Facultad de Ciencias Veterinarias -UNCPBA- La pasteurización como medida de control de las enfermedades causadas por micobacterias en los sistemas de crianza de producción lechera Nielsen Laura Mariela; Medina Luis Felipe; Traversa María Julia Tandil, agosto 2016 La pasteurización como medida de control de las enfermedades causadas por micobacterias en los sistemas de crianza de producción lechera Tesina de la Orientación Producción Bovinos de Leche, presentada como parte de los requisitos para optar al grado de Veterinario del estudiante: Laura Mariela Nielsen. Tutor: M. V. Medina Luis Felipe Directora: Dra. Traversa María Julia Evaluador: Dra. María Fernanda Vega Agradecimientos A María Julia Traversa y María Fernanda Vega A Luis Medina y Santiago Piagentini A Alejandra Díaz e Inés Rivas A mi familia A Camilo y su familia A mis compañeros y amigos, especialmente Valeria Pérez, Belén Acosta, Lucas Palacio, Gastón Arregui, Juan Manuel Herrera, Rocío Orellano y Julia Brea Dedicatoria En memoria de Papá Resumen En los bovinos existen dos enfermedades infectocontagiosas de gran importancia económica y sanitaria para los establecimientos de producción láctea a nivel mundial causadas por micobacterias, la tuberculosis (TBC) y la paratuberculosis (PTBC) causadas por Mycobacterium bovis y por M. avium subespecie paratuberculosis, respectivamente. Los agentes causales de estas dos enfermedades comparten la vía de transmisión digestiva y ambos presentan gran resistencia en el medio ambiente. Los objetivos de esta tesina son revisar la bibliografía concerniente a la respuesta al tratamiento térmico de estas micobacterias y efectuar recomendaciones para la implementación del proceso de pasteurización de la leche en los sistemas de crianza de tambo. Los datos concernientes al comportamiento térmico del género Mycobacterium se presentan ordenados de manera cronológica en una matriz de datos. A partir de la revisión se concluyó que la pasteurización es un proceso eficaz para evitar la transmisión de la tuberculosis bovina por la vía digestiva a los terneros y logra reducir la dosis infectiva del agente causal de la paratuberculosis bovina. Palabras clave: micobacterias, pasteurización, terneros. tuberculosis, paratuberculosis, leche, Índice 1. Introducción .............................................................................................................................1 2. Metodología .............................................................................................................................4 3. Resultados ................................................................................................................................6 3.1. Excreción de micobacterias en productos biológicos ........................................................9 3.1.1. Excreción de Mycobacterium bovis en leche ..............................................................9 3.1.2. Excreción de Map en leche y materia fecal ..............................................................10 3.2. Resistencia térmica de los microorganismos del género Mycobacterium en leche ........11 3.2.1. Valor D ......................................................................................................................13 3.2.2. Cinética de inactivación bajo condiciones de laboratorio ........................................14 3.2.3. Estudios de inactivación bajo pasteurización comercial ...........................................17 3.2.4. Pasteurización de la leche destinada a la alimentación de terneros ........................18 3.3. Recomendaciones para la implementación de la pasteurización en rodeos lecheros .....20 3.3.1. Requerimientos de instalación .................................................................................20 3.3.2. Consideraciones para el uso diario ...........................................................................21 3.3.3. Manejo de la leche previo y posterior a la pasteurización .......................................21 3.3.4. Opciones disponibles en el mercado ........................................................................21 3.3.5. Consideraciones al pasteurizar calostro ...................................................................22 3.4. Modificaciones a la pasteurización y estrategias que la complementan .........................23 3.4.1. Modificaciones a la pasteurización ...........................................................................23 3.4.2. Homogeneizado .......................................................................................................24 3.4.3. Bactofugación y microfiltrado ..................................................................................24 4. Conclusiones ..........................................................................................................................25 5. Bibliografía .............................................................................................................................26 1. Introducción En los bovinos existen dos enfermedades causadas por micobacterias, la tuberculosis (TBC) y la paratuberculosis (PTBC). La primera es una enfermedad infecciosa crónica causada por Mycobacterium bovis y caracterizada por la presentación de granulomas típicos en diversos órganos. Puede afectar a otras especies domésticas y silvestres, incluido el hombre. La segunda es también una enfermedad crónica producida por M. avium subsp. paratuberculosis (Map), que afecta a bovinos, ovinos y caprinos. Se caracteriza por la presentación de inflamación granulomatosa difusa de la mucosa intestinal lo que conlleva a la diarrea crónica y adelgazamiento progresivo en todas las especies afectadas (Blood y Radostits, 1992). Es considerada una enfermedad con potencial zoonótico ya que se la asocia a la enfermedad de Crohn en los humanos (EC) (Chiodini et al., 2012). Ambas enfermedades presentan una distribución mundial (Figuras 1 y 2). La prevalencia más elevada de tuberculosis se registra en gran parte de África y ciertas partes de Asia y América. Muchos países desarrollados han reducido o eliminado la TBC del ganado vacuno a través de planes de control y erradicación de la enfermedad. Sin embargo, en la fauna salvaje de Canadá, el Reino Unido, los Estados Unidos y Nueva Zelanda subsisten importantes fuentes de infección. Por su parte la presencia de PTBC en países de Europa, Estados Unidos y Australia ha motivado la implementación de planes de control de la enfermedad (Paolicchi y Romano, 2003, OIE, 2014). En nuestro país la prevalencia de infección de TBC se estima que oscila entre un 2% y un 4% (Torres, 2011), mientras que la información disponible de PTBC se limita a la provincia de Buenos Aires en rodeos de cría de la Cuenca del Salado con seroprevalencias de entre el 7,2% y el 19,6% (Paolicchi y Romano, 2003). 