemente, una forma de microautofagia conocida como pexofagia que
conduce a la degradation preferential de peroxisomas mediante la absortiOn
directa por la vacuola microautofagica; esta se ha identificado en levaduras.
AUTOFAGIA MEDIADA POR PROTEfNAS CHAPERONAS (AMC)
La caracterlstica principal de la AMC, en comparaciOn con la macro y
microautofagia, es que las protefnas sustrato son dirigidas directamente
hacia el lumen de lisosomas sin previa formation de veslculas intermedias.
Este tipo de autofagia, es una via lisosomal de proteOlisis que es responsable
de la degradation del 30% de las proteinas citosOlicas en conditiones de
privacidn prolongada de nutrientes. Protefnas chaperonas molecufares en el
citosol y en el lumen de lisosomas son responsables de estimular esta via
proteolltica. Las protefnas chaperonas en citosol desdoblan protefnas sustrato
antes de su traslado a travgs de la membrana lisosomal. Un componente
fundamental de la autofagia mediada por chaperonas es un receptor en la
membrana lisosomal, conocido como protefna de membrana asociada a
lisosomas tipo 2a (lamp-2a). Recientes resultados muestran que la autofagia
mediada por chaperonas es tambign activada por el estrgs oxidativo, y en este
caso la expresidn de lamp- 2a se incrementa debido
a regulaci6n
transcripcional. AMC puede reducirse mediante inhibidores de la glucosa 6fosfato deshidrogenasa y de la protefna de choque tgrmico de 90 kDa (hsc90)
La reducci6n de los niveles de lamp-2a utilizando estrategias
de RNA
interferente, reducen la actividad de AMC. AMC se activa en la mayorfa de las
cglulas, pero se ha estudiado mds en fibroblastos, hfgado y riftdn. AMC es
activada durante la privacidn de nutrientes por tiempos prolongados, como en
el hambre o la eliminacidn de factores de crecimiento en suero en cglulas en
cultivo.64,86
El motivo KFERQ en las protefnas sustrato
La mayorfa de los sustratos conocidos para autofagia mediada por
chaperonas contienen una secuencia de aminogcidos (motivo) relacionada con
el pentapgptido KFERQ. Esa secuencia esta presente en el 30% de las
protefnas citos6licas y es determinante en el reconocimiento de las protefnas
que ser£n degradadas mediante este mecanismo. Es posible que secuencias
similares a KFERQ puedan ser generadas en algunas protefnas por
modificaci6n post-traduccional. Este motivo es reconocido en el citosol por la
protefna de choque tgrmico de 73kDa (hsc73), un miembro de la familia de
chaperonas hsp70. La interacci6n entre el sustrato y hsc73 estg regulada por
nucle6tidos, y por otras co-chaperonas (figura ntimero 8). El complejo
sustrato/chaperdn es dirigido a la membrana lisosomal, donde se une a la
protefna-receptor, lamp-2a. El sustrato interactda directamente Con lamp-2a a
travgs de una regi6n diferente al motivo KFERQ, ocupada por la chaperona. El
desdoble del sustrato es necesario para su transporte hacia los lisosomas. La
multimerizacibn de lamp-2a es necesaria para la translocation del sustrato por
lo tanto, es posible que la asociacibn de multiples moteculas lamp-2a pueda ser
suficiente para crear una discontinuidad en la membrana lisosomal, necesaria
para el transporte de los sustratos.66-68
Figura N° 8: Modelo Hipotetico para el transporte de proteinas citos6licas hacia lisosomas
mediada por autofagia mediada por protefnas chaperonas. En condiciones de estr6s, el motivo
KFERQ en la secuencia de aminodcidos de las protefnas citosdlicas, es reconocida por un
chaperbn citos6lico y sus co-chaperones. Ei complejo sustrato/chaperdn se une a una proteina
de membrana lisosomal (lamp-2a) y el sustrato junto con el receptor de membrana, son
translocados hacia el lumen del lisosoma mediante la ayuda de un chaper6n lisosomal.
Mediante un mecanismo aun desconocido se disocian el chaper6n y el receptor del sustrato, el
cual es rdpidamente degradado por proteasas lisosomales. Abreviaturas: hsc73 (proteina de
choque termico de 73 kDa); lamp-2a (protefna de membrana asociada a lisosomas 2a); Lyshsc73 (hsc73 lisosomal).(Cuervo AM et al. 2004).
CAPlTULO III
LA AUTOFAGIA Y SU IMPORTANCE EN LA GENERACI6N DE RESPUESTA
INMUNE
La importancia de la autofagia en la defensa contra los patdgenos intra y
extracelulares ha sido reconocida por varios estudios recientes. En especial la
macroautofagia participa activamente en el secuestro, la degradaci6n y eliminacibn
de patdgenos bacterianos y protozoarios. En el presente capftufo se sintetiza la
informaci6n mas reciente en relaci6n al proceso de autofagia, como mecanismo de
defensa inmune innata y especffica.
