marcos antonio ulloa igor valdivia – chile 2011

Profesor Patrocinante
Dra. Ana María Zárraga
Instituto de Bioquímica y Microbiología
Facultad de Ciencias
CARACTERIZACIÓN DE UN NUEVO LOCUS DE INSERCIÓN IS711
EN EL GENOMA DE Brucella abortus.
Tesis de Grado presentada como parte de
Los requisitos para optar al grado de
Licenciado en Bioquímica y Título
Profesional de Bioquímico
MARCOS ANTONIO ULLOA IGOR
VALDIVIA – CHILE
2011
Dedicado a mi abuela Candelaria, mi madre Ellen
A Patricia y mis queridas hijas.
AGRADECIMIENTOS
Agradezco a la Dra. Ana María Zárraga, por recibirme nuevamente en su laboratorio
luego de estar perdido en el mundo de la acuicultura, por patrocinar esta tesis, por su gran
paciencia y apoyo. Agradezco al Dr. Marcos Mancilla, quien comenzó este proyecto en Brucella,
su conocimiento y asesoría fue clave para el desarrollo de esta tesis. .
Agradezco al Instituto de Bioquímica y Microbiología y al Instituto de Anatomía,
Histología y Patología de la UACh donde se realizó esta tesis. Agradezco al Servicio Agrícola y
Ganadero (SAG) por facilitar el material biológico y la posibilidad de realizar parte del trabajo en
el Laboratorio Regional de Osorno. En especial agradezco a la señora Minie Villaroel, por su
ayuda y conocimientos entregados. Al Dr. Ángel Oñate de la Universidad de Concepción por
facilitar la cepa de referencia de B. abortus 2308.
A mis compañeros Carlos Tejeda, Alejandro Albornoz, Pablo Santibáñez, Álvaro
Figueroa, Carlos Díaz y Jesús LLanquinao por su aporte para la elaboración de este escrito.
Mis agradecimientos a mi madre Ellen Igor, ya que sin su esfuerzo y dedicación no
hubiera podido llegar a estas instancias, gracias por tu paciencia y por estar ahí siempre.
Agradezco también a mis dos abuelas Candelaria y Luzmira, donde su espíritu esté, infinitas
gracias. A mis padrinos y familia por su apoyo incondicional a la distancia. Finalmente quiero
agradecer a mi compañera Patricia Sánchez por su paciencia, su apoyo y por estar conmigo
siempre.
Este proyecto fue financiado por FONDOSAG C5-10-100-23, FONDEF D02I-1111, DID-UACh
D-2005-17, DID S-2009-33 y FICR-EQU18.
i
INDICE GENERAL
INDICE FIGURAS Y TABLAS
iii
LISTA DE ABREVIATURAS
iv
1.0 RESUMEN
1.1 ABSTRACT
2.0 INTRODUCCIÓN
1
2
3
2.1 Generalidades del Género Brucella.
3
2.2 Características de Brucella abortus
5
2.3 Secuencias de Inserción.
7
2.4 Transposición.
9
2.5 Transposición de IS711 en B. abortus.
12
HIPOTESIS:
14
OBJETIVO GENERAL:
14
OBJETIVOS ESPECIFICOS:
14
3.0 MATERIALES Y MÉTODOS
15
3.1 MATERIALES
15
3.1.1 Material Químico
15
3.1.2 Material Biológico
16
3.1.3 Equipos Utilizados
16
3.2 MÉTODOS
17
3.2.1 Predicción bioinformática
17
3.2.2 Preparación de Medios de Cultivo
20
3.2.3 Extracción de DNA Genómico
20
3.2.4 IS711-PCR anclado
21
3.2.5 Purificación de DNA a partir de Geles de Agarosa.
23
ii
3.2.6 Preparación de Células Competentes.
23
3.2.7 Clonación del Fragmento que contiene la IS711 adicional de la cepa B12.
24
3.2.8 Transformación de células competentes.
26
3.2.9 Extracción DNA Plasmidial por Lisis Alcalina
27
3.2.10 Ensayo de Restricción
28
3.2.11 Secuenciación Plásmido Clon5 (pC5).
28
3.2.12 Análisis Bioinformático locus cepa B12.
28
3.2.13 PCR locus específico de la cepa B12
29
3.2.14 PCR confirmatorio cepa B12.
29
3.2.15 Purificación de la cepa B12.
30
3.2.16 Secuenciación de la IS711 adicional en la cepa B12.
31
4.0 RESULTADOS
32
4.1 Análisis Bioinformático.
32
4.2 Identificación del locus portador de la nueva copia de IS711, en la cepa B. abortus B12.
36
4.3 Secuencia nucleotídica del inserto conteniendo la nueva IS.
39
4.4 Comparación entre genomas de Brucella, del loci portador de la nueva IS.
39
4.5 Identificación de la nueva IS711 en el genoma de B. abortus B12.
42
4.6 Purificación de cepa silvestre B. abortus B12.
45
4.7 Origen de la nueva IS711
49
5.0 DISCUSIÓN
51
6.0 BIBLIOGRAFIA
59
iii
INDICE FIGURAS Y TABLAS
Figura 1. Estructura y organización de la secuencia de inserción IS711.
10
Figura 2. Esquema fragmento restricción portador nueva copia de IS711 en la cepa B12.
19
Figura 3. Esquema Vector pGEM-T-easy.
25
Figura 4. Esquema de las siete IS711 presentes en B. abortus 9-941.
33
Figura 5. Identificación del locus de inserción de la nueva IS711 por PCR anclado.
37
Figura 6. Identificación del plásmido recombinante conteniendo el inserto de 3,2 kb.
38
Figura 7. Secuencia del inserto conteniendo la nueva copia de IS711 en B. abortus B12.
40
Figura 8. Comparación del nuevo locus de IS711 entre genomas del género Brucella.
41
Figura 9. Identificación de la nueva IS711 en el genoma de la cepa B. abortus B12.
43
Figura 10. Corroboración nuevo locus IS711 en B. abortus B12.
44
Figura 11. Determinación proporción cepa B12 versus Brucella sp en el aislado clínico.
46
Figura 12. Identificación de la cepa silvestre de B12 portadora del nuevo locus IS711.
47
Figura 13. Identificación del locus conteniendo la nueva IS711 en cepas de Brucella.
48
Figura 14. Origen de la nueva copia IS711 en el genoma de B. abortus B12.
50
Figura 15. Modelo de transposición replicativa para IS711.
56
Tabla I. Secuencia oligonucleótidos.
22
Tabla II. Localización de las IS711 en el genoma de B. abortus cepa 9-941 digerido con
AvaI y ClaI.
34
Tabla III. Análisis Bioinformático fragmentos de restricción de 5,7 kb.
35
iv
Lista de abreviaturas
Amp
Ampicilina
ATCC
American Type Culture collection
CTAB
Bromuro de de cetiltrimetilamonio
dNTPs
Desoxirribonucleótidos trifosfato
DO
Densidad óptica
DR
Secuencia directa repetida
EDTA
Acido etilendiaminotetraacético
HGT
Transferencia horizontal de genes
IR
Secuencia inversa repetida
IS
Secuencia de inserción
kb
Mil pares de bases
Lldp
Lactatopermeasa
LPS
Lipopolisacárido
Orf
Marco de lectura abierto
pb
pares de bases
PCR
Reacción en cadena de la polimerasa
RFLP
Polimorfismo en el largo del fragmento de restricción
SDS
Sodio dodecilsulfato
TAE
Buffer Tris acetato EDTA
TE
Buffer Tris EDTA
Tm
Temperatura de mealting
Tn
Transposón
X-gal
5-Bromo-4-Cloro-3-indolil-β-D-galactósido
1
1.0 RESUMEN
Brucella abortus (B. abortus) es el agente etiológico del aborto infeccioso en bovinos y
causante de la brucelosis en humanos, una de las zoonosis más importantes a nivel mundial.
El genoma del género Brucella es muy estable, siendo una de las pocas fuentes de
polimorfismo, la distribución y número de copias de la secuencia de inserción IS711. Esta
secuencia de inserción es exclusiva de este género. Al respecto, las especies Brucella ovis y
Brucella pinnipedialis poseen más de 30 copias de IS711, a diferencia de Brucella melitensis,
Brucella suis y B. abortus,
las cuales poseen siete copias de IS711. La cepa vacuna de
B. abortus RB51 es una excepción, ya que posee ocho copias de esta IS.
Estudios previos de nuestro laboratorio reportaron dos nuevas variantes de B. abortus
conteniendo ocho copias de IS711 y con un perfil diferente a RB51. Esta tesis demuestra que la
copia adicional encontrada en uno de los nuevos perfiles de B. abortus, en la cepa B12,
efectivamente corresponde a la inserción de una copia de IS711 en un nuevo locus. Se discuten
las implicancias de esta transposición replicativa en la biología de B. abortus, ya que este
mecanismo además de generar polimorfismo genético, impacta la fisiología bacteriana.
2
1.1 ABSTRACT
Brucella abortus (B. abortus) is the causative agent of infectious abortion in cattle and
causes brucellosis in humans, one of the most important zoonoses worldwide.
The genome of Brucella is very stable, being one of the few sources of polymorphism, the
copies distribution and number of IS711 insertion sequence. This insertion sequence is unique to
this genus. In this respect, the species of Brucella ovis and Brucella pinnipedialis have more than
30 copies of IS711, in contrast to Brucella melitensis, Brucella suis and B. abortus, which carry
seven copies of IS711. The B. abortus RB51 vaccine strain is an exception, as it carries eight
copies of the IS.
Previous studies from our laboratory reported two new variants of B. abortus carrying
eight copies of IS711 with a different IS711- RFLP pattern compared to than RB51.This thesis
demonstrates that the additional copy found in the wild type strains of B. abortus, the strain B12,
corresponds to a new IS711 inserted at a new locus in the genome. The involvement of the
transposition mechanism as the source of strain diversity, polymorphism and its implication in
the biology of Brucella, is discussed.
3
2.0 INTRODUCCIÓN
2.1 Generalidades del Género Brucella.
La historia del género Brucella data del siglo XIX y nace en la Isla de Malta ubicada en
el mar mediterráneo. La cual fue ocupada por soldados ingleses, donde un gran número de ellos
falleció a causa de una infección adquirida en la isla. La corona inglesa envió un grupo de
científicos a Malta, liderado por Sir Davis Bruce, quien en 1887 logró aislar la bacteria
“Micrococcus melitensis” responsable de la muerte de los soldados. En el año 1897 Bernhard
Bang estudiando restos fetales bovinos descubrió la bacteria denominada Bacillus abortus o
bacilo de Bang, agente causal del aborto infeccioso en vacunos (Smith, 1919). En el año 1918 la
bacterióloga Alice Evans realizó un estudio comparativo morfológico, inmunológico y de cultivo
entre Micrococcus melitensis y el bacilo de Bang, resultado que agrupó a estas bacterias en el
género denominado Brucella (Laval, 2006).
En la actualidad existen diez especies en el género Brucella, clasificadas en relación al
hospedero que infectan. Brucella abortus afecta al ganado bovino, Brucella melitensis infecta al
ganado caprino, Brucella suis afecta a los porcinos, Brucella ovis afecta al ganado ovino,
Brucella neotomae aislada de rata del desierto Neotoma lepida, Brucella canis que afecta a los
caninos y Brucella maris que afecta a mamíferos marinos (Cloeckaert et al., 2000). En el año
2007 esta última especie fue subdividida en dos nuevas especies Brucella ceti que infecta
cetáceos marinos y Brucella pinnipedialis que infecta a las focas (Foster et al., 2007).
