Aminoácidos en alimentos

ANÁLISIS DEL CONTENIDO
AMINOACÍDICO DE LOS
ALIMENTOS CON FINES
NUTRICIONALES
ÍNDICE.
1.
Introducción. ................................................................................................. 3
2.
Objetivos. ....................................................................................................... 4
3.
Métodos de análisis de aminoácidos en alimentos. ....................................... 5
4.
Técnicas de separación de aminoácidos. ....................................................... 7
5.
4.1.
Cromatografía en Capa Fina. ............................................................. 7
4.2.
Electroforésis. .................................................................................... 8
4.3.
Cromatografía de Gases. .................................................................... 9
4.4.
Analizador automático de aminoácidos-HPLC.................................. 9
Reactivos de derivatización. ........................................................................ 11
5.1.
Ninhidrina. ....................................................................................... 12
5.2.
OPA.................................................................................................. 12
5.3.
Fluorescamina. ................................................................................. 13
5.4.
PITC. ................................................................................................ 13
5.5.
Cloruros de dansilo y dabsilo. .......................................................... 14
5.6.
FMOC-Cl. ........................................................................................ 14
5.7.
NBD-Cl y NBD-F. ........................................................................... 15
5.8.
Otros derivados del isotiocianato. .................................................... 15
5.9.
Reactivos mixtos. ............................................................................. 16
6.
Derivatización pre-columna frente a post-columna. .................................... 17
7.
Bibliografía. ................................................................................................. 19
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INTRODUCCIÓN.
Los aminoácidos, péptidos y proteínas son componentes importantes de los alimentos. Por un lado proporcionan los elementos necesarios para la síntesis proteica. Por
otro lado, los aminoácidos y péptidos contribuyen directamente al sabor de los alimentos
y son precursores de los componentes aromáticos y las sustancias coloreadas que se forman mediante las reacciones térmicas y/o enzimáticas que ocurren durante la obtención,
preparación y almacenamiento de los mismos.
Aminoácido. Los aminoácidos son ácidos carboxílicos que contienen un grupo
amino. Existen unos cien en la naturaleza. En el hidrolizado total de las proteínas existen veinte aminoácidos que tienen, con algunas excepciones, la fórmula general siguiente:
R-CH-COOH
NH2
En el caso más sencillo, el radical R es un átomo de Hidrógeno (ácido aminoacético o glicina), en los demás aminoácidos R es un resto alifático, aromático o heterocíclico, que puede ser portador de otros grupos funcionales.
Existen diez aminoácidos, denominados aminoácidos esenciales, que el organismo
es incapaz de sintetizar y que deben ser aportados por la alimentación. El organismo no
los puede sintetizar porque carece del mecanismo necesario para elaborar los -cetoácidos correspondientes; se ha comprobado que si se le suministran éstos y sales de amonio
es capaz de elaborarlos.
Los aminoácidos constituyentes de las proteínas son, aproximadamente, veinte:
alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutámico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina.
Todos ellos son -aminoácidos excepto dos, que son iminoácidos, la prolina y
la hidroxiprolina, que también pueden considerarse como aminoácidos por su similitud
estructural. Se les llama -aminoácidos porque el grupo amino está unido al carbono 
de la cadena que es, por convenio, el átomo de carbono adyacente al grupo carboxilo.
Los aminoácidos contienen tantos grupos ácidos como básicos, por lo que tienen
propiedades ácidas y básicas débiles y se les llama anfolitos. Se comportan como anfipróticos porque pueden aceptar o donar electrones. Las moléculas de aminoácidos
transportan una carga negativa y otra positiva, lo que da como resultado una carga total
nula, esta forma se conoce como “zwitterion” del aminoácido. La carga total transportada por un aminoácido depende del pH de la solución y de los valores de la constante
de acidez de los grupos ionizables presentes. Si el pH es mucho mayor que el valor de
la constante de un grupo, se libera un protón y la molécula tendrá una carga negativa,
pero si el pH es menor, tendrá carga positiva. El hecho de que a diferentes valores de
pH el aminoácido tenga distintas formas y lleve distintas cargas netas se utiliza en muchos métodos analíticos, como en la electroforesis y en la cromatografía de intercambio
iónico. El punto iso-iónico de una molécula es el pH en el que el número de cargas negativas debidas a los protones perdidos es igual al número de cargas positivas debidas a
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los protones ganados, entonces predomina la forma zwitteriónica. El punto isoeléctrico
es el pH en el que las moléculas no presentan migración en un campo eléctrico y puede
determinarse experimentalmente por electroforesis; en los aminoácidos es igual que el
punto iso-iónico.
Un aspecto importante en el análisis de los aminoácidos es el hecho de que no se
pueden detectar en el visible-UV. Existen varios reactivos que reaccionan con los aminoácidos dando compuestos coloreados o fluorescentes y que, por tanto, pueden utilizarse para análisis cualitativos o cuantitativos. Esto es lo que se denomina derivatización
de los aminoácidos. Los métodos fluorimétricos tienen muchas ventajas respecto a la
espectrofotometría para el análisis de aminoácidos.
Necesidades proteicas. Se requiere un criterio para fijar las necesidades o exigencias en proteínas para el ser humano. Por ello se establece una “proteína de referencia” o “patrón”.
Conocida la composición en aminoácidos de las proteínas de los distintos alimentos que se consumen y cuales han demostrado poseer mayor valor biológico, a saber: la
de la leche, la del huevo y las de la carne; y teniendo en cuenta la composición cualicuantitativa en aminoácidos, se ha adoptado dicha “proteína de referencia” o “patrón”.
En la calidad de las proteínas influye el contenido en aminoácidos esenciales, y es
importante la presencia de “limitantes”. En efecto, se llama así al aminoácido esencial
que en una proteína dada se encuentra en cantidad relativa más baja con respecto a la
proteína patrón porque limita el aprovechamiento de esa proteína a los fines biológicos.