3.1
PAPEL DE AUTOFAGIA EN LA INMUNIDAD INNATA
El rol de la autofagia en el hospedero en la eliminaci6n de patdgenos
intracelulares, ha recibido considerable atenci6n en alios recientes. Se reconoce
ahora que la autofagia participa como mecanismo de defensa innata, al restringir
algunas de las infecciones virales y la replicacidn de bacterias y pardsitos
intracelulares. Uno de estos ejempios es la infeccibn por L monocytogenes, la cual
es una bacteria intracelular facultativa que puede sobrevivir en macrdfagos e invadir
cglulas no fagocfticas como las cglulas epiteliales, hepatocitos y cglulas
endoteliales. Durante la infecci6n por este patggeno,
las cglulas fagocfticas
internalizan esta bacteria. En el interior de un fagosoma, la bacteria prepara un
ambiente hostil con pH dcido. Este microambiente, permite que la bacteria secrete
una exotoxina (listeriolisina O) que es capaz de lisar la membrana del fagosoma,
mucho antes de que gste complete la fusi6n con los lisosomas, organelos ricos en
proteasas bactericidas. Lo anterior permite a la bacteria escapar al citoplasma, su
nicho intracelular. En el citoplasma, la bacteria prolifera y se disemina a las cglulas
adyacentes por un mecanismo de contacto cglula a cglula sin exponerse al
ambiente extracelular y evadiendo la respuesta inmune de esta forma. Para
contrarrestar este mecanismo de evasi6n de la respuesta inmune, macr6fagos
infectados utilizan el mecanismo de autofagia para engullir la bacteria que ha
escapado hacia el citoplasma y regresarla al ambiente hostil que representan los
lisosomas donde la bacteria es degradada eficientemente y la infeccidn es
controlada parcialmente.69
Otro ejemplo de la participation de autofagia en la defensa inmune innata a
patOgenos, lo constituye la bacteria Staphylococcus aureus, la cual es eliminada
por degradation autof&gica. Esta bacteria es eficazmente secuestrada y degradada
en compartimentos lisosomales.70 En experimentos in vitro, usando Hneas celulares
deficientes en la proteina Atg5 -/-, las cuales son deficientes en la maquinaria
autotegica, la bacteria se multiplica sin control. Curiosamente, entre las distintas
cepas de S. aureus. Algunas cepas viruientas incluidas las cepas que son
resistentes a fdrmacos tales como meticilina, han puesto de manifiesto una
marcada resistentia a la elimination por autofagia.71
El patOgeno Gram-negativo, Salmonella typhlmurium reside y se replica en
compartimentos vinculados a las membranas. Un subconjunto de las bacterias que
son internalizadas en cOlulas presentadoras de antlgeno, daAan la membrana y
escapan de compartimentos fagosomales. Se ha demostrado recientemente que
estas bacterias que han escapado colocalizan con la proteina autotegica LC3.
Otro ejemplo de patOgeno que es controlado a travOs de autofagia, lo es Francisella
tularensis, la cual es una bacteria que escapa al citoplasma, sitio donde se replica,
tras replicarse, esta bacteria se reintroduce al compartimento endocltico por medio
de un proceso mediado por la autofagia, a pesar de que no se observa degradation
bacterial.72,73
En el caso de la infection por micobacterias se ha comprobado que estas pueden
interferir con la fusiOn entre fagosomas y lisosomas (impiden la maduratiOn que
resultarla en la biogenesis de fagolisosomas). Otro mecanismo que recientemente
se ha descrito es que M. tuberculosis puede accesar al citoplasma y de esta forma
evadir el ambiente hostil de fagolisosomas. La activation de la autofagia ya sea
fisiolOgicamente (es detir, por inanition) o farmacolOgicamente (tratamiento con
rapamitina) incrementa la colocalisaciOn de la Micobacteria con constituyentes
lisosOmicos y tambiOn con las protelnas autOfagas Beclin-1 y LC3. A nivel
estructural, se ha observado que las vacuolas contenlan bacilos y membranas
intemas caracteristicas de los autofagolisosomas. La activation de macrOfagos con
el IFNy estimula la autofagia y reduce la carga bacteriana. La estimulatiOn de la via
autofdgica re-direcciona a las bacterias a un compartimento en el que los patOgenos
son eliminados.72,73
Evasi6n de la respuesta Inmune innata y del mecanismo de autofagia.
Atgunas bacterias y virus utiiizan la maquinaria del proceso de autofagia para
invadir los tejidos de un hospedero. Por ejemplo, Porphyromonas gingivalis y
Brucella abortus se Iocalizan en autofagosomas y su virulencia o la capacidad
replicativa est£n asociadas con este evento. Ourante la infecci6n, estos patdgenos
son secuestrados en fagosomas e inducen autofagia, promoviendo asf la fusidn del
fagosoma con vacuolas autofagicas en lugar de endosomas. Este hecho impide la
degradacidn del agente patdgeno por hidrolasas lisosomales. La maduracidn de
autofagosomas se ve afectada en las cglulas infectadas con P. gingivalis y cepas de
B. Abortus. Las vacuolas autofagicas tambign proporcionan a estos agentes
patdgenos los nutrientes que facilitan su crecimiento en compartimento autofggico.