Posteriormente, se descubrieron dos nuevas especies, Brucella microti aislada del topillo de
campo Microtus arvalis (Scholz et al., 2008) y Brucella inopinata (del latín “inesperada”),
4
aislada de una paciente que presentó una infección posterior a realizarse un implante mamario
(De et al., 2008, Scholz et al., 2010).
De las diez especies mencionadas anteriormente, las tres primeras B. abortus, B.
melitensis y B suis son las principales agentes responsable de la brucelosis, una de las infecciones
zoonóticas más importantes a nivel mundial, la cual produce aborto infeccioso en animales
domésticos y una enfermedad febril en humanos. En consecuencia, la brucelosis es un problema
sanitario, que además ocasiona pérdidas económicas importantes en los países afectados (Pappas
et al., 2006).
B. abortus fue clasificada por el Center for Disease Control (CDC) de E.E.U.U y por
España, en el Real Decreto 664/1997 como un patógeno nivel 3. En el nivel 1 se encuentran los
microorganismos de menor riesgo para la salud humana y en el nivel 4 los más peligrosos. Los
patógenos nivel 3 causan graves enfermedades en el hombre, sin embargo existe tratamiento
eficaz para combatirlos a diferencia de los patógenos nivel 4. (http://www.insht.es)
B. abortus provoca una zoonosis conocida como fiebre ondulante o fiebre de malta, la
cual de no ser tratada adecuadamente puede derivar en una enfermedad crónica, con
complicaciones principalmente endocarditis (Leandro et al., 1998) y meningitis que pueden llevar
a la muerte (Ocon et al., 1994).
Las tres principales fuentes de contagio en el hombre son, el consumo de productos
lácteos no pasteurizados, el contagio en los mataderos al tener contacto con animales infectados y
el contagio en los laboratorios, debido a la inadecuada manipulación de las muestras.
5
En nuestro país esta enfermedad se encuentra diseminada en todas las regiones
productoras de ganado bovino. En el período Enero-Junio del 2010 se informaron 51 nuevos
focos y un total de 292 casos de Brucelosis bovina, comparado con el mismo período del año
2009 el cual registra 92 nuevos focos y 561 casos de brucelosis. Se observó, por lo tanto, una
reducción de aproximadamente un 50%, datos obtenidos del Office International des Epizooties
(www.oie.int/esp/es_index.htm). La autoridad sanitaria en nuestro país ha dispuesto un programa
de erradicación desde 1991, lo que ha disminuido la prevalencia de esta enfermedad a niveles que
bordean el 1% (Lopetegui, 2005). Sin embargo, la infección persiste en nichos tratados
sanitariamente lo que indica la necesidad de estudiar los genotipos de las cepas prevalentes.
2.2 Características de Brucella abortus
La bacteria B. abortus taxonómicamente está clasificada en el phylum Proteobacteria,
clase α-Proteobacteria, orden Rhizobiales, familia Brucellacea. En esta familia se encuentran los
géneros Brucella y Ochrobactrum. En este último género destaca la bacteria Ochrobactrum
antrophi, la cual es un patógeno oportunista del hombre y se diferencia morfológicamente del
género Brucella por poseer flagelo perítrico (Holmes et al., 1988)
B. abortus posee ocho biovares (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 9) el biovar 1 es el más prevalente a
nivel mundial (Megid et al., 2010). Los biovares se diferencian por susceptibilidad a
bacteriófagos, PCR y aglutinación con sueros monoespecíficos. Las cepas de B. abortus que
contienen el antígeno A corresponden a los Biovares 1, 2, y 6. Los que contienen el antígeno M a
los Biovares 4, 5 y 9. El biovar 7 contiene ambos antígenos A y M (Castro et al., 2005)
B. abortus es una bacteria gram negativo de morfología coco-bacilar intracelular
facultativa, es decir, puede sobrevivir en el interior y exterior de la célula huésped.
6
Fenotípicamente no presenta motilidad, es catalasa, oxidasa y ureasa positivas. Presenta
crecimiento lento y son nutricionalmente exigentes, requiriendo entre un 5 a un 10 % de CO 2 para
su crecimiento in vitro.
Esta bacteria carece de los factores de virulencia clásicos como exotoxinas, cápsula,
plásmidos, bacteriófagos, fimbrias, flagelo o endoesporas, además su endotoxina (lípido A) del
lipopolisacárido posee baja endotoxicidad. Algunos científicos consideran la ausencia de estos
factores de virulencia como un factor de virulencia per se ya que esto facilita la sobrevivencia y
multiplicación del patógeno al interior de los macrófagos del huésped (Freer y Castro, 2001).
Luego de ingresar al organismo del huésped, B. abortus es fagocitada por los macrófagos
y por un mecanismo no descrito aún, impide la fusión del fagosoma con el lisosoma, evitando de
esta manera ser destruido por el macrófago, multiplicándose en su interior evadiendo el sistema
inmune del huésped (Pizarro-Cerda et al., 1998).
Entre los factores esenciales para la virulencia y sobrevida intracelular del patógeno se
encuentra el lipopolisacárido (LPS) y factores de virulencia como el operón VirB, cuyo producto
proteico forma una estructura similar al pilus sexual bacteriano, el cual permite transferir
moléculas al macrófago en un sistema de secreción tipo IV (Sieira et al., 2000). Se ha descrito
también un sistema regulatorio BvrR/BvrS, el cual está involucrado en la expresión de las
proteínas de membrana externa Omps (Outer membrane proteins) las que estabilizarían la
estructura VirB (Guzman-Verri et al., 2002). Además, se han descrito los genes cgs y cgt
involucrados en la síntesis y transporte al espacio periplásmico del β-1,2 glucano cíclico,
molécula indispensable para el transito intracelular del patógeno, mutaciones en estos genes
generan cepas atenuadas de B. abortus (Roset et al., 2004).
7
La composición genómica de B. abortus consiste en dos cromosomas, un rasgo poco
común en procariontes y que comparte con algunas especies como el Vibrio cholerae (Trucksis et
al., 1998). El cromosoma I de B. abortus posee un tamaño de 2.12 Mb, este cromosoma contiene
la mayoría de los genes involucrado en la síntesis proteica. El cromosoma II es de un tamaño de
1,16 Mb y posee los genes que codifican para las enzimas del metabolismo de azúcares, proteínas
regulatorias y transportadores de membrana. Esta organización genómica es una característica del
género, excepto en B. suis biovar 3 que posee sólo un cromosoma de 3,1 Mb (Halling et al.,
2005).
Se ha informado que el genoma de Brucella es muy estable (Gandara et al., 2001) y que
una de las pocas fuentes de polimorfismo está dado por el número de copias y distribución de la
secuencia de inserción IS711 (Whatmore, 2009). Esta secuencia de inserción (IS) se encuentra
exclusivamente en el género Brucella (Hinic et al., 2008). Además existen otras IS presentes en
el genoma de B. abortus como ISBm1, ISBm2, ISBm3, ISBm4 (Ocampo-Sosa y Garcia-Lobo,
2008) e IS2020 que forma parte del transposón Tn2020 (Halling y Zuerner, 2002).
2.3 Secuencias de Inserción.
Los elementos genéticos transponibles o transposones, fueron descubiertos por Bárbara
Mcclintok en 1940 como explicación al cambio de color total o parcial en granos de maíz,
postulando que existían “elementos controladores” que eran capaces de “saltar” desde una
posición a otra y de esta manera activar e inactivar los genes involucrados en el color de los
granos de maíz. Posteriormente han surgido otros elementos genéticos transponibles, como
bacteriófagos (Sampson et al., 2009), elementos integrativos y conjugativos, ICE, (Smyth y
Robinson, 2009), transposones (Chen et al., 2010) y secuencias de inserción (Lee et al., 2011).
Este último grupo corresponde a los elementos genéticos móviles o transponibles más sencillos.
8
La estructura de las secuencias de inserción (IS) incluye un gen que codifica para la enzima
transposasa, flanqueada por dos secuencias inversas repetidas (IR) y por dos secuencias directas
repetidas (DR). La transposasa cataliza la excisión de la IS a la secuencia blanco por
transposición, este evento puede activar o inactivar genes localizados en la secuencia blanco. Un
ejemplo de ello, es la presencia de una secuencia de aproximadamente 900 pb interrumpiendo el
gen que codifica para la proteína inmunogénica BCSP31 en B. ovis. Al utilizar dicha secuencia
como sonda en un Southern blot se observó que esta secuencia se encontraba repetida en distinta
proporción entre las especies B. abortus y B. ovis sugiriendo la presencia de un elemento móvil
(Halling y Zehr, 1990). Este elemento móvil fue denominado IS711, también conocido como
IS6501, el cual pertenece a la familia IS5 de las secuencias de inserción.
La familia IS5 está compuesta por 47 miembros, que se subdivide en seis subfamilias
donde IS711 forma parte de la subfamilia IS427 (Mahillon y Chandler, 1998). La IS711 se
encuentra exclusivamente en el género Brucella y está distribuida en diferente proporción en las
diferentes especies del género, en B. melitensis, B.suis, B. abortus existen siete copias de este
elemento y en las especies B. ovis y B. pinnipedialis existen más de 30 copias de IS711 (OcampoSosa et al., 2008).
Esta secuencia de inserción tiene un tamaño de 842 pb y contiene en sus extremos dos
secuencias inversas repetidas (IR) imperfectas de 20 pb que flanquean al gen que codifica para la
transposasa. Este gen está dividido en dos marcos de lectura abierto (orfs) denominados orfA y
orfB donde la secuencia del orfA se encuentra sobrepuesta con la secuencia del orfB. Esta IS
tiende a insertarse en secuencias consenso YTAR donde Y corresponde a una pirimidina (C ó T)
9
y R corresponde a una purina (A ó G). Como resultado de la transposición, esta secuencia blanco
se duplica en ambos extremos de la IS (Halling et al., 1993), lo que se observa en la Figura 1.
2.4 Transposición.
Existen dos mecanismos de transposición, de las secuencias de inserción, descritos en
literatura. El primero es la transposición no replicativa o conservativa, en la cual el número de
copias de la IS permanece constante en el genoma, es decir, la IS se transpone desde su posición
original a una nueva secuencia blanco. El segundo mecanismo corresponde a la transposición
replicativa, en la cual el número de IS aumenta en el genoma debido a la duplicación y
movilización de una copia de la IS hacia una nueva secuencia blanco (Lewin, 2004).
En la transposición replicativa la transposasa cataliza la escisión de la IS, cortando ambos
extremos de la IS en sus secuencias inversas repetidas y al mismo tiempo corta ambos extremos
de la secuencia blanco. Cataliza la formación del enlace fosfodiester del extremo 3’ hidroxilo de
la IS con el extremo 5’ fosfato de la secuencia blanco. En la siguiente etapa las enzimas DNA
polimerasa y DNA ligasa generan la estructura intermediaria denominada cointegrado, la cual es
resuelta a través de recombinación por la enzima resolvasa. (Figura 14).
La transposición ocurre al azar y no requiere de secuencias específicas, sin embargo, en
Brucella se han descrito secuencias preferenciales de inserción (hot-spot) para IS711. La
secuencia YTAR y dos secuencias palindrómicas repetidas de 103 pb (Bru-RS1) y de 105 pb
(BRu-RS2) (Halling y Bricker, 1994).