1 Figura 1. Distribución mundial de tuberculosis bovina para el primer semestre del año 2014. Fuente: OIE, 2014 http://www.oie.int/es/ Figura 2. Distribución mundial de paratuberculosis para el primer semestre del año 2014. Fuente: OIE, 2014 http://www.oie.int/es/ Ambas enfermedades ocasionan pérdidas en los sistemas de producción animal. Se calcula que las debidas a TBC en Argentina, estarían en los 63 millones de dólares estadounidenses al año, siendo el principal componente la pérdida de peso en los bovinos (36%), las pérdidas en producción de leche (13%) y el decomiso en frigoríficos y mataderos (10%) (Torres, 2009). En el caso de PTBC se estima que durante el año 2001 se produjeron pérdidas 2 aproximadas de 6,3 y 22 millones de dólares estadounidenses en las cuencas lecheras de la provincia de Buenos Aires y en la Cuenca del Río Salado respectivamente, siendo la merma en la producción del 19% (Paolicchi, 2007). Más allá de las pérdidas económicas existen implicancias en salud pública ya que la TBC es una zoonosis presente en Argentina. Según datos del Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias entre los años 1988 y 2006 se confirmaron 2485 casos pulmonares de tuberculosis, el porcentaje de los debidos a M. bovis fue 2,7% entre 1988 y 1993, 1,7% entre 1994 y 1999 y 1,3% entre 2000 y 2006 (de Kantor et al., 2008). Con respecto al agente causal de la PTBC implicado como potencial agente etiológico de la EC, se cree que se transmitiría al humano a través de la leche ya que existen evidencias de que Map sobrevive al proceso de pasteurización y es posible cultivarlo a partir de muestras de leche comercializable (Cirone et al., 2007). Los agentes causales de estas dos enfermedades comparten la vía de transmisión digestiva siendo la principal en el caso de Map y segunda en orden de importancia, después de la respiratoria, para M. bovis. Las vacas infectadas pueden excretar ambos bacilos en la leche y de esta forma transmitirlos a las categorías más jóvenes. Según Traversa y Jorge (2006), el diseño de un programa de saneamiento debe estar compuesto por la interrelación de medidas sanitarias y de manejo destinada a impedir la transmisión de la infección y no quedar sujeto al éxito de una sola medida sanitaria. Por lo tanto, impedir la transmisión a las categorías más jóvenes es fundamental para lograr una reposición sana que permita al productor reemplazar los animales infectados eliminados y evitar la compra de vaquillonas con el riesgo sanitario que esto implica (Garro et al., 2010). La pasteurización de la leche es una medida sanitaria que ha sido utilizada para proveer a los terneros alimento seguro. Por tal motivo los objetivos de esta tesina son realizar una revisión bibliográfica concerniente a la respuesta al tratamiento térmico de las micobacterias y efectuar recomendaciones para la implementación del proceso de pasteurización en los sistemas de crianza de tambo. 3 2. Metodología El inicio de esta revisión bibliográfica fue la lectura de dos artículos denominados “Thermal inactivation of several Mycobacterium spp. in milk by pasteurization” y “Factores de riesgo de tuberculosis bovina en rodeos lecheros de las provincias de Córdoba y Santa Fe” publicados en Irlanda y Argentina en los años 1996 y 2010, respectivamente. A partir de ahí se valoraron las citas bibliográficas de ambos artículos y resultaron de relevancia los autores Hermon-Taylor y Chiodini quienes poseen un índice h de citas por autor en el buscador científico Scopus de 34 y 25, respectivamente. Otros autores revisados como Pavlas, M. y Stumbo C. R. con respectivos índices h de 4 y 3 no fueron seleccionados. Para avanzar cronológicamente en la búsqueda se consultaron artículos que citaban a estos autores hasta el año 2014. La búsqueda además se enriqueció con el buscador Google académico en el cual se buscaron en idioma castellano las palabras clave “pasteurización”, “leche”, “terneros” y “Mycobacterium”. Los criterios para la selección de los artículos estuvieron basados en: Idioma. Se seleccionaron aquellos artículos escritos en español o inglés. Fuente. Se seleccionaron artículos procedentes de universidades, instituciones gubernamentales y revistas indexadas. Lectura de título, resumen, autores y fecha para valorar relevancia en esta revisión. Finalmente, fueron 16 los artículos referidos a resistencia térmica micobacteriana incluidos para su evaluación (Figura 3) y complementados con 32 artículos relacionados. 4 “Factores de riesgo de tuberculosis bovina en rodeos lecheros de las provincias de Córdoba y Santa Fe”, Garro et al., 2010. Argentina “Thermal inactivation of several Mycobacterium spp. in milk by pasteurization”, Grant et al., 1996. Irlanda Referencias bibliográficas Surge relevancia Chiodini y HermonTaylor Google académico Criterios de selección: Palabras clave: “pasteurización”, “leche”, “terneros”, “Mycobacterium” Idioma Fuente Valoración del autor Valoración del título Valoración del resumen Trabajos que los citan Límite temporal: año 2014 Figura 3. Diagrama de flujo que muestra la estrategia de la búsqueda bibliográfica. 5 3. Resultados Los datos concernientes al comportamiento térmico del género Mycobacterium en la leche se presentan ordenados de manera cronológica en la siguiente matriz de datos de la bibliografía consultada (Tabla 1). Tabla 1. Matriz de datos Referencia Chiodini y HermonTaylor, 1993. Reino Unido Inóculo Mycobacterium spp. y Temp. Particularidades inicial Tiempo respuesta a (ºC) del ensayo (UFC/mL) pasteurización M. bovis sensible 100%. Map sobrevive 5-9%, 30´ 63 En laboratorio. equivale a 500-900 Inmersión en UFC/mL (reducción de baño de agua. 2 log10) Leche cruda 10 4 Tubo de ensayo, M. bovis sensible vol.: 10mL. 100%. Map Agitación durante sobrevive 3-5%, proceso 15" 72 equivale 300-500 UFC/mL (reducción de 2 log10) Sustrato Grant et al., 1996a. Leche cruda Irlanda del Norte 10 7 30´ 63,5 30´ 63,5 15" 71,7 10 4 Grant et al., 1996b. Leche cruda Irlanda del Norte 30´ 63,5 15" 71,7 10 7 En laboratorio. Inmersión en baño de agua. Tubo de ensayo, vol.: 5 mL. Sin agitar durante proceso M. bovis y M. fortuitum sensibles 100%. M. avium, M. intracellulare y M. kansasii sobreviven 10 UFC/mL (reducción de 6 log10) M. bovis sensible 100%. Map sobrevive < 1% en el 50% de las En laboratorio. muestras, equivale a Inmersión en menos de 100 UFC/mL baño de agua. (reducción > 2 log10) Tubo de ensayo, vol.: 5mL. Map sobrevive <1% en Sin agitar el 55% de las durante proceso muestras, equivale a En laboratorio. Inmersión en baño de agua. Unidad pasteurizadora HTST a escala, vol.: 250mL. Sin agitar durante proceso menos de 100 UFC/mL (reducción > 2 log10) M. bovis sensible 100%. Map sobrevive <1% en el 96% de las muestras, equivale a menos de 100.000 UFC/mL (reducción > 2 log10) Map sobrevive <1% en el 85% de las muestras, equivale a menos de 100.000 UFC/mL (reducción > 2 log10) 6 Millar et al., 1996. Reino Unido Muestreo semanal de leche pasteurizada comercializada en Inglaterra y Gales, durante 18 meses. Sometida a PCR Leche pasteurizada de supermercado 10 8 Stabel et al., 1997. EE.UU. Leche cruda 10 4-6 Sung et al., 1998. EE.UU. Leche cruda 10 6 Stabel, 2001. EE.UU. Leche cruda 10 3 Pearce et al., 2001. Nueva Zelanda 30´ Leche cruda 10 3 15" Map presente en el 7% de las muestras, con picos de detección en ene-mar y sep-nov Map bovina y humana. En laboratorio. A 65ºC, 5´: sobrevive Inmersión en 3 10 UFC/mL (reducción baño de agua. de 5 log10). Tubo de ensayo, A 72ºC, 1´: sobrevive 65vol.: 5mL. 104 UFC/mL (reducción 72Sin agitar de 4 log10). 