73
La inhibicidn de la autofagia, reduce la persistencia de P. gingivalis en las cglulas
infectadas. Legionella pneumophila y Coxiella burnetii, que son capaces de crecer
en lisosomas, pueden utilizar las vacuolas autofggicas para invadir nuevas
vesfculas. M£s recientemente, se ha descrito que Salmonella induce la muerte
celular de macrdfagos mediante la activacidn de macrdfagos. Esta bacteria entdrica
induce la formacidn de vesfculas multimembranosas similares a autofagosomas,
estructuras
que contienen tanto
marcadores
de mitocondrias
y
retfculo
endoplgsmico. Asi mismo la maquinaria de autofagia es utilizada por ciertos virus
para completar su replicacidn dentro de la cglula.
Otros
patdgenos, secretan factores que evitan la autofagia. Un ejemplo
notable es el caso de la Shigella flexneri. Shigella trastoma la membrana fagosomal
y de esa forma escapa hacia el citoplasma, en donde evade el mecanismo de
autofagia al secretar un factor de virulencia denominado como IcsB por medio de un
sistema de secrecidn tipo II, que interfere con el reclutamiento de la protefna
autofggica Atg5 y con la formacidn del autofagosoma.74,76
En la figura numero 9 se ilustra el mecanismo por el cual dos bacterias
intracelulares diferentes, son susceptibles o resistentes a los mecanismos de
Autofagia.
Figura N° 9: Accion y evasion del mecanismo de autofagia durante infeccion bacteriana.
Las bacterias pueden ser internalizadas por fagocitosis y el consiguiente fagosoma puede
fusionarse con endosomas y posteriormente con lisosomas; la gran mayorfa de pat6genos
bacterianos son susceptibles de ser degradados en fagolisosomas. Sin embargo algunos
agentes pat6genos, como L. monocytogenes, son capaces de lisar la membrana del fagosoma
y escapar al citoplasma. En este sitio, las bacterias pueden posteriormente convertirse en
bianco del mecanismo de autofagia en un intento por regresar a este pat6geno a
compartimentos de degradacibn. En el caso de L. pneumophila, P. gingivalis, y B. Abortus,
inhiben la maduraci6n de autofagosomas o retrasan la fusi6n con lisosomas, permitiendo a las
bacterias replicarse dentro del autofagosoma. Tornado de (Takahiro S. etal, 2004).
En conjunto, estas observaciones sugieren que en algunos casos, el
mecanismo de autofagia es utilizado por pat6genos para infectar y crecer dentro de
las cblulas hu6sped, pero en otros casos la autofagia puede funcionar como
mecanismo de protecci6n contra la infeccion. El esclarecimiento de las estrategias
moleculares utilizadas por los virus y bacterias para controlar el mecanismo de
autofagia podrla ayudar a entender los complejos mecanismos moleculares que
regulan la autofagia en celulas de mamiferos, y tambign podria contribuir a
desarrollar nuevas estrategias para el tratamiento y la prevenci6n de enfermedades
infecciosas. En la figura numero 10 se muestran los principales patdgenos que se
han estudiado en su resistencia o susceptibilidad al mecanismo de autofagia.74-77
Phagocytic I endocytic degradation
Most bacteria are killed
|
Some bacteria escape
Autophagic
\
degradation
Streptococcus pyogenes
Staphylococcus aureus
Mycobacterium sp,
Bacterial
evolution
for escape
Evade f r o m
autophagic
degradation
Shigella dysenteriae
I isteria monocytogene'1,
Legionella pneumophila
Brucella abortus
Figura N° 10: Diferente susceptibilidad/resistencia de patbgenos a la maquinaria autofegica
celular. (Amano A et al. 2006)
3.1.1 AUTOFAGIA EN LA DEFENSA INMUNE INNATA A VIRUS
Evasidn de la autofagia en Virus
Como ya se habla senalado al principio de este capltulo, durante un
evento infeccioso, sobre todo por patogenos intracelulares que escapan a los
mecanismos de degradacidn fagocltica, la autofagia representa un importante
mecanismo para regresar componentes constituyentes de patdgenos hacia
lisosomas para su completa degradacidn. En el caso particular de las
infecciones virales, en los Qltimos afios se ha comenzado a conocer m£s
acerca de cdmo el mecanismo de autofagia contribuye a potenciar la respuesta
inmune a este particular grupo de agentes patdgenos. Los virus, pardsitos
intracelulares obligados, se replican en el espacio citosdlico de la cdlula
hudsped, empleando la propia maquinaria celular para la sfntesis de su
material gendtico, as! como para la produccidn de protelnas constitutivas. Una
de las incdgnitas de cdmo las cdlulas infectadas eran capaces de responder a
dichos patdgenos, mediante la generacidn de mediadores solubles tales como
citocinas, en particular mediante la produccidn de IFN tipo I (incluyendo a INF-a
e IFN-P) fue despejada recientemente, e increlblemente involucra la
partidpacidn del mecanismo de autofagia.78,79
Al ser el espacio citosdlico el sitio en donde los virus se replican y
ensamblan, resultaba un misterio en como los componentes virales que
permanecen en el citosol y no son secretados al espado extracelular, eran
reconocidos por el sistema inmune, pues hasta la fecha, en el dtosol, pocos
receptores inmunoldgicos han sido descritos por partidpar del reconodmiento,
activacidn y produccidn de citocinas tales como la familia de interferones. De
esta forma el concepto ampliamente aceptado para explicar la respuesta de
citocinas a componentes virales, contemplaba como un paso obligado, la
secrecidn de componentes virales (protelnas de envoltura o cdpsides o material
gendtico desnudo) al espacio extracelular para su reconodmiento y para la
producddn de citodnas antivirales. Sin embargo en los ultimos afios se ha
demostrado que el mecanismo de autofagia, es responsable de sensar el
compartimento citosdlico y de esta forma componentes virales, tales como RNA
de cadena sencilla o cadena doble, DNA viral o protelnas virales, son
atrapados y dirigidos hada compartimentos endocfticos de la cdlula hudsped.