La transposición es un mecanismo ampliamente descrito en literatura. Se han reportado
eventos de transposición en un mismo genoma y de un genoma a otro a través de transferencia
horizontal de genes (HGT).
10
Figura 1. Estructura y organización de la secuencia de inserción IS711. El tamaño de la IS es
de 842 bp sin incluir la secuencia blanco de inserción YTAR (repetición directa). La secuencia IR
corresponde a una secuencia inversa repetida imperfecta de 20 pb. El gen que codifica para la
transposasa se encuentra dividido en los marcos de lectura orfA y orfB. Donde orfA se encuentra
sobrepuesto al orfB.
11
Recientemente, se ha descrito la presencia de la IS1245 característica de Mycobacterium
avium en el genoma de Mycobacterium kansasii (Da Silva Rabello et al., 2010). Estos eventos
también ocurren en patógenos de las plantas como Agrobacterium tumefaciens, que pertenece a la
clase α-proteobacteria al igual que B. abortus, donde se reportó la transposición de la IS1312
desde una bacteria relacionada filogenéticamente Rhizobium meliloti (Deng et al., 1995).
Los eventos de transposición se han vinculado a cambios fenotípicos importantes, un
ejemplo es la perdida de virulencia en Shigella flexneri 2a, bacteria que causa diarrea en
humanos. Se reportó una cepa atenuada debido a la inactivación del gen virF por la secuencia de
inserción IS1SFO, el gen virF codifica para un plásmido de invasión trascendental para la
patogenia de la bacteria (Mills et al., 1992). Por otra parte, se ha descrito el incremento en la
virulencia asociado a transposición, en Neisseria meningitidis, una bacteria intracelular patógena
exclusiva de los humanos. La transposición de IS1301 en el gen siaA involucrado en la síntesis de
ácido siálico, que forma parte de la cápsula, permite a esta cepa colonizar la mucosa con mayor
eficiencia, a diferencia de aquellas cepas que no poseen esta inserción en su genoma y sintetizan
su cápsula con normalidad (Hammerschmidt et al., 1996).
Se han descrito además importancias evolutivas asociadas a transposición de secuencias
de inserción, como es el caso de Yersinia pestis, bacteria intracelular causante de una de las
enfermedades zoonóticas más letales a nivel mundial, conocida como la peste negra o peste
bubónica,
caracterizada
por
necrosis
y
septicemia.
Esta
bacteria
está
relacionada
filogenéticamente con Yersinia pseudotuberculosis, la cual causa enteritis aguda en los humanos.
Ambas bacterias presentan una identidad genómica de un 97%, sin embargo, un 13% de los genes
de Y. pseudotuberculosis no tiene función en Y. pestis. Una explicación a este fenómeno es la
mayor cantidad de secuencias de inserción presentes en el genoma de Y. pestis, postulándose que
12
ambas bacterias provienen de un ancestro en común. No obstante, Y. pestis a través del tiempo
acumuló una serie de eventos de transposición lo que conllevó a una regulación genética que hizo
a esta bacteria mucho más patogénica y peligrosa que Y. pseudotuberculosis (Chain et al., 2004).
Distinto es lo que ocurre en Brucella donde B. ovis que contiene un mayor número de copias de
IS711, no es zoonótica y se encuentra exclusivamente en el ganado ovino (Whatmore, 2009).
2.5 Transposición de IS711 en B. abortus.
La cepa de B. abortus RB51 representa un caso excepcional de transposición de IS711.
Esta bacteria posee una alteración en la cadena O del Lipopolisacárido (LPS) en la membrana
externa de la bacteria. El LPS de B. abortus activa la respuesta humoral en el huésped, pero esta
es incapaz de eliminar a la bacteria, sin embargo, genera anticuerpos mayoritariamente contra la
cadena O del LPS. La transposición de IS711 en la cepa RB51 ocurrió en el gen wboA, el cual
está involucrado en la síntesis de la cadena O. Esto ocasiona la perdida de virulencia de RB51 y
además al no presentar el antígeno O, esta cepa no interfiere con el diagnóstico de las cepas
virulentas de B. abortus, características que hicieron de la cepa RB51 una vacuna ideal contra B.
abortus en el ganado bovino (Vemulapalli et al., 1999).
En el año 2008 se demostró in vitro por primera vez la transposición de la IS711 en cepas
de Brucella, para ello se utilizó el plásmido trampa pGBG1, el cual posee un gen de resistencia a
tetraciclina controlado por el gen represor del fago lambda cI. Este represor contiene quince
posibles sitios de inserción para IS711, donde al existir transposición es inactivado generando
colonias resistentes a tetraciclina. La transposición se identificó sólo en las especies que poseen
un alto número de copias de IS711 como lo son B. ovis y B. pinnipedialis, no así en B. abortus
(Ocampo-Sosa et al., 2008).
13
Estudios realizados recientemente en nuestro laboratorio indican que la transposición de
IS711 también es una fuente de variabilidad en B. abortus (Mancilla et al., 2008). En efecto, los
resultados de IS711-RFLP utilizando como sonda IS711, identificó 2 cepas de campo que
presentan un fragmento de restricción adicional con tamaños moleculares diferentes. Una de estas
cepas, denominada B12, fue aislada en la Región de los Ríos desde una muestra de leche, esta
cepa presenta un fragmento de restricción único (AvaI – ClaI) de 6,6 kb. En consecuencia, estos
resultados sugieren que este nuevo fragmento de 6,6 kb representa un nuevo sitio de inserción de
IS711 y da cuenta de una nueva variante de B. abortus no descrita previamente.
En base a los antecedentes expuestos, esta tesis propone la siguiente hipótesis:
14
HIPOTESIS:
La copia adicional de la IS711 encontrada en la cepas silvestre de Brucella abortus, B12,
es el resultado de la transposición de la secuencia de inserción IS711 en un nuevo locus del
genoma bacteriano.
OBJETIVO GENERAL:
Demostrar que el nuevo perfil IS711 identificado en la cepa silvestre de B. abortus, B12,
deriva de la inserción de una copia adicional de la IS711 en un nuevo locus del genoma
bacteriano.
OBJETIVOS ESPECIFICOS:
1. Determinar in silico la distribución de las copias de IS711 en el genoma de B. abortus.
2. Secuenciar y definir el contexto genómico del locus que contiene la copia adicional no
reportada de IS711
3. Inferir el origen de la nueva copia de IS711 encontrada en la cepa de B. abortus B12.
15
3.0
MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 MATERIALES
3.1.1 Material Químico
BioMériux SA: Sistema GENbag cultivo en microaerofilia
BioRad: Agarosa grado Biología Molecular
BDTM: Caldo Brucella, Triptona, Extracto de Levadura
IDT: Oligonucleótidos
Invitrogen: Platinum Taq DNA polimerasa, dNTPs, RNAsa A, Células competentes TOP10.
Fermentas: GeneRulerTM 100 bp, Fago λ/Hind III, EcoRI, X-gal y Loading Buffer 6X
Merck: Agar-agar, D (+) glucosa monohidrato, etanol absoluto (grado biología molecular), Acido
acético Glacial, Acetato de Potasio
Promega: kit de clonamiento pGEM-T-easy
Qiagen: kit QIAEX II
Sigma: Agua Biología Molecular, Bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB), Ampicilina
US Biologicals: EDTA, NaCL, SDS, NaOH, CaCl2, MgSO4, TRIS base, Glicerol, FenolCloroformo-Isoamilico (25:24:1)
Winkler: Bromuro de etidio, isopropanol, etanol 70%, TAE 50X, Buffer TE pH 8
16
3.1.2 Material Biológico
Las cepas de B. abortus RB51 cepa vacuna, cepa de referencia 544, las cepas de campo
incluidas B12 y B16 además de las cepas de B. mellitensis 16M, B. suis 1330 y B.ovis 63/290
fueron obtenidas del Laboratorio central del Servicio Agrícola y Ganadero (SAG) Lo Aguirre,
Santiago y del laboratorio Regional de Osorno. La cepa B. abortus 2308 fue facilitada por el
Dr. Ángel Oñate de la Universidad de Concepción.
Todas las cepas fueron cultivadas en placa conteniendo 20 ml de medio Agar Brucella
previamente autoclavado. El tiempo de incubación fue de 48 a 72 horas a 37ºC en condiciones de
microaerofilia generada con el kit GenBag (Biomerieaux). Posteriormente las células fueron
guardadas en soluciones “stock” de caldo de Brucella conteniendo un 20% de glicerol y
conservadas en frezer a – 80ºC hasta su utilización. Las cepas fueron manipuladas en el
laboratorio de patógenos del Instituto de Bioquímica y Microbiología, el cual cuenta con una
sala de bioseguridad nivel 3, certificada, con presión negativa y de uso restringido.
3.1.3 Equipos Utilizados
Gabinete de Bioseguridad Thermo Forma clase II tipo A/B3, incubador con agitación IKA
KS 4000i, termoblock type 17600 Barnstead Thermoline, termociclador Thermo Hybaid modelo
Px2, balanza analítica Precisa 405M-200A, balanza precisa 180A, agitador magnético Nuova II
Sybron Thermoline, vortex Genie 2, sistema de fotodocumentación Kodak EDAS 120, centrifuga
refrigerada Hettich MIKRI 200R, centrifuga Eppendorf mini spin 22331 Hamburg, sistema
electroforético BioRad, Freezer -80ºC Forma Scientific Biofreezer 8425.
17
3.2 MÉTODOS
3.2.1 Predicción bioinformática
Antecedentes previos de nuestro laboratorio evidenciaron que dos aislados de B. abortus,
B12 y B16 de un total de 46 cepas provenientes de diferentes partes del país, presentaron un
perfil diferente de IS711-RFLP no descrito con anterioridad (Mancilla et al, 2008). La diferencia
radica en la presencia de un fragmento de restricción adicional de 6,6 kb y 5,5 kb
respectivamente.
Con el objeto de dilucidar si el nuevo fragmento de 6,6 kb en la cepa B12 corresponde a
una nueva copia de IS711, se determinó en primer lugar, la posición de las siete IS711 endógenas
del genoma de B. abortus. Se obtuvo la secuencia de los dos cromosomas de B. abortus cepa
9-941 (AE017224 y AE017223) desde GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/).
Luego, se simuló el perfil de restricción de estos cromosomas con las enzimas AvaI y ClaI,
utilizando
la
herramienta
“Restriction
digest”
(http://cmr.jcvi.org/tigrscripts/CMR/
CmrHomePage.cgi), obteniéndose diferentes fragmentos con sus respectivas coordenadas de
posición en el genoma. Basándonos en el perfil IS711-RFLP que genera siete fragmentos de
restricción (7,2 kb, 6,2 kb, 4,2 kb, 3,8 kb, 2,4 kb, 1,4 kb y 1,1 kb) se analizó el genoma para
determinar los loci de las siete IS711. Para este propósito se utilizó el programa Artemis
(http://www.sanger.ac.uk/ Software/ Artemis) el cual es un visualizador de genomas que permite
evaluar parámetros simultáneamente, como por ejemplo, secuencias nucleotídica, aminoacídicas,
orfs (marcos de lectura abierto) y pseudogenes. Donde en los diferentes fragmentos de restricción
seleccionados de acuerdo al perfil RFLP, se rastreó la presencia del orfA y orfB de IS711.
