Biofísica Trabajo Práctico Número 1 Para comenzar con la actividad

Biofísica
Trabajo Práctico Número 1
Para comenzar con la actividad abra una terminal de Linux, y ejecute el programa.
Esto se hace escribiendo la palabra “pymol” y luego Enter. Se abrirán dos ventanas
como las observadas a continuación, la de arriba es la ventana principal de PyMOL y la
de abajo es el visualizador (PyMOL Viewr). En el esquema se señalan algunos botones y
funciones que serán utilizadas durante este trabajo práctico.
Línea de comando
Lista de comandos
Acción
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Antes de empezar propiamente con el primer ejercicio del trabajo aquí encontrará
algunos tips para manejar PyMOL:
- Manteniendo pulsado el botón izquierdo del mouse (y desplazando el mismo) en el
fondo negro podrá rotar la estructura.
- Manteniendo pulsado el botón derecho del mouse (y desplazando el mismo) en el
fondo negro podrá hacer zoom.
- Manetiendo pulsado el botón central del mouse (y desplazando el mismo) podrá
desplazar la estructura.
- Resulta útil poder visualizar la secuencia de aminoácido de la molécula con la cual se
está trabajando, para ello en la barra de menú seleccionar Display → Sequence.
- (En la linea de comandos) mediante los comandos: hide y show, combinados con los
comandos: all, cartoon, sticks, lines, etc, puede elegirse la forma en que el programa
muestra la molécula. A continuación se muestra a modo de ejemplo la sintaxis de tres
comandos:
hide all
show cartoon
show lines
Luego de esta breve introducción al uso de PyMOL se da comienzo al Trabajo Práctico
Número 1 de Biofísica.
Construcción de péptidos
Utilizando el PyMOL construir el siguiente péptido:
KYLEFISEAIIHVLHSRHPGDFGADAQGAMNKALELFRKDIAAKYKE
1.
En la barra de menú seleccionar Build → Residue y elegir Helix. Esta es una de
las opciones de estructura secundaria permitida por PyMOL.
2.
En la barra de menú seleccionar Build → Residue y elegir el primer aminoácido
de la secuencia. Repita este paso para todos los residuos de la primera hélice
alfa.
3.
Para finalizar la construcción de la primer hélice alfa se debe fijar el N
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terminal y C terminal. Para ello, seleccione (Ctrl + botón del medio) el oxígeno
en el grupo C terminal.
4.
Luego, cambie el estado de ionización: en la barra de menú seleccionar Build →
Make (pk1) Negative y a continuación corrija la valencia mediante Build → Fill
Hydrogens on (pk1).
5.
Elimine la selección mediante el botón Unpick en la ventana menú.
6.
Seleccione (Ctrl + botón del medio) el nitrógeno en el grupo N terminal.
7.
Luego, cambie el estado de ionización: en la barra de menú seleccionar Build →
Make (pk1) Positive y a continuación corrija la valencia mediante Build → Fill
Hydrogens on (pk1).
8.
Elimine la selección mediante el botón Unpick en la ventana menú.
9.
Guarde el trabajo hasta aquí realizado, para ello en la barra de menú
seleccionar File → Save Session (Este paso será repetido varias veces a lo
largo del TP. Se aconseja generar un nuevo archivo cada vez que se guarde el
avance, por lo que es conveniente agregarle un número al nombre del archivo
de modo de mantener un orden secuencial lógico).
10. Continuar con la construcción del péptido: para ello se le ha de indicar al
PyMOL desde donde se desea prolongar la cadena. Seleccionar el carbono alfa
del residuo C terminal (Ctrl + botón del medio).
11. A continuación, en la barra de menú seleccionar Build → Residue y elegir el
primer aminoácido del loop. Repita este paso para todos los residuos del
mismo. (Note que en este paso no se ha seleccionado ningún tipo de estructura
secundaria.)
12. Para concluir con la construcción del loop repita los pasos: 7, 8, y 9.
13. A continuación, y para finalizar la construcción del péptido repita los pasos del
1 al 9 de modo de obtener la segunda hélice alfa.