En estos endosomas la presencia de una familia de receptores conodda como
receptores similares a Toll (del inglds Toll like Receptors o TLRs) es crftica para
el reconodmiento de moldculas que son degradadas ahi. Los receptores tipo
Toll o TLRs, son una de las principales familias de receptores que partidpan
en la respuesta inmune innata a travds del reconodmiento de moldculas
presentes en patdgenos. Los TLRs al reconocer a sus ligandos, inducen la
produccidn de citocinas tales como TNF-a, IL-12, IL-18, e importantemente la
production
de
interferones,
asl
como
la
expresiOn
de
molOculas
coestimuladoras sobre la superficie de las cOlulas presentadoras de antlgenos,
participando de esta manera en la interacci6n que se establece entre el sistema
inmune innato y el adquirido. Se han descrito a la fecha 13 diferentes TLRs.
Cada uno de estos receptores reconoce de forma "especifica" a diferentes
molOculas presentes en bacterias, hongos, virus o bien a molOculas propias del
hospedero generadas en estados de estrOs celular. 79>8°
Un miembro de esta familia,
que es TLR7, detecta RNA de cadena
sencilla. En estudios de los casos de la infection por el Virus de la Estomatitis
Vesicular (VSV) y el Virus Sendai (SV), la activation dependiente de TLR7 de
COIulas Dendrlticas Plasmocitoides (CDPs) y su secreciOn de IFN tipo I parece
depender en la autofagia pues se ha demostrado que las dendrlticas
deficientes de Atg5 no son capaces de Secretar IFNa en respuesta a la
infection de SV y VSV.81"84
3.2
PAPEL DE AUTOFAGIA EN LA INMUNIDAD ESPECIFICA.
3.2.1 ENTENDIENDO
EL
PRINCIPIO
DE
COMPARTAMENTALIZACI6N
DURANTE EL PROCESAMIENTO Y PRESENTACI6N DE ANTiGENOS.
Como se ha abordado en el capitulo I, las molOculas del MHC de clase I
esten especializadas en la presentation de pOptidos derivados de protelnas
citosOlicas, degradadas por el proteasoma. Estas proteinas tambiOn pueden tener
un origen nuclear o bien provenir del retfculo endoptesmico o mitocondria. Los
productos de degradation de estas protelnas (pOptidos) son translocados desde el
citosol hacia el retlculo endopl£smico, en donde se encuentran en espera las
molOculas del MHC de clase I. En el retlculo endopldsmico entonces se ensamblan
los complejos pOptido-MHC clase I, para su posterior transporte a la membrana
plasmdtica.
En contraste, las molOculas del MHC clase II son diferentes, ya que evitan
tomar pOptidos en el interior del retlculo endoplasmics al ser protegidas por
la cadena invariante, la cual actda como un pseudopOptido que protege el sitio de
uniOn, ademSs de dirigir el transporte de las molOculas del MHC clase II hacia
compartimentos endocfticos tardfos. En este sitio la cadena invariante es degradada
e intercambiada por fragmentos de protefna que provienen del exterior celular
(llamados protefnas o antfgenos exdgenos).85,88
Estas son definidas como las rutas "cldsicas" de presentacidn de antfgenos
para clase I y clase II. Sin embargo actualmente se sabe que este patr6n de
compartamentalizaci6n no es rfgido al 100 % y las cglulas presentadoras de
antfgeno, pueden mediante algunos mecanismos, intercambiar estas rutas de
presentacidn. Lo anterior significa que antfgenos exdgenos que son internalizados
por una CPA pueden llegar a acceder al citoplasma, y ahf pueden ser degradados
via proteasoma en pdptidos y estos ser dirigidos a retlculo endopldsmico para su
asociacidn "atfpica" con moldculas del MHC clase I. La ventaja de este tipo de
presentacidn cruzada (del tdrmino en ingles "Cross Presentation") es que un
antfgeno exdgeno, puede inducir respuestas tanto de linfocitos CD4 (a travds de
pdptidos que son cargados y presentados por MHC clase II), asf como inducir
respuesta de linfocitos CD8 (a travds de pdptidos que son cargados y presentados
por MHC clase I) al mismo tiempo.88,88
Otro ejemplo de presentacidn de antfgenos mediante una ruta "no cldsica",
que en los ultimos afios mds se ha explorado, lo constituye el hecho de que
protefnas de origen citopldsmico (que tendrfan que ser procesadas y presentadas
en el contexto de moldculas del MHC clase I), bajo determinadas circunstancias,
pueden ser transportadas y ganar acceso hacia endosomas-lisosomas, en donde
son degradadas en pdptidos que pueden ser cargados por moldculas del MHC
clase II, y presentados a linfocitos T CD4. Este ultimo ejemplo de presentacidn
atfpica es expiicado a travds del mecanismo de autofagia.