Es importante determinar el contenido en aminoácidos, en conjunto, para estimar
el grado de proteólisis enzimática que ha sufrido el producto, así como la proporción de
cada uno de ellos, como componentes de la proteína, cuando se desea establecer su valor
biológico.
La determinación de aminoácidos en alimentos permite extraer algunas conclusiones acerca de su composición; por ejemplo, la gelatina usada como espesante se diferencia rápida y sencillamente, de otros hidrocoloides (grasas vegetales, almidón, etc.), en
función de su composición aminoacídica.
OBJETIVOS.
En primer lugar recogemos los distintos métodos oficiales y estándares para el
análisis de aminoácidos en alimentos, encontrados en Métodos Oficiales de Análisis
editados por el Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación (1986) y en Methods of
Analysis of AOAC (1995), así como algunos métodos recomendados.
Posteriormente, en la discusión, tratamos sobre las distintas técnicas de separación
(cromatográficas y electroforesis), del analizador automático de aminoácidos, de los
distintos reactivos derivatizantes y el tipo de detección apropiada para cada uno, y las
ventajas y desventajas de la derivatización, tanto antes (precolumna) como después
(postcolumna) de la separación.
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MÉTODOS DE ANÁLISIS DE AMINOÁCIDOS EN ALIMENTOS.
Métodos oficiales.
Determinación de prolina en miel.
Reacción de la prolina con ninhidrina en medio ácido y posterior determinación a
517 nm de la absorbancia del compuesto formado.
Preparación de la muestra: Suponiendo que la miel ya ha sido separada del panel
por escurrimiento a través de un filtro de luz de malla, optaremos por realizar el siguiente paso, la homogeneización. Reblandecer la muestra calentando entre 25-30ºC agitándola al mismo tiempo. Una vez homogeneizada se calienta a 50ºC al baño María hasta
que se consiga la fusión y se deja enfriar rápidamente.
Determinación de hidroxiprolina en carnes.
Previa hidrólisis en medio ácido de las proteínas y oxidación de la hidroxiprolina.
El derivado formado con el p-dimetilaminobenzaldehido se valora colorimétricamente a
560 nm..
Preparación de la muestra: Primero, se quitan las diferentes capas protectoras del
producto para poder tomar una muestra representativa. Se parten trozos de 0,5 - 1 cm y
se cortan dichos trozos en pequeños cubos. Después se pasan por una trituradora varias
veces hasta conseguir una mezcla homogénea. Se guarda en frascos limpios y secos
para prevenir la pérdida de humedad. Se conserva en refrigeración de forma que evite
su deterioro y cualquier cambio en su composición.
Métodos estándares.
Determinación de prolina en miel.
Determinación de hidroxiprolina en carnes.
Determinación de aminoácidos en preparados vitamínicos.
Determinación de lisina en suplementos nutricionales.
Los grupos amino de las proteínas reaccionan con DNFB dando lugar a
los derivados lisina-DNFB. Posteriormente se produce una hidrólisis ácida y la determinación en un analizador de aminoácidos de la lisina.
Determinación de triptófano en alimentos.
La muestra es hidrolizada en medio básico, seguidamente se realiza un
ajuste de pH. El triptófano es separado por cromatografía líquida de intercambio iónico
y determinado por un detector UV a 280 nm.
Determinación de aminoácidos sulfurados en alimentos (metionina y cisteína).
En primer lugar las proteínas son oxidadas con ácido perfórmico para
conseguir ácido cisteico y metionina sulfonada, luego se realiza una hidrólisis ácida con
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HCl. Realizamos una cromatografía de intercambio iónico aplicándole un detector que
sea capaz de medir a 570 nm.
Métodos recomendados.
Análisis de aminoácidos por HPLC seguido del método del fenilisotiocianato.
(Lab. Enzymology and Physical Chemistry of Proteins).
A continuación, incluimos un protocolo típico del análisis de aminoácidos en
harinas:
 Dejar a reflujo la muestra con HCl 6N durante 24 horas. Evaporar a sequedad
en evaporador rotatorio.
 Añadir agua y evaporar a sequedad.
 Realizar el examen cromatográfico de una solución problema al 10% de la
muestra tratada en solución acuosa de isopropanol a 10%.
 El sistema solvente: n-butanol/Hac/H2O en proporción 12:3:5.
 Soporte papel Whatman nº1.
 Longitud del papel 50 cm.
 Método cromatográfico descendente.
 Duración: 12 horas.
 Solución reveladora: solución acetónica de ninhidrina al 0.25%.
 Condiciones de revelado: 20 min a 105ºC.
 Comparación frente a muestras puras de clorhidratos de aminoácidos.
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TÉCNICAS DE SEPARACIÓN DE AMINOÁCIDOS.
A menudo es necesario identificar y cuantificar los aminoácidos individuales de
una mezcla, tanto en estudios metabólicos como en las investigaciones de la estructura
de las proteínas.
El uso de la cromatografía en capa fina o de la electroforesis son adecuados para
averiguar el número y la cantidad relativa de los diferentes aminoácidos presentes en
una muestra (análisis cualitativo), aunque para los análisis cuantitativos es necesaria la
cromatografía de gases o un analizador de aminoácidos.
Cromatografía en capa fina.
Una importante aplicación de la cromatografía en capa fina es la de servir como
guía para el desarrollo de las condiciones óptimas para realizar separaciones por cromatografía de líquidos en columna. Proporciona una idea rápida de los aminoácido mayoritarios existentes en la muestra. Las ventajas de este procedimiento son la rapidez y el
bajo coste de los ensayos experimentales. De hecho, algunos cromatografistas son de la
opinión de que los ensayos en capa fina deberían preceder siempre al uso de la columna
En la cromatografía de papel se pueden aplicar grandes volúmenes de muestra, lo
que permite la elución posterior de un aminoácido en particular para su posterior purificación y análisis, factor que tiene gran importancia en la identificación de un constituyente desconocido de la muestra.