74-76 durante No se inactiva proceso. totalmente luego de 30´. Sonicado para No se obtienen ventajas romper en la reducción a 74 y agrupamientos 76ºC 5560657072-75 Pasteurizador comercial a escala, vol.: 12L. Leche fluye por el circuito. Sonicado para romper agrupamientos Map bovina y humana sensible 100% a partir de los 65ºC En laboratorio. Inmersión en baño de agua. Tubo de ensayo, Map bovina y humana. vol.: 1,5mL. D72ºC 11.6. HTST 100% Sin agitar Varios efectiva en 62durante intervalos concentraciones 65proceso. de iniciales <10 1 UFC/mL. 68-72 Una porción se tiempo Los agrupamientos homogeneiza celulares no afectan al para estudiar valor D efecto del agrupamiento celular sobre el valor D 30´ 65,5 Pasteurizador LTLT. Con revolvedor Map sensible 100% 15" 636669-72 Pasteurizador a escala HTST. Capacidad de 120L/hora. Flujo turbulento Map sensible 100%. Valor extrapolado D72ºC: 2,03 (implica una reducción > 7 log10) 7 Grant et al., 2002. Irlanda del Norte No calculado. PCR y cultivo Leche cruda para detectar (infectada presencia y naturalmente) viabilidad, respectivamente. Leche cruda (12 litros) Stabel et al., 2004. EE.UU. Ayele et al., 2004. República Checa. Calostro 10 2-6 10 5 Leche pasteurizada de supermercado 15"25" 73 15" 72 15" 15" Leche cruda (infectada naturalmente) McDonald et al., 2005. Australia Leche cruda 4 X 10 3-4 15"20"25" Grant et al., 2005. Irlanda del Norte Leche cruda 10 1-5 15"25"60" 6472 Estudio longitudinal. Pasteurizador comercial HTST. Capacidad de 2000L/hora. Flujo turbulento. Con y sin homogeneizado Map puede resistir a 73ºC, por 15 o 25”, con o sin homogeneizado, si se encuentra en cantidades suficientes previo al tratamiento térmico. No obstante, habría alguna ventaja si la pasteurización se combina con el homogeneizado Map sensible 100% Pasteurizador comercial HTST. Flujo turbulento A 72ºC: Map sensible 100%. A 64ºC: sobrevive menos de 3 UFC/mL. La IgG presenta una reducción promedio del 25% Muestreo de leche pasteurizada comercializada Map presente en el en República 1,6% de las Checa (n=244), muestras durante 6 72 meses. Sometida a cultivo y PCR. Unidad Map presente en el pasteurizadora 2% de las muestras a escala. Pasteurizador comercial El homogeneizado HTST. aumentó 10 veces Capacidad de las UFC/mL 72presentes. Map 3000L/hora. 75Flujo turbulento. sobrevive 1 78 Homogeneizado UFC/250mL en el previo al 85% de las muestras tratamiento (reducción > 6log 10) térmico Map sobrevive 10-20 UFC/150mL en el Pasteurizador a 3% de las muestras escala HTST. (reducción de 4-5,2 Flujo turbulento. log10). 72,5Con y sin Extender el tiempo 84,5 homogeneizado no implica mayor previo al reducción tratamiento bacteriana. Mejor térmico resultado al homogeneizar. 8 Ellingson Leche et al., pasteurizada 2005. de EE.UU. supermercado Muestreo de leche pasteurizada comercializada en EE.UU. (n=702), durante 12 meses. Sometida a cultivo y PCR Map presente en el 2,8% de las muestras, con picos de detección en JulSept. Paolicchi et al., 2007. Argentina 72,5 Pasteurizador comercial HTST. Capacidad de 300L/hora. Flujo turbulento Map y M. phlei sensibles 100% 63 72 132 Muestreo de leche pasteurizada comercializada en Argentina (n=70), durante 7 meses. Sometida a cultivo y PCR. Map presente en el 2,86% de las muestras Leche cruda Paolicchi Leche et al., pasteurizada 2012. de Argentina supermercado 10 4-6 15"30"60" 30´ 15" 2" 3.1. Excreción de micobacterias en productos biológicos Los animales infectados eliminan las micobacterias en diversas secreciones constituyendo la principal fuente de infección para el resto de los animales del rodeo (Blood y Radostits, 1992). Conocer la excreción de micobacterias a través de las secreciones implicadas en la transmisión digestiva y cuantificarlas, resulta fundamental para determinar el riesgo de infección al que están expuestos los animales, así como para desarrollar medidas de control adecuadas. 3.1.1. Excreción de Mycobacterium bovis en leche En 1981 Matthias estimó que sólo el 4% de las vacas positivas a la prueba tuberculínica elimina M. bovis por leche. En investigaciones posteriores se determinó mediante el cultivo bacteriológico un porcentaje similar de excretoras y a este dato se adicionó que menos del 0,5% de las vacas reactoras 9 evidencian lesiones tuberculosas en la glándula mamaria o en los linfonodos retromamarios drenantes (Goodchild y Clifton-Hadley, 2001; Pardo et al., 2001). Estudios basados en PCR sobre muestras de leche de vacas tuberculinopositivas provenientes de rodeos infectados muestran resultados oscilantes desde la no detección de animales positivos hasta amplificaciones del 14 al 100% de las muestras procesadas. Estas diferencias estarían dadas por el patrón errático de eliminación del bacilo tuberculoso asociado con la inmunidad mediada por células en vacas tuberculosas y otros factores epidemiológicos como la inmunosupresión viral, el desbalance metabólico, la utilización de corticosteroides y la presencia del periparto (Serrano-Moreno et al., 2008). En este sentido ha sido descripto que una hiporeactividad inmunológica general asociada al parto en vacas tuberculosas implicaría una falta de respuesta a la prueba anocaudal (Blood y Radostits, 1992) y una reactivación de la infección aumentando la excreción de M. bovis (SerranoMoreno et al., 2008). Los terneros de un establecimiento de producción lechera con TBC están en riesgo de contraer la infección cuando son alimentados con un pool de calostro y leche cruda (Rentería y Hernández, 1996, Philips et al., 2003, Garro et al., 2011b). La dosis infectiva para establecer la infección tuberculosa por la vía oral es superior a la necesaria para establecer la infección por la vía respiratoria, entre varios miles a un millón de microorganismos versus un microorganismo contenido en una gota infectiva que logre alcanzar el alvéolo (Menzies y Neill, 2000, Philips et al., 2003). No obstante, un estudio confirmó que el consumo de calostro proveniente de ganado reactor es una fuente de transmisión de M. bovis para los terneros y que la transmisión puede tener lugar aún por la ingestión de calostro de vacas falso negativas a la prueba anocaudal (Rentería y Hernández, 1996). De igual forma los terneros pueden infectarse al ingerir leche de vacas subclínicamente infectadas que excretan 103 UFC/mL (Philips et al., 2003). 