87,88
3.2.2 AUTOFAGIA COMO MECANISMO CELULAR QUE PROVEE ANTfGENOS
CITOS6LICOS PARA SU PRESENTACI6N NO CLASICA POR MOLDCULAS
DEL MHC CLASE II.
El papel de autofagia en la inmunidad no se limita a la directa
eliminaci6n de pat6genos intracelulares o a la estimulaci6n de la produccidn de
IFN tipo I. Por lo menos en ciertos contextos, la autofagia prOmueve la
presentaci6n de antlgenos citosdiicos a travds de moldculas del MHC clase II,
lo que permite asociar este fen6meno con la inmunidad adaptativa. Schmid y
colaboradores han reportado la presencia de autofagosomas constitutivos en
cdlulas B, cdlulas dendrfticas y cglulas epiteliales. En estas cdlulas, por lo
menos la mitad de todos los autofagosomas se entrecruzan o fusionan con
compartimentos de carga ricos en moldculas del MHC de clase II. Esta via de
trdfico puede ser de gran importancia para la presentacidn de antfgenos. La
forma "individualizada" de autofagia denominada autofagia mediada por
moldculas chaperonas tambidn tiene un papel en la presentacidn de antfgenos
enddgenos a travds del MHC de clase II. Esta forma de autofagia permite la
importacidn de protefnas individuates citosdlicas que contengan la secuencia o
motivo de reconodmiento detectada por lamp-2a.
La protefna de choque
tdrmico HSC70 participa de manera relevante en este mecanismo al transportar
proteinas citosdlicas hada el interior de fagolisosomas.8M1
(a) Endocytosis
(b) Microautophagy
• ^ r
'
X
b
A MIIC
r
V V <
I
v
v
V
Late endosome
(d) Chapcrone-mcdiatcd autophagy
(c) Macroautophagy
**v
Hsp
— V
Autophagasome
M
^Cytopa
lsmci
1 prduoylssi
Hsp
Figura N° 11: Diagrama de las posibles vias para la generacidn y presentation de
epitopes por mol6culas MHC de clase II. (A) En la via endocitica, las proteinas exdgenas
son internalizadas y sometidas a procesamiento proteolitico. (B) Microautofagia se caracteriza
por la invaginacidn lisosomal, que secuestra componentes citos6licos. (C) En macroautofagia,
una doble estructura membranosa encierra y aisla componentes citos6licos, y eventualmente
se fusiona con lisosomas. (0) En la autofagia mediada por mol6culas chaperonas, proteasas
citos6licas generan p6ptidos que se transportan hacia lisosomas mediante la actividad de
mol6culas hsp y/o hsc y lamp-2a. Los ultimos tres procesos probablemente liberan antfgenos
citoptesmicos o p6ptidos a compartimentos endosomales para su asociacibn a MHC de clase II.
Los p6ptidos resultantes entonces se entrecruzan con las mol6culas MHC de clase II en sitios
ricos en estas mol6culas (compartimento MIIC) antes de transportarse y presentarse en la
superficie celular para la activacibn de C6lulas T CD4+. (Strawbridge AB, etal. 2007).
3.2.3 MECANISMOS DE SENALIZAClbN QUE REGULAN EL MECANISMO
DE AUTOFAGIA
La relaci6n entre autofagia e inmunidad es bidireccionai. No s6lo ia
autofagia potencia ia inmunidad innata y las respuestas adaptativas, en
paralelo, algunas moldculas efectoras del sistema inmune tales como citocinas,
receptores y sus ligandos celulares que participan en la inmunidad innata y
adaptativa, tambidn regulan el proceso de autofagia en un mecanismo de
retroalimentacidn. Algunas moldculas del sistema inmunoldgico que regulan
positivamente el proceso de autofagia, incluyen IFN-y y miembros de la familia
de TNF-a (TNF-a, TRAIL) y el receptor CD40L. En contraste, la autofagia es
regulada negativamente por citocinas del perfil TH2, tales como la interleucina4 (IL-4) e IL-13, aunque esto ultimo se ha demostrado hasta la fecha sdlo en
lineas celulares. En general, existe una correlacidn entre la activacidn de
autofagia por mediadores inmunoldgicos y el control de la infeccidn con
patdgenos intracelulares.
