Validación preliminar de la técnica de rotaevaporación como

Validación preliminar de la técnica de rotaevaporación como método para concentrar
aluminio, selenio y hierro en agua potable y posterior determinación por espectrofotometría
de absorción atómica de llama
GINETH XIMENA MONCADA PIÑEROS
MÓNICA ALEJANDRA SANCHEZ ARDILA
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito para optar al título de
MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS
MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
Bogotá D.C. Colombia
Junio de 2013
1
Validación preliminar de la técnica de rotaevaporación como método para concentrar
aluminio, selenio y hierro en agua potable y posterior determinación por espectrofotometría
de absorción atómica de llama
GINETH XIMENA MONCADA PIÑEROS
MÓNICA ALEJANDRA SANCHEZ ARDILA
___________________________
INGRID SCHULER Ph.D.
Decana Académica Facultad de Ciencias
______________________________
JANETH ARIAS
Directora Carrera de Microbiología
Facultad de Ciencias
2
Validación preliminar de la técnica de rotaevaporación como método para concentrar
aluminio, selenio y hierro en agua potable y posterior determinación por espectrofotometría
de absorción atómica de llama
GINETH XIMENA MONCADA PIÑEROS
MÓNICA ALEJANDRA SANCHEZ ARDILA
_______________________
Luis Gonzalo Sequeda. PhD Cand
Director
_______________________
Crispin Astolfo Célis . PhD.
Par Académico
Microbiología Industrial
3
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución No. 13 de Julio de 1994
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus
trabajos de tesis. Sólo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral
católica y por qué las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien
se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
4
AGRADECIMIENTOS
En primera medida queremos agradecerle a Dios por permitirnos llegar a donde estamos, por la
salud y la sabiduría que nos ha concedido para poder finalizar esta meta trazada.
Agradecemos al laboratorio de calidad de aguas y lodos de la Pontificia Universidad Javeriana y en
especial a Claudia Campos por permitirnos llevar a cabo este proyecto. De igual manera queremos
agradecer a Luis Gonzalo Sequeda por la dirección y el conocimiento que nos ha proporcionado
durante todo este tiempo, y los laboratorios que nos acogieron para llevar a cabo nuestro trabajo de
grado (Laboratorio de Absorción Atómica, Laboratorio de Bioquímica Básica y Laboratorio de
Aguas y Lodos).
Queremos extender nuestros agradecimientos a nuestros asesores Marcela Duarte, Andrés Ortiz y
Paola Correa, por sus grandes aportes en las diferentes temáticas y constante acompañamiento en el
transcurso del proyecto.
A nuestros padres por darnos el apoyo económico y moral para llegar a este punto de nuestras
carreras, por guiarnos y por darnos la fuerza para seguir adelante cada día.
A todos nuestros amigos y amigas que nos han brindado un constante acompañamiento en este
proceso y por los grandes momentos compartidos.
5
TABLA DE CONTENIDO
RESUMEN…………………………………………………………………………………..…....11
1. INTRODUCCIÓN ………………………………………………….……………..………..12
2. PLANTEAMIENTO Y JUSTIFICACIÓN DEL PROBLEMA………………..…………14
3. MARCO TEÓRICO……………………………………………………………….…………15
3.1 Metales traza ………..……....………………………………………………………………. 15
3.1.1Aluminio…..………………………………………………………………...…………… 15
3.1.2 Hierro……………………………………..……………………………………………. 16
3.1.1 Selenio ...…………………………………………….………………………………… 16
3.2 Agua potable y legislación…...……………………………….………………………………. 17
3.3 Métodos de concentración de muestras………………..……………………………………... 18
3.3.1 Resinas macroporosas XAD……………………..……………………………………… 18
3.3.2 Discos de filtración – Siloxano…………………..…………………………………….... 19
3.3.3 Rotaevaporación……………………………..…………………………………………. 20
3.3.4 Liofilización……………………………….…………………………………………… 20
3.4 Validación de un método………………...…………………..…………………….……… 20
3.4.1 Selectividad ..…………………….…………………………………………………… 21
3.4.2 Linealidad ….…………………….……………………………………………………. . 21
3.4.3 Precisión…………………………..…………………………………………………….. 21
3.4.4 Exactitud……………………………….………………………………………..…….. 22
3.4.5 Límite de detección y cuantificación………………………………….…………….…. 22
3.5 Pruebas de genotoxicidad y mutagenicidad ……………………………………...………… 22
3.5.1 Test de Ames……………………………………………………………………..……. 23
3.5.2 Ensayo de Allium cepa…………………………………...……………………..….…… 23
4. OBJETIVOS……………………………………………………………………..………..….. 24
4.1 Objetivo General……………………………………………………………..……………. 24
4.2 Objetivos Especificos……………………………………………………….…………….. 24
5. METODOLOGÍA…………….……………………...…………………………….………... 25
5.1Materiales y reactivos…………………………………………………………………….. 25
5.2Equipos………………………………………………………………………………….. 25
5.3Curvas de calibración…………………………………………………………………….. 25
5.4Determinación de selectividad……………………………………………………………. 25
5.5Determinación de linealidad……………………………………………………………… 25
5.6Determinación del límite de detección y de cuantificación……………………………….. 26
5.7Determinación de exactitud……………………………………………………………… 26
5.8Determinación de precisión……………………………………………………………… 26
5.9Determinación del porcentaje de recuperación…………………………………………… 26
5.10 Determinación de metales en agua potable…………………………………………..…….. 27
6
6. RESULTADOS ……………..………………………………………………………….……… 28
7.
8.
9.
10.
11.
6.1 Determinación de linealidad... ……………………………………………….…………….….28
6.2 Determinación de límite de detección y cuantificación …...…...……………..………………29
6.3 Determinación de exactitud.….……………………….................................................................... 30
6.4 Determinación de precisión …………………………………………….…………………….32
6.5 Determinación del porcentaje de recuperación por rotaevaporación y por liofilización……......34
6.6 Determinación de aluminio, hierro y selenio en agua potable…….……………………….…..35
DISCUSIÓN…………………………………………………………….…………………..… 37
CONCLUSIONES……………………………………………………….……………..…….. 41
RECOMENDACIONES ..…………………………………………….…………….………. 42
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………………….……………..………… 43
ANEXOS…………………………………………………………………………………..…… 46
7
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Curva calibración de aluminio, relacionando concentración vs absorbancia promedio…… …….28
Figura 2. Curva calibración de selenio, relacionando concentración vs absorbancia promedio…………….28
Figura 3. Curva calibración de hierro, relacionando concentración vs absorbancia promedio……………..29
8
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Absorbancias de réplicas de blancos, con el promedio y desviación estándar, para la determinación
del límite de detección y de cuantificación de aluminio……………………………………………………...29
Tabla 2. Absorbancias de réplicas de blancos, con el promedio y desviación estándar, para la determinación
del límite de detección y de cuantificación de selenio………………………………………………………..30
Tabla 3. Absorbancias de réplicas de blancos, con el promedio y desviación estándar, para la determinación
del límite de detección y de cuantificación de hierro………………………………………………………....30
Tabla 4. Porcentaje de error para la determinación de la exactitud en mediciones de aluminio, hierro y selenio
…………………………………………………………………………………………………………….31
Tabla
5.
Valores
de
coeficiente
de
variación
para
la
repetibilidad
de
aluminio……………………………………………………………………………………………………32
Tabla 6. Valores de coeficiente de variación para la repetibilidad de selenio………………………………..32
Tabla 7. Valores de coeficiente de variación para la repetibilidad de hierro…………………………………33
Tabla 8. Porcentaje de recuperación de aluminio por rotaevaporación y liofilización como métodos de
concentración……………………………………………………………………………………………….34
Tabla 9. Porcentaje de recuperación de selenio por rotaevaporación y liofilización como métodos de
concentración……………………………………………………………………………………………….34
Tabla 10. Porcentaje de recuperación de hierro por rotaevaporación y liofilización como métodos de
concentración……………………………………………………………………………………………….35
Tabla 11. Resultados para hierro de las diez muestras tomadas en tres lugares diferentes de la ciudad de
Bogotá, junto con el porcentaje de recuperación del método………………………………………….…….35
Tabla 12. Resultados para selenio de las diez muestras tomadas en tres lugares diferentes de la ciudad de
Bogotá, junto con el porcentaje de recuperación del método………………………………………………..36
Tabla 13. Resultados para aluminio de las diez muestras tomadas en tres lugares diferentes de la ciudad de
Bogotá, junto con el porcentaje de recuperación del método………………………………………………..36
9
LISTA DE ANEXOS
Anexo 1. Pruebas estadísticas de t de Student y Kruskal-Wallis para aluminio…………..………….46
Anexo 2. Pruebas estadísticas de t de Student y Kruskal-Wallis para selenio……………………....47
Anexo 3. Pruebas estadísticas de t de Student y Kruskal-Wallis para hierro………………………..48
Anexo 4. Listado de metales con absorbancias para el Espectrofotómetro de Absorción Atómica de
Llama…………………………………………………………………………………………….. 49
Anexo 5. Mediciones de pH....……………………………………………………………………49
RESUMEN
10
Algunos metales traza se requieren en pequeñas cantidades por los seres vivos, sin embargo, cuando
éstos se encuentran en agua potable en cantidades mayores a las normales, pueden causar problemas
en la salud, o incluso, al bioacumularse pueden llegar a generar enfermedades a largo plazo. El
objetivo de este estudio fue validar de manera preliminar la rotaevaporación y la liofilización, como
técnicas de concentración para determinar aluminio, selenio y hierro en agua potable por
Espectrofotometría de Absorción Atómica de Llama, con el fin de evaluar a futuro pruebas de
mutagenicidad y genotoxicidad. Los parámetros que se evaluaron durante el proceso de validación
fueron la selectividad, linealidad, límite de detección, límite de cuantificación, exactitud (expresada
como porcentaje de error), precisión, y porcentaje de recuperación para el método. Para ello se
elaboraron curvas de calibración con seis puntos para cada metal, y se leyeron a las diferentes
longitudes de onda dependiendo del elemento a analizar. Para el porcentaje de recuperación que se
obtiene al rotaevaporar, se preparó una solución stock de 5 ppm para hierro, 20 ppm de aluminio y
50 ppm de selenio. A partir de la solución stock, se prepararon tres soluciones de diferente
concentración para cada metal, y se leyeron en el espectrofotómetro antes y después de rotaevaporar.
Luego, se procedió a concentrar muestras de agua potable de tres lugares diferentes de Bogotá.
Adicionalmente, se evaluó la liofilización como otro método de concentración, en donde se
determinó el porcentaje de recuperación y se comparó con los resultados obtenidos por
rotaevaporación. Para todos los metales se evidenció linealidad, con buena selectividad, debido a que
no hay interferencias por parte de otros elementos; se obtuvo una mayor exactitud para hierro (2.5%
de error en promedio); y límites de detección y cuantificación altos para selenio (1.44 y 2.41 ppm,
respectivamente), siendo los más bajos los de hierro con un límite de detección de 0.06 ppm y de
cuantificación de 0.1 ppm; en cuanto a la precisión en términos de repetibilidad, se encontraron
coeficientes de variación de 10.19% para aluminio, 6.71% para selenio y 13.23% para hierro. De
acuerdo con lo encontrado en las 10 muestras de agua potable recolectadas, no se detectó presencia
de selenio, se encontró hierro en todas, y se detectó aluminio en 6 muestras. En cuanto a los
porcentajes de recuperación de rotaevaporación y liofilización, se encontró un promedio del 65%
para rotaevaporación y 85% para liofilización. Finalmente, se concluye que se realizó una validación
preliminar para el método de rotaevaporación para realizar la determinación de metales por
Espectrofotometría de Absorción Atómica en llama, para la determinación de aluminio, hierro y
selenio en muestras de agua potable.