14. Guarde la molécula construida en formato PDB, en la barra de menú
seleccionar File → Save Molecule. Aquí se le preguntará por el objeto que
desea guardar, seleccione la molécula a ser guardada y a continuación deberá
elegir un nombre de archivo y el formato que desea (el formato por default es
PKL, en el menú desplegable seleccione PDB).
15. Habiendo terminado con esta parte del TP, limpie todo: haga click en el botón
A (Acción, ver Figura 2) que aparece en la parte superior derecha de la
ventana PyMOL Viewer, y del menú desplegable seleccione la opción delete
everything.
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Llegado este punto, se ha construido un péptido de 47 aminoácido, esta estructura
NO se encuentra en el mínimo de energía por lo que es necesario aplicar el proceso
denominado Minimización para llevarla a dicho mínimo. A los efectos de este trabajo
práctico se les entrega el péptido ya minimizado: myoglobin_amber-min.pdb
A continuación se obtendrá una medida de la divergencia estructural entre la molécula
por usted construida y la misma luego de ser minimizada. Una buena medida del grado
de divergencia estructural entre dos moléculas viene dada por el RMSD (root-meansquare deviation, por sus siglas en inglés).
Calculó del RMSD mediante PyMOL
1. Si aún tiene abierto el PyMOL aseguresé de haber borrado todo (paso 15 de la
etapa anterior). Si lo cerró, ábralo nuevamente escribiendo en la terminal la
palabra “pymol” y luego Enter.
2. En la barra de menú seleccione File → Open. Se abrirá una ventana en la cual
debe seleccionar el archivo PDB que corresponde a la molécula que usted ha
construido.
3. A continuación repita el paso anterior pero esta vez abra el PDB denominado
myoglobin_amber-min.pdb
4. Mediante el comando align el PyMOL calcula el RMSD entre ambas estructuras.
En la línea de comandos de la ventana principal de PyMOL escriba la siguiente
sentencia:
align nombre_archivo_pdb_suyo, myoglobin_amber-min.pdb
No olvide la “,” luego del primer nombre de archivo.
5. En la lista de comandos que se observan en la ventana principal podrá visualizar
el valor de RMSD resultante. ¿Cual es el RMSD entre las dos moléculas en
cuestión?
6. Según lo que puede observar, ¿a que se debe la divergencia estructural
observada?
Superficie de Contacto con el Solvente
La Superficie de Accesibilidad al Solvente (descripta por primera vez en 1971 por Lee
& Richards) (ASA: accessible surface area o SASA: solvent-accessible surface area)
es la superficie de una biomolécula que es accesible a un solvente.
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Normalmente el ASA se mide en angstroms cuadrados. El ASA se calcula normalmente
utilizando el método de la bola rodante (“rolling ball” Shrake & Rupley 1973), este
método utiliza una esfera de un radio particular como sonda para medir la superficie
de la molécula. El radio depende de la molécula de solvente, dado que la esfera simula
el solvente, en el caso del agua el radio de la esfera vale 1.4 angstroms.
La Superficie de contacto con el Solvente, se obtiene de modo similar a la ASA. En
este caso la sonda utilizada no es una esfera sino los radios de van der Waals de los
átomos que forman el solvente. Por lo que esta medida representa una mejor
aproximación a lo que sucede in vivo.
Para comenzar esta parte del práctico se debe descargar el PDB a utilizar, el mismo
corresponde a la estructura de la Hemoglobina y su código PDB es: 2HHB.
Entrar al sitio: http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do. Una vez allí ingresar el
código 2HHB en la barra de búsqueda:
Descargar el archivo Text de la ventana desplegable Download Files en la derecha del
navegador. Y guardarlo en la carpeta donde se está trabajando.
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En esta parte del trabajo práctico se calculará la superficie de contacto entre las
cadenas A y B de la Hemoglobina. Se calculará la superficie de contacto de la cadena
A y de la cadena B como objetos separados, así también se calculará la superficie de
las cadenas A y B como un único objeto, y restando la segunda menos las dos primera
se obtendrá la superficie de contacto entre ambas cadenas. Para ello, una vez
descargado el PDB de la Hemoglobina y guardado en la carpeta de trabajo, abra una
Terminal de Linux y entre en la carpeta donde guardó la estructura en cuestión, desde
allí:
1. Ejecute PyMOL: escriba pymol en la Terminal y a continuación Enter.
2. En la barra de menú seleccionar File → Open, elija el PDB correspondiente a la
Hemoglobina y ábralo.
