fosfolipidos totales - Revista Clínica Española

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FOSFOLIPIDOS TOTALES
5.a Las complicaciones descritas por otros
autores como meningoencefálicas no son más
que la acentuación en cantidad de los síntomas
constantes de la fiebre recurrente.
6.a Basándonos en h. observación clínica y
en el estudio histopatológico de un caso, podemos admitir la existencia de una diencefalitis
recurrencial, como la modalidad típica de invasión del espirilo en el sistema nervioso central.
7.a Las dos muertes en 180 casos y la gravedad de algunos de los síntomas descritos en
los enfermos desmienten la opinión generalizada de la benignidad de esta enfermedad f ebril,
máxime cuando los casos son cada día más frecuentes y de sintomatología más acentuada.
8.a Se echa de menos una labor sanitaria que
ataje la procreación de los "chinchorr os" y la
extensión de la enfermedad, en beneficio de los
obreros agrícolas, clase la más expuesta a esta
enfermedad.
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l
ORIGINALES
ADAPTACION DEL METODO DE STEWART
Y HENDRY, PARA FOSFOLIPIDOS TOTALES, AL COLORIMETRO FOTOELECTRICO
DE EVELYN
H. J. CASTRO-MENDOZA y A. MARTÍNEZ GoNZÁLEZ
Instituto de Investigaciones Médicas. Facultad de Medí. cina de Madrid. Director: PROF. C. JIMtNEZ DIAZ.
tr·Las determinaciones cuantitativas colorimétcas utilizando el aparato de DUBOSCQ y simiｾ｡ｲ･ｳＬ＠
quedan siempre sujetas a errores consierables, sobre todo si los colores a comparar
radican en los extremos del espectro. Este y
otros entorpecimientos han sido superados por
el colorímetro fotoeléctrico de luz monocroma.
Los fosfolípidos totales, aislados o no, se estiman por el fósforo contenido en los extractos
alcohol-etéreos (BLOOR) y clorofórmicos (HARNES), procedentes de material biológico. Aunque
los métodos ponderables proporcionan resultados más seguros, usualmente tal análisis se hace
por colorimetría, a causa de la enorme ventaja
de r equerir pequeñas cantidades de muestra.
Entre las técnicas propuestas preferimos la estudiada por STEWART y HENDRY (1935); algunos inconvenientes encontrados en la .confrontación del testigo y problema nos decidieron
a adaptarla al uso del colorímetro fotoeléctrico
de EVELYN.
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REVISTA CLINICA ESPａｾｏｌ＠
300
METÓDICA.
·.
..
•
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..
•'.
•'
1
.
'•' a
Reactivos.-Mezcla de BLOOR: tres partes de
alcohol de 95o y una parte de éter libre de peróxidos.
Eter de petróleo (p. e. 60 '), purificado, según
FOWWEATHER (1926).
Acetona redestilada.
(MgCl2. 6 H 20), 1.478
Cloruro de ｭ｡ｧｮ･ｾｩｯ＠
moles en alcohol de 95 por 100.
Acido sulfúrico 10 N.
Agua oxigenada (•).
Molibdato amónico (NH.) r. Mo1 Ü2 4 -4 H20 0,02
moles en agua destilada.
Acido 1 : 2 : 4 amino-naftol-sulfónico (Iconógeno) , preparado siguiendo la pauta de FISKE
y SUBBAROW (1925).
Solución de tipo de fósforo, 4.388 g. de fosfato
monopotásico, KH2 PO., SoRENSEN, se disgregan
en agua destilada pasta un litro: 1 ml. - 1 mg.
de fósforo; par.a el uso se diluye de modo que
1 ml. contenga 10 microgramos.
Procedimiento.-A 1 ml. de plasma heparinizado, suero ó 0,5 g. de tejido, colocado en un
Erlenmeyer apropiado, añadir 25 ml. de mezcla
de BLOOR, dejando en reposo doce a veinticuatro horas; filtrar con papel de filtro exento de
grasa a un matraz aforado de 50 ml.; la vasija
y el precipitado de proteínas se lavan repetidas veces y se completa hasta la marca.