PALABRAS CLAVES: Validación preliminar, rotaevaporación, liofilización, agua potable, aluminio,
selenio y hierro.
1. INTRODUCCIÓN
11
El agua recibe varios tratamientos para eliminar microorganismos y sustancias químicas dañinas, que
causan serias enfermedades en los seres humanos, por medio de un proceso de potabilización, que
busca disminuir la probabilidad de encontrar agentes contaminantes en el agua. Este recurso natural,
está expuesto a diferentes contaminantes ambientales, incluyendo los metales pesados, los cuales
pueden ser introducidos al agua, por medio de fuentes naturales (desgaste y erosión del lecho de
roca, depósitos minerales y acción volcánica) y antropogénicas (minería, industrias, irrigación de agua
residual y actividades agrícolas). (Muhammad et al. 2011)
Los metales son estables ambientalmente, no son biodegradables y tienen la capacidad de acumularse
en los tejidos de los seres vivos causando toxicidad (Farahmand et al. 2011), a este último proceso se
le conoce como bioacumulación, el cual se define como un aumento en la concentración de un
producto químico en un organismo vivo en un cierto plazo de tiempo, comparada a la concentración
de dicho producto químico en el ambiente que lo rodea (Mackay & Fraser 2000). El grupo de los
metales se constituye como un componente muy importante de la corteza terrestre, dentro del cual,
se encuentran elementos indispensables para los procesos metabólicos de los organismos vivos; éstos
están normalmente presentes a nivel de trazas (µg) en el ambiente, pero al aumentar los niveles de
estos metales debido a procesos industriales, sus roles cambian a una dimensión negativa (Gawdzik J
& Gawdzik B 2012). Zhou et al. (2007), asevera que el consumo de agua potable que contenga altas
concentraciones de metales traza, incrementa los riesgos de cáncer en animales y humanos; por lo
cual, la exposición a estos elementos debe ser minimizada.
Al tener los metales la capacidad de bioacumularse y al estar en concentraciones bajas, pueden
provocar que las enfermedades que ocasionan se manifiesten a largo plazo; metales como el hierro
(Fe), aluminio (Al), selenio (Se), entre otros, se manifiestan en el desarrollo de cáncer en piel,
pulmones, hígado, riñones (OMS), además de irritaciones en la piel y mucosas (ocular, respiratoria y
digestiva), anemia, alteraciones neurológicas, etc. (Mencías & Mayero 2000).
Actualmente en Colombia, la Resolución 2115 del 2007 establece las concentraciones permisibles de
metales traza en agua potable, estas concentraciones están dadas por la Organización Mundial de la
Salud, sin embargo, los valores presentados en estos documentos, son el resultado de los valores
límites de detección de los equipos usados en pruebas laboratorios de agua potable y en la mayoría de
los casos para estos valores de referencia no se tiene claridad sobre los efectos en la salud a largo
plazo. Dentro de las técnicas de lectura de metales, se destaca la Espectrometría de Absorción
Atómica de Llama (FAAS), la cual es una técnica sencilla, conocida desde hace mucho tiempo y que
elimina interferencias, aunque, los límites de detección con esta técnica no son lo suficientemente
bajos (Morand et al. 2002), por tal motivo, es necesario usar técnicas de concentración, para
aumentar o encontrar la detección de contaminantes en una muestra de agua potable, y lograr realizar
pruebas de toxicidad.
Estas pruebas se realizan con el fin de evaluar si una sustancia puede llegar a ser tóxica para los
organismos vivos, y dentro de éstas se encuentran los ensayos de mutagenicidad y genotoxicidad, en
donde las pruebas de mutagenicidad buscan observar si se producen alteraciones o mutaciones en la
12
estructura del ADN de células procariotas, por medio de pruebas como el Test de Ames (Trossero et
al. 2006), el cual permite obtener una aproximación en cuanto si una sustancia es carcinogénica o no.
Las pruebas de genotoxicidad pretenden comprobar si una sustancia puede generar afectaciones en el
genoma, induciendo aberraciones cromosomales en células eucariotas, por medio del ensayo de
Allium cepa, evidenciando reducciones en el crecimiento radicular y anormalidades mitóticas (Radic et
al. 2010). Este tipo de pruebas se deben realizar a partir de muestras con una menor intervención,
con el fin de evitar reportar falsos positivos, por la adición de otras sustancias que no sean propias de
la muestra a analizar.
Por tal motivo, se escogieron dos técnicas de concentración como la rotaevaporación y la
liofilización, debido a que con ambas técnicas no hay un tratamiento agresivo de las muestras
analizadas, siendo el objetivo de este estudio, validar una técnica de concentración de muestras por
rotaevaporación para detectar aluminio, hierro y selenio en agua potable por espectrofotometría de
absorción atómica de llama con el fin de evaluar a futuro pruebas de mutagenicidad y genotoxicidad.
13
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA – JUSTIFICACIÓN
Es de importancia saber que los metales pesados no son biodegradables y entran en un ciclo
ecológico global a través del agua natural (Farahmand el al. 2011). Estos metales pueden concentrase
fácilmente a lo largo de la cadena alimentaria, por lo cual causa toxicidad en las plantas y acumulación
en los tejidos humanos (Barati et al. 2010). Actualmente en Colombia la Resolución 2115 del 2007
establece las concentraciones permisibles de metales traza en agua potable, dichas concentraciones
han sido estipuladas por la Organización Mundial de la Salud (OMS).
La OMS como entidad guía para la calidad de agua potable, no establece valores de referencia en
concentraciones inferiores a los límites de detección que son alcanzados en condiciones de
operación rutinarias en laboratorios, por lo tanto en algunos casos han fijado valores de referencia
provisionales para contaminantes de los que se dispone de información sujeta a cierta incertidumbre
o cuando no es posible, en la práctica, reducir la concentración hasta los niveles de referencia
calculados. De ahí la importancia de implementar métodos que mejoren la determinación de
componentes ligados a la calidad de agua potable, en este caso de aluminio, hierro y selenio, con el
fin futuro de realizar estudios de mutagenicidad y genotoxicidad con los valores presentes de estos
compuestos en agua potable, para que de esta manera se pueda sugerir valores de referencia acordes
al contexto nacional.
La técnica de Espectrofotometría de Absorción Atómica de Llama (FAAS), es la de mayor demanda
en los laboratorios de aguas, aunque, los límites de detección con esta técnica no son lo
suficientemente bajos (Morand et al. 2002). Por tal motivo se desea validar la técnica de
rotaevaporación, como mecanismo para la concentración de aluminio, hierro y selenio en muestras
de agua potable, lo cual proporcionaría un aumento en el límite de detección de la técnica, de igual
manera se quiere evaluar la liofilización proponiéndolo como un método de concentración para estos
tipos de analitos.
Se proponen estos métodos de concentración puesto que ofrecen una mínima intervención en la
muestra de interés, lo que facilita para estudios futuros ensayos de genotoxicidad y mutagenicidad.
14
3. MARCO TEÓRICO
3.1 Metales traza
Los elementos de la tabla periódica, son en su mayoría metales, los cuales se caracterizan por ser
sólidos (excepto el mercurio), conducir la electricidad, ser dúctiles, maleables y formar aleaciones
(Kotz et al., 2005); además, tienen densidades mayores a la del agua, son totalmente no degradables,
con lo cual pueden acumularse en los sistemas ambientales, generando toxicidad (Baird, 2001).
Manahan (2006) define los metales o elementos traza, como:
“Aquellos que existen a niveles muy bajos, de unas partes por millón o menos, en un sistema dado
que se pueden encontrar en aguas naturales. Algunos de éstos están reconocidos como nutrientes
requeridos para la vida de plantas y animales, incluyendo algunos que son esenciales a niveles bajos
pero tóxicos a niveles más altos”.
Aproximadamente 17 elementos se requieren en cantidades de traza en la mayoría de los sistemas
biológicos, aunque no en todos; algunos de ellos son el zinc, el silicio, cobalto, flúor, yodo, selenio,
hierro, entre otros (Kotz et al., 2005).
La toxicidad de este tipo de elementos, está dada por la fuerte afinidad de los cationes por el azufre,
en donde los cationes metálicos ingeridos se logran enlazar fácilmente a los grupos sulfhidrilo,
presentes comúnmente en las enzimas catalizadoras de las reacciones metabólicas, generando que la
enzima no pueda actuar normalmente, y por lo tanto, afectando la salud humana (Baird, 2001).
También, se ha encontrado que los metales se pueden enlazar químicamente a los grupos carboxilo (COOH) y los grupos amino (-NH2) de las proteínas, impidiendo los procesos de transporte a través
de la pared celular (Manahan, 2006).
Por estas razones, este tipo de elementos se consideran contaminantes en un sistema de agua
potable, en donde son la mayor preocupación en la seguridad de los organismos que consumen esta
agua; pueden proceder de fuentes industriales, agrícolas y de escorrentía urbana, generando toxicidad
e impactos en la salud y en la biota acuática (Manahan, 2006).
3.1.1 Aluminio
El aluminio es el metal más abundante de la corteza terrestre, y su abundancia sólo es inferior a la de
los no metales oxígeno y silicio, encontrándose generalmente combinado en arcilla y otros minerales
comunes (Kotz et al., 2005); aun así, no se han encontrado especies que necesiten el aluminio como
un elemento esencial (Emsley, 2011).
Este elemento se usa en forma de sulfato de aluminio para la purificación del agua, en donde es
utilizado como un agente floculante (Emsley, 2011). Las dosis que habitualmente se agregan son de 2
a 5 mg/L, aun cuando no se han establecido valores de referencia, debido a las limitaciones de los
datos de estudios con animales como modelos para seres humanos (OMS, 2006).
15
En los últimos años, ha habido una mayor exposición al aluminio reactivo biológicamente, con
posibles consecuencias en la salud humana (Crisponi et al., 2012); factores responsables de esta
reciente sobreexposición, es la lluvia ácida, la cual actúa liberando el aluminio de los depósitos
minerales, en forma de hidroxi-aluminosilicatos (HAS), causando su aparición en aguas
contaminadas (Exley et al., 2002), otro de los factores determinantes ha sido la actividad humana,
incluyendo la tecnología moderna para extraer el aluminio en forma de criolita y bauxita (Crisponi et
al., 2013), y eso sin contar los residuos que se generan provenientes de industrias, y se vierten al agua
sin ningún tipo de tratamiento.
Esta creciente sobreexposición es alarmante, debido a las tres enfermedades asociadas a la ingesta de
aluminio, como lo son: la demencia por diálisis, osteomalacia y anemia microcítica sin deficiencia de
hierro, las cuales se manifiestan en síntomas como inhabilidad para concentrarse, pérdida de la
memoria, cambios en la personalidad, depresión, alucinaciones visuales y/o auditivas, debilidad,
fatiga, convulsiones epilépticas, entre otros (Crisponi et al., 2013).
3.1.2 Hierro
El hierro es el cuarto elemento más abundante en la corteza terrestre (Kotz et al., 2005). Es esencial
para casi todos los organismos vivos, desde los microorganismos hasta los seres humanos,
encontrando un promedio de 4 gramos de hierro en el cuerpo humano (Emsley, 2011), en donde
juega un papel importante en la química de la hemoglobina, ya que es el componente de la sangre que
transporta el oxígeno (Kotz et al., 2005).