Antes de la realizar la cromatografía, es necesario eliminar las sustancias que interfieren, tales como proteínas, carbohidratos y sales, lo que puede hacerse con una resina de intercambio iónico. Los aminoácidos retenidos pueden eluirse a continuación
añadiendo a la columna un pequeño volumen de amoniaco y lavando después con agua
destilada.
La separación de los aminoácidos se basa en que éstos se reparten de modo diferencial entre la fase móvil y la fase estacionaria. Generalmente se realizan por el procedimiento ascendente: introduciendo el borde inferior de la placa cromatográfica en el
eluyente que será succionado por acción de las fuerzas capilares del recubrimiento de la
superficie del la placa.
La identificación de un aminoácido se realiza comparando los valores de Rf (factor
de retraso: cociente entre la distancia recorrida por el compuesto desde el origen y la
distancia recorrida por el solvente desde el origen), con otros tomados como referencia,
debiéndose utilizar al menos tres sistemas de disolventes distintos para establecer su
identidad con un cierto grado de seguridad.
La naturaleza de los aminoácidos es un factor importante a la hora de elegir un disolvente, ya que los diferentes solventes pueden permitir una mejor resolución de los
componentes ácidos, básicos o neutros. En general, aumentando la proporción de agua
en el disolvente se incrementan todos los valores de Rf e introduciendo pequeñas cantidades de amoniaco aumentan los valores del factor de retraso de los aminoácidos básicos. Algunos disolventes contienen compuestos nocivos, por ejemplo el fenol, lo que
restringe su uso rutinario. La composición química del disolvente puede también limitar
el rango de reactivos de localización que pueden aplicarse satisfactoriamente. Por
ejemplo, el ácido sulfanílico no puede utilizarse con disolventes fenólicos.
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El poder de resolución de la cromatografía de capa fina puede aumentarse empleando técnicas bidimensionales, o sea, utilizando dos disolventes distintos. Se aplica
una cantidad de muestra mayor que la utilizada generalmente para la separación cromatográfica de una dimensión (aproximadamente el triple) en una esquina del papel o placa
y se hace correr en una dimensión. Entonces el cromatograma se seca completamente al
aire, se gira un ángulo de 90º y se desarrolla con el segundo solvente. Tras un nuevo
secado, se sumerge en el reactivo de localización elegido. En la cromatografía de dos
dimensiones, la composición de los dos disolventes es la que determina el orden en que
debe utilizarse.
Las separaciones bidimensionales permiten la resolución de un gran número de
aminoácidos presentes en una muestra, ya que los que tienen una movilidad similar en la
primera dimensión se separan en la segunda. Ésto es muy útil en la detección de los
componentes que están en muy baja concentración y pueden quedar enmascarados por
otros compuestos que tengan una concentración alta cuando se utiliza la cromatografía
en una dimensión.
Electroforesis.
La electroforesis es un proceso en el cual las especies cargadas (iones o partículas
coloidales) se separan en función de su distinta velocidad de migración en un campo
eléctrico. Desde los años cincuenta, las separaciones electroforéticas fueron la piedra
angular de gran parte de la investigación de químicos y biólogos moleculares relacionada con la separación y análisis de proteínas, polinucleótidos y otros biopolímeros. Estas
separaciones han sido (y continúan siendo) muy eficientes y de una extensa aplicación,
pero por desgracia, son unas técnicas muy lentas y laboriosas que tienen tendencia a ser
poco reproducibles.
A mediados de los ochenta, esta situación cambió espectacularmente con la aparición de aparatos comerciales para realizar electroforesis analíticas a microescala en columnas capilares (electroforesis capilar).
El hecho de que los distintos aminoácidos transporten diferentes cargas netas a un
pH particular, permite separarlos de una mezcla mediante la electroforesis de alto o bajo
voltaje. Los medios utilizados más frecuentes como soporte son el papel o las placas de
capa fina (celulosa o gel de sílice), pudiéndose utilizar para visualizar las manchas, los
reactivos de localización que describiremos más adelante. Las separaciones se pueden
realizar más fácilmente con alto que con bajo voltaje, siendo una de las principales ventajas de la primera, el que las sales y otras sustancias presentes en la muestra afectan en
menor extensión la calidad del electroforetograma.
A pesar de que se pueden conseguir separaciones electroforéticas con támpones a
distintos pH, en la práctica los valores de pH escogidos están entre 2 y 5’3. A pH 2 todos los aminoácidos tienen carga positiva y los de tipo básico que tienen la mayor carga
positiva migran más rápidamente hacia el cátodo, mientras, que a pH 5 los aminoácidos
se dirigen hacia ambos electrodos, dependiendo de la carga transportada. Las separaciones a pH 5’3 se utilizan para determinar la naturaleza ácida o básica de un aminoácido desconocido.
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Cromatografía de gases.
Se han hecho muchos ensayos para aprovechar la velocidad y sensibilidad que
ofrece la cromatografía de gases, pero aunque se han realizado considerables progresos
en el desarrollo de tales métodos, aún no se utiliza de forma rutinaria para el análisis de
aminoácidos en muestras biológicas. La razón de ésto radica en el hecho de que los
aminoácidos, aunque similares, son compuestos químicamente heterogéneos y además
no son suficientemente volátiles a menos que se conviertan en algún derivado apropiado. Aparecen dificultades no sólo a la hora de elegir el método de obtención de tales
derivados, sino también en la selección de una fase estacionaria que sea capaz de resolver los derivados de todos los elementos de un grupo tan diverso de compuestos. A lo
hora de elegir el detector aparecen también problemas similares.