3.1.2. Excreción de Map en leche y materia fecal La leche obtenida del ordeño de vacas provenientes de un rodeo infectado con PTBC es una fuente de infección de Map para los terneros. Por un lado, se 10 produce la contaminación fecal de la ubre, siendo los recuentos de Map en heces de vacas con PTBC clínica de 108-12 UFC/g (Chiodini y Hermon-Taylor, 1993; Grant et al., 2002). Por otro lado, es posible la excreción directa de Map en la leche (Stabel et al., 2014). Existen estudios que informan el aislamiento de Map de un 35% de las muestras de leche obtenidas de vacas con PTBC clínicamente avanzada, con recuentos microbianos de 100 UFC/mL de leche (Chiodini y Hermon-Taylor, 1993, Giese y Ahrens, 2000). No obstante, a nivel de rodeo los animales infectados clínicamente normales son más numerosos. Los estudios sobre esta población indican un 22% y un 11,6% de positividad a partir de muestras de linfonodos retromamarios y de leche respectivamente, con recuentos celulares de 2 a 8 UFC/50mL de muestra (Sweeney et al., 1992). Teniendo en cuenta que la PTBC tiene un largo periodo de incubación, y los signos clínicos pueden no ser visibles hasta que el animal tiene entre 3 y 5 años de vida, es posible que animales asintomáticos eliminen Map en heces y leche por 18 meses previo a mostrar signos de enfermedad, por lo que el productor no es consciente del problema (Blood y Radostits, 1992). A pesar de las dificultades que se presentan al momento de cultivar este microorganismo que posee desarrollo lento y requerimientos nutricionales especiales, estos investigadores han logrado aislarlo y cuantificarlo a partir de leche naturalmente infectada ratificando la posibilidad de difusión hematógena y linfógena del bacilo hacia la leche (Matthias, 1981). 3.2. Resistencia térmica de los microorganismos del género Mycobacterium en leche Los estudios sobre resistencia térmica de los patógenos en la leche son fundamentales para evaluar la seguridad de los alimentos lácteos. Sin embargo, no existe un protocolo estandarizado para desarrollar estas pruebas de resistencia térmica sobre los peligros potenciales para la salud humana y animal (Condron et al., 2014). En este sentido, existen distintos grupos de trabajo abocados a estudiar la resistencia térmica de las micobacterias en la leche (Figura 4). Las metodologías utilizadas son diversas lo que dificulta y a veces impide comparar los resultados obtenidos llevando a desacuerdos que no pueden resolverse fácilmente (Figura 5) (Grant, 1998, Cerf y Griffiths, 11 2000). Un ejemplo de esto son los resultados obtenidos en el laboratorio que no pueden extrapolarse directamente a las condiciones de pasteurización comercial. No obstante, ambas metodologías se complementan; mientras los estudios de laboratorio proveen el conocimiento básico sobre la resistencia térmica microbiana, los resultados obtenidos en el laboratorio son validados bajo condiciones de pasteurización comercial (Condron et al., 2014). Figura 4. Resistencia térmica de las micobacterias en leche. Trabajos publicados por país desde el año 1993 hasta el año 2012. 12 Figura 5. Variables analizadas en los estudios acerca de resistencia térmica de las micobacterias. 3.2.1. Valor D Una forma de reflejar la resistencia térmica de los microorganismos es a través del valor D. Éste se define como el tiempo de reducción decimal o tiempo en segundos requerido para destruir el 90% de los microorganismos presentes a una temperatura determinada; es una medida de la velocidad de muerte microbiana (Jay et al., 2009). Cuanto mayor sea el valor D, tanto más resistente al calor será la bacteria. A modo de ejemplo, en la Tabla 2 pueden observarse valores D correspondientes a diversas micobacterias. Según Sung y Collins (1998), el valor D71,7ºC para M. bovis es igual a 4, mientras que para Map el D72ºC es de 11,6, indicando su mayor resistencia al calor. Estos valores fueron 13 determinados a partir de tubos de ensayo inmersos en un baño de agua en laboratorio. En contraposición, Pearce et al (2001) citan un valor D72ºC para Map de 2,03 utilizando un pasteurizador comercial a escala. Tabla 2. Valores D para diferentes micobacterias. Valor D (en segundos) Bacteria M. bovis Map Referencia D62ºC D65ºC D71,7ºC D72ºC - - 4 - Sung y Collins, 1998 229 48 - 11,6 Sung y Collins, 1998 15 6 - 2,03 Pearce et al., 2001 - - - M. tuberculosis 12-18 Stumbo, 1973 en Jay et al., 2009 3.2.2. Cinética de inactivación bajo condiciones de laboratorio Inóculos iniciales de M. bovis de 104 UFC/mL resultaron ser completamente sensibles a los tratamientos térmicos LTLT y HTST bajo condiciones de laboratorio, mientras que el mismo experimento sobre Map permitió recuperar bacterias viables (Chiodini y Hermon-Taylor, 1993). En un ensayo que estudió la cinética de inactivación de estas micobacterias (Grant et al., 1996a) se encontró que M. bovis exhibe una curva de muerte térmica lineal, con 104 UFC/mL se inactiva en 10 minutos; mientras que con 107 UFC/mL lo hace en 20 minutos, tal como puede observarse en la Figura 6 donde el eje de las ordenadas indica el número de sobrevivientes expresado en Log 10UFC/mL en función del tiempo expresado en minutos a una temperatura de calentamiento de 63,5ºC. Por su parte, la mayoría de la población de Map es destruida en los primeros 5 a 10 minutos, pero quedan sobrevivientes responsables de la forma cóncava de la curva de muerte térmica (Figura 7). 14 Figura 6. Curva de muerte térmica para M. bovis en leche a 63,5ºC. Cada punto representa la media de tres repeticiones (± error estándar). Fuente: Grant, et al., 1996b. Figura 7. Curva de muerte térmica para Map en leche a 63,5ºC. Cada punto representa la media de tres repeticiones (± error estándar). Fuente: Grant et al., 1996b. Estos hallazgos coinciden con un estudio posterior (Grant et al., 1996b) sobre varias micobacterias aisladas en leche de origen bovino. M. bovis y M. fortuitum son destruidas en su totalidad. Sin embargo, el resto de las micobacterias estudiadas, M. avium, M. intracellulare y M. kansasii, describen una curva de muerte térmica con cola, similar a la obtenida para Map, pudiendo recuperarse 15 microorganismos viables de las tres especies luego del tratamiento térmico (Figura 8). Es importante destacar que M. intracellulare es patógeno para los animales y se aísla de reactores positivos a la prueba tuberculínica anocaudal que presentan lesiones compatibles con tuberculosis (Traversa et al., 2011) y M. kansasii es responsable de infecciones pulmonares en los seres humanos y se aísla de ganglios linfáticos y leche de vacas asintomáticas (Bercovier y Vincent, 2001). Figura 8. Curva de muerte térmica de algunas micobacterias en leche a 63,5ºC: (a) M. bovis; (b) M. fortuitum; (c) M. avium; (d) M. intracellulare; (e) M. kansasii. Fuente: Grant et al., 1996a. La explicación de este diferente comportamiento térmico para bacterias del mismo género estaría dada por dos características: A. Tendencia a agruparse en medio líquido, debido a la hidrofobicidad de su pared (McFadden en Grant et al., 1996a). Las paredes de las micobacterias tienen un contenido muy elevado de lípidos, de hasta el 60%, del cual gran parte está adherido a polisacáridos, formando glucolípidos que se ubican en una capa externa de la pared, siendo los responsables del carácter hidrófobo de la misma (Wolinsky, 1996). Esto les permite agruparse (Figura 9) y, en consecuencia, las bacterias que se hallan en el centro del agrupamiento requieren un calentamiento adicional para ser inactivadas (Grant et al., 2005). 