3. En la linea de comandos escriba: hide all, y luego show cartoon
4. A continuación encontrará la lista de comandos (y su explicación entre
paréntesis) que le permitirá realizar el cálculo de la superficie de contacto:
create alpha1, 2HHB and chain A (creará la cadena A)
create beta1, 2HHB and chain B (creará la cadena B)
create ab1, 2HHB and chain A+B (creará la cadena A+B)
h_add. (agregará los hidrógenos a todos los átomos)
flag ignore, none (asegura de que todos los átomos dentro de un objeto se
ocluyan entre sí)
set dot_solvent, 1
set dot_density, 3 (Este comando más el anterior le indican a PyMOL que utilice
ASA con muestreo de alta densidad)
alpha1_area=cmd.get_area("alpha1") (mide el ASA de la cadena A gurdando el
valor para utilizarlo posteriormente)
beta1_area=cmd.get_area("beta1") (ídem para la cadena B)
ab1_area=cmd.get_area("ab1") (ídem para el par A+B)
Ahora se imprimirán los resultados, tome nota de los valores en el lugar
reservado a tal efecto al lado de cada comando:
print alpha1_area (................. angstroms²)
print beta1_area (................. angstroms²)
print ab1_area (................. angstroms²)
print (alpha1_area + beta1_area) – ab1_area (................. angstroms²)
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PyMOL puede mostrar la superficie
representaciones de puntos o de esferas.
accesible
al
solvente
usando
Para representación por medio de puntos, en la linea de comandos escribir:
show dots
set dot_mode,1
set dot_density,3
Para representación por medio de esferas, en la linea de comandos escribir:
alter all,vdw=vdw+1.4
show spheres
Así también puede representarse mediante superficies:
alter all,vdw=vdw+1.4
show surface
Medida de distancias
Descargue del PDB la estructura cuyo ID es 1A1L guardando la misma en la carpeta de
trabajo, o bien muévala luego de haber sido descargada. Abra con PyMOL el PDB
descargado. Como ha hecho anteriormente, cambie la forma en que visualiza el archivo
para verlo como “cartoon”: hide all y luego show cartoon.
Recuerde activar la barra que muestra la secuencia, para ello en la barra de menú
seleccionar Display → Sequence. Una vez activada la secuencia, busque los tres átomos
de Zn (desplace la barra horizontal que aparece bajo la secuencia). Luego, haciendo
click y del menú desplegable que se abrirá seleccione show y spheres.
En la línea de comandos escriba show lines, con ello volverán a aparecer las cadenas
laterales.
Ubique uno de los tres átomos de Zn y mediante el mouse rote y traslade la molécula
para lograr obtener un buen acercamiento al átomo de Zn elegido. Identifique las dos
Cisteínas y las dos Histidinas que forman el complejo de coordinación con el Zinc. En
esta parte del práctico se determinará la distancia del metal a cada uno de los átomos
a los cuales está enlazado. Para ello, en la barra de menú seleccionar Wizard →
Measurement. Esto abrirá un sub-menú abajo a la derecha en la ventana de
visualización. Haga click en la opción Distances y del menú desplegable elija Distances.
Observe que aparece una leyenda en la parte superior izquierda del visualizador, en la
misma se lee “Please click on the first atom... ” seleccione con el botón izquierdo del
mouse el primer átomo del par al cual va a calcularle la distancia, ahora la leyenda reza
“Please click on the second atom...” seleccione el segundo átomo del par. El programa
colocará una línea punteada que conecta ambos átomos e informará la distancia entre
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ellos.
Repita el procedimiento para
los tres átomos de Zinc y con
los
valores
obtenidos
complete la siguiente tabla.
En la columna número de
residuo coloque el número de
residuo de la Histidina o la
Cisteína según sea el caso.