Una parte alícuota del filtrado (10 mi. de extracto de plasma ó 5 ml. del de órgano) se pipetea en un tubo de centrífuga Pirex (160 X 16),
graduado a 10 ml.; la mixtura es evaporada hasta sequedad en atmósfera inerte (N o C02), temperatura no mayor de 50° y 10-15 mm. de presión. El residuo se disuelve en 1 ml. de éter de
petróleo y los fosfolípidos precipitados por 7 ml.
de acetona y 0,1 mi. de cloruro magnésico, dejándose en la nevera dos ·horas, al cabo de las
cuales se centrifuga durante cinco minutos a
3.000 r/m; se descarta el sobrenadante y agrega 10 ml. de acetona y nuevamente se centrifuga; la acetona se separa como sea posible y sus
restos en baño maría.
Se destruye la materia orgánica mediante
1 mi. de ácido sulfúrico 10 N. y calentamiento
con microbunsen hasta completa carbonización;
el proceso se acelera con unas gotas de agua
oxigenada, cuidando de que los humos blancos
desprendidos no sobrepasen la señal ; si es necesario, se adiciona oxidante hasta que el líquido
permanezca incoloro y transparente.
(*) Diferentes marcas de agua oxigenada nos han
dado valores blancM muy altos, revelando la existencia
de sustancias fooforadas o de comportamiento análogo.
Una manera práctica de eliminarlas consiste en alcalinizar (carbonato sódico) hasta. pH 8, diez mililitros
del de 40 volúmenes y extraer con 120 mi. de éter· al
Hqu_ido et_éreo incorporar 5 mi. de agua destilada y 'vaｰｯｮｾ｡ｲ＠
dteho solvente a 25• y baja presión; el peróxido
de hidrógeno substraido por el éter se une al agua quedando a una concentración alta.
'
El agua oxigenada purificada de este modo en ausencia de estabilizador, dura poco tiempo.
'
28 ｦ･｢ｾｲｯ＠
Ｑ ｾ＠
El tubo se enfría a la temperatura amb·1
y sus paredes son lavadas con 8,5 ml. de :nte,
destilada; seguidamente se agrega o5 mi ｾ｡＠
molibdato amónico y 0,4 mi. de agente ｾ･､ｵ｣ｴ＠
ｾ＠
después de mezclar los reactivos se lleva albo_:,
, h'1rv1en
. do y 1u ego a 1 agua corriente.ano
mana
se
comple!a a 10 ml. y se hace la lectura en elfotocolonmetro de EVELYN con filtro 620.
El calibrado del instrumento se verifica co
Ｑｾ＠ ｾｯｬｵ｣ｩ￳ｮ＠
standard ｾｩｬｵ￭､｡＠
de fosfato ｭｯｮｰｾ＠
tas1co, tomando canbd:;t?es ｰｲｯｧ･ｾｩｶ｡ｳ＠
de 0,5
hasta 5 ml. ; la proporcwn de los diferentes reactivos es la misma que en los ensayos problema. Es indispensable ｲ･｡ｬ
ｾｺ｡ｲ＠
una prueba en
blanco. que lleva agua destilada en lugar de
bifosfato.
•
Cálculo.-Transformadas las lecturas galvanométricas en el llamado "valor L" (2 -log G) ,
o densidad fotométrica, la cantidad de fósforo
expresado en microgramos, se determina en ﾡｾ＠
gráfica.
Los fosfolípidos globales se deducen multiplicando los microgramos de metaloide por cualquiera de los siguientes factores: 23,5 de PAGE
y colaboradores (1935), 25,8 de KIRK (1938) ó
25 de THANNHAUSER y otros (1939).
RESULTADOS.
Hemos estimado cinco series de 6 muestras
de fósforo, oscilantes entre 5 y 50 p.g., contenido& en un volumen final de 10 ml., partiendo
de la solución tipo diluída de fosfato monobásico de potasio, cuyo título es de 10 p.g. por ml.
TABLA I
Fósforo
5
10
20
30
40
50
Lectura
del
Galvanómetro
71,75
51,25
27,50
14,50
7,75
4,25
0,144
0,290
0,561
0,838
1,112
1,387
La tabla resume la media aritmética de las
iecturas del galvanómetro y del denominado
lor L", obtenidas en dichas series, las cu es
se superponen con absoluta regularidad Y son
reproducibles en todo momento.