16 M. bovis es la excepción, la cual muestra una orientación paralela en su agrupamiento (Grant et al., 1996a). Esta diferencia podría ser la responsable de su mayor sensibilidad térmica. B. Velocidad de crecimiento. El incremento en la resistencia térmica ha sido relacionado con una célula microbiana menos activa. Aunque el mecanismo no es conocido, las células bacterianas tienden a ser más resistentes al calor en la fase estacionaria del crecimiento y menos durante la fase logarítmica, (Jay et al., 2009). Esto podría explicar la mayor sensibilidad térmica de M. fortuitum, una bacteria de crecimiento rápido dentro de las micobacterias. Figura 9. Células de Map agrupadas (A) y aisladas (B). Ambas muestras fueron ácido-alcohol resistentes, las fotos fueron tomadas con microscopio de luz (Zeiss, Oberkochen, Germany). Magnificación: 38.300. Fuente: Sung y Collins, 1998. 3.2.3. Estudios de inactivación bajo pasteurización comercial La resistencia térmica de Map ha sido y continúa siendo objeto de gran debate entre los investigadores. A diferencia de lo que ocurre con M. bovis las investigaciones llevadas a cabo en el laboratorio no logran la eliminación completa de Map. La principal hipótesis para explicar este hecho apunta a la permanencia estática de la leche durante el tratamiento térmico, ya que la totalidad de la leche debe alcanzar rápidamente la temperatura de pasteurización (Grant et al., 1996b). Para esto debe circular de manera turbulenta. En los pasteurizadores comerciales el flujo turbulento se produce a causa de los relieves de las superficies de las placas (Alais, 1988). 17 Con el uso de pasteurizadores comerciales a escala se logró imitar el flujo turbulento de la leche y bajo estas condiciones inóculos de Map de entre 103 y 106 UFC/mL de leche son destruidos totalmente (Stabel et al., 1997; Pearce et al., 2001). No obstante, otros investigadores propusieron evaluar el comportamiento térmico de cepas salvajes de Map utilizando leche naturalmente infectada sometida a una pasteurización comercial. Es así que la efectividad del tratamiento térmico HTST sobre Map fue evaluada en un estudio prospectivo longitudinal utilizando un pasteurizador comercial y leche naturalmente infectada recolectada semanalmente durante los meses de diciembre del año 1999 a marzo del año 2000 (Grant et al., 2002). Este periodo fue elegido en base a una investigación previa que estudió la presencia de Map en leche de supermercados y que señala a los meses de enero a marzo y de septiembre a noviembre como los períodos en los que se producen picos de detección del microorganismo (Millar et al., 1996). Se encontró que la pasteurización HTST no es completamente efectiva todo el tiempo. Es decir, Map puede resistir el calentamiento a 72ºC, por 15 segundos si se encuentra en cantidades suficientemente altas antes de ser sometida al proceso de pasteurización (Grant et al., 2002). 3.2.4. Pasteurización de la leche destinada a la alimentación de terneros Según algunos estudios, es posible la implementación exitosa de la pasteurización baja de la leche destinada a la alimentación de los terneros. Así lo demuestra un ensayo realizado en un establecimiento lechero equipado con un pasteurizador discontinuo mediante el cual se logró destruir Map presente en concentraciones de 103 UFC/mL. En la Figura 10 puede observarse la recuperación de bacterias viables, representada en la ordenada por las UFC/mL en función de la temperatura de calentamiento (Stabel, 2001). El tiempo que insume todo el proceso es de 90 minutos, incluyendo el tiempo necesario hasta alcanzar la temperatura de pasteurizado y el mantenimiento por 30 minutos (Figura 11). 18 Figura 10. Recuperación de Map viables en la leche antes y después del tratamiento térmico en la unidad pasteurizadora discontinua. Los valores representan la media ± desvío estándar para dos experimentos replicados. Fuente: Stabel, 2001. Figura 11. Tiempo versus temperatura de la leche en la unidad pasteurizadora. Los valores representan la media ± desvío estándar para dos experimentos replicados. Fuente: Stabel, 2001. En cuanto a la pasteurización alta, un ensayo utilizando un pasteurizador con capacidad de 300 l/h disponible en un establecimiento lechero encontró que se 19 logra la eliminación completa de Map en leche inoculada con 106 UFC/mL bajo esas circunstancias de trabajo (Paolicchi, et al., 2007), coincidiendo con los hallazgos previos publicados por Stabel et al (2004). 3.3. Recomendaciones para la implementación de la pasteurización en rodeos lecheros Un trabajo de la Universidad de Minnesota (Godden, 2003) plantea una serie de consideraciones para la implementación de la pasteurización de la leche destinada a los terneros. 3.3.1. Requerimientos de instalación En primer lugar, se debe determinar el volumen de leche a procesar diariamente para seleccionar el pasteurizador de capacidad adecuada. En cuanto al calentador de agua hay que tener en cuenta si la unidad pasteurizadora lo trae incorporado o debe comprarse aparte, o bien, si el establecimiento posee un calentador asegurarse que podrá abastecer el volumen de agua a la temperatura necesaria. Existen en el mercado pasteurizadores continuos de pequeñas capacidades que tienen incorporado un calentador eléctrico a la unidad y cuando los volúmenes son mayores, la fuente energética es el gas. Es importante conocer el espacio que ocupará la unidad pasteurizadora y su ubicación final. Los pasteurizadores no vienen provistos de un tanque de recepción ni de salida de leche. Por lo tanto, debe tenerse en claro si la bomba de leche succionará a partir del tanque de frío o si será necesario contar con un recipiente para tal fin. De igual forma, hay que determinar si la leche pasteurizada será recolectada directamente en el tanque de distribución o será almacenada en otro sitio. Finalmente, se evaluará las opciones disponibles en el mercado, teniendo en cuenta los costos de compra, instalación y consumo, además de la disponibilidad de repuestos. 