Linfocitos CD4+ pueden cooperar con Cdlulas Presentadoras de
Antlgenos para inducir autofagia en dstas ultimas a travds de la interaccidn
entre CD40 y su ligando (CD40L), estimulacidn que protege a las CPAs en
contra del pardsito Toxoplasma gondii. IFN-y y TNF-a son cruciales para la
proteccidn
contra
la infeccidn por micobacterias
y otros
patdgenos
intracelulares que pueden replicarse en macrdfagos, y estas citocinas se ha
demostrado son potentes inductores de autofagia tanto en los macrdfagos,
como en otras cdlulas.92-98
A continuacidn se muestra en la figura ntimero 12, un modelo hipotdtico
de cdmo se lleva a cabo este tipo de presentacidn a travds de dstas vlas
autofdgicas, en conjunto con las moldculas de seftalizacidn implicadas.
Figura N° 12: Regulacidn del proceso de autofagia a traves de sefiales
moleculares que se establecen entre cdlulas presentadoras de antigeno y Linfocitos T
CD4. A travds de la autofagia los antigenos citopldsmicos pueden ser transportados para su
presentacidn hacia compartimentos abundantes en moldculas de clase II del MHC. En estos
compartimentos, el antfgeno es procesado en pdptidos que son cargados en las moldculas de
clase II para la estimulacidn de cdlulas T CD4+. Las cdlulas T CD4+ a su vez, una vez
activadas a travds de la interaccidn MHC-TCR, regulan positivamente el proceso de autofagia a
travds de la secrecidn de IFN-y y miembros de la familia de TNF-a (TNF, TRAIL) y el receptor
CD40L. Las Cdlulas T CD4+ polarizadas a Th2 son susceptibles a muerte celular por
macroautofagia. Tornado de: (Schmid D. et al, 2007).
CONCLUSIONES
•
De acuerdo a la evidencia revisada, se puede concluir que la Autofagia es
un proceso biol6gico relacionado directamente con la adaptation y con la
supervivencia celular ya que permite a la cOlula obtener energla en
condiciones adversas.
•
La Autofagia esta Intimamente relationada con numerosos procesos
fisiolOgicos celulares tales como proliferation, diferenciaciOn y apoptosis y
de igual manera en el contexto de inmunidad innata y adaptativa. Cabe
destacar que falta mucho por saber y que numerosas investigationes en
curso podran aportar nuevos datos sobre la relation con el proceso saludenfermedad.
•
La Autofagia participa como defensa innata, al restringir algunas infecciones
virales y la replication de bacterias y pardsitos intracelulares.
•
Las CPAs utilizan el mecanismo de la Autofagia para engullir los agentes
infecciosos y regresarios a los autofagolisosomas donde son finalmente
degradados.
•
Aditionalmente, dado que los patOgenos utilizan armas moleculares
diferentes para modular la Autofagia, entre mas information se tenga sobre
las estrategias utilizadas por estos para inhibir a la autofagia, se ganara
mucho mas conotimiento acerca de la ruta autofagica misma.
•
Por medio de la Autofagia se lleva a cabo la presentation de antlgenos
citosOlicos hacia compartimentos abundantes en molOculas de clase II del
MHC.
•
Los mecanismos de la Autofagia estan estrechamente vinculados a la
defensa contra agentes infecciosos y dado que Ostos pueden de alguna
manera verse involucrados en la modulation de la Autofagia e incluso
inhibiria, es fundamental conocer estas interacciones y con respecto a esto,
determinar en que casos, es factible ya sea estimular o suprimir a la
autofagia para poder evaluar la respuesta inmune que se desencadene en
el hospedero, y as! desarrollar nuevas estrategias para el tratamiento y/o
prevention de enfermedades infecciosas.
6LOSARIO
Agonista Parcial: Variedad de ligando peptfdico de un RCT que s6lo induce
un subgrupo de las respuestas funcionales de los linfocitos T o que induce
respuestas totalmente distintas de las que produce el pdptido intacto (original).
AP: Protefnas adaptadoras. Intervienen en las vias de transducci6n de sefiales
en los linfocitos, actuando como moldculas puente o "andamiaje" para el
reclutamiento de otras moldculas de seftalizacidn.
ATG: Siglas que sirven para nombrar a la familia descubierta de los Genes
Relacionados o Involucrados con la Autofagia.
Autofagia: Proceso celular mediante el cual una membrana envuelve protefnas
u organelos y se dirije al lisosoma, donde se fusiona con su membrana y libera
en su interior el contenido para ser degradado.
AMC: Autofagia mediada por protefnas chaperonas. Proceso por el cual las
protefnas citosolicas son reconocidas por protefnas chaperonas del citosol y
forman un complejo que es reconocido por un receptor de la membrana del
lisosoma que a travds de este se internaliza la protefna en el lisosoma, para ser
degradada por proteasas.
BPIP: Protefna bactericida potenciadora de la permeabilidad.
Catepsinas: Son las proteasas mds abundantes de los endosomas de las
CPAs y probablemente tienen una participacidn importante en la generacidn de
los fragmentos peptldicos de antlgenos extraftos proteicos que se unen al MHC
de clase II.