Las necesidades diarias mínimas de este elemento oscilan entre 10 a 50 mg/día (OMS, 2006), pero al
ser consumido en exceso se pueden generar problemas de hígado y riñón, ya que el hierro se adhiere
a la proteína transferrina, impidiendo que ésta pueda transportar otros metales esenciales en el
cuerpo (Emsley, 2011). Además, a medida que transcurren los años, el hierro tiene la capacidad de
acumularse lentamente en los tejidos del cuerpo y causar finalmente artritis, disfunciones cardíacas, o
daños hepáticos, incluyendo cirrosis (Hotz et al., 2012).
Este metal está presente en aguas dulces naturales en concentraciones de 0.5 a 50 mg/L, pudiendo
haber también presencia de hierro en el agua de consumo, debido a la utilización de coagulantes de
hierro en una concentración de 4 a 10 mg/L, o a la corrosión de tuberías de acero o hierro colado
durante la distribución del agua; aun así no se han determinado valores de referencia para las sales de
hierro utilizadas en el proceso de potabilización (OMS, 2006).
3.1.3 Selenio
El selenio clasifica entre los elementos raros del planeta, estando en el lugar 67 de la lista de los
elementos más abundantes en la tierra, con una concentración aproximada de 50 ppb (µg/kg) en la
corteza terrestre (Emsley, 2011), las fuentes de las cuales proviene son fuentes naturales y carbón, y
es clasificado como un metaloide (Manahan, 2006).
Además de considerarse un componente esencial de la dieta humana (Kotz, 2005) con un valor de
ingesta diario promedio de 4 µg/kg de peso corporal (OMS, 2006), puede llegar a ser tóxico a niveles
16
superiores (Manahan, 2006), en donde 5 mg pueden llegar a producir reacciones altamente tóxicas e
inclusive la muerte, y una exposición prolongada de bajo nivel causa pérdida de peso, anemia, y
dermatitis, así como mal olor corporal y mal aliento (Emsley, 2011), comprobándose que los
compuestos de selenio son genotóxicos en sistemas in vitro con activación metabólica (OMS, 2006).
Al estar presente en la corteza terrestre (OMS, 2006), y debido a los depósitos atmosféricos, el
drenaje de suelos y subsuelos (Mehdi et al., 2013), el selenio puede llegar a fuentes de agua, siendo
este elemento, junto con el arsénico y el antimonio, contaminantes importantes del agua (Manahan,
2006), y encontrándose en la mayoría de los casos un máximo de 10 mg/L en forma de selenato y
selenito en aguas frescas, y en forma de seleniuro y selenato de sodio en agua superficial,
considerando estos últimos los más solubles y móviles en agua (Mehdi et al., 2013). Aun así, en los
procesos de potabilización, la concentración de selenio (IV) podría llegar a reducirse hasta 0.01 mg/L
con la coagulación, mientras que el selenio (VI) no se puede eliminar mediante tratamientos
convencionales; siendo su concentración máxima admisible en agua 0.01 mg/L (OMS, 2006).
3.2 Agua potable y legislación
Según el Decreto 1575 del 2007, el agua potable se define como “Aquella que por cumplir las
características físicas, químicas y microbiológicas, en las condiciones señaladas en el presente decreto
y demás normas que la reglamenten, es apta para consumo humano. Se utiliza en bebida directa, en la
preparación de alimentos o en la higiene personal.” (Ministerio de la Protección Social, de Ambiente,
Vivienda y Desarrollo Territorial, 2007a), y debe cumplir con ciertos requisitos estipulados en la
Resolución 2115 del 2007, con el fin de asegurar la calidad de agua para el consumo humano
(Ministerio de la Protección Social, de Ambiente, Vivienda y Desarrollo Territorial, 2007b). Dentro
de estos requisitos, se especifican las características químicas a tener en cuenta, en donde se señalan
los valores máximos aceptables de cada una de las sustancias de interés, observando un valor de 0.2
mg/L para aluminio, de 0.3 mg/L para hierro total y de 0.01 mg/L para selenio (Ministerio de la
Protección Social, de Ambiente, Vivienda y Desarrollo Territorial, 2007b).
Dentro de las organizaciones con mayor reconocimiento a nivel mundial que establecen parámetros
para la calidad del agua potable se encuentran la Organización Mundial de la Salud (OMS), la Agencia
de Protección Ambiental de los Estados Unidos (USEPA), entre otras.
La OMS, ha establecido como valor de referencia para selenio, 0.01 mg/L, pero aún no se han fijado
valores de referencia basados en efectos sobre la salud para el caso del aluminio y del hierro, debido a
las limitaciones de datos de estudio con animales como modelo, y a la incertidumbre de los datos
generados en estudios con personas, por lo que se establecieron valores de 0.1 y 0.3 mg/L,
respectivamente, basados en la optimización de los procesos de coagulación en las plantas de
tratamiento de agua para consumo, y en un cambio en la coloración del agua para el caso del hierro
(OMS, 2006).
17
Al fijar valores de referencia, se busca que la aplicación de éstos sea práctica y factible, protegiendo
además, la salud pública. Aun así, estos valores de referencia no suelen establecerse en
concentraciones inferiores a los límites de detección que proporcionan las técnicas rutinarias de
laboratorio, y deben tener en cuenta la concentración alcanzable mediante los tratamientos
disponibles para controlar, reducir o eliminar el contaminante hasta su máximo nivel (OMS, 2006).
En cuanto a la EPA, ésta estableció como nivel máximo de concentración para selenio un valor de
0.01 mg/L; este elemento se encuentra clasificado dentro del Reglamento Nacional Primario de Agua
Potable, por lo cual es obligatorio cumplir con lo estipulado en la norma, para asegurar una buena
calidad del agua y para proteger a los consumidores de algún riesgo a su salud. Dentro de los
contaminantes que hacen parte del Reglamento Nacional Secundario de Agua Potable, es decir,
aquellas sustancias que no son obligatorias y que se establecen como guías para asegurar
características organolépticas adecuadas del agua, se encuentra el aluminio y el hierro, con niveles
máximos de concentración secundarios de 0.05 a 0.2 mg/L y 0.3 mg/L, respectivamente (EPA,
2013).
3.3 Métodos de concentración de muestras
La preparación de alguna muestra de interés, es un proceso en el cual se transforma dicha muestra en
una forma adecuada que facilita su análisis. En este proceso se puede incluir la extracción de un
analito de una matriz compleja o sencilla, de igual forma se pude realizar una preconcentración de
analitos que se encuentren muy diluidos, hasta obtener una concentración suficiente para ser medida
(Harris, 2007).
La potencia mutagénica se puede detectar en muestras no concentradas de aguas superficiales, sin
embargo, cada contaminante está presente normalmente en niveles tan bajos que es difícil de
detectar, y por lo tanto se requiere algún tipo de método de extracción / concentración para la
evaluación fiable de mutagenicidad o genotoxicidad de muestras de agua superficial (Ohe et al. 2004).
Estos métodos de concentración se proponen como una solución a problemas cotidianos en los
laboratorios ya que usualmente se puede encontrar equipos que presenten bajos límites de detección,
que por consiguiente no alcanzan a detectar un analito en una muestra sin tratamiento, ya que se
encuentra altamente diluido. De igual manera si lo requerido es un mínimo tratamiento en la muestra
para posteriores estudios de genotoxicidad y mutagenicidad, los métodos de concentración para
diferentes analitos son los más eficientes.
3.3.1 Resinas macroporosas XAD
La adsorción en resinas Amberlite XAD es el método más comúnmente aplicado para la
concentración de sustancias orgánicas a partir de diferentes tipos de aguas superficiales (Ohe et al.
2004).
18
Las resinas XAD son polímeros sintéticos macroporosos. Están formadas por un matriz polimérica
aromática o alifática, diferenciándose de las resinas de intercambio iónico por la ausencia de grupos
funcionales iónicos. Generalmente pueden adsorber una amplia clase de compuestos mutagénicos,
incluyendo hidrocarburos aromáticos policíclicos, arilaminas, nitro-compuestos, quinolinas,
antraquinonas (Horta 2008).
La adsorción, seguido de elución con solventes orgánicos, es eficiente en la extracción de todos los
productos químicos tóxicos y mutágenos/genotoxicos polares y no polares (Ohe et al. 2004).
Estas resinas tiene una clasificación variable en donde las de tipo XAD-2 proporcionan elevadas
capacidades de extracción de compuestos altamente hidrofobicos, en cuanto a la de tipo XAD-4 es
recomendada para solutos de bajo peso molecular, esta dos son utilizadas usualmente en procesos de
depuración de aguas (Gusler et al. 1993), para los solutos de peso molecular medio esta la resina de
tipo XAD-16, esta se usa en los procesos de separación de cefalosporina-C, antibiótico comúnmente
usado en la industria farmacéutica, y para solutos orgánicos de bajo peso molecular se recomienda las
resinas de tipo XAD-1180. La única resina Amberlita XAD moderadamente polar es la XAD-7
empleada para la recuperación de compuestos no aromáticos de disolventes polares (Horta 2008).
3.3.2 Discos de filtración – Siloxano
Los discos de siloxano proporcionan una alternativa eficiente de extracción líquido / líquido para la
preparación de una muestra. Son fabricados en fibra de vidrio con una superficie de sílice, estas
partículas tienen 30 μm de diámetro y tienen un tamaño de poro de 70 Å, con una fase ligada de
octadecilo (C18) o octilo (C8), son resistentes a pH bajos. (Rodriguez 1999).
Es un proceso patentado que se utiliza para atrapar partículas, los discos pueden ser usados con
fines para la purificación y concentración de analitos a partir de muestras acuosas.
Estos discos proporcionan una solución para preparación de grandes volúmenes de muestras
acuosas. El Formato en disco ofrece una gran área de superficie de contacto lo que ayuda a tener
tasas de flujo rápido y un alto rendimiento.
Estos discos están disponibles en una variedad de materiales químicos para complementar
aplicaciones de más analíticos. Cada material exhibe propiedades únicas de retención y selectividad
para un analito en particular. La elección del material que es mejor para un método, se verá
influenciada por la diferencia en la naturaleza química del analito en la matriz de la muestra y la
limpieza de la cromatografía resultante.
Los discos de C18 y C8 tiene aplicaciones típicas incluyen hidrocarburos policíclicos aromáticos
(PAHs), bifenilos policlorados (PCBs), ftalatos, compuestos orgánicos semivolátiles, paraquat y
diquat, pesticidas y herbicidas, según como lo dice la casa comercial Sigma - Aldrich.
19
3.3.3 Rotaevaporación
Este método para concentrar un analito de interés, usa el fundamento de la destilación sencilla que
consiste en el aumento de la temperatura de un líquido, lo cual hace que se aumente de la energía
cinética de las moléculas, y por consiguiente se comience la evaporación de las moléculas que se
hallan próximas a la superficie del líquido, hasta que la presión del vapor interna iguala a la presión
externa que soporta el sistema, cuando estas presiones se igualan, se puede observar la evaporación o
ebullición del líquido (Lamarque et al., 2008).
Sin embargo en la rotaevaporación, la rápida ebullición del líquido se ve favorecida por la aplicación
de vacío, el cual ayuda a que a temperaturas menores se evapore la sustancia de interés, puesto que se
igualan las presiones con mayor rapidez y con menor temperatura, separando de esta manera el
analito de interés de la matriz (Fieser, 2004).
3.3.4 Liofilización
Esta técnica usando frio se basa en la eliminación del agua contenida en una muestra, mediante su
congelación y sublimación posterior, es decir, el paso del hielo al estado de vapor y la eliminación de
éste (Vincent, Álvarez y Zaragozá, 2006).