Analizador automático de aminoácidos - HPLC.
Existen dos técnicas para la determinación de aminoácidos a través de cromatografía líquida: cromatografía de reparto en fase reversa y cromatografía de intercambio
iónico.
La cromatografía de líquidos de alta resolución es la técnica de separación más
ampliamente utilizada. Las razones más importantes son su sensibilidad, su fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la separación de
especies no volátiles o termolábiles y, sobre todo, su gran aplicabilidad a sustancias que
son de primordial interés en la industria, en muchos campos de la ciencia y para la sociedad en general. Algunos ejemplos de estos materiales incluyen los aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos y otros.
Cromatografía de reparto en fase reversa.
La cromatografía en fase reversa consiste en un disolvente fundamentalmente polar como fase móvil y una cadena hidrocarbonada ligada como fase estacionaria. Algunas de las ventajas más sustanciales de esta alternativa son su gran reproducibilidad,
tiempos de retención cortos, velocidad de muestreo alta, sistema cromatográfico simple
y amplio campo de aplicación. Por todo ello, las aplicaciones son cada vez más numerosas.
La selectividad se basa en las interacciones específicas entre el soluto y la fase
móvil, ya sea de tipo polar, de formación de puentes de hidrógeno o mediante equilibrios secundarios provocados al variar la composición de la fase móvil (ácido-base,
formación de complejos o pares iónicos, adición de complejos metal-ligando o reactivos
quirales para separar los isómeros ópticos, etc.).
Cromatografía de intercambio iónico.
La cromatografía iónica está relacionada con los métodos modernos y eficaces para la determinación de iones que se basan en el uso de resinas de intercambio iónico.
Existen métodos automatizados para la separación y detección de aminoácidos y
otras especies iónicas en mezclas complejas. El desarrollo de la HPLC moderna empe9
zó a finales de los años sesenta, pero su aplicación a la separación por intercambio iónico se retraso debido a la inexistencia de un método general y sensible para la detección
de especies como los cationes alcalinos y alcalinotérreos, y aniones como los haluros,
acetato y nitrato. Esta situación se remedió en 1975 al desarrollarse por técnicos de
Dow Chemical Company la técnica de supresión del efluente, la cual hace posible la
detección conductimétrica de los iones eluídos. El analizador de aminoácidos, con el
que se lleva a cabo la cuantización de los aminoácidos se basa en esta técnica.
Analizador automático de aminoácidos. La separación de aminoácidos fue el
primer proceso cromatográfico automatizado con derivatización post-columna. La separación fue llevada a cabo por Moore, Spackman y Stein (1958), mediante un intercambio iónico, seguido de su cuantización de cada componente eluido de la columna por
reacción con ninhidrina y posterior detección en el visible. Este método se ha realizado
durante más de treinta años, en cualquier laboratorio de proteínas.
El equipo usado actualmente se basa en el original pero introduciendo algunas
modificaciones para conseguir un mejor grado de eficacia. Consiste en bombear tampones de pH o de fuerza iónica variables, a través de una columna termostatizada. Entre
las novedades está la fabricación de resinas de alta calidad, desarrollo del HPLC, sistemas de automatización sofisticados y un aumento en la sensibilidad de los métodos de
detección.
La separación tiene lugar en una columna de resina de poliestireno sulfonado. Inicialmente el pH de la fase móvil es bajo, por lo que los aminoácidos cargados positivamente se verán atraidos por los grupos sulfurosos ( SO3- ). Conforme se va aumentando
el pH del támpon los aminoácidos se eluyen diferencialmente al disminuir su carga positiva y ser menos atraidos por el anión. A pH 3.5 los aminoácidos con un grupo ácido
extra, de su cadena tendrán muy poca afinidad por la resina y serán los primeros en salir
de la columna, mientras que los que tengan un grupo extra ionizable capaz de transportar una carga positiva (e.g. lisina, histidina) serán retenidos fuertemente por la resina y
se eluirán sólo cuando el pH haya aumentado sustancialmente y se haya reducido su
carga neta positiva.
Además del pH también hay que considerar la concentración del tampón eluyente,
pues influye en la elución de tal modo que cuando la concentración de ion aumenta en
mismo, los aminoácidos se eluyen más rápidamente.
Las interacciones no iónicas entre los aminoácidos y la resina también influyen en
la secuencia de elución, permitiendo que algunos aminoácidos que tienen un comportamiento similar se eluyan de forma separada.
La resolución cuantitativa de mezclas de aminoácidos se consigue variando la
composición del támpon, bien incrementando del pH y manteniendo constante la concentración, o viceversa, o incluso variando ambos. Hay otros factores menos significativos en la calidad de la separación como son la temperatura, la velocidad de flujo del
tampón o el tipo de catión utilizado.
Aspectos prácticos del analizador:
Columna: en los analizadores tipo se usan dos columnas, una para separar los
aminoácidos ácidos y neutros y otra para los básicos. Las de vidrio o acero inoxidable
dan picos estrechos y altos, mejorando la separación de aminoácido similares.
Solución tampón: suele ser citrato sódico o de litio, al que se le añade un detergente, un antioxidante y un conservante. Actualmente se utilizan dos disoluciones tampón,
una ácida y otra básica. Se mezclan en proporciones variables para conseguir un au10
mento de pH. De esta forma se mejora la separación disminuyendo el tiempo de análisis
y se eliminan las fluctuaciones bruscas de la linea base debidas a cambios repentinos en
el tampón, como sucedia con anteriores técnicas.