Para determinar la posición de la IS711 adicional en el genoma de la cepa B12 se
realizaron varias suposiciones. La primera es que en el fragmento de restricción de 6,6 kb existe
18
sólo una copia de IS711. Segundo, la IS711 adicional se encuentra completa en dicho fragmento.
Tercero, el sitio preferencial de inserción (hot-spot) donde se inserta IS711 corresponde la
secuencia conservada de inserción CTAG (Marianelli et al., 2003). Cuarto, la IS711 adicional no
interrumpe ningún marco de lectura abierto (orf) esencial para la bacteria ya que la cepa no
presenta cambios fenotípicos aparentes. Basados en estos supuestos, se analizaron los fragmentos
generados en la cepa 9-941 con las enzimas AvaI y ClaI de aproximadamente 5,7 kb, ya que la
inserción de una IS711 en este fragmento genera un fragmento de 6,6 kb, tamaño que concuerda
con el fragmento de restricción obtenido sólo en la cepa B12, esto se ilustra en la figura 2.
Se seleccionaron los fragmentos de restricción entre 5500 pb y 5800 pb, generados con el
programa “restriction digest” y utilizando las coordenadas de posición, se graficaron en el
programa Artemis. Las secuencias se analizaron con el programa ApE-A Plasmid Editor
(http://www.biology.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/) se rastreó la presencia del sitio de
inserción CTAG y se verificó con Artemis si este sitio se encuentra en una región intergénica ó
interrumpe algún orf de importancia para la bacteria, en cuyo caso se descarta el sitio como
posible blanco de inserción de IS711
19
Figura 2. Esquema fragmento restricción portador nueva copia de IS711 en la cepa B12. El
fragmento de restricción de 6,6 kb corresponde al fragmento IS711-RFLP distintivo de la cepa de
B. abortus B12. El fragmento de restricción (rectángulo blanco) portador de la nueva copia de la
IS711 (triángulo negro) en la cepa B12, corresponde a un fragmento de restricción de 5,7 kb
conteniendo el sitio blanco de inserción CTAG para IS711 (cuadrado gris). La sumatoria de la IS
con dicho fragmento, concuerda con el fragmento de 6,6 kb distintivo de la cepa B12.
20
3.2.2 Preparación de Medios de Cultivo
El medio LB liquido o caldo LB se preparó con 10 g de NaCl, 10 g de triptona, 5 g de
extracto de levadura y 1,10 mL de NaOH 1N. Se disolvió con agitación y temperatura en 500 mL
de agua destilada, una vez disuelto se agregó agua destilada, cantidad suficiente para (csp)
completar un litro. El medio LB sólido se preparó de modo similar, a excepción que se adicionó
14 g de agar-agar y luego se agregó agua destilada csp un litro.(Maniatis et al., 1982)
El caldo de Brucella se preparó agregando 28 g de Brucella broth (BBL, BecktonDickinson) en 500 mL de agua destilada disolviéndose con agitación y temperatura. Una vez
disuelto se ajustó el pH a 6,6 y se agregó agua destilada csp un litro. El medio sólido se preparó
de igual manera excepto que se adicionaron 14 g de agar agar al medio (Mancilla et al., 2008).
Todos los medios fueron autoclavados a 121ºC y 1 atm de presión por 20 min.
3.2.3 Extracción de DNA Genómico
Las siguientes etapas se realizaron en sala de bioseguridad aplicando los procedimientos
de seguridad establecidos. Para la extracción de DNA genómico de Brucella, se sembraron 100
µL de las cepas conservadas a – 80ºC en 2 mL de medio de Brucella a 37ºC y 100 rpm por 30 a
48 horas. Posteriormente se traspasó 1,4 mL de cultivo a un tubo nuevo. Se centrifugó a 10000
rpm por 5 min. Las bacterias fueron lisadas con 8 µL de lisozima (50 mg/mL) a 37ºC por 30
minutos. Posteriormente se adicionó 9 µL de SDS al 20% y 5 µL de proteinasa K (20 mg/mL) e
incubó a 60ºC por un tiempo adicional de 30 min (Hermans et al., 1990). Los siguientes pasos
fueron realizados para la eliminación de polisacáridos que interfieren en la digestión con enzimas
de restricción. Se adicionaron 54 µL de H2O libre de nucleasas y 45 µL de NaCl 5M, luego se
homogenizó en vortex y se agregó 30 µL de una solución de detergente catiónico Bromuro de
cetiltrimetilamonio (CTAB) al 10% y NaCl al 4,1 % precalentado a 65° (Maniatis et al., 1982).
21
La suspensión lechosa se incubó a 65ºC por 30 min. Posteriormente, se realizó una extracción
orgánica con un volumen (300 µL) de una solución cloroformo / alcohol isoamílico (24:1) se
agitó en vortex y se centrifugó a 13000 rpm por 5 min, la fase superior o fase acuosa se recuperó
sin tocar la fase orgánica y se traspasó a un tubo Eppendorf de 1,5 mL. El DNA se precipitó con
300 µL de etanol 100 % a -20ºC durante media hora y se recuperó centrifugando a 13000 rpm por
5 min a 4°C. El sobrenadante se eliminó y el precipitado se lavó dos veces con etanol 80%
(enfriado a -20ºC) para remover sales y detergente residual. El DNA se recuperó por
centrifugación a 13000 rpm por 5 min a 4°C y el sedimento se secó sobre papel por 15 min.
Finalmente el DNA se resuspendió en 30 µL de H2O libre de nucleasas, se cuantificó en
NanoDropTM2000 (Thermo) y se preparó soluciones de trabajo a una concentración de 20 ng/µL.
3.2.4 IS711-PCR anclado
Para demostrar la presencia de una IS711 adicional en el genoma de B. abortus cepa B12,
se realizó un PCR utilizando el partidor IS711out, complementario 120 pb río arriba del extremo
3’ de la IS y un partidor de 10 pb (P5), el cual presenta un % GC similar al genoma de Brucella y
se une al azar a múltiples zonas del genoma de B. abortus (Fekete et al., 1992). La secuencia de
los partidores se encuentra en la Tabla I. Para la reacción de PCR se utilizó un volumen de 25 µL
donde la concentración final de los reactivos fue buffer de la enzima 1X, dNTPs 0,4 mM, MgCl 2
2 mM, partidor IS711out 0,5 µM, partidor P5 1 µM, Platinum Taq DNA Pol 1 U y 40 ng de
templado. La amplificación se realizó en termociclador Thermo Hybaid Px2 con una temperatura
inicial de 95ºC por 2 min seguida de 30 ciclos de denaturación a 95ºC por 20 seg, hibridación a
50ºC por 30 seg, extensión a 72ºC por 1 min y por último una extensión final a 72ºC por 5 min.
Los productos de PCR se analizaron por electroforesis en geles de agarosa al 1,5% conteniendo
Bromuro de etidio, la electroforesis se corrió a 70 mA por 30 min.
22
Primer
Secuencia (5' --> 3')
Referencia
CAAGTTGAAACGCTATCGTCGC
Este estudio
B12f
TTGGTTTCCTTGCGACAGAT
Este estudio
B12r
AACCTTGCCTTTAGTTGCTCA
Este estudio
B16f
ATCAGGCTTTGCTGGCAATC
Este estudio
B16r
TCGTTTGCCATCTTGTTCAG
Este estudio
CGGCCCCGGT
Fekete et al, 1992
IS711out
P5
Tabla I. Secuencia oligonucleótidos. Partidores utilizados en este estudio, su secuencia y la
referencia de cada uno de ellos.
23
3.2.5 Purificación de DNA a partir de geles de agarosa.
El fragmento de 3,2 kb obtenido exclusivamente en la cepa B12 con el IS711-PCR
anclado, se separó en gel de agarosa al 1,5% y se extrajo para su purificación con el kit QIAEX
II. El trozo de gel conteniendo el producto de PCR se transfirió a un tubo Eppendorf de 1,5 mL,
se agregó al tubo 10 µL de resina, 300 µL de Buffer QX1 y se incubó a 50ºC por 10 min, con el
fin de solubilizar la agarosa y unir el DNA a la resina. El DNA unido a la resina se recuperó por
centrifugación a 13000 rpm por 1 min y se lavó el sedimento con 500 µL de QX1 luego se
centrifugó a 13000 rpm por 1 minuto y se lavó el sedimento dos veces con 500 µL de buffer PE.
La resina conteniendo el DNA se dejó secar a temperatura ambiente 10 minutos, posteriormente
se resuspendió en 10 µL de H2O libre de nucleasas y se centrifugó a 13000 rpm por 2 min.
Finalmente se traspasó el DNA purificado a un tubo de 0,2 mL.
3.2.6 Preparación de células competentes.
Las células competentes son aquellas capaces de incorporar en su interior DNA exógeno,
esta capacidad se puede generar tratando un cultivo bacteriano de Escherichia coli JM109 o
Top10 con CaCl2 el cual permeabiliza la membrana celular. En este estudio se utilizó la cepa
bacteriana Escherichia coli Top10 (Invitrogen) la cual se cultivó en placa con agar LB por 12 a
14 horas a 37ºC, posteriormente se seleccionó 1 colonia aislada y transfirió a 5 mL de caldo LB
en tubo Falcon de 15 mL y se incubó entre 14 y 16 horas a 37ºC en agitación (200 rpm). Se
Inoculó 1 mL del cultivo anterior en 100 mL de caldo LB en matraz de 500 mL, se incubó a
37ºC hasta que alcanzó un DO600 entre 0,5 y 0,7. Posteriormente se dejó en hielo a 4°C por 1
hora, luego el cultivo se traspasó a dos tubos falcon de 50 mL y se centrifugó a 3000 xg por 7
min, se descartó el sobrenadante y resuspendió el pellet en 25 mL de CaCl 2 0,1 M previamente
enfriado en hielo y se centrifugó a 3000 xg por 7 min, el sedimento se resuspendió en 20 mL de
24
CaCl2 0,1 M frío y se incubó en hielo a 4°C por 45 min. Luego se centrifugó a 3000 xg por 7 min
y se resuspendió el sedimento en 1 mL de CaCl2 0,1M conteniendo un 15% de glicerol y
finalmente se incubó en hielo a 4ºC por 24 horas. Se alicuotó 100 µL de células competentes en
tubos estériles de 1,5 mL y se conservaron a -80ºC por un tiempo máximo de seis meses
(Maniatis et al., 1982).
3.2.7 Clonación del fragmento que contiene la IS711 adicional de la cepa B12.
El fragmento purificado que contiene la IS711 adicional de la cepa B12 fue clonado en el
vector pGEM-T-easy, el cual es un vector linealizado que posee en sus dos extremos 3’ una única
timidina lo que permite ligar productos de PCR generados con una DNA polimerasa carente de
actividad exonucleasa 3’→5’ o actividad “proofreading”, como la taq polimerasa, que genera
productos de PCR con una adenina en cada extremo (Tindall y Kunkel, 1988). Este vector posee
un gen de resistencia a ampicilina, el gen LacZ dividido por un sitio de múltipleclonamiento. El
sitio de multipleconamiento posee, dos sitios de corte para la enzima EcoRI lo que permite liberar
el inserto, además este sitio está flanqueado por las secuencias SP6 y T7 que permiten secuenciar
el inserto en estudio (Figura 3).
Para la ligación del fragmento con el vector se utilizó la siguiente mezcla de reacción en
un volumen final de 10 µL, se tomaron 0,8 µL de vector pGEM-T-easy, 1 µL de buffer 10X, 2
µL del fragmento purificado, 5,2 µL de H2O libre de nucleasas y finalmente se agregó 1 µL de
T4 DNA ligasa, se dejó incubar a temperatura ambiente por 1 hora y finalmente a 4ºC toda la
noche para realizar la transformación al día siguiente.