La liofiliación es empleada en la industria de alimentos y farmacéutica por ofrecer ventajas de
deshidratación superiores a otras técnicas, su ventaja esta en no usar calor, lo que favorece a que no
sean alterados compuestos termosensibles para que no se presente denaturación de los mismos,
también es eficiente cuando lo que se requiere es reducir el volumen mejorando así el transporte o
envasado de algún producto (Labconco, 2012).
No se han encontrado reportes en los cuales se utilice este proceso de deshidratación por frío para
muestras de análisis químico o en su efecto para concentrar muestras de agua con un analito de
interés como es este caso los metales aluminio, hierro y selenio, sin embargo por su alto potencial de
no alterar las muestras se pretende evaluar los resultados verificando si es posible usar este método
de deshidratación para concentrar muestras con analitos de interés como los metales.
3.4 Validación de un método
La validación de un método se pude definir como el proceso que establece que un método es
aceptable para realizar su objetivo. Las características que hacen que un método sea aceptable se
expresan en función de una serie de parámetros analíticos (Morante, Sierra y Del Hierro, 2007).
La validación garantiza que el procedimiento escrito es suficientemente detallado como para que
distintos analistas o laboratorios obtengan resultados comparables cuando lo utilicen (Harvey, 2002).
El Instituto de Salud Pública de Chile (2010), menciona que la validación es un paso fundamental
para asegurar que los resultados entregados por un método son confiables. Ya que cuando se realiza
la validación de un método por parte del laboratorio, lo que se busca es poder determinar con
20
fundamento estadístico que el método es adecuado para los fines previstos. Esto se logra con cinco
parámetros que son primordiales en la validación analítica: selectividad, linealidad, precisión,
exactitud y límites de detección y cuantificación (AEFI, 2001).
3.4.1 Selectividad
En la validación de un método hace referencia a la capacidad que tiene dicho método analítico para
medir y/o identificar simultáneamente o separadamente los analitos de interés, de forma inequívoca,
en presencia de otras sustancias químicas que puedan estar presentes en la muestra (Harvey, 2002).
La selectividad de un método analítico se debería determinar antes de iniciar el estudio de cualquier
otro parámetro de validación, dado que debe conocerse en qué grado de respuesta se encuentra el
método en relación al analito, sin interferencia de otras sustancias relacionadas con el (AEFI, 2001).
3.4.2 Linealidad
La linealidad es la capacidad de un método de análisis, dentro de un determinado intervalo, de dar
una respuesta o resultados instrumentales que sean proporcionales a la cantidad del analito que se
habrá de determinar en la muestra de laboratorio (ISP de Chile, 2010).
Para estimar cómo los datos experimentales se ajustan a una recta, se calcula el coeficiente de
correlación (r). Donde un valor de uno corresponde a un ajuste ideal a una línea recta, mientras que
un valor de cero implica que no hay correlación lineal entre las respuestas y la concentración (Sierra
et al, 2010).
Otra alternativa que propone Sierra et al. (2010), es utilizar el coeficiente de correlación al cuadrado
(r2). Para el cual, un r2 por encima de 0.995 se considera un buen ajuste, pero si el valor de r2
disminuye lentamente o de repente con el tiempo, significa que algo no funciona correctamente.
3.4.3 Precisión
Se define como el grado de concordancia entre los resultados de test individuales cuando el
procedimiento es aplicado repetidas veces para una muestra homogénea. Generalmente, la precisión
de un método se expresa en términos de desviación estándar (SD) o de desviación estándar relativa
(RSD) en porcentaje (coeficiente de variación) (Morante, Sierra y Del Hierro, 2007).
Con este parámetro se conoce la variabilidad del método, esta variabilidad es debida a errores
aleatorios inherentes a todo método de ensayo. Los factores susceptibles de influir sobre los
resultados de un ensayo no pueden ser siempre controlados (analistas, equipo instrumenta, reactivos,
tiempo, etc.) (AEFI, 2001).
Generalmente la precisión se puede estimar de tres formas como lo propone (AEFI, 2001):
Repetibilidad: Se lleva a cabo en un mismo laboratorio y en un corto periodo de tiempo, en donde
se analiza la misma muestra bajo condiciones iguales (mismos analistas, aparatos y reactivos).
21
Precisión Intermedia: Se analiza la misma muestra en un mismo laboratorio pero en condiciones
diferentes (diferentes analistas, aparatos, reactivos, días)
Reproducibilidad: Establece la variabilidad del método bajo condiciones operativas diferentes y en
diferentes laboratorios.
3.4.4 Exactitud
Es la medida de proximidad existente entre el resultado de un experimento o resultado experimental
y el resultado esperado o resultado teórico (Harvey, 2002). Cuando un método posee una elevada
exactitud, la medida de la muestra proporciona un valor que idealmente es idéntico al valor
verdadero o previamente conocido (Morante, Sierra y Del Hierro, 2007).
Usualmente se confunde la exactitud con la precisión sin embargo se debe tener en cuenta que la
precisión se relaciona con la dispersión de una serie de mediciones, pero no da ninguna información
sobre lo cerca que esta dicha medición del valor verdadero. Entonces se debe tener mediciones muy
precisas pero con una baja exactitud (AEFI, 2001).
3.4.5 Límite de detección y cuantificación
El límite de detección (LOD) se puede describir como aquella concentración que proporciona una
señal en el instrumento significativamente diferente de la señal del blanco (Harris, 2007). En donde la
mínima cantidad del analito se puede detectar aunque no necesariamente cuantificar (AEFI, 2001).
En cuanto a límite de cuantificación (LC) de un método, se define como la mínima cantidad de
analito presente en la muestra que se puede cuantificar, con una adecuada precisión y exactitud
(AEFI, 2001).
3.5 Pruebas de genotoxicidad y mutagenicidad
Los bioensayos son pruebas que permiten detectar una gran variedad de sustancias químicas que
pueden producir daños genéticos, sin la necesidad de información previa acerca de la identidad y
propiedades físico-químicas de las mezclas, determinando si una sustancia o una mezcla de
compuestos genera toxicidad, y cuantificando la relación entre la concentración de un contaminante
con la respuesta que genera en un organismo vivo (Ohe et al., 2004); esto es aplicable a aguas
superficiales, ya que éstas reciben grandes cantidades de residuos provenientes de fuentes
industriales, domésticas y de agricultura, lo que indica que pueden contener muchos compuestos
desconocidos, y aun así, pueden ser usadas como fuente de agua de consumo, o para actividades
agrícolas, religiosas y recreacionales, generando problemas de salud pública y en los ecosistemas
acuáticos (White & Rasmussen, 1998; Ohe et al., 2004).
22
Dentro de los diversos ensayos que se utilizan para detectar la genotoxicidad/mutagenicidad
producto de sustancias o mezclas de compuestos, se encuentran:
3.5.1 Test de Ames
El Test de Ames es un ensayo de mutación que emplea a Salmonella typhimurium como bacteria
indicadora para detectar agentes mutagénicos en diversas sustancias; es la prueba más difundida,
siendo una de las más simples, rápidas y económicas, que permite evidenciar una mutación reversa
(Trossero et al., 2006).
Este test se basa en la detección de revertantes1 independientes de histidina (his), después de la
exposición a las sustancias mutagénicas, en donde las diferentes respuestas de las cepas de Salmonella
proveen información de los tipos de mutágenos presentes en el agua (Ohe et al., 2004).
3.5.2 Ensayo de Allium cepa
El ensayo de Allium cepa es usado para medir una variedad de parámetros morfológicos y
citogenéticos que pueden servir como indicadores de toxicidad, lo cual incluye las aberraciones
cromosomales y de micronúcleos (Leme & Marin-Morales, 2009), y se utiliza para monitorear los
efectos potenciales de una mezcla de contaminantes que incluyen a los metales pesados, y los
químicos hidrofílicos y lipofílicos (Caritá & Marin-Morales, 2008).
Este ensayo es un indicador de toxicidad de bajo costo que requiere corto tiempo, y provee
información acerca de la presencia de sustancias mutagénicas/genotóxicas en aguas, demostrando el
potencial que tienen estos compuestos para inducir aberraciones cromosomales en las células
radiculares de la planta de Allium cepa (Radic et al., 2010).
1. En esta prueba el indicativo de la mutación es la reversión his- a his +, los revertantes se conocen porque crecen en medio mínimo sin
histidina (Melédez, 2012)
23
4. OBJETIVOS
4.1 General
Realizar una evaluación preliminar del uso de las técnicas de rotaevaporación y liofilización como
métodos de concentración para determinar aluminio, selenio y hierro en agua potable por
Espectrofotometría de Absorción Atómica de Llama.
4.2




Específicos
Realizar un estudio de la precisión, exactitud, linealidad, límite de detección y límite de
cuantificación como indicadores operativos estadísticos para validar de forma preliminar, el uso
de la técnica de rotaevaporación para detección aluminio, selenio y hierro en agua.
Evaluar la técnica de liofilización como una alternativa de concentración de aluminio, hierro y
selenio en muestras de agua.
Establecer la diferencia de recuperación de ambos métodos.
Detectar la presencia de aluminio, selenio y hierro metales traza en muestras de agua potable de
tres puntos de muestreo en la ciudad de Bogotá.
24
5. METODOLOGÍA
5.1 Materiales y reactivos
En la elaboración de las tres curvas patrón realizadas a lo largo del estudio para cada elemento, así
como para la adición de los metales en las muestras a liofilizar, se utilizaron soluciones stock de 1000
ppm de Aluminio (JT Baker), Hierro (JT Baker) y Selenio (Merck). En la preparación de las
soluciones de concentración conocida se utilizó agua ultrapura tipo I (Milli-Q) acidulada con ácido
nítrico al 0.2% v/v; el lavado del material requerido en el estudio se realizó con agua y jabón, luego
se enjuagó con abundante agua, y finalmente se agregó agua tipo I con ácido nítrico al 0.2% v/v;
luego se colocaron en mufla a 120°C durante 12 horas, para eliminar humedad y otras impurezas.
5.2 Equipos
Durante la realización del estudio, se utilizó el espectrofotómetro de absorción atómica en llama
marca Varian AA 140, con lámparas de cátodo hueco monoelemento de aluminio, hierro y selenio,
configurando el equipo para una lectura de tres réplicas, tiempo de integración de 3 segundos y
tiempo de retraso en la lectura de 5 segundos. Un rotaevaporador LabTech EV311 con bomba de
presión de vacío marca Labtech modelo VP3; y un liofilizador marca Labconco FreeZone Plus con
capacidad de 4.5 litros en cascada.
5.3 Curvas de calibración de aluminio, hierro y selenio
Para la elaboración de las curvas patrón, se tomaron seis puntos más el blanco, en un rango de
concentraciones de 5 a 100 ppm para aluminio (5, 20, 40, 60, 80 y 100 ppm), 0.06 a 15 ppm para
hierro (0.06, 3, 6, 9, 12 y 15 ppm), y 5 a 250 ppm para selenio (5, 50, 100, 150, 200 y 250 ppm),
llevando a un volumen final de 25 ml con agua acidulada. Los blancos contenían agua tipo I
acidulada con ácido nítrico al 0.2% v/v. Luego, se leyó en el espectrofotómetro a una longitud de
onda específica para cada metal, 396.1 nm para aluminio, 248.3 nm para hierro y 196.0 nm para
selenio. Este mismo procedimiento se realizó para las nueve réplicas del estudio.