20 3.3.2. Consideraciones para el uso diario Es fundamental que las personas encargadas de procesar la leche estén capacitadas para operar el pasteurizador y realizar la limpieza adecuada del equipo, respetando los tiempos y las temperaturas sugeridos/as por el fabricante. La limpieza inadecuada permite la acumulación de grasa, proteína y minerales lo que interfiere en la transferencia de calor hacia la leche, además de servir para el desarrollo bacteriano. Una rutina adecuada de lavado de la unidad pasteurizadora consta de los mismos pasos de lavado de la ordeñadora y de los tanques de frío. 3.3.3. Manejo de la leche previo y posterior a la pasteurización En caso de almacenar la leche fuera del tanque de frío, se deben utilizar recipientes cerrados y limpios, debiendo refrigerar la leche si no se va a pasteurizar en el corto plazo. De esta manera se evita el desarrollo bacteriano y fermentación posterior, con la consecuente producción de ácido y caída de pH. Esto es importante, debido a que la leche fermentada tiene modificada su estructura proteica, de manera tal que cuando es sometida al calor se produce coagulación de la proteína y formación de cuajada. Cuando esta leche es administrada a los terneros se ve desprovista de gran cantidad de nutrientes que quedan retenidos en el cuajo. De igual forma, si la leche pasteurizada no es administrada rápidamente a los terneros debe ser almacenada en recipientes cerrados y limpios para evitar la contaminación posterior al tratamiento térmico. 3.3.4. Opciones disponibles en el mercado En la Tabla 3 se presentan los pasteurizadores disponibles en Tandil. Todos son de tipo HTST y en la actualidad el mercado no ofrece pasteurizadores de tipo LTLT. Las unidades con capacidad de hasta 1000 L/hora utilizan la electricidad como fuente energética, mientras que aquellas con capacidades mayores requieren gas. El costo de la luz se estima en $1,25/Kw y el del gas en $12,5/Kg. Los puntos de venta consultados instalan el equipo y ofrecen servicio técnico y disponibilidad de repuestos. La limpieza del pasteurizador se realiza mediante el sistema de limpieza en el lugar (conocido como “CIP” del 21 inglés cleaning in place) utilizado para el lavado de la ordeñadora y del tanque de refrigeración donde la leche permanece hasta que es retirada por el servicio que la transporta a la usina concentradora. Tabla 3. Pasteurizadores comerciales disponibles en Tandil. Precios a abril 2016. * Consumo estimado por ternero: 6 litros de leche diarios y dos pasteurizaciones al día. Capacidad (L/hora) 300 500 500 1000 Calentador de agua Eléctrico Eléctrico Eléctrico Eléctrico 220 voltios CA 220 voltios CA 220 voltios mono/trifásica 220 voltios CA - 7 KW/h 12 KW/h - 18 KW/h - 4 KW/h 7 KW/h 7 KW/h (mono) 3-4 KW/h (tri) 15 KW/h - Consumo de gas - - - - 3 Kg de gas licuado/h Termógrafo Sí Sí Sí Sí Sí Sí Sí Sí 6400 8100 14600 11900 16500 9.503 12.089 13.587 17.810 24.600 100 160 160 330 660 Tensión de alimentación Consumo eléctrico máximo Consumo eléctrico en régimen de trabajo Sistema de lavado CIP Precio (en USD) Instalación: 10% del valor del equipo Terneros a alimentar * Sí 2000 Calderín a gas incorporado Sí 3.3.5. Consideraciones al pasteurizar calostro Algunos investigadores sugieren que los terneros alimentados con un pool de calostro están en riesgo de infectarse con M. bovis debido a la presencia de vacas falso negativas a la prueba anocaudal (Evangelista, 1996, Garro et al., 2011). Serrano-Moreno et al (2008) lograron amplificar el genoma de M. bovis mediante PCR a partir de muestras de calostro, tanto de ganado reactor como no reactor a la prueba tuberculínica. Si bien los ensayos de pasteurización de calostro revisados se focalizaron en la destrucción de Map, los resultados de los mismos indican que esta bacteria puede ser destruida mediante LTLT y HTST. Sin embargo, se observan pérdidas de inmunoglobulinas del orden del 12,3 al 30% por lo que estos investigadores sugieren que la pasteurización del 22 calostro sólo debe implementarse en aquellos casos en que se clasifique la calidad del mismo mediante calostrómetro, utilizando sólo aquel de alta calidad (más de 60mg/mL de inmunoglobulina) además de suministrarlo en el momento adecuado y en cantidad suficiente (Stabel et al., 2004, Godden, 2009). 3.4. Modificaciones a la pasteurización y estrategias que la complementan Map ha sido vinculado a la EC en los humanos y la vía de transmisión estaría dada por el consumo de leche bovina pasteurizada contaminada con el agente (Tabla 4) (Cirone et al., 2007). De confirmarse el rol de Map como agente etiológico en la EC, los parámetros establecidos para la pasteurización y diversas estrategias complementarias deberán ser evaluadas. Tabla 4. Aislamientos de Map a partir de leche comercial. Fuente: Cirone et al., 2007. País Reino Unido Cultivos positivos (%) 2 Referencia Grant et al., 2002 Estados Unidos 2,8 Ellingson et al., 2005 República Checa 1,6 Ayele et al., 2005 Argentina 2,86 Paolicchi et al., 2005 . 3.4.1. Modificaciones a la pasteurización En 1998 la industria láctea del Reino Unido adoptó voluntariamente incrementar de 15 a 25 segundos el tiempo de la pasteurización alta para incrementar la letalidad del proceso (Grant et al., 2002) debido a que un estudio llevado a cabo sobre leche de supermercados encontró que el 7% de la leche estudiada arrojó resultados positivos a Map mediante PCR, aunque no pudo aislarse mediante cultivo bacteriano (Millar et al., 1996). Sin embargo, diversos investigadores no hallaron diferencias significativas al extender el tiempo de pasteurización (Grant et al., 2002; McDonald et al., 2005; Grant et al., 2005; Paolicchi et al., 2007). 23 En relación a la temperatura de pasteurización, tampoco se obtienen ventajas significativas en cuanto a la reducción microbiana de Map al elevar la temperatura del tratamiento térmico entre 74 y 85°C (Stabel et al., 1997; McDonald et al., 2005; Grant et al., 2005). 3.4.2. Homogeneizado A pesar de que algunos autores no encontraron diferencias en el comportamiento térmico de micobacterias agrupadas y aisladas (Sung y Collins, 1998), otros autores obtuvieron una mayor reducción bacteriana al homogeneizar la leche previo a la pasteurización de la misma (Grant et al., 2002, Grant et al., 2005). La industria láctea homogeneiza la leche destinada a la venta en góndola. Este proceso consiste en la ruptura mecánica y dispersión de los glóbulos grasos de la leche para evitar la separación de fases de la misma (Alais, 1988). Al evaluar el efecto del homogeneizado sobre los agrupamientos microbianos se encontró que reduce el tamaño de los mismos permitiendo que más células queden expuestas al efecto de la temperatura (McDonald et al., 2005). 3.4.3. Bactofugación y microfiltrado Ha sido propuesto el estudio de diversas tecnologías de proceso para combinar con la pasteurización, tales como la bactofugación y el microfiltrado. El primero se basa en el uso de la fuerza centrífuga para remover partículas pesadas como esporas y potenciales agrupamientos bacterianos; mientras que el segundo utiliza filtros de 1,4 µm para remover bacterias y esporas de la leche (Grant et al., 2005). 