25
Figura 3. Esquema Vector pGEM-T-easy. Estructura del vector destacándose las timidinas en
los extremos 3’ del vector, el gen de resistencia a ampicilina (Ampr), el gen lacZ y los promotores
SP6 y T7 que permiten secuenciar el inserto utilizando partidores dirigidos hacia estas regiones.
26
3.2.8 Transformación de células competentes.
Para la transformación se descongeló en hielo 50 µL de células competentes y adicionó 2
µL de la mezcla de ligación e incubó por 20 min, posteriormente las células fueron sometidas a
un shock térmico a 42ºC por 50 seg y rápidamente incubadas en hielo por 2 min. Luego de
transcurrido el tiempo las células fueron revividas en 950 µL de medio SOC, el cual se preparó
con 20 g de triptona, 5 g extracto de levadura, 0,5 g NaCl, 10 mL de glucosa 2M filtrada y 10 mL
de una solución Mg 2M, la que se preparó con volúmenes equivalentes de MgCl 2 1M y MgSO4
1M y finalmente se agregó agua deionizada CSP 1L. Las células fueron cultivadas a 37ºC por 1
hora y media sin agitación, se centrifugó a 2000 rpm (centrífuga Eppendorf minispin) por 10 min
se descartó el sobrenadante y se resuspendió suavemente en 200 µL de medio SOC. Se sembró
100 µL de las células transformadas en placa de agar LB Amp/X-gal (Ampicilina 100 µg/mL y
40 µL de X-gal 20 mg/mL) se incubó toda la noche a 37ºC formándose dos poblaciones de
colonias unas de coloración azul y unas de coloración blanca, las colonias azules son aquellas
células transformadas con el vector recircularizado, por ende, el gen lacZ se encuentra activo y
expresa la enzima β-galactosidasa que degrada el X-gal generando galactosa y un producto
insoluble de color azul. Las colonias blancas corresponden a las bacterias transformadas con un
plásmido que contiene un inserto interrumpiendo el gen lacZ, por lo cual no expresan la enzima
β-galactosidasa y son incapaces de degradar el X-gal. Posteriormente se analizaron las colonias
blancas para rastrear el clon que contiene el fragmento de 3,2 kb proveniente de la cepa B12
(Maniatis et al., 1982).
27
3.2.9 Extracción DNA Plasmidial por lisis alcalina
Para determinar el clon que posee el fragmento de 3 kb purificado anteriormente, se
cultivaron las colonias blancas obtenidas en 5 mL de caldo LB/Amp (100 µg/mL) en tubos de 15
mL a 37ºC por 12 - 18 horas, se transfirieron 1,4 mL del caldo a un tubo de 1,5 mL y centrifugó a
10000 rpm (centrífuga Eppendorf minispin) por 1 min descartándose el sobrenadante, se
resuspendió el pellet en 100 µL de solución I autoclavada (glucosa 50mM, Tris-HCl 25mM pH
8, EDTA 10 mM pH 8) se adicionó 8 µL de lisozima (50mg/mL), 1 µL de RNAsa (10mg/mL) y
se incubó a 37ºC por 30 min, posteriormente se adicionaron 200 µL de solución II (NaOH 0,2N y
SDS al 1%) se mezcló por inversión 5 veces hasta obtener translucidez y se adicionó 150 µL de
solución III (acetato de potasio 3M y ácido acético glacial) se homogenizó por vortex e incubó en
hielo por 5 min se centrifugó a 13000 rpm (centrífuga Eppendorf minispin) por 10 min quedando
en el precipitado DNA genómico y restos celulares, luego se transfirió el sobrenadante
conteniendo el DNA plasmidial a un tubo de 1,5 mL y se realizó una extracción orgánica
adicionando un volumen de cloroformo-isoamílico (24:1) se agitó en vortex y se centrifugó a
13000 rpm (centrífuga Eppendorf minispin) por 2 min, la fase acuosa superior se transfirió a un
tubo nuevo y el DNA plasmidial se precipitó por adición de 2 volúmenes de etanol 100%, se lavó
el precipitado 2 veces con 1 mL de etanol 70% se centrifugó a 13000 rpm (centrífuga Eppendorf
minispin) por 5 min, se descartó el sobrenadante y dejó secar el sedimento sobre papel absorbente
por 10 min y finalmente se resuspendió el DNA plasmidial en 30 µL de agua libre de nucleasas
(Maniatis et al., 1982).
28
3.2.10 Ensayo de Restricción
Para liberar el fragmento de 3 kb desde el vector se utilizó la enzima EcoRI, la mezcla de
reacción utilizada en un volumen final de 10 µL fue 1 µL de buffer 10X, 4,7 µL de H2O libre de
nucleasas, 4 µL del plásmido purificado y 0,3 µL de enzima EcoRI se incubó por 1 hora a 37ºC y
los productos de digestión se resolvieron por electroforesis en gel de agarosa al 1,5% con
bromuro de etidio. Los tamaños de los fragmentos se analizaron con el sistema de
fotodocumentación Digital Kodak EDAS 120.
3.2.11 Secuenciación plásmido clon5 (pC5).
Luego de realizar el ensayo de restricción a los diferentes clones se determinó que el
inserto del plásmido del clon 5 (pC5) posee un inserto de 3,2 k, para demostrar que corresponde
al fragmento de interés se envió a secuenciar a la empresa Macrogen, Corea. Se enviaron 250 ng
totales de plásmido, el cual fue secuenciado por el método de Sanger (Mathews et al., 2000) con
los partidores SP6 y T7. Se obtuvieron dos secuencias, una con cada partidor, correspondientes a
los extremos 5’ y 3’ del inserto del pC5. Las secuencias fueron analizadas utilizando la
herramienta BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/). Se determinó el locus donde se insertó la
copia de IS711 en la cepa B12 el cual se analizó con el programa Artemis la secuencia del
cromosoma I de la cepa 9-941 de B. abortus (Genbank AE017224) determinando el sitio de
inserción donde se insertó la copia adicional de IS711 en B12.
3.2.12 Análisis Bioinformático locus cepa B12.
Para el análisis se utilizaron las secuencias del cromosoma I de las siguientes especies B.
abortus 9-941 (AE017224), 2308 (AM040264), S19 (CP000887),B. melitensis 16M (AE008917),
B. suis 1330 (AE014291), B. canis ATCC 23365 (CP000872), B. microti CCM 4915 (CP001578)
y B. ovis ATCC 25840 (CP000708). Utilizando el programa Artemis se analizó en cada especie el
29
locus que contiene el gen que codifica para la L-lactatopermeasa, las coordenadas se obtuvieron
con la opción Find Orf by name de In silico molecular experiments (http://insilico.ehu.es/)
excepto en las especies B. melitensis, B. canis y B. abortus S19, donde se utilizó una secuencia
de 30 pb correspondientes al extremo 5’ del gen de la L-lactatopermeasa en el programa Artemis,
para identificar el locus en análisis.
3.2.13 PCR locus específico de la cepa B12
Luego de determinar el sitio preciso donde se insertó la nueva copia de IS711 en la cepa
B12, se diseñaron partidores que flanqueen el sitio de inserción, para lo cual se utilizó el
programa Primer3 (http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi). Los partidores
fueron denominados B12F y B12R y las secuencias se encuentran en la tabla I. El producto de
PCR esperado en las diferentes cepas de Brucella spp. sin la copia de IS711 en este locus es de
233 pb y en la cepa B12 con la copia de la IS en dicho locus es de 1075.
EL PCR se realizó en un volumen final de 25 µL donde la concentración final de los
reactivos fue, buffer de la enzima 1X, dNTPs 0,4 mM, MgCl 2 2 mM, partidor B12F 0,5 µM,
partidor B12R 0,5 µM, Platinum Taq DNA Pol 1 U y 40 ng de molde. El programa de
amplificación fue 95°C por 5 min, 35 ciclos de denaturación a 95ºC por 20 seg , apareamiento a
60ºC por 20 seg y extensión a 72ºC por 1min, seguido de una extensión final a 72ºC por 5min.
Los productos de PCR se resolvieron por electroforesis en gel de agarosa al 1,5%.
3.2.14 PCR confirmatorio cepa B12.
Al amplificar la cepa B12 con los partidores B12F y B12R se obtuvieron dos productos de
PCR en lugar de uno, para verificar la presencia de la cepa B12, se utilizó el partidor IS711out y
30
el partidor B12R, que generaron un producto de PCR de 180 pb exclusivamente en la cepa de B.
abortus B12, se utilizaron las mismas condiciones del PCR específico para cepa B12.
El producto obtenido se purificó utilizando QIAEX II y se envió a secuenciar
a la
empresa Macrogen Corea, fue secuenciado con los partidores IS711out y B12R, las secuencias
obtenidas fueron alineadas con el programa ContigExpress (Vector NTI) y la secuencia consenso
fue analizada en BLAST.
3.2.15 Purificación de la cepa B12.
Debido a los resultados anteriores se decidió realizar una purificación de la cepa, para lo
cual se estimó la proporción entre las cepa de Brucella sp. y la cepa B12 presente en la muestra
original, para dicho propósito se utilizó un PCR diseñado para identificar la cepa B16, cepa que
posee una secuencia de inserción adicional en otro locus, el PCR diseñado genera un producto de
aproximadamente 1100 pb para la cepa B16 y de 300 pb para las demás cepas del género
Brucella. Se mezclaron diferentes proporciones de DNA genómico de la cepa B16 y cepa de
referencia 544 de B. abortus (1:1, 1:10, 1:25, 1:50, 1:100) dichas mezclas fueron utilizada como
molde en una reacción de PCR con los partidores B16F y B16R (Tabla I). Se utilizaron
condiciones idénticas del PCR con los partidores B12F y B12R. Los productos se resolvieron por
electroforesis en gel de agarosa al 1,5%. Se comparó la intensidad el producto de 1100 bp de la
cepa B16 con el producto de 1075 bp en la cepa B12, determinando una relación 1:10 existente
entre la cepa B12 y la cepa “contaminante” en la muestra original. Posteriormente se cultivó una
placa de agar Brucella con la muestra original, posteriormente se repicaron 50 colonias,
sembrando con un mondadientes estéril una estría en agar Brucella y luego sembrando en caldo
de Brucella, se creció el caldo y la placa a 37°C en microaerofilia por 48 horas. Crecieron 40
colonias, en placa y caldo, de las cuales se inactivaron 200 µL por calor en termociclador por 30
31
min a 99 °C. Posteriormente se centrifugó a máxima revolución por 5 min (centrífuga Eppendorf
minispin), el sobrenadante conteniendo DNA se traspasó a un tubo nuevo. Se conformaron 8
grupos de cinco colonias cada uno, además se agregó una muestra de DNA de una colonia aislada
de una placa de agar sangre. Se determinó la presencia de la cepa B12 utilizando un PCR con los
partidores B12F y B12R, diseñados para identificar esta cepa. Una vez identificada la cepa B12
se prepararon glicerol stock conteniendo un 20% de glicerol. La cepa se conservó en “freexer” a
-80°C.