5.4 Determinación de la selectividad
Este parámetro se estableció por las diferencias de longitudes de onda (λ) a la que son medidas los
metales en el espectrofotómetro de absorción atómica en llama marca Varian AA 140 y las
propuestas por el Standard Methods, para verificar que no hay interferencia de otros metales en las
mediciones, ver en Anexos.
5.5 Determinación de la linealidad
A partir de las curvas patrón realizadas a lo largo del estudio, se evaluó el coeficiente de correlación,
el cual debía tener un valor mayor o igual a 0.995 (APHA, 1998). Además, se evaluó el
comportamiento de los datos obtenidos, con el fin de saber si éstos tenían una distribución normal o
25
no, efectuando una prueba de Shapiro-Wilk; y posteriormente, se realizó una prueba de KruskalWallis, para realizar una comparación de las réplicas evaluadas en donde se postula que Ho: No hay
diferencias significativas y Hi: Hay diferencias significativas. Ambos test se realizaron el software
SigmaPlot 10.0
Para una mayor confianza en la determinación de linealidad se realizó el test de t de Student, en
donde se dice que Ho: No existe correlación lineal y Hi: Existe correlación lineal.
Tanto en el test de t de Student como para Kruskal-Wallis, se mantuvo un alfa de 0.05 para un nivel
de confianza del 95%.
5.6 Determinación del límite de detección y de cuantificación
Con el fin de hallar el límite de detección, se leyeron más de 10 blancos medidos una vez cada uno,
se calculó la absorbancia promedio y ésta se sumó al producto de 3 veces la desviación estándar.
Posteriormente, el valor resultante se restó a la absorbancia promedio y se dividió entre la pendiente
de la curva de calibración, obteniendo el límite de detección en mg/L (UBA, 2012).
Para el cálculo del límite de cuantificación, se leyeron más de 10 blancos medidos una vez cada uno,
se calculó la absorbancia promedio y ésta se sumó al producto de 5 veces la desviación estándar. A
este valor resultante se le restó la absorbancia promedio sobre la pendiente de la curva de calibración,
obteniendo el límite de cuantificación en mg/L (UBA, 2012).
5.7 Determinación de exactitud
Para la determinación de la exactitud, se prepararon muestras de concentración conocida de cada
uno de los metales, a partir de la adición de una cantidad específica de los patrones. En el caso del
hierro, se leyeron en el espectrofotómetro concentraciones de 3, 9 y 15 ppm; para selenio se leyeron
de 50, 150 y 250 ppm, y finalmente para aluminio, las concentraciones leídas fueron de 5, 60 y 100
ppm. La exactitud se expresa en este estudio como porcentaje de error, calculada mediante la
siguiente ecuación (Arias, 2008):
5.8 Determinación de la precisión
En cuanto a la precisión, se calcularon las desviaciones estándar y desviaciones estándar relativas de
las muestras mencionadas en la determinación de exactitud, buscando obtener valores menores o
iguales al 5% en las desviaciones estándar relativas (AEFI, 2001).
5.9 Determinación del porcentaje de recuperación por liofilización y por rotaevaporación
Para la determinación del porcentaje de recuperación por liofilización, se prepararon muestras de
concentraciones conocidas para cada uno de los tres metales, mediante adición de los patrones, y
aforando a 50 ml con agua acidulada. Las concentraciones escogidas fueron de 5, 8 y 10 ppm para
26
aluminio: 1, 5 y 10 ppm para selenio; y 0.1, 0.5 y 1.3 ppm para hierro. Cada una de estas
concentraciones fue leída en el espectrofotómetro de absorción atómica en llama (FAAS), con el fin
de saber la concentración real de cada una de las soluciones. Posteriormente, se procedió a liofilizar
cada una de las muestras, ajustando el vacío a 0.040 mbar y una temperatura de -82°C, finalmente, se
midió el volumen final obtenido y se leyó en el espectrofotómetro.
En cuanto al porcentaje de recuperación por rotaevaporación, se prepararon soluciones stock de
cada metal con valores de 5, 20 y 50 ppm, para hierro, aluminio y selenio, respectivamente, mediante
la adición de cantidades conocidas de cada metal en presentación en polvo, los cuales se solubilizaron
según lo descrito en el manual del espectrofotómetro (Varian, 1989), aforando a un volumen final de
1 litro con agua acidulada. Estas soluciones se leyeron en el espectrofotómetro, y a partir de ellas se
prepararon las tres concentraciones conocidas de cada metal, con valores de 0.1, 0.5 y 1.3 ppm para
hierro; 5, 8 y 10 ppm para aluminio; y 1, 10 y 25 ppm para selenio, con un volumen final de 500 ml
en matriz de agua acidulada. Cada una de estas soluciones fue leída en el espectrofotómetro, y luego
fueron rotaevaporadas, estableciendo una temperatura de 70°C, una velocidad promedio de 110 rpm,
y un vacío constante de 0.07 MPa. Finalmente, se concentraron aproximadamente entre 10 y 20
veces, se midieron los volúmenes finales obtenidos, y se procedió a leer en el espectrofotómetro.
Los porcentajes de recuperación de cada uno de los métodos, se determinó mediante la siguiente
ecuación (AEFI, 2001):
A las muestras concentradas por rotaevaporación y por liofilización, se les midió el pH con tiras
indicadoras, con el fin de saber el estado final de las muestras.
5.10 Determinación de aluminio, hierro y selenio en tres lugares de la ciudad de Bogotá
Para determinar la concentración de estos tres metales en agua potable, se escogieron tres lugares de
muestreo en la ciudad de Bogotá (Universidad Javeriana, calle 129 y cercanías al hospital de Usme),
de los cuales se recolectó una muestra diaria de 1 litro, durante tres días consecutivos, a diferentes
horas. La Universidad Javeriana fue el único lugar del cual se obtuvieron cuatro muestras, debido a
observaciones de cambios en las características organolépticas del agua en este lugar, después del
tercer día de muestreo.
Las muestras recolectadas fueron aciduladas con 2 ml de ácido nítrico, con el fin de evitar adherencia
de los metales al material de vidrio utilizado, y luego fueron leídas en el espectrofotómetro. A
continuación, las muestras se rotaevaporaron según lo descrito anteriormente, concentrándolas entre
10 y 20 veces, para ser leídas nuevamente en el espectrofotómetro y cuantificar la concentración de
cada uno de los metales.
Finalmente, se midió el pH de cada una de las muestras rotaevaporadas, mediante tiras indicadoras.
27
6. RESULTADOS
6.1 Determinación de linealidad
Al realizar las curvas patrón de cada uno de los metales con nueve réplicas, se obtuvieron
coeficientes de correlación de 0.85, 0.96 y 0.98, y se determinaron las diferentes ecuaciones de la
recta, según lo muestran las Figuras 1-3.
Fig. 1. Curva calibración de aluminio, relacionando concentración vs absorbancia promedio
Según el análisis estadístico para la evaluación de la linealidad (t de student) para las curvas de
calibración de los tres metales en estudio, existe correlación lineal entre las concentraciones y el
promedio de las absorbancias, ver Anexos.
Fig. 2. Curva de calibración de selenio, relacionando concentración vs absorbancia promedio
A partir de la prueba de Shapiro-Wilk, se pudo determinar que los datos de las réplicas (absorbancias)
no tenían un comportamiento normal para los tres metales, para el análisis de las varianzas por
Kruskal Wallis se determinó que no existen diferencias significativas entre las réplicas; los informes
de las pruebas se encuentran en Anexos.
28
Fig. 3. Curva de calibración de hierro, relacionando concentración vs absorbancia promedio
6.2 Determinación de límite de detección y cuantificación
Para el caso del aluminio, al determinar el límite de detección y cuantificación, se obtuvieron valores
de 0.25 ppm y 0.42 ppm, respectivamente, al reemplazar en la ecuación de la recta, las mínimas
absorbancias que se diferencian de las respuestas del blanco. La ecuación de la curva de calibración
fue: y=0.002x + 0.011. A continuación, en la Tabla 1, se muestran los datos para los límites de
detección y cuantificación de aluminio.
Tabla 1. Absorbancias de réplicas de blancos, con el promedio y desviación estándar, para la determinación
del límite de detección y de cuantificación de aluminio
Absorbancia
0.0075
0.0073
0.0074
0.0074
0.0075
0.0075
0.0077
0.0077
0.0078
0.0075
0.0077
0.0078
Promedio Desv. Est. YL LoD YL LoQ LoD (ppm) LoQ (ppm)
0.00757
0.000167
0.0081
0.0084
0.25
0.42
YL LoD= Mínima absorbancia detectada que se puede diferenciar de la absorbancia del blanco
YL LoQ= Mínima absorbancia cuantificada que se puede diferenciar de la absorbancia del blanco
LOD= Límite de Detección; LOQ= Límite Cuantificación
Al determinar el límite de detección y de cuantificación para selenio, se obtuvieron valores de 1.44 y
2.41 ppm, respectivamente, luego de haber reemplazado las absorbancias en la curva: y= 0.002x +
0.015. En la Tabla 2, se detallan los resultados de las absorbancias obtenidas y los cálculos hallados.
29
Tabla 2. Absorbancias de réplicas de blancos, con el promedio y desviación estándar, para la determinación
del límite de detección y de cuantificación de selenio
Absorbancia
0.0072
0.0071
0.0088
0.0094
0.0098
0.0085
0.0079
0.0095
0.0086
0.0078
0.0084
0.0 1
0.0092
0.0074
Promedio Desv. Est. YL LoD YL LoQ LoD (ppm) LoQ (ppm)
0.0085
0.0010
0.0114
0.0134
1.44
2.41
YL LoD= Mínima absorbancia detectada que se puede diferenciar de la absorbancia del blanco
YL LoQ= Mínima absorbancia cuantificada que se puede diferenciar de la absorbancia del blanco
LOD= Límite de Detección; LOQ= Límite Cuantificación
Para hierro, se determinaron igualmente ambos parámetros, obteniendo un límite de detección de
0.06 ppm, y un límite de cuantificación de 0.10 ppm, reemplazando en la curva patrón de hierro: y=
0.053x + 0.137, los cuales se especifican en la Tabla 3.
Tabla 3. Absorbancias de réplicas de blancos, con el promedio y desviación estándar, para la determinación
del límite de detección y de cuantificación de hierro
Absorbancia
0.0057
0.0037
0.0033
0.002
0.0027
0.0021
0.002
0.0026
0.0013
0.002
0.0022
0.0019
0.0022
0.0023
Promedio Desv. Est. YL LoD YL LoQ LoD (ppm) LoQ (ppm)
0.0026
0.0011
0.0058
0.0080
0.06
0.10
YL LoD= Mínima absorbancia detectada que se puede diferenciar de la absorbancia del blanco
YL LoQ= Mínima absorbancia cuantificada que se puede diferenciar de la absorbancia del blanco
LOD= Límite de Detección; LOQ= Límite Cuantificación
6.3 Determinación de exactitud
Para la exactitud se evaluó la proximidad entre concentraciones teóricas y concentraciones
experimentales, en el caso de aluminio se evaluó este parámetro para tres concentraciones, 20, 60 y
100 ppm, en la Tabla 4 se puede observar el porcentaje de error correspondiente a la proximidad de
dichas concentraciones, con un promedio del 14.9%.