CD: Cdlulas dendrfticas. Cdlulas accesorias procedentes de la mddula dsea
que se encuentran en los tejidos epiteliales y linfdticos y que se caracterizan
morfoldgicamente por poseer finas proyecciones membranosas. Actdan como
CPA para los linfocitos T vfrgenes y son importantes para la iniciacidn de las
respuestas inmunitarias adquiridas frente a antfgenos protefcos.
Cdlula Plasm&tica: Linfocito B totalmente diferenciado secretor de anticuerpos
que muestra un aspecto histoldgico caracterfstico, con forma ovalada, nucleo
excdntrico y un halo perinuclear.
Cdlulas de Langerhans: Cdlulas dendrfticas inmaduras que forman una trama
contfnua en la capa epiddrmica de la piel y cuya funcidn consiste en atrapar y
transportar los antfgenos proteicos hacia los ganglios linfdticos de drenaje.
Durante su migracidn hacia los ganglios linfdticos, maduran a cdlulas
dendrfticas que pueden presenter de manera eficaz los antfgenos a los
linfocitos T vfrgenes.
C6lulas efectoras: C&ulas que realizan funciones efectoras durante la
respuesta inmunitaria, tales como secreci6n de citocinas (por ejemplo linfocitos
T cooperadores), elimination de los microorganismos (macrdfagos) secreti6n
de anticuerpos (linfocitos B diferenciados).
Citocinas: Protelnas sintetizadas por muchos tipos de c£lulas distintas que
intervienen en las reacciones inflamatorias e inmunitarias. Son los principales
mediadores de la comunicati6n entre las c£lulas del sistema inmunitario.
CLIP: P6ptido de la cadena invariable asociado a la clase II. Resto peptidico de
la cadena invariable que se acopla en la hendidura de uni6n a los p6ptidos que
tiene el MHC de clase II y que se elimina por la accidn de la motecula HLA-DM
antes de que la hendidura sea accesible a los p&ptidos producidos a partir de
antlgenos proteicos extraftos.
CPAs: Cglulas presentadoras de Antlgenos, especializadas en mostrar
fragmentos peptldicos o antlgenos proteicos, asotiados a mol6culas de su
MHC, sobre su superficie, con el fin de activar a los linfocitos T especlficos de
estos antlgenos. Tambten expresan mol6culas coestimuladoras para que la
activaci6n de los linfocitos T sea 6ptima.
"Cross Priming": Presentatidn Cruzada. Mecanismo por el que una CPA
activa o prepara a un LTC CD8+ vlrgen especlfico del antlgeno de una tercera
c6lula (c6lula tumoral o infectada por un virus). Ocurre cuando una CPA ingiere
una c6lula infectada (a menudo apopt6sica) y los antlgenos microbianos se
presentan asotiados al MHC de clase I, exactamente igual que cualquier otro
antlgeno fagocitado.
DAG: Diacilglicerol. Mol6cula de seflalizaci6n unida a la membrana y generada
mediante la hidrdlisis del fosfatidilinositol, durante la activaci6n de los linfocitos
por los antlgenos. Su funtidn consiste en activar una enzima denominada
protefna cinasa C que participa en la generaci6n de factores de transcripcidn
activos.
Defensinas: P6ptidos ricos en cistefna que se encuentran en los grdnulos de
los neutr6filos y que actuan como antibi6ticos de amplio espectro, eliminando
una amplia variedad de bacterias y hongos. La slntesis de defensinas aumenta
en respuesta a citocinas inflamatorias como IL-1 y TNF.
Fc: Fragmento cristalino. Se
de una motecula intacta de
unirse a receptores de la
Complemento. Reciben este
encuentran en soluci6n.
utiliza para referirse a la regi6n conrespondiente
Ig que interviene en las funciones efectoras al
superficie celular o a la proteina C1q del
nombre porque tienden a cristalizar cuando se
GM-CSF: Factor estimulador de las colonias de granulocitos-macr6fagos.
Citosina sintetizada por los linfocitos T activados, los macrdfagos, las c£lulas
endoteliales y los fibroblastos del estroma y que actua en la m6dula 6sea, en
la que incrementa la produccibn de neutrdfilos y monocitos. Es un factor de
activacidn de macrdfagos y estimula la diferenciacidn de las cdlulas de
Langerhans en cdlulas dendrfticas maduras.
GPI: Glucosilfosfatidilinositol.
HLA-DM: Moldcula de pdptidos de intercambio que tiene una funcidn esencial
en la via del MHC de clase II de la presentacidn de antigenos. Se encuentra en
el compartimento endosdmico especializado MHC y facilita la eliminacidn del
pdptido CLIP, derivado de la cadena invariable, asf como la unidn de las
moldculas de clase II del MHC a otros pdptidos. Esta codificado por un gen del
MHC y su estructura es similar a la de las moldculas del MHC de clase II,
aunque no es polimorfa.
Hsc70: Protefna de choque tdrmico de 70 kOa.