3.2.16 Secuenciación de la IS711 adicional en la cepa B12.
Posterior a la purificación de la cepa B12 se realizó el PCR diseñado para B12
obteniéndose el producto de 1075 pb, el cual fue purificado desde gel de agarosa con el kit
QIAEX II, y fue secuenciado en ADL diagnostic, utilizando los partidores B12F y B12R las
secuencias resultantes fueron alineadas con la aplicación ContigExpress del programa Vector
NTI (Invitrogen), la secuencia consenso se comparó con las seis IS711 completas presentes en el
genoma de B. abortus cepa 9-941 las cuales fueron numeradas IS711 1, 2, 3, 4, 5 y 7 en relación
al perfil RFLP correspondiente 7,2, 6,2, 4,2, 3,8, 2,4 y 1,1 kb respectivamente. La IS 6 no se
analizó debido a que corresponde al orfB de IS711. Además se comparó la nueva copia de IS711
del locus B12 con dos IS descritas en literatura, la primera pertenece a la cepa vacuna B. abortus
RB51 que interrumpe el gen wboA y la segunda IS711 interrumpe el gen BCSP31 en B. ovis.
Todas las secuencias fueron descargadas desde GenBank y fueron alineadas con la aplicación
AlignX del programa Vector NTI de Invitrogen
32
4.0 RESULTADOS
4.1 Análisis Bioinformático.
Con el fin de localizar la nueva copia de la IS711 en el cromosoma de la cepa B12 de B.
abortus, se identificó la región genómica y posiciones de las siete IS711 en ambos cromosomas
de B. abortus cepa 9-941 utilizando el programa de Artemis. Dichos cromosomas fueron
posteriormente digeridos in silico con las enzimas de restricción AvaI y ClaI, dado que al digerir
el DNA genómico con estas enzimas y realizar un IS711-RFLP, se genera un perfil de siete
fragmentos correspondientes a las siete IS711 presentes en B. abortus (Fig. 4). Los resultados
arrojaron 1615 fragmentos en el cromosoma I,
de los cuales cuatro mostraron una copia
completa de IS711. Por otra parte, el análisis de restricción del cromosoma II generó 821
fragmentos, de los cuales tres exhibieron una copia de IS711. Una de estas copias contiene sólo
el orfB de la IS (Figura 4, Tabla II).
Los fragmentos de restricción de 5,7 kb (según se describió en métodos) fueron
analizados en busca de la secuencia CTAG, blanco preferente de inserción de la IS711. Los
resultados mostraron cuatro posibles sitios de inserción de la IS en el cromosoma I y tres sitios
en el cromosoma II. De estos, cinco copias CTAG se encontraron en regiones intergénicas y dos
copias, interrumpiendo regiones que codifican para proteínas hipotéticas. En suma, según se
muestra en la Tabla III, existen siete posibles sitios de inserción de la IS711 distribuidos en el
genoma de B. abortus 9-941.
.
33
IS711-RFLP
CROMOSOMA I
tRNA-ribosiltransf. Trunc.
Sensor histidina Quin.
IS711
4.2 kb
BruAb1_0985
ISBm1.orfC
IS711
ISBm1 orfB
3,8 kb
BruAb1_0552
Hp
2.4 kb
BruAb1_0134
Hp
BruAb2_0382
alkB
IS66, orf4
1.1 kb
IS711
BruAb1_0927
CROMOSOMA II
IS711
Hp
IS711
ISBm1.orfB
orfB
IS711
BruAb2_0692
BruAb2_0672
BruAb2_0386
7.2 kb
D-aminopeptidasa
6.2 kb
1.4 kb
Figura 4. Esquema de las siete IS711 presentes en B. abortus 9-941. Se esquematiza la
ubicación de las seis IS711 completas, cuatro en el cromosoma I y dos en el cromosoma II,
además se observa una IS reducida al marco de lectura orfB en el cromosoma II. Se presenta
además, cada fragmento del IS711-RFLP donde se encuentra cada copia de IS711 en B. abortus.
34
Coordenadas
RFLP tamaño kb
Tamaño pb
Ubicación
Fragmento
IS711
7.2
7175
Cromosoma II
380568-387743
383785-384520
6.2
5520
Cromosoma II
700740-706260
701304-702039
4.2
4231
Cromosoma I
963110-967341
963547-964282
3.8
3801
Cromosoma I
543972-547773
545772-546507
2.4
2364
Cromosoma I
151129-153493
151587-152322
1.4
1386
Cromosoma II
681774-683160
682382-682468
1.1
1162
Cromosoma I
913779-914941
914004-914739
Tabla II. Localización de las IS711 en el genoma de B. abortus cepa 9-941 digerido con
AvaI y ClaI. Ubicación de las diferentes IS711 presentes en el genoma de B. abortus cepa 9-941.
La IS truncada conteniendo sólo el orfB corresponde al fragmento de 1,4 kb del cromosoma II.
35
Cromosoma I
Fragmento (pb)
Coordenadas
CTAG
Posición
5752
324768-330519
1
327688
Interétnica
5729
775615-781343
1
780913
Hypothetical protein
2
781118
Intergénica
1
722604
Epimerase/Dehydratase
2
726508
L-lactate permease
3
726808
Intergénica
1
1644579
Acetyltransferase
2
1648999
Sodium/bile acid transporter
CTAG
Posición
5692
5595
721239-726929
1643988-1649582
Ubicación
Cromosoma II
Fragmento (pb)
Coordenadas
Ubicación
694107-699985
897340 - 902937
0
5575
838303 - 843878
0
5537
981163 - 986700
0
5521
700740 - 706260
1
701287
Alkylated DNA repair protein
2
702131
Intergénica
3
702205
Intergénica
4
702293
Major facilator family transporter
5
704869
Hypothetical, aminopeptidasa
5880
5597
0
Tabla III. Análisis Bioinformático fragmentos de restricción de 5,7 kb. En esta tabla se
presentan los fragmentos de restricción AvaI - ClaI de 5,7 kb conteniendo la secuencia CTAG y
su ubicación en el genoma de B. abortus 9-941 (orf ó intergénica).
36
4.2 Identificación del locus portador de la nueva copia de IS711, en la cepa B. abortus B12.
El análisis bioinformático indicado antes sugiere siete posibles sitios de inserción de IS711
en el genoma de B. abortus cepa B12. Para confirmar estos resultados, se utilizó una variante del
PCR denominado “PCR anclado”. Este utiliza un partidor que se une específicamente a la región
3’ de IS711 y el segundo, P5 (Fekete et al., 1992), que se une al azar a secuencias del genoma de
B. abortus. Con esta estrategia se logró obtener un producto único de PCR con la cepa B.abortus
B12 de 3,2kb, comparado con el producto de amplificación generado con el genoma de la cepa de
B. abortus 544 (Figura 5).
El producto de PCR de 3,2 kb generado del genoma de la cepa B12, se ligó al vector
pGEM-T-easy y el vector recombinante se transformó en células competentes. De las seis
colonias blancas portadoras de plásmido con inserto, los clones 2 y 4 presentaron tres fragmentos.
El mayor de 3 kb corresponde al vector linearizado y los dos siguientes, eventualmente
corresponderían al inserto portador de la IS digerido con la enzima EcoRI. El clon cinco, de aquí
en adelante, pC5, generó dos fragmentos de restricción, uno de 3194 pb y otro de 2936 pb, que
corresponde al inserto y vector linearizado, respectivamente. Este tamaño de inserto concuerda
con el fragmento previamente purificado, por ende, dicho inserto fue secuenciado (Fig. 6).
37
Figura 5. Identificación del locus de inserción de la nueva IS711 por PCR anclado. Carril 1:
productos de PCR cepa B. abortus 544. Carril 2: productos de PCR de la cepa B12. Carril 3.
Control negativo de PCR sin templado. Flecha: producto de PCR de la cepa B12, potencial
portador de la nueva IS711. Carril ST: Estandar 100 pb DNA ladder plus. Gel de agarosa al 1,5%.
38
ST
1
2
3
4
5
6
3,2 kb
* Inserto
pGem-T-easy
3000 bp
2000 bp
1000 bp
500 bp
100 bp
Carril 1
Carril 2
Carril 3
Carril 4
Carril 5
Carril 6
Tamaño (bp)
3065
2968
2968
2903
3194
3000
Tamaño (bp)
2290
2194
447
2000
2936
2226
Tamaño (bp)
1083
1734
Figura 6. Identificación del plásmido recombinante conteniendo el inserto de 3,2 kb.
Carriles 1-6: Perfil de restricción EcoRI de DNA plasmidial aislado de colonias Amp r Flecha:
vector linearizado de 3018 pb. Flecha *: tamaño de inserto compatible con el largo del producto
generado por IS711-PCR anclado. Tabla: tamaño de cada fragmento. ST: Estandar 100 pb ladder
plus. Gel de agarosa al 1,5%.
39
4.3 Secuencia nucleotídica del inserto conteniendo la nueva IS.
Para la identificación del inserto contenido en el plásmido pC5, se analizó por secuencia
los extremos de dicho inserto usando los partidores SP6 y T7 complementarios al sitio de
clonamiento del vector. Los resultados indican que, hacia el extremo 5´del inserto, la secuencia
presenta un 97% de identidad con el orfB de IS711 y un 99% de identidad con el gen lldp que
codifica para la enzima L-lactatopermeasa (fragmento 741 pb, Figura 7). Por otra parte, hacia el
extremo 3´del inserto, la secuencia corresponde a una porción del gen que codifica para la
proteína hipotética BruAb1_0739 del cromosoma I de B. abortus (fragmento de 713 pb, Fig 7).
La nueva copia de IS711, correspondiente al fragmento de 741 pb, se localiza adyacente a la
secuencia TTAG en la posición 724826 del cromosoma I, sitio que cumple el requisito YTAR de
inserción de la mencionada IS (Halling et al., 1993) (Fig. 7).
4.4 Comparación entre genomas de Brucella, del loci portador de la nueva IS.
La comparación del locus conteniendo la nueva copia de IS711 de la cepa de B. abortus
B12 con su ortólogo en especies del género Brucella que se indica en la Fig. 8, demuestra que la
nueva IS está presente exclusivamente en la cepa silvestre B12. Por otra parte, destaca la ausencia
del gen hipotético BruAb1_0736 en la cepa B. abortus 2308, río arriba del sitio de inserción de la
IS. En B melitensis 16M, el gen de la L-lactatopermeasa ubicado río abajo del sitio de inserción
de IS711, se encuentra dividido en dos marcos de lectura (Fig.8). Cabe hacer notar la presencia
en la región intergénica entre BruAb1_0736 y el gen lldp, de la secuencia palindrómica Bru-RS1
(GenBank L24480) descrita como sitio preferencial (hot spot) de inserción de IS711 (Halling et
al., 1994). Esta característica se encontró constante en la mayoría de los genomas analizados, con
un 95% de identidad, excepto en B. melitensis 16M y B. abortus 2308 y S19 (Fig.8).
40
Panel A
Lldp, L-lactate permease
IS711, transposase orfB
Panel B
741 bp
IS711
713 bp
Lactatopermeasa
Figura 7. Secuencia del inserto conteniendo la nueva copia de IS711 en B. abortus B12.
Panel A: secuencia del extremo 5´ del inserto conteniendo la nueva copia de la IS. Flechas roja
vacía: orfB de IS711. Recuadro azul: sitio CTAG. Flecha verde vacía: gen L-lactatopermeasa.
Panel B: Organización genómica del inserto conteniendo la nueva IS711 clonado en pGEM-Teasy.