Temperatura: puede ser constante para evitar cambios en el pH y en la ionización
de los aminoácidos, o bien puede utilizarse un programa de temperaturas que implica un
cambio de ésta en diversos momentos del proceso.
Flujo de la columna: se requiere un flujo de tampón constante para permitir la reproducibilidad. Se consigue por uso de bombas de presión o de desplazamiento constante.
Detección: es necesaria una segunda bomba para el reactivo derivatizante (generalmente ninhidrina) que se ha de mezclar con el eluyente de la columna. Cuando la
reacción ha tenido lugar, la corriente se controla en una célula de flujo de un colorímetro
o un fluorímetro. Se mide la absorbancia continuamente a 570 y 440 nm. para detectar
los amino e iminoácidos respectivamente.
El análisis aminoacídico es un buen ejemplo del hecho de que raramente hay un
único sistema de separación para problemas analíticos, sino que de la elección del sistema apropiado depende el problema analítico. Por ejemplo, de la matriz en la cual los
aminoácidos van a ser determinados, de la sensibilidad deseada y en la velocidad requerida para el análisis.
Los actuales métodos de detección para aminoácidos dependen de la reacción del
grupo amino primario del aminoácido para formar un derivado coloreado o fluorescente,
esta derivatización tiene lugar tanto antes como después de que la separación de los
aminoácidos haya sido efectuada. La menor variedad de tipos de aminoácidos en comparación con las estructuras de los péptidos hace que los modos de HPLC disponibles
para el investigador sean la cromatografía de intercambio catiónico (CEC), y la cromatografía de fase reversa (RPC). La cromatografía en fase reversa es más apropiada para
la separación de derivados aminoacídicos que para aminoácidos libres.
La elección de HPLC está limitada por la elección del agente de derivatización
y/o la decisión de usar tanto pre- como post-columna de derivatización, de hecho, algunos de los más interesantes descubrimientos llevados a cabo en la separación de aminoácidos por HPLC reside en el desarrollo y optimización de nuevos agentes de derivatización. Reacciones muy rápidas como la derivatización con fluorescamina y ortoftaldehido (OPA) están siendo empleadas en aumento con el clásico método de la ninhidrina.
REACTIVOS DE DERIVATIZACIÓN.
El problema de la derivatización de aminoácidos está concentrado en la detección
selectiva y sensible de los mismos. Las cantidades de muestra disponibles son muy pequeñas, ya sean proteínas cuya estructura vaya a ser determinada o muestras de investigaciones en el campo de la ciencia alimenticia, de modo que la reacción de derivatización debería permitir la detección en el rango del pmol.
La derivatización puede ser llevada a cabo antes de la separación. Debería ocurrir
cuantitativamente para producir productos sencillos para cada aminoácido, el reactivo
no debería interferir. Es probable que la derivatización genere productos que son más
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parecidos el uno al otro, de cualquier modo, la alta selectividad de separación de los
sistemas cromatográficos implica que raramente haya problemas. La derivatización
precolumna puede ser llevada a cabo automáticamente inmediatamente antes de la separación.
La derivatización tras la separación requiere, en general, una complejidad instrumental mayor. Los instrumentos comerciales a menudo necesitan ser optimizados para
alcanzar sensibilidad de detección más alta.
Ninhidrina.
La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) reacciona con los aminoácidos en medio ácido (pH entre 3 y 4) y en caliente produciendo amoniaco, dióxido de carbono y un
complejo de color púrpura azulado. Todos los aminoácidos primarios forman el mismo
complejo tras su reacción con ninhidrina, haciendo este agente inapropiado para la precolumna de derivatización. La mayoría de columnas de HPLC de intercambio catiónico
utilizadas para el análisis de aminoácidos con postcolumna basada en la ninhidrina todavía emplean resinas de sulfonato de poliestireno/divinilbenceno.
Los primeros sistemas automáticos para el análisis de aminoácidos descritos en
1958 basados en la separación de aminoácidos por cromatografía de intercambio catiónico y posterior reacción con ninhidrina, permanecen hoy día como la metodología más
fiable para el análisis de aminoácidos en péptidos y proteínas. Analizadores comerciales
basados en esa metodología están disponibles en compañías como Beckman y Pharmacia. A altas temperaturas ( 100ºC), todos los aminoácidos primarios reaccionan con
dos moléculas de ninhidrina para formar un cromóforo (púrpura de Ruthermann) con
máxima absorción a 570 nm.
En la cuantificación de los aminoácidos individuales puede utilizarse el coeficiente de absorción molar del compuesto coloreado, aunque su valor varía de un aminoácido
a otro y debe determinarse para las condiciones particulares del análisis. Sin embargo,
se debe escoger un valor de referencia para utilizarlo en la cuantificación de los aminoácidos totales de una mezcla.
La reacción coloreada de la ninhidrina se utiliza en trabajos analíticos, así como en
la visualización de las bandas de los aminoácidos después de su separación por electroforesis o por cromatografía. El reactivo que se utiliza en estas circunstancias se prepara
generalmente disuelto en etanol; cuando se añade 2,4-6colidina, las diferencias de color
entre cada mancha ayudan a la identificación de los distintos aminoácidos.
o-Ftaldehido (OPA).
El OPA fue originalmente introducido como un reactivo alternativo a la ninhidrina
en la postcolumna de derivatización y suministró un significante incremento en la sensibilidad. Los aminoácidos reaccionan con el OPA en presencia de un reductor fuerte, en
condiciones alcalinas (pH 9-11), dando un compuesto fluorescente. La separación en
fase reversa seguida de detección fluorescente constituye un método de detección rápido, sensible y selectivo para todos los aminoácidos con grupos amino primario. Los
péptidos son menos reactivos que los -aminoácidos y las aminas secundarias no reaccionan.