24 4. Conclusiones Los parámetros de tiempo y temperatura de pasteurización de la leche, tanto LTLT como HTST, han sido establecidos en base a la sensibilidad térmica de M. bovis. Los trabajos analizados corroboran este hecho y utilizan a esta bacteria como control del proceso de pasteurización. Más aun, ha sido y continúa siendo la estrategia de control para evitar el contagio de tuberculosis bovina a través de la leche hacia los seres humanos. La pasteurización de la leche destinada a los terneros es una medida de control de la transmisión de M. bovis por la vía digestiva. Además, otros autores han probado métodos alternativos como la acidificación de la leche y en sus ensayos concluyen que la metodología de inactivación de excelencia es la pasteurización (Michel et al. 2015, Macuamule et al. 2016). La eficacia de los tratamientos térmicos para eliminar Map de la leche es de interés mundial y en la actualidad aún resulta controvertida. Aunque varios investigadores han logrado eliminarlo completamente tanto en LTLT como en HTST bajo ciertas condiciones de trabajo, otros investigadores no han tenido tal éxito a punto de aislarla de leche pasteurizada comercializada en supermercados. De acuerdo a los estudios de resistencia térmica revisados se encontró que la cantidad de Map presente en la leche afecta la eficacia de la pasteurización. La carga bacteriana en leche naturalmente infectada varía a lo largo del tiempo y se conoce que mientras mayor es el número de microorganismos, mayor es el riesgo de obtener un producto no apto al final del proceso de pasteurización. Por lo tanto, un establecimiento lechero que implemente la pasteurización de la leche destinada a sus terneros debe evitar el uso de aquella proveniente de animales clínicos que son eliminadores de Map a través de la leche y heces, además de aplicar prácticas higiénicas adecuadas en la rutina de ordeño que disminuyan la contaminación de la leche, reduciendo así la carga de Map en el pool de leche que ingresa al sistema de pasteurización. 25 5. Bibliografía - Alais C. (1988). La leche de consumo pasteurización y esterilización, pp 419-445. En: C. Alais (ed) Ciencia de la leche. Principios de técnica lechera. Compañía editorial continental, México. - Ayele, W. Y.; Svastova, P.; Roubal, P.; Bartos, M.; Pavlik, I. (2004). Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis cultured from locally and commercially pasteurized cow´s milk in the Czech Republic. Applied and environmental microbiology. 71, 1210-1214. - Bercovier, H.; Vincent, V. (2001). Mycobacterial infections in domestic and wild animals due to Mycobacterium marinum, M. fortuitum, M. chelonae, M. porcinum, M. farcinogenes, M. smegmatis, M. Scrofulaceum, M. xenopi, M. kansasii, M. simiae y M. genavense. Rev sci tech Off int Epiz. 20, 265-290. - Blood D. C.; Radostits O. M. (1992). Enfermedades causadas por bacterias, pp 764-784. En: D. C. Blood y O. M. Radostits (eds) Medicina Veterinaria volumen I. Interamericana McGraw – Hill, Madrid. - Cerf, O.; Griffiths, M. W. (2000). Mycobacterium paratuberculosis heat resistance. Letters in applied microbiology. 30, 341-344. - Cirone, K.; Morsella, C.; Romano, M.; Paolicchi, F. (2007). Mycobacterium avium subsp paratuberculosis: presencia en los alimentos y su relación con la enfermedad de Crohn. Revista argentina de microbiología. 39, 57-68. - Chiodini, R. J.; Hermon-Taylor, J. (1993). The thermal resistance of Mycobacterium paratuberculosis in raw milk under conditions simulating pasteurization. J Vet Diagn Invest. 5, 629-631. - Chiodini, R. J.; Chamberlin, W. M; Sarosiek, J.; McCallum, R. W. (2012). Crohn's disease and the mycobacteriosis: a quarter century later. Causation or simple association? Critical reviews in microbiology. 38, 52-93. - Condron R., Farrokh C., Jordan K., McClure P., Ross T., Cerf O. Guidelines for experimental design protocol and validation procedure for the measurement of heat resistance of microorganisms in milk. 2014; 1 (1): [11 26 pantallas]. Disponible en el URL: http://dx.doi.org./10.1016/j.ijfoodmicro.2014.09.027 (15/11/14). - Ellingson, J.; Anderson, J.; Koziczkowski, J.; Radcliff, R.; Sloan, S.; Allen, S.; Sullivan, N. (2005). Detection of viable Mycobacterium avium subsp. Paratuberculosis in retail pasteurized whole milk by two culture methods and PCR. J. Food Prot. 68, 966-972. - Garro, C.; Abdala, A.; Garbaccio, S.; Späth, E.; León, E.; Paolicchi, F. (2010). Factores de riesgo de tuberculosis bovina en rodeos lecheros de las provincias de Córdoba y Santa Fe. Revista Argentina de Producción Animal. 30, 166-178. - Garro C., Morris W., Delgado F., Garbaccio S. Tuberculosis bovina en terneros. 2011 a; 1 (1): [10 pantallas]. Disponible en el URL: http://www.veterinariargentina.com/revista/2011/04/tuberculosis-bovina-enterneros/ (05/05/14). - Garro C., Cobos Roldán M., Oriani S., Garbaccio S. Tuberculosis en terneros: resultados de un estudio prospectivo. 2011 b; 1 (1): [20 pantallas]. Disponible en el URL: http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n121211/121108.pdf (15/04/14). - Giese, S. B.; Ahrens, P. (2000). Detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in milk from clinically affected cows by PCR and culture. Veterinary Microbiology. 77, 291-297. - Godden, S. (2003). A review of issues surrounding the feeding of waste milk and pasteurization of waste milk and colostrum. From the proceedings of the Minnesota dairy health conference college of veterinary medicine, University of Minnesota. - Goodchild, A. B.; Clifton-Hadley, R. S. (2001). Cattle to cattle transmission of Mycobacterium bovis. Tuberculosis. 81, 23-41. - Grant, I. R.; Ball, H. J.; Rowe, M. T. (1996a). Thermal inactivation of several Mycobacterium spp. in milk by pasteurization. Letters in Applied Microbiology. 22, 253-256. - Grant, I. R.; Ball, H. J.; Neill, S. D.; Rowe, M. T. (1996b). Inactivation of Mycobacterium paratuberculosis in cows’ milk at pasteurization temperatures. Applied and environmental microbiology. 62, 631-636. 27 - Grant, I. R. (1998). Does Mycobacterium paratuberculosis survive current pasteurization conditions? Applied and environmental microbiology. 64, 27602761. - Grant, I. R.; Hitchings, E. I.; McCartney, A.; Ferguson, F.; Rowe, M. T. (2002). Effect of commercial-scale high-temperature, short-time pasteurization on the viability of Mycobacterium paratuberculosis in naturally infected cows’ milk. Applied and environmental microbiology. 68, 602-607. - Grant, I. R.; Williams, A. G.; Rowe, M. T.; Muir, D. (2005). Efficacy of various pasteurization time-temperature conditions in combination with homogenization on inactivation of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in milk. Applied and environmental microbiology. 