41
Figura 8. Comparación del nuevo locus de IS711 entre genomas del género Brucella. 1: gen
BruAb1_0736. 2: gen lldp. 3: nueva IS711. 4: ausencia de BruAb1_0736. 5: gen lldp dividido en
dos orfs. 6: secuencia palindrómica conservada de inserción Bru-RS1.
42
4.5 Identificación de la nueva IS711 en el genoma de B. abortus B12.
Con el objeto de confirmar la presencia de la nueva copia de IS711 exclusivamente en el
genoma de B. abortus B12, se diseñaron nuevos partidores (B12F y B12R) para amplificar la
región que contiene el sitio TTAG, secuencia blanco de inserción de la IS. Como templado se
utilizó DNA genómico de las cepas de B. abortus, B. melitensis, B. suis y B. ovis. Los resultados
muestran tres productos para la cepa B. abortus B12 (Fig 9). Uno, de 233 pb presente en todas
las cepas analizadas, indicativo de ausencia de la IS. El segundo, de 800 pb correspondiente a un
fragmento inespecífico, presente incluso, cuando se realiza PCR en gradiente. El fragmento más
grande de 1075 pb concuerda con el tamaño esperado para la región conteniendo la IS711. Este
fragmento se observó sólo en el producto obtenido de la cepa B. abortus B12. Sin embargo, la
presencia del fragmento de 233 pb en dicha cepa, es sugerente de que la cepa silvestre B12 se
encuentra contaminada. Para descartar un problema de PCR con los partidores B12F y B12R
diseñados para la cepa B12, se corroboró la presencia de la cepa B12 por PCR con los partidores
IS711out y B12R. Se obtuvo un producto de 180 pb exclusivamente en la cepa B12 y el plásmido
pC5 (Fig 10, panel A). El producto generado en la cepa B12 se secuenció obteniendo idénticos
resultado a los obtenidos con el pC5, se encontró un 94% de identidad con el orfB de IS711 y un
96% de identidad con el gen lldp. (Fig. 10, panel B). Este resultado corroboró la presencia de la
nueva IS en la cepa B12 en la muestra original. Sin embargo, la baja señal obtenida con el
genoma de la cepa silvestre fue sugerente de que dicha cepa estuviera contaminada.
43
Figura 9. Identificación de la nueva IS711 en el genoma de la cepa B. abortus B12.
Carriles 2 al 8: Producto de PCR utilizando como templado el genoma de B. melitensis 16M, B.
suis 1330, B.ovis 63/290, B. abortus 544, B. abortus 2308, B. abortus B16 y B. abortus B12,
respectivamente. Carril 1: control negativo sin templado. ST: Estandar 100 pb DNA ladder plus.
Gel Agarosa 1,5% teñido con bromuro de etidio, imagen en negativo. Flecha 233 pb: ausencia
nueva copia de IS711. Flecha 800 pb: producto inespecífico. Flecha 1075 pb: presencia de la
nueva copia de IS711 cepa B12.
44
A
ST
1
2
3
4
5
6
7
500 pb
200 pb
180 pb
100 pb
B
IS711, transposase orfB
Lldp, L-lactate permease
Figura 10. Corroboración nuevo locus IS711 en B. abortus B12. Panel A: Carril 1 y 2:
producto PCR plásmido pC5. Carril 3 – 6: productos PCR cepa B. abortus B12, B. abortus B16,
B. abortus 544, B. abortus 2308. Carril 8: control negativo PCR sin templado. Flecha: producto
específico cepa B12 enviado a secuenciar. Carril ST: Estandar 100 pb. Gel de agarosa al 1,5%,
teñido con bromuro de etidio. Imagen en negativo. Panel B: Secuencia del producto de PCR de
180 pb de la cepa B12, se encontró identidad con el orfB de IS711 y con el gen que codifica para
la enzima L-Lactatopermesa.
45
4.6 Purificación de cepa silvestre B. abortus B12.
Con el fin de purificar la cepa B. abortus B12 se estimó la cantidad de colonias a sembrar en
placas agar Brucella. Se estimó la probabilidad de encontrar la cepa B12 utilizando como referencia la
intensidad del producto de PCR de 1,3 kb obtenido de la amplificación del genoma de B. abortus B16
mezclado con proporciones crecientes del genoma de la cepa de B. abortus 544. Para determinar el grado
de contaminación, la intensidad del producto de amplificación de la cepa B12 se contrastó con su
equivalente obtenido del genoma de B. abortus B16. Se utilizó diferentes juegos de partidores para
distinguir la cepa silvestre B. abortus B16 de la B12. Se determinó que la cepa silvestre B12 se
encontraba diluida en una proporción de 1:10 (Fig.11). Con este resultado se sembraron en placa
cincuenta colonias, de las cuales crecieron sólo cuarenta. Se conformaron ocho grupos con el
DNA de cinco colonias, se rastreó la presencia de la cepa B12 por PCR utilizando los partidores
para generar el producto específico de 1075 pb, indicativo de la presencia del nuevo locus. Siete
grupos resultaron negativos a la cepa B12 y uno fue positivo (Fig.12 A). De lo anterior, dos de las
cinco colonias designadas como M41 y M48, se ingresaron al cepario como cepas puras de B.
abortus B12 (Fig.12 B). La identidad de estas cepas se confirmó demostrando la presencia del
nuevo locus exclusivamente en la cepa B. abortus B12, según se indica en la Figura 13. Cabe
destacar que la cepa B12 pareciera cultivarse de manera más eficiente en agar sangre por cuanto
bastó aislar una colonia de una primera azada cultivada para detectar la cepa B12 (Fig 12 A).
46
Figura 11. Determinación proporción cepa B12 versus Brucella sp en el aislado clínico.
Productos de PCR utilizando como templado una mezcla de los genomas de B. abortus B16 / B.
abortus 544. Carril 1al 5: proporción 1:1. Carril 2: proporción 1:10. Carril 3: proporción 1:25.
Carril 4: proporción 1:50. Carril 5: proporción 1:100. Carril ST: standard 100 pb. Gel de agarosa
al 1,5% teñido con bromuro de etidio, imagen colores invertidos.
47
Figura 12. Identificación de la cepa silvestre B12 portadora del nuevo locus IS711. Panel A.
Carriles 1 – 8: producto de amplificación del locus de 1075 pb de colonias aisladas del cultivo
original de la cepa de B. abortus B12 y analizadas en grupos de a 5. Carril 9: producto de
amplificación del locus de 1075 pb de una colonia aislada en agar sangre. Flecha B12: indica
presencia del locus de 1075 pb. Panel B. Carril 1- 5: producto de PCR de las colonias aisladas
cuya combinación resultó positiva al locus de 1075 pb. Carril 6: control positivo. Carril 7:
Control sin templado. Carril ST: Standard 100 bp DNA ladder. Geles agarosa 1,5 % teñidos con
bromuro de etidio, imágenes en negativo.
48
Figura 13. Identificación del locus conteniendo la nueva IS711 en cepas de Brucella. Carril 1:
control sin templado. Carriles 2 – 12: producto PCR B. abortus 544. B. abortus RB51. B. abortus
2308. B. abortus S19. B. abortus silvestre B10. B. abortus silvestre B16. B. abortus silvestre
B18. B. abortus silvestre B12. B. melitensis 16 M. B. suis 1330. B.ovis 63/290. Carril 13: control
positivo locus 1075 pb, pC5. Carril ST: Estandar 100 pb. Gel de agarosa al 1,5% teñido con
bromuro de etidio.
49
4.7 Origen de la nueva IS711
Para establecer el origen probable de la nueva IS711 encontrada en la cepa de B. abortus
B12, se realizó un análisis de homología de secuencia entre la nueva copia de la IS711 de dicha
cepa con: 1. las seis copias de IS711 completas del genoma de B. abortus 9-941 (# 1, 2, 3, 4,5 y
7) 2. La IS711 presente en la cepa vacuna B. abortus RB51. 3. Con la IS711 que interrumpe el
gen BCSP31 en B. ovis. Los resultados demuestran que la nueva IS711 presenta una alta
identidad con las copias # 2 (xa) del cromosoma II y #5 (x1) del cromosoma 1 de B. abortus 9941, lo que sugiere que la nueva IS pueda haberse originado de la transposición de una de estas
dos copias. Destaca de la figura la baja similitud de estas IS con el resto de las IS711 descritas
para B. abortus 9_941 y B. ovis. (Panel A, Fig. 14). Por otra parte, la nueva IS muestra a ambos
lados la repetición de la secuencia blanco de inserción, de acuerdo a lo esperado para esta IS
(Panel B, Fig 14).
50
Figura 14. Origen de la nueva copia IS711 en el genoma de B. abortus B12. Panel A.
Dendrograma de homología de secuencia entre la nueva IS711 de la cepa B12 y las copias
presentes en B. abortus 9-941, cepa vacuna (utilizada en bovinos) B. abortus RB51 y B. ovis.
Panel B. locus de Secuencia inserción de la IS711 muestra la duplicación de la secuencia blanco
de inserción. YTAR .
51
5.0 DISCUSIÓN
La brucelosis es una patología zoonótica de difícil erradicación, razón por la cual este
patógeno ha sido incluido en los proyectos de genoma a fin de conocer los mecanismos de
patogenicidad que determinan su persistencia. El genoma de las especies que integran el género
de Brucella es muy estable, observándose cierto polimorfismo en la distribución de las
secuencias de inserción IS711. El resultado del análisis bioinformático del genoma de B. abortus
9-941 realizado en este trabajo, identificó siete copias de IS711 de las cuales, cuatro están
contenidas en el cromosoma I y tres en el cromosoma II. Una de las IS del cromosoma II se
encuentra reducida a un fragmento de 87 pb, correspondiente al extremo carboxilo terminal de la
transposasa (orfB). El análisis experimental del perfil IS711-RFLP de la cepa B. abortus B12
identificada en nuestro laboratorio, muestra un fragmento de restricción AvaI - ClaI de 6,6 kb,
no descrito con anterioridad. La comparación de este perfil con las cepas de referencia y cepa
vacuna, demuestra que este nuevo fragmento concuerda con un fragmento de restricción de 5,7
kb presente en el resto de las cepas de B. abortus, sumado a una copia de IS711 (900 pb). Para la
confirmación experimental de la inserción de IS711 en un nuevo locus, se analizó la secuencia
del producto del ensayo de PCR anclado. Se consideró además que la inserción de IS711 ocurre
en sitios conservados identificados en Brucella como YTAR, donde Y corresponde a una
pirimidina y R corresponde a una purina (Halling et al., 1993). Los resultados demostraron que
efectivamente el fragmento de 6,6 kb contiene una nueva copia de la IS no descrita en otras
variantes de B. abortus. Dicho fragmento AvaI – ClaI es de 5,692 kb y contiene la nueva copia
de la IS en las coordenadas 724826 – 725668 del cromosoma I en la cepa B12. En este sitio se
observó además en los extremos de la IS las secuencias 5´- TTAG y 3´- CTAG, concordante con
52
una de las secuencia más recurrentes de inserción de IS711 (CTAG) y con la duplicación de la
secuencia TA a ambos lados de la IS posterior a la transposición (Marianelli et al., 2003).
El análisis de organización de los genes en el sitio de inserción TTAG (posición 724826
del cromosoma I), muestra que la IS711 en la cepa B12 se encuentra flanqueada por dos genes.