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Aunque el OPA fue originalmente aplicado solamente para postcolumnas de derivatización ahora está ampliamente usado como un agente para precolumnas. Mientras
que la separación de aminoácidos siguiente a una precolumna de derivatización está
llevada a cabo por cromatografía de fase reversa, ambas, cromatografía de fase reversa y
cromatografía de intercambio catiónico pueden ser utilizadas cuando el OPA es el agente de derivatización en la postcolumna.
Una desventaja del OPA reside en la relativa inestabilidad de sus derivados, quizás añadida a los problemas de cuantización, aunque ésto no es de gran dificultad en la
técnica de derivatización en postcolumna. Sin embargo, en precolumna y desde el punto
más bajo de pH 7’2 hasta un pH típico de reacción de 9’5, los productos deben ser inmediatamente aplicados a un sistema cromatográfico. Bajando estos dos pH se amortigua la reacción y sirve para estabilizar ligeramente los productos de reacción. La mayor
desventaja del OPA es que no reacciona con aminas secundarias (prolina e hidroxiprolina) aunque ésto puede ser solventado con su oxidación por cloramina-T o hipoclorito.
Una estratégica combinación del uso de OPA con FMOC (9-fluorenilmetil cloroformato) ha sido recientemente introducida para solucionar esta deficiencia.
El método con OPA se utiliza específicamente con precolumna de derivatización
para el análisis de aminoácidos porque es más sensible y tarda menos tiempo que otros
métodos HPLC.
Fluorescamina.
La fluorescamina fue también introducida como una posible alternativa a la ninhidrina en postcolumnas de derivatización. Todas las aminas primarias reaccionan con la
fluorescamina en medio básico (pH 9-11) dando un producto fluorescente con un incremento en sensibilidad de detección mayor que la ninhidrina, aunque la fluorescamina
por si misma no tiene fluorescencia. El producto fluorescente es inestable en disolución
acuosa y el reactivo debe prepararse en acetona. Las aminas secundarias no reaccionan,
a menos que se conviertan previamente en aminas primarias, lo que puede hacerse con
N-clorosuccinimida, hipoclorito o cloramina-T. Aunque el reactivo tiene interés por su
rápida velocidad de reacción con los aminoácidos a temperatura ambiente, la reacción
no es tan sensible como la de la ninhidrina.
Isotiocianato de fenilo (PITC).
El PITC, también conocido como reactivo de Edman, ha sido largamente usado
para la secuenciación de polipéptidos y proteínas y fue introducido para el análisis de
aminoácidos al principio de los años ochenta. Es actualmente, el agente más usado para
precolumnas de derivatización, seguido de cromatografía en fase reversa, en análisis de
aminoácidos, siendo empleado para mezclas de aminoácidos de una gran variedad de
fuentes.
En lugar de ser analizados como derivados de PTH (feniltiohidantoin), como ocurre durante la secuenciación de péptido o proteínas, los aminoácidos son analizados como derivados de PTC (feniltiocarbamol). Así, a pH alcalino, los aminoácidos primarios
y secundarios producen derivados de PTC, que pueden ser registrados por absorbancia
UV (240-255 nm) con un límite de detección en el rango de 5 a 50 pmol. Todos los
aminoácidos forman derivados mono-PTC, excepto lisina y cisteína, que producen do13
bles formas PTC. Los productos son relativamente estables, aunque alguna conversión
al derivado PTH puede ocurrir si el pH no se controla adecuadamente.
Aunque la metodología PITC puede ser considerada superior al resto de las técnicas en un gran número de aspectos, tiene una mayor desventaja en que algunos derivados PTC de aminoácidos son fuertemente afectados por la presencia de algunas sales,
cationes divalentes, metales e iones tampon. Así, mientras el acetato amónico, el cloruro sódico y el borato sódico se ha encontrado que no tienen efecto en aminoácidos PTC,
otras sales, como el fosfato de sodio y el bicarbonato de sodio si que lo tienen. Además
la contaminación por trazas de iones metálicos se ha encontrado que reduce la formación de aminoácidos PTC. Incluso añadiendo EDTA se han conseguido mejores rendimientos para la derivatización.
Cloruro de dansilo y cloruro de dabsilo.
El cloruro de dansilo (cloruro de 1-dimetilaminonaftaleno-5-sulfonilo) fue inicialmente introducido para el análisis del nitrógeno terminal de los aminoácidos en péptidos y proteínas, un propósito para el cual todavía es empleado. Reacciona con aminas
primarias y secundarias para producir derivados fluorescentes. Su aplicación adolece de
la presencia de numerosos productos laterales y de la formación de múltiples derivados
de ciertos aminoácidos. Además de ésto está el requerimiento de un largo tiempo de
reacción. Así, aunque el cloruro de dansilo es frecuentemente empleado por lo investigadores para la derivatización en precolumna seguida de cromatografía en fase reversa,
este método nunca ha sido ampliamente aceptado para el análisis automático de aminoácidos.
El cloruro de dabsilo (cloruro de dimetilaminoazobencenosulfonilo) es un agente
muy relacionado con el cloruro de dansilo. Fue introducido y desarrolla por Chang y
sus colaboradores, para la detección de aminoácidos en el rango del visible y en el nivel
del pmol. Reacciona con aminoácidos primarios y secundarios para producir derivados
que tienen una gran absorbancia en el rango del visible. La reacción se realiza a unos
70ºC y un pH de 8 a 8’5, produciendo derivados altamente estables en 10 o 12 minutos.
Se forman mono y bis-derivados de lisina, tirosina e histidina.
A pesar de las ventajas sobre el cloruro de dansilo como agente de derivatización,
la técnica del cloruro de dabsilo tiene una tolerancia limitada a la presencia de sales, y
aun no está clara cómo se vería afectada la detección a altos niveles de sensibilidad
(rango del 10 al 20 pmol) por la presencia de metales, sales y otros contaminantes.