Hsc73: Protefna de choque tdrmico de 73 kDa.
li: Cadena invariable. Protefna no polimorfa que se une a moldculas del MHC
clase II recidn sintetizadas en el retfculo endopl&smico. Evita que las
hendiduras de unidn a los pdptidos de las moldculas de clase II del MHC se
ocupen con pdptidos existentes en el retlculo endopldsmico, de modo que
dstos pdptidos puedan asociarse a moldculas de clase I. Facilita el plegamiento
y ensamblaje de las moldculas de clase II y conduce a las moldculas de clase II
recidn formadas hacia el compartimento MIIC endosdmico especializado,
donde tiene lugar la carga de pdptidos.
LAM: Lipoarabinomananas de micobacterias.
LAMP-2A: Protefna de membrana asociada a lisosomas tipo 2A.
LBP: Protefna que une al lipopolisacdrido.
Ligando de Fas: Protefna de membrana que pertenece a la familia de
protelnas TNF y se expresa en los linfocitos T activados. Se une a Fas y
estimula una via se seftalizacidn que conduce a la muerte celular por apoptdsis
de las cdlulas que expresan Fas.
LPA: Ligandos peptfdicos alterados. Pdptidos con residuos de contacto con el
RCT alterados que inducen respuestas distintas de las que provocan los
ligandos peptfdicos originates.
LMP2 Y LMP7: Del inglds Large Multifunctional Proteasome o Gran
Proteasoma Multifuncional. Dos subunidades catalfticas del proteasoma, una
organela que degrada las protefnas citosolicas a pdptidos en la vfa del MHC
clase I. Estdn codificadas por genes del MHC. IFN-y estimula su sfntesis y
amabas son especialmente importantes en la generacidn de pdptidos de unidn
al MHC de clase I.
LPPG: Lipopdptidofosfoglicana de Entamoeba histolytica.
LPS: LipopolisacSrido. Sin6nimo de eridotoxina.
LT: Lipoteicoicos.
Microautofagia: Proceso mediante ei cual se degradan componentes
pequeftos y suele generarse a trav6s de invaginaciones del propio lisosoma
que internalizan componentes que van a ser degradados.
MBL: Lectina que une manosa.
MHC: Complejo Principal de Histocompatibilidad.
MIIC: Compartimento del MHC clase II. Subgrupo de endosomas presentes en
los macrbfagos y en linfocitos B y que son importantes en la via del MHC de
clase II de presentaci6n de antlgenos. El MIIC tiene todos los componentes
necesarios para la formaci6n de complejos entre las mol6culas de clase II y los
pgptidos, incluidas las enzimas que degradan los antlgenos proteicos, las
mol6culas de clase II, la cadena invariable y el HLA-DM.
Motfvos: Secuencias de amino&cidos.
PAMPs: Patrones moleculares asociados a pat6genos.
PAS: Estructura Preautofagosomal.
PEA: Fosfatidiletanolamina.
Pentraxinas: Familia de protelnas plasmdticas formadas por cinco
subunidades globulares id6nticas; una de ellas es la proteina C reactiva, un
reactante de fase aguda.
P6N: Peptidoglicana.
PI3K. Fosfatidilinositol-3-cinasa.
Proteasas: Enzimas que rompen los enlaces peptldicos y que por lo tanto,
degrada las protelnas a peptidos. Distintos tipos de proteasas tienen
especificidades diferentes por enlaces entre aminodcidos especlficos. Las
proteasas de los fagocitos son importantes en la eliminacidn de los
micoorganismos ingeridos durante las respuestas inmunitarias innatas y las
proteasas liberadas por los fagocitos en los focos de inflamaci6n pueden
provocar lesiones mlsticas. Las proteasas de las CPAs son esenciales para la
generaci6n de los fragmentos peptldicos de los antlgenos proteicos que se
unen a las moteculas del MHC durante las respuestas inmunitarias celulares.
PRPs: Receptores de reconocimiento de patrones.
Rapamicina: Inmunosupresor, cuyo efecto principal consiste en inhibir la
proliferaci6n de linfocitos T.
TCR: Receptores de las Cdlulas T.
Receptores "Scavenger": Familia de receptores de la superficie celular
expresados en los macrdfagos y definidos originalmente como receptores
involucrados en la endocitosis de partlculas de Lipoprotefnas de baja densidad
oxidadas o acetiladas, pero que tambidn se unen y participan en la fagocitosis
de distintos microorganismos.
RM: Receptor de manosa.
TAP: Transportadores asociados con el procesamiento de antlgenos.
TLRs: Receptores Homdlogos a Toll.
TNF: Factor de Necrosis Tumoral. Citocina producida principalmente por los
fagocitos mononucleares activados y que actCia estimulando la atraccidn de
neutrdfilos y monolitos hacia los focos de infeccidn y activando a las cdlulas
que llegan para que erradiquen los microorganismos. Estimula a las cdlulas de
los endotelios vasculares para que expresen nuevas moldculas de adhesidn,
induce la secrecidn de quimiocinas en los macrdfagos y cdlulas endoteliales y
favorece la apoptosis de las cdlulas diana. En las infecciones graves se
sintetizan cantidades importantes de TNF que ejercen efectos sistdmicos, tales
como induccidn de fiebre, slntesis de protelnas de fase aguda en el hlgado.
TOR: Target of Rapamycin. Protefna del bianco de rapamicina.
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