30
Tabla 4. Porcentaje de error para la determinación de la exactitud en mediciones de aluminio, hierro y selenio
Concentración teórica
(ppm)
Analito
Concentración
experimental (ppm)
Promedio %
de error
20
17
60
56
14.9
100
82
50
57
Selenio
150
170
9.7
250
245
3
2.92
Hierro
9
8.8
2.5
15
14.6
*Número de muestras para cada concentración de cada analito = 18 muestras
Aluminio
Para el cálculo del porcentaje de error de muestras de selenio, se realizaron mediciones de
concentraciones de 50, 150 y 250 ppm, de las cuales se evaluó la proximidad con base a las
concentraciones experimentales, tal como se muestra en la Tabla 4, obteniendo un promedio de
porcentaje de error del 9.7%
En la Tabla 4 también se presenta la evaluación de proximidad correspondiente de las
concentraciones de teóricas de 3, 9 y 15 ppm y las concentraciones experimentales, para mediciones
de hierro, con un promedio del 2.5% de error.
6.4 Determinación de precisión
Para la determinación de precisión se analizó la repetibilidad del sistema de medición de dos curvas
de aluminio, bajo las mismas condiciones de medición, hallando el coeficiente de variación como se
muestra en la Tabla 5. Cada concentración fue leída dos veces por triplicado, para un total de 6
valores de absorbancia para cada concentración de cada analito.
Tabla 5. Valores de coeficiente de variación para la repetibilidad de aluminio
Concentración
(ppm)
5
20
Absorbancias
0.0205
0.0269
0.0204
0.0204
0.0267
0.0268
0.0818
0.1011
0.0819
0.082
0.1014
0.1013
Abs. Prom ± Desv. Est.
CV %
0.0236 ±
0.0035
14.77
0.0916 ±
0.0106
11.58
31
40
60
80
100
0.1579
0.1913
0.1587
0.1595
0.1982
0.1923
0.2311
0.2765
0.2293
0.229
0.2760
0.2763
0.2993
0.3497
0.2976
0.3496
0.297
0.3493
0.3656
0.4157
0.3649
0.4161
0.3645
0.4158
0.1763 ±
0.0194
11.03
0.2530 ±
0.0255
10.06
0.3238 ±
0.0283
8.73
0.3904 ±
0.0279
7.14
Al igual que aluminio se realizó para selenio el análisis de dos curvas para la repetibilidad del sistema
de medición, en la Tabla 6 se puede observar los coeficientes de variación obtenidos bajos las
mismas condiciones de medición.
Tabla 6. Valores de coeficiente de variación para la repetibilidad de selenio
Concentración
(ppm)
5
50
100
150
200
250
Absorbancias
0.0102
0.0161
0.0107
0.0109
0.0168
0.0163
0.1364
0.1412
0.1362
0.1397
0.1371
0.1428
0.2731
0.2631
0.2722
0.2729
0.2627
0.2635
0.3935
0.3677
0.3911
0.3908
0.3644
0.361
0.4932
0.4551
0.4938
0.4572
0.4929
0.4584
0.5919
0.5445
0.5901
0.5449
0.5907
0.5462
Abs. Prom ± Desv. Est.
CV %
0.014 ±
0.0032
23.65
0.139 ±
0.0028
1.98
0.268 ±
0.0053
1.97
0.378 ±
0.0152
4.02
0.475 ±
0.0200
4.20
0.568 ±
0.0250
4.41
32
En la Tabla 7 se muestra los coeficientes de variación para dos curvas de calibración de hierro,
obtenidas bajo las mismas condiciones de medición, analizando de esta manera la repetibilidad del
sistema.
Tabla 7. Valores de coeficiente de variación para la repetibilidad de hierro
Concentración
(ppm)
0.06
3
6
9
12
15
Absorbancias
0.018
0.0174
0.0169
0.2822
0.2817
0.2812
0.5025
0.5008
0.4996
0.6818
0.6813
0.6818
0.7958
0.7977
0.7942
0.8864
0.8851
0.8829
0.0248
0.0251
0.0259
0.2661
0.2631
0.2667
0.4696
0.4759
0.4776
0.6382
0.638
0.6307
0.7425
0.7499
0.7342
0.8156
0.8192
0.8198
Abs. Prom ± Desv.
Est.
CV %
0.0214 ± 0.0043
20.23
0.2735 ± 0.0091
3.32
0.4877 ± 0.0148
3.04
0.6586 ± 0.0253
3.85
0.7691 ± 0.0298
3.88
0.8515 ± 0.0365
4.29
6.5 Determinación del porcentaje de recuperación por rotaevaporación y por liofilización.
Se analizaron los resultados obtenidos de la concentración de aluminio por rotaevaporación como el
método de concentración principal del estudio y de liofilización como un método adicional,
determinando en cada caso el porcentaje de recuperación como se muestra en la Tabla 8. Cada
concentración de cada analito se leyó tres veces por triplicado.
Tabla 8. Porcentaje de recuperación de aluminio por rotaevaporación y liofilización como métodos de
concentración
Conc.
Inicial
(ppm)
Conc.
Final
(ppm)
5
8.08
10.02
114
141
170
Conc.
Vol.
Vol. Inicial
Factor de
% de
Teórica
Final
(ml)
Concentración Recuperación
(ppm)
(ml)
Concentración por rotaevaporación
166.5
202.0
250.5
500
500
500
33
15
20
20
33.3
25
25
68.5
69.8
67.9
1
5.9
7.8*
15.3
64.6
23.2
34
33.59
Concentración por liofilización
9.1
46.8
5.1
49.38
45.2
5.4
39
20
4
147.8
46.4
4.8
9.1
8.3
5
9.6
709.89
46.98
87.18
22.73
*La evaluación de este estudio fue preliminar para observar si existía evidencia de concentración por el método de
liofilización.
Para la evaluación de la concentración de selenio por rotaevaporación como método principal y de
liofilización como método adicional, se halló el porcentaje de recuperación como se muestra en la
Tabla 9.
Tabla 9. Porcentaje de recuperación de selenio por rotaevaporación y liofilización como métodos de
concentración
Conc.
Inicial
(ppm)
Conc.
Final
(ppm)
1
9.2
24.9
44
218
296
0.95
6.21
6.5*
13.93
11.7
52
48
138.6
Conc.
Vol. Inicial
Vol.
Factor de
% de
Teórica
(ml)
Final (ml) Concentración Recuperación
(ppm)
Concentración por rotaevaporación
69.4
500
7.2
306
500
15
443
500
28
Concentración por liofilización
14.3
45.5
3
63.3
46
4.5
54,1
25
3
154.6
48
4.3
69.4
3.33
17.85
63.4
71.24
66.81
15.1
10.2
8.3
11.1
81.56
82.09
88.89
89.64
*La evaluación de este estudio fue preliminar para observar si existía evidencia de concentración por el método de
liofilización.
En la Tabla 10 se puede encontrar el porcentaje de recuperación resultante, después de concentrar
muestras de hierro por rotaevaporación como estudio principal y liofilización de manera adicional.
Tabla 10. Porcentaje de recuperación de hierro por rotaevaporación y liofilización como métodos de
concentración
Conc.
Inicial
(ppm)
Conc.
Final
(ppm)
0.13
0.48
1.32
3
12.2
17.3
0.33
0.56
1.38
3.5
4.7
13.4
Conc.
Vol. Inicial
Vol.
Factor de
% de
Teórica
(ml)
Final (ml) Concentración Recuperación
(ppm)
Concentración por rotaevaporación
5.15
500
12.6
18.00
500
13.3
27.84
500
23.7
Concentración por liofilización
4.36
46.2
3.5
5.38
48.2
5
16.42
45.4
3.8
34
39.6
37.5
21
58.3
67.8
62.1
13.2
9.6
11.9
80.35
87.43
81.60
6.6 Determinación de aluminio, hierro y selenio en tres lugares de la ciudad de Bogotá
Se determinó la concentración de estos tres metales en muestras de agua potable, de tres puntos
diferentes de la ciudad de Bogotá, esto se hizo antes y después de rotaevaporar, los resultados
obtenidos se muestran en las tablas a continuación.
Tabla 11. Resultados para hierro de las diez muestras tomadas en tres lugares diferentes de la ciudad de
Bogotá, junto con el porcentaje de recuperación del método
Muestras
Conc. Inicial
(ppm)
Conc. Final
(ppm)
Conc. Teórica
(ppm)
Vol. Inicial
(ml)
Vol. Final
(ml)
% de
Recuperación
Usme 12-06
1.46
11.58
16.18
500
45
71.57
Usme 13-06
0.55
9.89
13.64
500
20
72.51
Usme 14-06
0.46
6.93
10.07
500
23
68.83
Casa* 11-06
1.21
10.81
15.13
500
40
71.43
Casa 12-06
0.68
10.95
15.55
500
22
70.39
Casa 13-06
0.15
1.72
2.54
500
30
67.54
PUJ** 11-06
0.04
0.41
0.61
500
30
66.29
PUJ 12-06
0.03
0.26
0.39
500
40
65.33
PUJ 13-06
0.05
0.36
0.57
500
40
63.38
PUJ 14-06
2.00
23.97
33.30
500
30
71.98
* Este lugar se encuentra en la calle 129 de Bogotá.
** Este lugar hace referencia a la Pontificia Universidad Javeriana, en la cual se tomaron las muestras de la Facultad de Ciencias.
Para la totalidad de las muestras recolectadas, no se encontró presencia de selenio, tal como se
observa en la Tabla 12, presentada a continuación.
Tabla 12. Resultados para selenio de las diez muestras tomadas en tres lugares diferentes de la ciudad de
Bogotá, junto con el porcentaje de recuperación del método
Muestras
Conc. Inicial
(ppm)
Conc. Final
(ppm)
Conc. Teórica
(ppm)
Vol. Inicial
(ml)
Vol. Final
(ml)
% de
Recuperación
Usme 12-06
ND
ND
ND
500
45
ND
Usme 13-06
ND
ND
ND
500
20
ND
Usme 14-06
ND
ND
ND
500
23
ND
Casa 11-06
ND
ND
ND
500
40
ND
Casa 12-06
ND
ND
ND
500
22
ND
Casa 13-06
ND
ND
ND
500
30
ND
PUJ 11-06
ND
ND
ND
500
30
ND
PUJ 12-06
ND
ND
ND
500
40
ND
35
PUJ 13-06
ND
ND
ND
500
40
ND
PUJ 14-06
ND
ND
ND
500
30
ND
ND= No Detectado.
Para las muestras de aluminio (Tabla 13), se evidenció presencia de este metal en todas las muestras
recolectadas de Usme, y en tres de las cuatro tomadas en la Universidad Javeriana.
Tabla 13. Resultados para aluminio de las diez muestras tomadas en tres lugares diferentes de la ciudad de
Bogotá, junto con el porcentaje de recuperación del método
Muestras
Conc. Inicial
(ppm)
Conc. Final
(ppm)
Conc. Teórica
(ppm)
Vol. Inicial
(ml)
Vol. Final
(ml)
% de
Recuperación
Usme 12-06
0.66
6.33
7.38
500
45
85.81
Usme 13-06
0.08
1.23
2.10
500
20
58.60
Usme 14-06
0.44
7.15
9.65
500
23
74.08
Casa 11-06
ND
ND
ND
500
40
ND
Casa 12-06
ND
ND
ND
500
22
ND
Casa 13-06
ND
ND
ND
500
30
ND
PUJ 11-06
0.06
0.43
1.07
500
30
40.38
PUJ 12-06
0.10
0.72
1.30
500
40
55.69
PUJ 13-06
ND
ND
ND
500
40
ND
PUJ 14-06
0.70
8.08
11.73
500
30
68.84
ND= No Detectado.
36
7. DISCUSIÓN
En el análisis de la linealidad para aluminio, selenio y hierro se obtuvo el coeficiente de correlación al
cuadrado (r2), el cual tuvo un valor de 0.8529, 0.9865 y 0.9637 respectivamente; según Sierra et al.