Aunque no se usa ampliamente en análisis automáticos de aminoácidos como la
ninhidrina, el OPA y el PITC, una adaptación comercial del método del cloruro de dabsilo está disponible en Beckman Instruments.
Cloruro de 9-Fluoroenilmetil cloroformato (FMOC-Cl).
El FMOC-Cl reacciona con grupos amino para formar derivados carbamados altamente fluorescentes y estables. Este agente altamente reactivo, originalmente y todavía usado como grupo amino protector en síntesis de péptidos, fue primeramente aplicado como un agente derivatizante en precolumna para análisis de aminoácidos. El
FMOC-Cl reacciona con todos los aminoácidos a pH alcalino y temperatura ambiente
para producir derivados aminoacídicos altamente estables que tienen una fluorescencia
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comparable a los derivados de OPA. Se pueden formar mono- y bis-derivados con histidina, tirosina y lisina. Las proporciones relativas de estos derivados varían en función
del pH y de la proporción de reactivo y aminoácido.
Durante la reacción con FMOC-Cl, los productos de hidrólisis del reactivo que se
forman tienen fluorescencia parecida a la de los derivados aminoacídicos. Estos productos interfieren en la separación por cromatografía de fase reversa a menos que sean eliminados por el disolvente orgánico de extracción, antes de aplicar la muestra a la columna de cromatografía de fase reversa. Una versión automatizada de este procedimiento de derivatización ha sido desarrollada y comercializada.
Betnér y Foldi solucionaron el problema de las interferencias por la elución de
grandes picos de FMOC-Cl y sus productos de hidrólisis, FMOC-OH, que son eluídos
en la misma región cromatográfica que muchos de los aminoácidos FMOC, por derivatización del volumen de exceso FMOC-Cl con una amina hidrofóbica. El derivado resultante es eluído más tarde en el cromatograma después de todos los aminoácidos
FMOC.
Una combinación entre OPA/FMOC ha sido descrita, la cual usa un analizador
comercialmente disponible (Hewlett-Packard Amino Quant). La reacción de aminoácidos primarios es llevada a cabo inicialmente por OPA, seguida por la reacción de prolina e hidroxiprolina con FMOC. La determinación de la fluorescencia para los derivados
de aminoácidos primarios OPA y FMOC-prolina es llevada a cabo entonces a longitudes
de onda apropiadas.
7-cloro y 7-fluro-4-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole (NBD-Cl y NBD-F).
Reactivos de derivatización basados en la estructura del nitrobenzofurazan, NBDCl y NBD-F, tienen probada utilidad para aplicaciones específicas en el análisis de todos
los aminoácidos.
El NBD-Cl fue introducido por Ghosh y por Whitehouse como un agente fluorigénico para aminas, incluyendo aminoácidos y posteriormente Rot como una útil herramienta para el análisis de aminoácidos, particularmente por su realzada reactividad con
aminas secundarias. Desde entonces, este reactivo ha tenido empleo ocasionalmente
para la detección de aminoácidos, con particular énfasis en la detección de prolina e
hidroxiprolina. NBD-Cl ha sido aplicado a la derivatización en pre- y post-columna,
con un límite de detección en éstas últimas de 1 nmol para prolina e hidroxiprolina y un
límite de detección en las primeras algo menor. Aunque NBD-Cl es estable y permite
una detección sensible de aminoácidos, reacciona algo más despacio con aminas y no ha
tenido un uso extendido como agente analítico general para aminoácidos.
NBD-F es más reactivo que su análogo de cloro, permitiendo una derivatización
más rápida, acompañada de una gran fluorescencia para prolina e hidroxiprolina. De
forma similar al NBD-Cl, el NBD-F ha sido aplicado tanto a derivatizaciones precolumna como postcolumna. Los límites de detección para la precolumna están definidos en
el rango de 5-15 fmol para la mayoría de los aminoácidos. El NBD-F tampoco ha sido
utilizado ampliamente como método analítico para aminoácidos, aunque algunos investigadores emplean este reactivo habitualmente.
Otros reactivos derivados del isotiocianato.
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El 4’-N,N-dimetilamino-4-azobencenoisotiocianato (DABITC) ha sido usado satisfactoriamente en la secuenciación manual y análisis de nitrógeno terminal de péptidos
y proteínas. La degradación tipo Edman de péptidos y proteínas efectuada por este
agente produce derivados tiohidantoin coloreados (DABTH), que pueden ser separados
por cromatografía de fase reversa. El método de degradación generalmente comprende
un doble acoplamiento, primero con DABITC y luego con PITC. La 4-N,Ndimetilnaftilazobenzeno homologa del DABITC (DANABITC) ha sido también aplicada con éxito, aunque en menor grado que el DABITC.
Difenilindenonilisotiocianato (DIITC) ha sido estudiada para ser utilizada cuando
la espectrometría de masas por ionización química es acoplada con identificaciones previas por cromatografía de fase reversa. La detección de derivados de tiohidantoin
(DITH) se lleva a cabo por determinación UV (en el rango por debajo del pmol). La
detección electroquímica es un utensilio alternativo.
Otros reactivos isotiocianatos de derivatización precolumna son 4-(tbutiloxicarbonilaminometil)fenil isotiocianato (BAMPITC, detección fluorescente),
trimetilsisil isotiocianato para análisis de secuencia de carbono terminal (detección UV)
y p-N,N-dimetilaminofenil isotiocianato (DMAPI) como una instrumento electroquímico para el análisis de aminoácidos.
Reactivos mixtos.