En la figura 1 se establece la relación entre
aquel valor (L) y los microgramos de ｦ￳ｳｯｾ＠
existentes en el líquido problema. El ｰｲｯｭ･､ｾ＠
de la constante K resulta igual a 0,0282 Y
la Kz a 34,45.
'Ja-
DISCUSIÓN.
Conviene insistir en varios puntos del méto·
do que acabamos de describir.
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fO)IO
FOSFOLIPIDOS TOTALES
ｾ＠
301
NCliiRO
en
La gasificación de la mezcla ｡ ｬ ｣ｯｨｬＭ￩ｾ･ｲ＠
atmósfera inerte, teHmperatura no supe:wr de
o y 10-15 mm. de
_g, _como paso previo para
50 ·slamiento de los llp01des fosforados, se con1
e·tra indispensable si se quieren resultados saｾ［｡｣ｴｯｲｩｳＬ＠
según MANN (1937), ELLIS y MAYNARD (1937) , BLOOR (1937), ｗｉｌａｍｾ＠
y colaboradores (1938) y nosotros. Un cambw ｾ･＠ tales
requisitos conduce a obtener valores baJOS hasta 30 por 100.
. .
,
La solubilidad de los fosfollpo1des en eter de
RESUMEN.
.
1400
1200
1
IOCD
1
1
Los autores describen detalladamente una técnica de adaptación del método de STEWART y
HENDRY, para fosfolípidos totales, al fotocolorímetro eléctrico de EVELYJ:l".
V
01100
V
BIBLIOGRAFIA
1
V
0200
1
1
10
20
directamente proporcional a la cuantía de elemento. Las cantidades entre 5 y 50 ¡..c.g. obedecen
la ley de Beer.
En nuestros estudios (plasma, suero, órganos) , h emos elegido como zona de trabajo más
apropiada la compre ndida de 10 a 40 ¡..c.g., que
corresponden a concentraciones de 0,1 a 0,4 miligramos por 100, margen suficiente para todos
los fines.
Después de varios intentos, el filtro espectral
620 mostró ser el más adecuado en nuestros
propósitos.
40
SO
)1 ()
dQ
tóstoro
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Fig. l.
petróleo depende de la temperatura a la cual se
ha evaporado el solvente d e BLOOR, hecho resaltado por KIRK (1934), y sus conclusiones confirmadas por BRUN.
SINCLAIR y DOLAN (1942) señalan la influencia de la cantidad de cloruro magnésico aplicado al aislamiento de los fosfolípidos por la acetona, particularmente en el plasma. Utilizando
0,1 ml. al 30 por 100 consiguen una separación
cuantitativa y el precipitado por completo soluble en éter húmedo.
De manera habitual se acidifica la solución
standard fosfórica con objeto de asegurar su
estabilidad y evitar el f enómeno de adsorción
､ｾ＠ elemento por las paredes de vidrio de las vaSIJas ｾ ｮ＠ que se conservan (A.LLPORTJ 1945). Heｾｯ＠
omitido ese cuidado para no alterar las condiciones de pH en que se efectúa el desarrollo de
color y usando siempre soluciones recién prepa-
radas.
Como hemos visto antes, la gráfica indica el
es?'echo enlace del "valor L" (ordenadas) y los
ｾｉ｣ｲｯｧ｡ｭｳ＠
de fósforo examinados (abscisas) .
e observa que se trata de una relación lineal,
demostrativa de que la intensidad del color es
SUMMAR Y
-- ﾷｾＭ
Ｍ
ｾ＠
- - ----..¡rrr-r
.............,...,.
... -
The authors describe in det a il a t echnique for
the adaptation of Stewart and Hendry's method
for total phospholipoids to E velyn's electrical
photocolorimeter.
ZUSAMMENFASSUNG
ｾ Ｂ＠
•.
... ...,.,.....::..Ｍ .ＮＭｾＬＺｸｲＢＱＪｏｴ＠
Die Autoren geben eine ausführliche Beschr eibung über éne Adaptationstechnik von der
Methode nach Stewart und H endry zur Bestimmung der Phospholipoide mit dem elektrischen
Photokolorimeter von Evelyn.
ｒｾｓＮｕｍＺｊｮ＠
Les auteurs décrivent en détail une technique
d'adaptation de la méthode de Stewart et Hendry, pour phospholipoides totaux, au photocolorimetre electrique d'Evelyn.