(2010) si un r2 es igual o mayor a 0.995 se considera que hay un buen ajuste. En este estudio, el r2
está por debajo del valor ideal, lo cual indica que no hay una proporcionalidad adecuada entre el
analito y la respuesta generada, por este motivo se decidió realizar el test de t de student, puesto que
es un método con mayor robustez para el análisis de este tipo de datos. El análisis estadístico
demostró que existe correlación lineal para cada una de las curvas de los tres metales, lo cual indica
que la linealidad se cumple.
Además, se realizó un análisis estadístico, el cual demostró que para 9 réplicas no había una
distribución normal de los datos (prueba de Shapiro-Wilk), y al hacer un análisis de varianzas se
comprobó que no existen diferencias estadísticamente significativas entre las réplicas (prueba de
Kruskal-Wallis). Este resultado fue el mismo para aluminio, selenio y hierro.
Para el caso de los límites de detección y cuantificación de cada uno de los metales estudiados, se
realizaron las determinaciones desarrolladas por Eurachem (2005) y la Universidad de Buenos Aires
(UBA), obteniendo los mayores valores para el caso de selenio, con un límite de detección de 1.44
ppm y un límite de cuantificación de 2.41 ppm, lo cual indica que el método no detecta ni cuantifica
concentraciones del metal menores a las mencionadas, por lo tanto, con el fin de reducir estos límites
se podría plantear la espectrofotometría de absorción atómica con generación de hidruros (HG-AAS)
para leer este metal a menores concentraciones (del orden de µg/L) y con ellos mejores los límites de
detección (Morand et al. 2002).
Con respecto a los límites de aluminio, se obtuvo un valor de 0.25 ppm como límite de detección, y
0.42 ppm para límite de cuantificación, en donde las lecturas de los blancos arrojaron valores
cercanos al cero, muy similares entre sí, lo cual se refleja en la desviación estándar hallada para este
metal, siendo ésta la menor de los tres metales evaluados, con un valor de 0.000167.
Los datos arrojados para hierro, revelaron un límite de detección de 0.06 ppm y un límite de
cuantificación de 0.10 ppm, siendo el método para hierro, el que tuvo ambos límites con los menores
valores. Esto se puede relacionar con el poco uso que se le ha dado a esta lámpara, en comparación a
las demás, siendo estos datos los más cercanos a los límites que plantea el manual del equipo, ya que
este último señala un límite de detección de 0.06 ppm.
Para aluminio y selenio, se obtuvieron porcentajes de error promedio de 14.7% y de 9.7,
respectivamente, tal como se muestra en la Tabla 4; al ser estos resultados mayores al 5%, se
considera que la exactitud del método analítico es baja (Harvey, 2002). Se debe tener en cuenta que
dos concentraciones experimentales en el caso de selenio fueron mayores a la concentración teórica
como se muestra en la Tabla 4, esto puede deberse a una saturación del sistema, la cual puede
suceder después de pasar por el equipo una concentración alta del metal y no dejar transcurrir un
lapso de tiempo adecuado para que el sistema limpie trazas del analito. Finalmente para hierro se
37
encuentra un porcentaje de recuperación de 2.5%, lo cual indica que el método analítico es
moderadamente exacto, puesto que se encuentra entre el 1% y el 5%, según lo planteado por Harvey
(2002).
En el análisis de la precisión sólo se calculo la repetibilidad, puesto que para evaluar la
reproducibilidad era necesario variar las condiciones de los laboratorios, reactivos, material y equipos,
lo cual no se logro realizar en este trabajo. Para la repetibilidad se realizaron dos curvas de calibración
por metal, las cuales se llevaron a cabo bajo las mismas condiciones. En general el coeficiente de
variación (CV) no debería ser mayor al 5% para el análisis de impurezas (AEFI, 2001); los resultados
de aluminio presentan en todas las concentraciones un CV mayor al 5%, en el caso de selenio y
hierro se presenta un CV mayor al 5% en las menores concentraciones de la curva de calibración (5 y
0.06 ppm, respectivamente) como se muestran en la Tabla 6 y 7; esta alta variabilidad es producida
por efecto de las bajas concentraciones, en donde se asegura que los coeficientes de variación
aumentan a medida que disminuye la concentración del analito (ISP de Chile, 2010); para las demás
concentraciones de hierro y selenio hay evidencia de una adecuada precisión. Analizando los
coeficientes de variación de selenio, se puede decir que hay una buena precisión, sin embargo, se
tiene una baja exactitud, esto es posible ya que la precisión está relacionada con la dispersión de una
serie de mediciones, pero no da ninguna información sobre lo cerca que está una medición del valor
verdadero (AEFI, 2001), en el caso de hierro, se cumple con una exactitud moderada, además se
obtiene una buena precisión de los datos, mientras que para aluminio no se evidencia exactitud ni
precisión. Los métodos de concentración por rotaevaporación y liofilización se evaluaron empleando
el porcentaje de recuperación, lo cual mostró que la rotaevaporación en promedio tiene un
porcentaje de recuperación de 65%, esto es un 17% menos de recuperación en comparación a los
resultados que se muestran en el estudio de Rodríguez (1999), aunque en general las condiciones
fueron similares entre ambos estudios, no hay evidencia si en el estudio de Rodríguez se utilizó
alguna técnica de conservación de muestras para evitar la baja solubilización y adherencia de los
metales al material de vidrio, igualmente no se específica el tipo de vidrio que fue el utilizado. Sin
embargo el 65% de recuperación alcanzado en este estudio, posiblemente se dio por la adherencia de
los metales al material de vidrio, aunque se haya usado ácido nítrico para la conservación de las
muestras y lavado del material.
Para los estudios de mutagenicidad y genotoxicidad, el método de rotaevaporación es empleado para
la eliminación de los solventes orgánicos que son usados para eluir las muestras concentradas por
medio de resinas XAD 2 y XAD 8 (Carraro, 2000); sin embargo no se usa para concentrar
directamente el analito. Lo mismo sucede en el procedimiento de Guzzela (2002), en el cual la
rotaevaporación es usada para eliminar las sustancias usadas en la elución de los cartuchos C18.
Griffol (1992) y Dutka (1981) usan el método de rotaevaporación, para luego filtrar las muestras y
agregar DMSO. En estos estudios se logra ver la eficiencia de la concentración, pero son realizados
para un conjunto de agentes contaminantes diferentes a los metales.
Como un método de concentración alterno para metales, se propuso y se evaluó la liofilización, este
procedimiento fue propuesto por el director de este trabajo (Luis Gonzalo Sequeda), ya que no se ha
38
reportado para concentrar muestras que contengan analitos de interés que vayan a ser posteriormente
cuantificados; usualmente su uso está ligado a la industria de alimentos y farmacéutica, en donde es
utilizado para reducir volumen, envasado de algún producto, conservación de muestras o alimentos,
por este motivo se realizó un ensayo para observar la recuperación que este método tiene para
concentrar aluminio, selenio y hierro, encontrándose que este presenta un porcentaje de recuperación
promedio del 85% para selenio y hierro, en el caso del aluminio los resultados presentaron una alta
variación puesto que durante el estudio se evidencio la deficiencia de la lámpara de aluminio, por esto
los datos de este metal no se incluyen en el promedio anterior. El resultado de 85% en la liofilización
puede deberse a que el proceso favorece la eliminación de agua sin alterar los componentes de la
muestra, quedando intactos en el concentrado. Es posible que este método arroje un porcentaje de
recuperación mayor, si el material volumétrico usado fuese de teflón, para evitar adherencia de los
analitos a las paredes internas del material. Se evidencia que esta técnica supera a la rotaevaporación
en un 13%, lo cual puede ser posible ya que el proceso de rotaevaporación se realiza en material de
vidrio, lo cual hace que se presenten mayores pérdidas de metales por adherencia.
En cuanto a los resultados obtenidos para las muestras de agua potable recolectadas, no hubo
detección de selenio en las muestras antes y después de rotaevaporar, ya sea porque no se encontraba
en las muestras, o debido a que los límites de detección y cuantificación para el método de selenio
son los más altos como se muestra en la Tabla 2, y no se esperan concentraciones muy altas en agua
potable para este metal (Mehdi et al., 2013); por lo tanto, no fueron detectados en las muestras
analizadas en este estudio, sin embargo este análisis se hizo directamente sin el uso del generador de
hidruros, lo cual influye en gran medida en la determinación de este metal.
Para la determinación de aluminio, se encontró presencia de este metal en todas las muestras de
Usme, y en tres muestras de la Universidad Javeriana como se muestra en la Tabla 13, logrando un
porcentaje de recuperación promedio de 64% con este método. Esto puede explicarse debido al uso
de este elemento en forma de sal, como coagulante (OMS, 2006), o por la liberación de aluminio
debido a la lluvia ácida, que hace que éste pueda movilizarse en corrientes de agua (Exley et al., 2002;
Crisponi G, 2012).
La Resolución 2115 del 2007, señala que el valor máximo permisible de aluminio en agua potable es
de 0.2 mg/L, este valor se ve sobrepasado en tres muestras antes de ser rotaevaporadas, como se
muestra en la (Tabla 13) (Usme 12 -06, Usme 14 -06 y PUJ 14 – 06), estos valores pueden ser el
resultado de un exceso en el uso de coagulante en el proceso de potabilización. Sin embargo se debe
tener en cuenta que el límite de detección del aluminio en el sistema en este estudio es de 0.25 ppm
Tabla 1, por lo cual, para este metal no se pueden obtener datos confiables por debajo de este límite
de detección. Las implicaciones que tiene el aluminio al encontrarse en una mayor cantidad a la
permitida es la aparición de síntomas como inhabilidad para concentrarse, pérdida de la memoria,
cambios en la personalidad, depresión, alucinaciones visuales y/o auditivas, debilidad, fatiga,
convulsiones epilépticas, entre otros (Crisponi et al., 2013).
En las Tablas 11, 12 y 13 se pueden observar las concentraciones iniciales de las muestras de agua
potable para los tres metales en estudio, en las cuales se puede observar que existe un porcentaje de
39
recuperación considerable y que en muestras en donde no se detectó el metal al inicio si se detectó
después de realizar la concentración por rotaevaporación, lo cual indica que aunque no se detecte al
inicio del análisis con ayuda de la concentración se puede determinar con facilidad aluminio y hierro.
La Resolución 2115, también establece que el valor máximo aceptable de hierro en agua potable es
de 0.3 mg/L, el cual es sobrepasado al inicio del tratamiento, en 6 de las 10 muestras recolectadas
(Tabla 11), estos valores indican que el agua que se usa para el consumo no cumple con la normativa
actual, esto puede presentarse al igual que el aluminio por la mala dosificación del floculante al
momento de su adición, ésta es una de las razones planteadas por la OMS. Incluso, las
concentraciones que se encontraron por debajo de lo establecido, pueden significar un peligro
potencial para la salud, ya que el hierro tiene la capacidad de acumularse lentamente en los tejidos del
cuerpo (Hotz, 2012), llegando a causar enfermedades a largo plazo, incluido el estrés oxidativo
inducido por hierro (Barton et al. 1998).
Finalmente, se logró determinar la presencia de hierro en todas las muestras recolectadas en el
estudio, obteniendo un porcentaje de recuperación promedio del método del 69%. Su presencia en el
agua no se debe solamente a su uso como agente coagulante en el proceso de potabilización, sino
también por la corrosión de las tuberías durante la distribución del agua a los hogares (OMS, 2006).