Otros reactivos están siendo continuamente desarrollados y utilizados para detecciones de aminoácidos. Algunos tienen aplicaciones muy específicas y limitadas, mientras otros son tratados como posibles competidores para amplios usos en sistemas automáticos. Tales reactivos incluyen el ácido 2,4,6-trinitrobencensulfónico (TNBS) y su
análogo 2,4-dinitrobenceno (DNBS), N,N-dietil-2,4-dinitro-5-fluoroanilina, fluoro-2,4dinitrobenceno, ácido 1,1-difenilbórico y 1-fluoro-2,4-dinitrofenil-5-L-alanina amida
(reactivo de Marfey). La detección fluorescente es posible cuando se emplean reactivos
tales como pentano-2,4-diona/formaldehido, 9-antrildiazometano, cloruro laril, 2,3naftaleno-dicarboxialdehido, succinimida -naftilcarbamato, 3-benzoil-2quinolinacarboxaldehido, 9-hidroximetilantraceno e isotiocianato fluorescente y 1-naftil isocianato. Un reactivo quimioluminiscente, 4-isocianatoftalhidrazida, también ha sido investigado. Con excepción del pentano-2,4-diona/formaldehido, donde el reactivo fue usado
en derivatización postcolumna seguida de intercambio iónico HPLC de aminoácidos,
todos los demás fueron utilizados para la derivatización previa de cromatografía de fase
reversa.
En la siguiente tabla se pueden comparar las diferentes características de los reactivos de derivatización más importantes para la determinación de aminoácidos:
REACTIVOS DE DERIVATIZACIÓN
Complejos Método de separaPost- o precon:
ción
columna
1os
CIC o electroforésis PostOPA 1os
CFR (en postPre- y postcolumna,CIC)
Fluorescamina 1os
CIC o electroforésis Post16
Detección
VIS 570 nm
Fluorescencia
Fluorescencia
PITC
Cloruro de dansilo
Cloruro de dabsilo
FMOC-Cl
NBD-Cl
NBD-F
1os y 2os
1os y 2os
1os y 2os
1os y 2os
1os y 2os
1os y 2os
CFR
CFR
CFR
CFR
CFR
CFR
PrePrePrePrePre- y postPre- y post-
UV 240-255 nm
Fluorescencia
VIS
Fluorescencia
Fluorescencia
Fluorescencia
Preparación de las muestras. La reacción con los derivatizantes forma el mismo
cromóforo con las aminas primarias que con las secundarias, por tanto las muestras deben estar libres de sales y lípidos antes de que tengan lugar la hidrólisis y los pasos de
derivatización. La mayor causa de los bajos rendimientos en las reacciones de derivatización es la presencia de contaminantes en la muestra, como son las sales no-volátiles,
detergentes y lípidos. Las sales y los támpones interfieren tanto en la hidrólisis como en
la posterior derivatización, distorsionan la cromatografía y añaden picos extra al cromatograma.
Las sales pueden ser eliminadas de las proteínas y de los péptidos usando támpones volátiles y HPLC de fase reversa, precipitación, diálisis o columnas de filtración de
gel.
DERIVATIZACIÓN PRE-COLUMNA FRENTE A POST-COLUMNA
Las opiniones de investigadores sobre los ventajas relativas de la derivatización
antes o después del HPLC, de aminoácidos serán determinadas por los requerimientos
de la aplicación específica. Factores como la sensibilidad requerida en la detección,
cantidad de muestra disponible, tipo de muestra, fuente de muestra, velocidad de análisis y reproducibilidad e incluso consideraciones económicas influirán en la elección
entre la derivatización pre- o post-columna de aminoácidos.
Derivatización post-columna. La derivatización siguiendo a una cromatografía
de intercambio catiónico de aminoácidos libres tiene distintas ventajas, con tal de que la
instrumentación produzca velocidades y temperaturas de reacción reproducibles. Además, para la derivatización no es necesario proceder al completo, y los problemas de
estabilidad del derivado son insignificantes. Otras ventajas son que la automatización es
fácil y que el tiempo consumido y la pérdida a causa de la preparación de la muestra son
innecesarias. También pueden ser usados detectores en serie. Una gran cantidad de experiencias han sido adquiridas del tradicional método de intercambio catiónico y tinción
con ninhidrina, el cual ha resultado ser fiable, preciso y capaz de una separación excelente de mezclas complejas de aminoácidos y sus metabolitos.
Una desventaja con un sistema HPLC convencional es que son necesarios instrumentos más complejos que para el método de pre-columna. La derivatización postcolumna requiere la adición de una o más bombas para los disolventes y reactivos derivatizantes. También se requiere la adición de un reactor post-columna, el cual llevará a
un ensanchamiento de banda adicional, y por esto, un decrecimiento en la sensibilidad
de detección. La columna de elución es continuamente diluida por el reactivo derivatizante, provocando un descenso en la sensibilidad de detección. Así, la máxima sensibilidad alcanzable por derivatización post-columna será menor que en el caso de la precolumna.
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Derivatización pre-columna. Ésta, acoplada con cromatografía de fase reversa
en lugar de con cromatografía de intercambio catiónico, fue originalmente introducida
como respuesta al incremento en la demanda de mayor sensibilidad y mayor velocidad
de análisis. Las ventajas de la metodología de la derivatización pre-columna incluyen
simplicidad, velocidad y alta sensibilidad. Por ello, si se requiere máxima sensibilidad
de detección, un reactivo fluorescente combinado con la derivatización pre-columna es
el método más indicado.
Como desventaja está la necesidad de garantizarse la completa reacción del reactivo derivatizante y la posibilidad de interferencia con la separación por exceso de reactivo, el medio de reacción o la producción de diferentes derivados de un componente.
Además, la estabilidad del derivado puede ser un importante factor durante la derivatización pre-columna, la demora entre la derivatización y la inyección llega a ser fundamental para los resultados obtenidos.
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