Un vez concluida la medición
de las distancias hacer click
en Done (en el sub-menú que
aparece abajo a la derecha en
el visualizador).
Número de residuo
Distancia al Zinc (Å)
Histidina
Zinc 1
Histidina
Cisteína
Cisteína
Histidina
Zinc 2
Histidina
Cisteína
Cisteína
Histidina
Zinc 3
Histidina
Cisteína
Cisteína
Mapa de contactos de proteínas
Un mapa de contactos representa la distancia entre todos los pares posibles de
aminoácidos de una proteína usando una matriz binaria bidimensional, es decir la
información presente en la estructura tridimensional de la proteína es representada
por una matriz binaria bidimensional. Para dos residuos “i” y “j”, el elemento “ij” de la
matriz es 1 si la distancia entre ellos es menor a un cierto umbral (preestablecido de
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antemano), y es 0 si dicha condición no se cumple.
Se han propuesto muchas definiciones de contacto, es decir, que átomos deben ser
utilizados para medir la distancia entre residuos: la distancia entre Cα-Cα con un
umbral entre 6-12 Å, la distancia entre Cβ-Cβ con un umbral entre 6-12 Å (aquí ha de
usarse Cα para las Glicinas), y la distancia entre los centros de masas de las cadenas
laterales.
Como se menciono anteriormente, los mapas de contactos proveen una representación
más reducida de la estructura tridimensional de una proteína que sus coordenadas
atómicas. La ventaja es que los mapas de contactos son invariantes a las rotaciones y
translaciones de la molécula. La predicción por métodos computacionales (machine
learning) de los mapas es más sencilla. Y ha sido mostrado que bajo ciertas
circunstancias es posible reconstruir las coordenadas 3D de una proteína usando su
mapa de contactos (Vassura et all. Transactions on Computational Biology and
Bioinformatics 5 (3): 357–367 2008).
Dichos mapas son utilizados también para superponer proteínas y para describir la
similitud estructural (Holm et all. Science 273 (5275) 1996) . Pueden ser predichos a
partir de la secuencia o calculados a partir de cierta estructura.
Para comenzar con esta parte del TP debe entrar en la carpeta donde se haya
instalado el CMView. Al llegar a esta parte, si aún no se les ha proporcionado esta
información, consúltela con el instructor. Suponga que la ruta a la carpeta donde está
en programa es: /alumno/CMView/
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En la terminal de Linux escriba: cd /alumno/CMView/ y luego Enter
Una vez allí, escriba: sh cmview.sh y luego Enter. Esto abrirá el PyMOL en
conjunto con el CMView.
Luego, en la barra de menú de CMView seleccione File → Load from → PDB file...
Ello abrirá una ventana como la que se ve a continuación:
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Abra el Browser y cargue el PDB cuyo ID es: 2L4S.
En Chain code elija A (única opción posible en este caso)
Note que en esta ventana se puede elegir el tipo de contacto ( Contact type), en
este caso C alpha. Y por otro lado el umbral ( cutoff), en este caso 8.0 Å.
Luego de seleccionar el PDB y la cadena A haga click en OK, esto generará el
mapa de contactos deseado:
Distribuya en la pantalla la ventana del CMView y el Visualizador de PyMOL de
modo de ver ambas ventanas simultaneamente.
Note que al recorrer el mapa de contactos con el puntero del mouse PyMOL
muestra el par de aminoácidos “ij”, y a su vez, la distancia entre dicho par.
Recorra el mapa de contactos con el puntero del mouse, identifique y marque en
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el mapa de contactos impreso en el práctico las alfa hélices, las hojas beta
paralelas, las hojas beta anti-paralelas, y loops que detecte.
Note que por el umbral elegido no se observan las hojas beta paralelas. Si se
utiliza un umbral de 12 Å en lugar 8.0 Å se obtendrá el siguiente gráfico:
Identifique y marque en este segundo mapa de contactos las hojas beta antiparalelas.
Note como al haber cambiado el umbral se ha obtenido una mayor cantidad de
puntos, es decir el “ruido” presente en la señal es mayor, lo cual es lógico
porque aumenta la cantidad de pares de residuos considerados para
confeccionar el mapa.
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