71, 28532861. - Jay J. M. (2009). Protección de los alimentos mediante altas temperaturas y características de los microorganismos termófilos, pp 417-442. En: J. M. Jay; M. J. Loessner; D. A. Golden (eds) Microbiología moderna de los alimentos, Zaragoza. - Kantor I. N., Paolicchi F., Bernardelli A., Torres P. M., Canal A., Lobo J. R., Zollin de Almeida M. A., Paredes Noack L. A., López J. F., Garín A., López Insaurralde A., Boschiroli-Cara M. L., Cataldi A., Ambroggi M. La tuberculosis bovina en América Latina. Situación actual y recomendaciones. Taller patrocinado por la OIE. III Congreso Latinoamericano de zoonosis. Buenos Aires. 2008; 1 (1): [46 pantallas]. Disponible en el URL: http://www.rramericas.oie.americas.oie.int/es/proyectos/zoonosis/tuberculosis recomendaciones ago.html (15/04/14). - Macuamule, C. L S.; Wiid, I. J.; van Helden, P. D.; Tanner, M.; Witthuhn, R. C. (2016). Effect of milk fermentation by kéfir grains and selected single strains of lactid acid bacteria on the survival of Mycobacterium bovis BCG. 217, 170-176. - Matthias D. (1981). Infecciones por micobacterias, pp 229-255. En: J. Beer (eds) Enfermedades infecciosas de los animales domésticos tomo II enfermedades producidas por bacterias y hongos e intoxicaciones. Acribia, Zaragoza. 28 - McDonald, W. L.; O´Riley, J. O.; Schroen, C. J.; Condron, R. J. (2005). Heat inactivation of Mycobacterium avium subsp paratuberculosis in milk. Applied and environmental microbiology. 71 (4), 1785-1789. - Menzies, F. D.; Neill, S. D. (2000). Cattle-to-cattle transmission of bovine tuberculosis. The veterinary journal. 160, 92-106. - Michel, A. L.; Geoghegan, C.; Hlokwe, T.; Raseleka, K.; Getz, W. M.; Marcotty, T. (2015). Longevity of Mycobacterium bovis in raw and traditional souring milk as a function of storage temperature and dose. Plos one. 10 (6), 112. - Millar, D., Ford, J., Sanderson, J., Withey, S., Tizard, M., Doran, T., Hermon- Taylor, J. (1996). IS900 PCR to detect Mycobacterium paratuberculosis in retail supplies of whole pasteurized cows´milk in England and Wales. Applied and environmental microbiology. 62, 3446-3452. - O.I.E. World Organization for Animal Health. Paratuberculosis. 1(1): [11 pantallas]. Disponible en el URL: http://www.oie.int/fileadmin/Home/esp/Media_Center/docs/pdf/Disease_cards/P ARATUBERCULOSIS-ES.pdf (20/06/14). - O.I.E. World Organization for Animal Health. Tuberculosis bovina. 1(1): [11 pantallas]. Disponible en el URL: http://www.oie.int/fileadmin/Home/esp/Media_Center/docs/pdf/Disease_cards/B OVINE-TB-ES.pdf (20/06/14). - Paolicchi F., Romano M. I. Paratuberculosis. 2003; 1(1): [14 pantallas]. Disponible en el URL: http://www.vet.unicen.edu.ar/html/Areas/Prod_Animal/Documentos/2012/Sanid ad%20Ganadera/2_42_ParaTBC%20ultima%20version.pdf (26/05/15). - Paolicchi, F., Morsella, C., Cipolla, A., Seguro, R., & González, A. (2007). Pasteurización de leche destinada a terneros: efecto sobre la inactivación de Mycobacterium avium subsp paratuberculosis. REVISTA DE MEDICINA VETERINARIA. 88(3), 117-124. - Paolicchi, F.; Cirone, K.; Morsella, C.; Gioffré, A. (2012). First isolation of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis from comercial pasteurized milk in Argentina. Brazilian Journal of Microbiology. 1034-1037. 29 - Pardo, R. B.; Langoni, H.; Mendonca, L. J.; Chi, K. D. (2001). Isolation of Mycobacterium spp. in milk from cows suspected or positive to tuberculosis. Braz. J. vet. Res. anim Sci. 38, 284-287. - Pearce, L. E.; Tuan Trong, H.; Crawford, R. A.; Yates, G. F.; Cavaignac, S.; de Lisle, G. F. (2001). Effect of turbulent flow pasteurization on survival of Mycobacterium avium subsp paratuberculosis added to raw milk. Applied and environmental microbiology. 67, 3964-3969. - Phillips, C. J. C.; Foster, C. R. W.; Morris, P. A.; Teverson, R. (2003). The transmission of Mycobacterium bovis infection to cattle. Research in Veterinary Science. 74, 1-15. - Rentería Evangelista, T. B.; Hernández de Anda, J. (1996). Tuberculosis in dairy calves: risk of Mycobacterium spp. exposure associated with management of colostrum and milk. Preventive Veterinary Medicine. 27, 23-27. - Serrano-Moreno, B. A.; Romero, T. A.; Arriaga, C.; Torres, R. A.; Pereira- Suárez, A. L.; García-Salazar, J. A.; Estrada-Chávez, C. (2008). High frequency of Mycobacterium bovis DNA in colostra from tuberculous cattle detected by nested PCR. Zoonoses and Public Health. 55, 258-266. - Stabel, J. R.; Steadham, E. M.; Bolin, C. A. (1997). Heat inactivation of Mycobacterium paratuberculosis in raw milk: are current pasteurization conditions effective? Applied and environmental microbiology. 63, 4975-4977. - Stabel, J. R. (2001). On–farm batch pasteurization destroys Mycobacterium paratuberculosis in waste milk. J. Dairy Sci. 84, 524-527. - Stabel, J. R.; Hurd, S.; Calvente, L.; Rosenbusch, R. F. (2004). Destruction of Mycobacterium paratuberculosis, Salmonella spp., and Mycoplasma spp. in raw milk by a commercial on- farm high temperature, short time pasteurizer. American dairy science association. 87, 2177-2183. - Stabel, J. R.; Bradner, L.; Robbe-Austerman, S.; Beitz, D. C. (2014). Clinical disease and stage of lactation influence shedding of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis into milk and colostrum of naturally infected dairy cows. J. Dairy Sci. 97, 6296-6304. - Sung, N.; Collins, M. T. (1998). Thermal tolerance of Mycobacterium paratuberculosis. Applied and environmental microbiology. 64, 999-1005. 30 - Sweeney, R.; Whitlock, R. H.; Rosenberger, A. E. (1992). Mycobacterium paratuberculosis cultured from milk and supramammary lymph nodes of infected asymptomatic cows. Journal of clinical microbiology. 30, 166-171. - Torres, P. M. (2009). Sistema de vigilancia epidemiológica mediante la detección en faena de la Tuberculosis bovina para la caracterización epidemiológica y control de la enfermedad en la Provincia de Entre Ríos. Tesis de Magíster de la Universidad de Buenos Aires en Salud Pública. - Torres P. M. Situación de la tuberculosis bovina en la república Argentina. 2011; 1 (1): [56 pantallas]. Disponible en el URL: http://www.senasa.gov.ar/Archivos/File/File1013situacion_tuberculosis_bovina_ junio_2011.pdf (12/05/14). - Traversa, M. J.; Jorge, M. C. (2006). Factores epidemiológicos que intervienen en el saneamiento de los rodeos con tuberculosis bovina. Veterinaria Argentina. 226, 413-426. - Traversa M. J. y col. Report of mycobacteria isolated from domestic and wildlife species during 2004-2008. Analecta Veterinaria (VE) 2011; 31 (1): 10-14 [10 pantallas]. Disponible en el URL: http://www.fcv.unlp.edu.ar/analecta (21/10/15). - Wolinsky E. (1996). Micobacterias, pp 619-635. En: B. D. Davis; R. Dulbecco; H. N. Eisen y H. S. Ginsberg (eds) Tratado de Microbiología. Masson, Barcelona. 31