Al lograr un aumento en la concentración de los contaminantes analizados en este estudio, mediante
la técnica de rotaevaporación, se podría llegar a utilizar este método para la evaluación de
mutagenicidad y genotoxicidad; sin embargo, aparte de la determinación de los analitos en estudio, se
midió al final del proceso el pH de las muestras tratadas, encontrándose valores inferiores a 1, según
la escala de la prueba; un pH tan bajo afecta el crecimiento adecuado de los organismos empleados
como indicadores de toxicidad, y pueden generar falsos positivos; por este motivo si se requieren las
muestras para realizar bioensayos, se deberá hacer la evaluación de proceso con otro material para no
acidificar las muestras y lograr comparar los resultados obtenidos con los arrojados por este estudio.
En general, se puede afirmar que los resultados de hierro fueron mejores en comparación a los
resultados de aluminio y selenio, esto se debe en su mayoría a que la lámpara de hierro tiene un
menor tiempo de uso. Esto se vio reflejado al momento del ajuste del equipo, ya que para las
lámparas de aluminio y selenio se tenía que colocar una mayor corriente para poder arrancar el
proceso y la ganancia promedio obtenida era de 26%, en cambio para la lámpara de hierro no hubo
problemas en el ajuste, y la ganancia promedio era del 84%.
Es importante tener en cuenta que al igual que la exactitud, la precisión se ve afectada por los
factores que influyen directamente sobre la relación entre la señal y el analito (Harvey, 2002), por este
motivo es de esperarse que la señal deficiente que emite la lámpara de aluminio por el desgaste que
presenta, afecte directamente las mediciones.
40
8. CONCLUSIONES
Se realizó una validación preliminar de la técnica de rotaevaporación como método de concentración
para aluminio, selenio y hierro, evaluando los parámetros de selectividad, linealidad, exactitud,
precisión en términos de repetibilidad, límites de detección y de cuantificación.
Analizando las dos técnicas puestas a punto para concentrar aluminio, selenio y hierro, se encontró
que el porcentaje de recuperación promedio para la rotaevaporación y liofilización es de 66% y 85%
respectivamente, se puede ver, entonces, que el método de concentración por liofilización es un 19%
mejor que la rotaevaporación.
Los resultados de las Tablas 11 y 13, muestran que se halló hierro y aluminio en muestras donde al
inicio no son detectados, e igualmente se evidenció concentración del analito en muestras que
presentaban concentraciones bajas antes de rotaevaporar o liofilizar; esto demuestra que las técnicas
cumplen con el objetivo de recuperar metales en muestras de agua potable que se encuentran por
debajo del límite de detección.
El pH menor a 1 de las muestras concentradas por ambas técnicas, hace que no sea posible la
realización de ensayos de mutagenicidad y genotoxicidad a partir de dichas muestras, debido a la
susceptibilidad de los organismos indicadores al bajo pH.
41
9. RECOMENDACIONES
La técnica de liofilización no fue un método de concentración óptimo para concentrar grandes
volúmenes muestras, esto, por las limitaciones del equipo que se encuentra en el laboratorio de
bioquímica especializada, es por esta razón que es importante hacer un escalado del proceso, si se
desea realizar más estudios.
De igual manera se debe tener en cuenta que la liofilización no se encuentra reportada por la EPA u
otra entidad, para la concentración de metales en agua potable, y que es necesario realizar más
ensayos para saber qué tan eficiente es a la hora de ser aplicada a este tipo de pruebas.
Con el fin de llegar a implementar la técnica de rotaevaporación como método de concentración, se
recomienda evitar el material de vidrio y usar teflón para rotaevaporar las muestras, con el fin de no
acidular las muestras y no reportar falsos positivos en las pruebas de mutagenicidad y genotoxicidad
Al momento de realizar la validación se debe contar con lámparas de cátodo hueco que presenten
condiciones óptimas de trabajo, y realizar un seguimiento de la vida útil de éstas.
42
10. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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45
11. ANEXOS
Anexo 1. Pruebas estadísticas de t de Student y Kruskal-Wallis para aluminio
Modelo de linealidad Aluminio
Prueba de normalidad (Shapiro-Wilk)
Pasado (P = 0,923)
1.
Nombre del
grupo
Prom
Media poblacional hipotética
N
Faltante
Promedio
6
0
0,184
Des.
estandar
0.122
SEM
0.0498
0,000
t = 3,694 con 5 grados de libertad.
(P = 0,014)
Intervalo de confianza del 95 por ciento para la media poblacional: 0,0559 a 0,312
Existe una diferencia estadísticamente significativa entre la media de la población de la muestra y la
media poblacional hipotética (P = 0,014).
Poder de la prueba realizada con alfa = 0,050: 0,836
Análisis de varianza de Aluminio
Prueba de normalidad (Shapiro-Wilk)
Fallo (P <0,050)
Kruskal-Wallis una forma de análisis de varianza de Rangos
Grupo
Col 2
Col 3
Col 4
Col 5
Col 6
Col 7
Col 8
Col 9
Col 10
N
6
6
6
6
6
6
6
6
6
Faltante
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Mediana
0,195
0,194
0,194
0,234
0,234
0,234
0,134
0,134
0,134
25%
0,0665
0,0665
0,0666
0,0825
0,0827
0,0827
0,0489
0,0489
0,0487
75%
0,316
0,314
0,314
0,366
0,366
0,366
0,214
0,213
0,212
H = 4832 con 8 grados de libertad. (P = 0,775)
Las diferencias en los valores medios entre los grupos de tratamiento no son lo suficientemente grande
como para excluir la posibilidad de que la diferencia se debe a la variabilidad del muestreo aleatorio, y no
hay una diferencia estadísticamente significativa (P = 0,775).
46
Anexo 2. Pruebas estadísticas de t de Student y Kruskal-Wallis para selenio
Modelo de linealidad Selenio
Prueba de normalidad (Shapiro-Wilk)
Nombre del
grupo
Prom
Pasado (P = 0,921)
N
Faltante
Promedio
Des. estandar
SEM
6
0
0,308
0.208
0.0850
Media poblacional hipotética
0,000
t = 3.631, con 5 grados de libertad. (P = 0,015)
Intervalo de confianza del 95 por ciento para la media poblacional: 0,0901 a 0,527
Existe una diferencia estadísticamente significativa entre la media de la población de la muestra y la
media poblacional hipotética (P = 0,015).
Poder de la prueba realizada con alfa = 0,050: 0,824
Análisis de varianza Selenio
Prueba de normalidad (Shapiro-Wilk)
Fallo (P <0,050)
Kruskal-Wallis una forma de análisis de varianza de Rangos
Grupo
Col 1
Col 2
Col 3
Col 4
Col 5
Col 6
Col 7
Col 8
Col 9
N
6
6
6
6
6
6
6
6
6
Faltante
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Mediana
0,333
0,332
0,332
0,315
0,314
0,312
0,338
0,340
0,339
25%
0,105
0,105
0,106
0,110
0,109
0,111
0,112
0,112
0,110
75%
0,518
0,518
0,517
0,477
0,479
0,480
0,505
0,502
0,478
H = 0280 con 8 grados de libertad. (P = 1,000)
Las diferencias en los valores de la mediana entre los grupos de tratamiento no son lo suficientemente
grande como para excluir la posibilidad de que la diferencia se debe a la variabilidad del muestreo
aleatorio, y no hay una diferencia estadísticamente significativa (P = 1,000).
47
Anexo 3. Pruebas estadísticas de t de Student y Kruskal-Wallis para hierro
Modelo de linealidad para hierro
Prueba de normalidad (Shapiro-Wilk)
Nombre del
grupo
Prom
Pasado (P = 0,921)
N
Faltante
Promedio
Des. estandar
SEM
6
0
0,308
0.208
0.0850
Media poblacional hipotética 0,000
t = 3.784, con 5 grados de libertad. (P = 0,013)
Intervalo de confianza del 95 por ciento para la media poblacional: 0133 a 0696
Existe una diferencia estadísticamente significativa entre la media de la población de la muestra y la
media poblacional hipotética (P = 0,013).
Poder de la prueba realizada con alfa = 0,050: 0,853
Análisis de varianza Hierro
Prueba de normalidad (Shapiro-Wilk)
Fallo (P <0,050)
Kruskal-Wallis una forma de análisis de varianza de Rangos
Grupo
Col 2
Col 3
Col 4
Col 5
Col 6
Col 7
Col 8
Col 9
Col 10
N
6
6
6
6
6
6
6
6
6
Faltante
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Mediana
0,327
0,328
0,337
0,554
0,553
0,558
0,486
0,483
0,487
25%
0,118
0,120
0,109
0,200
0,199
0,202
0,171
0,170
0,169
75%
0,497
0,507
0,492
0,761
0,767
0,756
0,709
0,706
0,709
H = 5493 con 8 grados de libertad. (P = 0,704)
Las diferencias en los valores medios entre los grupos de tratamiento no son lo suficientemente grande
como para excluir la posibilidad de que la diferencia se debe a la variabilidad del muestreo aleatorio, y no
hay una diferencia estadísticamente significativa (P = 0,704).
48
Anexo 4 Listado de metales con absorbancias para el Espectrofotómetro de Absorción
Atómica de Llama
Metal Longitud de Metal Longitud de Metal Longitud de Metal Longitud de Metal Longitud de Metal Longitud de
onda (λ)
onda (λ)
onda (λ)
onda (λ)
onda (λ)
onda (λ)
Ag
328.1
Cr
425.4
Ho
559
Nb
405.9
Rh
369.2
Te
214.3
Al
396.1
Cs
852.1
Ln
451.1
Nd
660.8
Ru
372.8
Ti
399.8
As
189
Cu
327.4
Lr
380
Ni
341.5
Sb
259.8
Tl
535.1
Au
267.6
Dy
526.5
K
766
Os
426.1
Sc
402
Tm
410.6
B
249.7
Er
400.8
La
441.7
P
213.6
Se
196
u
591.5
Ba
553.6
Eu
459.4
Li
670.8
Pb
405.8
Si
251.6
V
437.9
Be
234.9
Fe
372
Lu
466.2
Pd
363.5
Sm
442.4
W
400.9
Bi
223.1
Ga
403.3
Mg
285.2
Pr
284
Sn
284
Y
407.7
Ca
422.7
Gd
461.7
Mn
403
Pt
266
Sr
460.7
Yb
398.8
Cd
326.1
Hf
368.2
Mo
390.3
Rb
780
Ta
481.3
Zn
213.9
Co
345.4
Hg
253.7
Na
589
Re
346.1
Tb
596
Zr
360.1
Anexo 5. Mediciones de pH
Fig. 2. Prueba control de agua Tipo I y agua
acidulada al 2%. Fuente: Autor
Fig. 1. Tabla de comparación para resultados de
las tiras de pH. Fuente: Autor
49
Fig. 3. pH de muestras de hierro después de
rotaevaporar. Fuente: Autor
Fig. 6. pH de muestras de aluminio después de
rotaevaporar. Fuente: Autor
Fig. 4. pH de muestras de hierro después de
liofilizar. Fuente: Autor
Fig.7. pH de muestras de selenio después de
rotaevaporar. Fuente: Autor
Fig. 5. pH de muestras de aluminio después de
liofilizar. Fuente: Autor
Fig. 8. pH de muestras de selenio después de
liofilizar. Fuente: Autor
50
Fig.11. pH de muestras de la calle 129 después de
rotaevaporar. Fuente: Autor
Fig.9. pH de muestras de la PUJ después de
rotaevaporar. Fuente: Autor
Fig. 10. pH de muestras de Usme después de
rotaevaporar. Fuente: Autor
51