Río arriba, el gen BruAb1_0736, que codifica para una proteína hipotética y río abajo el gen
lldP, que codifica para la L-lactatopermeasa. El gen BruAb1_0736 posee un tamaño de 156 pb y
codifica para una proteína hipotética de cincuenta y un aminoácidos, de un peso molecular de
5,74 kDa, cuya función es desconocida y no existe proteína homóloga reportada.
Las secuencias de los genomas bacterianos depositados en la base de datos, sumado al
uso de herramientas bioinformáticas, han evidenciado la gran cantidad de estos genes presentes
en los patógenos emergentes (Lerat y Ochman, 2005).
El gen lldp codifica para una permeasa que corresponde a una porción del operón
involucrado en el metabolismo del L-Lactato (lldPRD). Este operón está compuesto por el gen
lldP que codifica para la permeasa (transportador de membrana), el gen lldR que codifica para
una proteína reguladora y el gen lldD que codifica para la enzima L-Lactato deshidrogenasa. La LLactatopermeasa transporta el L-Lactato desde el medio extracelular hacia el interior de la
bacteria. En condiciones normales, la proteína reguladora está reprimiendo al operón. Al ingresar
L-Lactato
este se une a la proteína reguladora generando un cambio conformacional en esta
proteína que activa al operón lldPRD (Aguilera et al., 2008). La enzima L-Lactato deshidrogenasa
cataliza la conversión del L-Lactato a piruvato, molécula utilizada por las bacterias para obtener
energía (Gao et al., 2008). Sin embargo, esta organización de operón no se observa en Brucella,
ya que, el gen lldP que codifica para la permeasa no se encuentra asociado a los demás genes del
53
operón descrito anteriormente, sino que se encuentra aislado. El locus donde se transpuso
la IS711 en la cepa B12, se encontró conservado en las diferentes especies de Brucella, sin
embargo, en B. melitensis cepa 16M, el gen lldP está dividido en dos marcos de lectura (orfs), a
diferencia de las demás especies analizadas. Por otra parte el pseudogen BruAb1_0736 no se
observa al analizar el genoma de la cepa de B. abortus 2308.
Interesantemente, al analizar la secuencia de la región intergénica que contiene la IS711
adicional en la cepa B12, se encontró que posee una alta identidad con la secuencia palindrómica
Bru-RS1 descrita como sitio hot spot de inserción para IS711 (Halling et al., 1994). Es decir, este
locus posee dos sitios hot spot de inserción para IS711, por una parte la secuencia palindrómica
(Bru-RS1) de 103 pb y el sitio de inserción TTAG para IS711, lo que podría haber facilitado la
inserción de esta IS en este locus en la cepa B12.
El análisis bioinformático indica que en el genoma de B. abortus existe una copia de
IS711, denominada x1, en la posición 151587 del cromosoma I (Ocampo-Sosa et al., 2008), de
igual manera esta IS711 se encuentra en dicha posición en el genoma de B. melitensis y B. suis.
En la especie B. abortus existe una copia de la IS711x1 con un 100 % de identidad, denominada
xa, ubicada en la posición 701304 del cromosoma II. Esta copia xa se encuentra adyacente al
gen alkB (Figura 4), cuyo producto participa en la reparación de DNA. El locus de la IS711xa
es utilizado para distinguir a B. abortus de las demás especies del género Brucella (Bricker et al.,
2003). El genoma de la cepa de B. abortus 2308 presenta en la posición 910190 dos copias
adyacentes de IS711, de las cuales una corresponde a una copia de la IS711x1 (denominada x08).
Este locus con dos IS711, distingue a la cepa 2308 de las demás cepas de B. abortus. Cabe
mencionar que las copias IS711xa e IS711x08 pudieran derivar de la transposición replicativa de
IS711x1, asumiendo que esta IS es ancestral ya que no se encuentra solamente en B. abortus sino
54
que también en B. melitensis y B. suis. Sin embargo, no se puede descartar que el origen de estas
copias de IS711 (xa y x08), sea producto de transferencia horizontal de genes (HGT) entre cepas
de Brucella, ya que este mecanismo es ampliamente utilizado por las bacterias para transferir
material genético de una bacteria a otra (Thomas y Nielsen, 2005). Por otra parte, la alta
identidad entre las copias de IS711 x1, xa y x08 sugiere que la transposasa de esta IS711 es
activa en comparación a las otras IS711 presentes en B. abortus.
La secuencia de la nueva IS711 encontrada en la cepa B12 presenta un 99,4 % de
identidad con las copias de las secuencias de inserción IS711x1 (B. melitensis, B. suis y B.
abortus), IS711xa (B. abortus) e IS711x08 (B. abortus 2308) referidas en la lietaratura. En
suma, estos antecedentes sugieren que la transposasa de esta IS es activa y que la nueva IS711 de
la cepa B12 podría provenir de la transposición replicativa de la IS711x1 del cromosoma I o de
la transposición replicativa de IS711xa del cromosoma II.(Ocampo-Sosa et al., 2008)
La frecuencia de transposición de IS711 en Brucella es muy baja del orden de 10-8 y se
presenta en especies que presentan un alto número de copias de IS711, como lo son B. ovis y B.
pinnipedialis (Ocampo-Sosa et al., 2008). Por otra parte, el evento de transposición depende de la
expresión del gen de la transposasa que se encuentra al interior de IS711, flanqueado por dos
secuencias inversas repetidas (Mancilla et al., 2010). El análisis bioinformático de IS711 indica
limitaciones en la traducción de la transposasa debido a que el codón de inicio corresponde a
CTG en lugar del canónico ATG, además la superposición de los orfs que codifican para la
transposasa implican un corrimiento negativo del ribosoma o “frameshift -1” (Sekine y Ohtsubo,
1989) para la correcta traducción del mRNA correspondiente a la transposasa. Más aún se ha
descrito en la familia IS1, donde el gen de la transposasa está codificado de igual manera por dos
orfs, la expresión del péptido orfA, que corresponde al extremo amino terminal de la transposasa,
55
reprime la expresión de la transposasa completa. (Sekine et al., 1997). Por tanto, la transposasa de
la IS711 tendría una baja tasa de traducción. En consecuencia, esto sugiere una explicación para
la baja frecuencia de transposición de esta IS.
En Brucella no está claro el mecanismo por el cual se resolvería el cointegrado luego de
existir un evento de transposición replicativa (Figura 15), ya que la IS711 solo codifica para la
transposasa y carece del gen que codifica para la resolvasa, enzima descrita como responsable de
la resolución del cointegrado en un evento de transposición replicativa. Recientemente se ha
reportado transposición replicativa del transposón Tn502, a través de dos mecanismos
independientes, uno utilizando la enzima resolvasa y otro utilizando la proteína RecA del sistema
SOS de reparación de daño de DNA (Petrovski y Stanisich, 2010), este último evento con una
eficiencia mucho menor comparado con el mecanismo mediado por la resolvasa. Se ha descrito
además, que la transposasa de la IS1 activa la proteína RecA, esto permite la transposición
replicativa de la IS1, ya que RecA supliría la carencia de la enzima resolvasa para resolver el
cointegrado (Lane et al., 1994).
Además, cabe considerar que en el evento de transposición replicativa (Figura 14)
participan otros factores, como por ejemplo proteínas chaperonas involucradas en la expresión
de la transposasa o en el ensamble del complejo DNA-proteína para que ocurra una correcta
transposición
(Mahillon
y
Chandler,
1998).
Por
otra
parte,
participan
proteínas
chaperonas/proteasas que desarman el complejo DNA-proteína luego de la transposición, como
por ejemplo, la proteasa Lon, involucrada en la proteólisis de la transposasa de la IS903 posterior
a la transposición. (Derbyshire et al., 1990)
56
Figura 15. Modelo de transposición replicativa para IS711. La enzima transposasa cataliza: i.
El corte en los extremos de la IS711 y del el sitio de inserción TTAG. ii. Movilización de la IS
uniendo el extremo 3’ OH de la IS711 con el extremo 5’ fosfato del sitio de inserción CTAG. iii.
La enzima DNA polimerasa cataliza la extensión de los extremos 3’ OH iv. La DNA ligasa
cataliza la formación del cointegrado v. La recombinación catalizada por la enzima resolvasa
genera las dos copias de la IS. Se observa la duplicación del sitio de inserción CTAG en la nueva
copia de IS711.
57
Luego de determinar el locus exacto donde se ubica la nueva IS711 de la cepa B12, se
analizó por PCR un aislado de leche proveniente de animales infectados con el fin de pesquisar la
IS en cepas silvestres. Los resultados obtenidos sugirieron que en la muestra de leche podrían
existir dos genotipos de Brucella, la cepa B12 y una cepa de Brucella sp. Ambas cepas se
encontraron en cultivo en una proporción de 1:10, cepa B12: cepa Brucella sp. Durante los
sondeos de cultivo para la purificación, se observó además que la cepa B12 presenta preferencia
por el medio agar sangre en lugar del medio Brucella base. Hasta el momento no existe una
explicación de la preferencia por este medio enriquecido. Cabe mencionar que en el primer
aislamiento de la cepa B12 desde la muestra de leche, el agar Brucella fue preparado con el
buffer Mcllvaine’s a pH 6,6, el cual contiene Na2HPO4 y acido cítrico, lo que pudiera haber
favorecido su crecimiento en este medio a diferencia del medio agar Brucella pH 6,6 preparado
sin este buffer.
La presencia de dos genomas de B. abortus en la muestra de leche desde donde se aisló
la cepa B12 sugiere una posible co-infección. La co-infección es la infección de un hospedero por
múltiples patógenos. En Nigeria el año 2008 se reportó una co-infección con Brucella y
Mycobacterium al analizar muestras de bovinos sacrificados (Cadmus et al., 2008). En relación a
Brucella, se reportó en EEUU una co-infección con B. abortus, aislándose dos cepas de diferente
biotipo o biovar desde un animal infectado (Jones et al., 1982). Este trabajo sugiere el hallazgo de
dos cepas de B. abortus del mismo biovar, pero de diferente genotipo en el mismo animal
infectado. No obstante, existe la posibilidad que el genotipo de la cepa B12 se haya generado en
el interior del animal infectado por un evento de transposición replicativa, siendo este animal el
primer reservorio de dicha cepa.
58
Sin lugar a dudas el caso más importante, relacionado a eventos de transposición en
Brucella es lo ocurrido en la cepa RB51. Esta cepa es actualmente utilizada como vacuna en el
ganado bovino. RB51 sufrió un evento de transposición donde IS711 se transpuso en el gen
wboA, el cual está involucrado en la síntesis del LPS en Brucella (Vemulapalli et al., 1999). De
esta manera se altera la síntesis de este factor de virulencia, transformando a esta cepa en una
bacteria avirulenta incapaz de sobrevivir intracelularmente una vez que ha sido fagocitada por los
macrófagos del hospedero (Vemulapalli et al., 2000). Se ha descrito además la transposición de
Tn5 en el operon ureasa de B. abortus, lo que inhibe el funcionamiento de la ureasa, enzima que
degrada la urea en dióxido de carbono (CO2) y amonio (NH4+). Las cepas con esta transposición
son incapaces de sobrevivir en el medio gastrointestinal debido al bajo pH existente. En
contraste, las cepas que no poseen esta transposición, sobreviven debido a la neutralización del
pH a través de los iones amonio (NH4+) generados por la ureasa (Sangari et al., 2007). Este
antecedente indica que la transposición en B. abortus de Tn5 produce cambios fenotípicos
importantes para la patogenia de esta bacteria, ya que perjudica la infección a través de la vía
gastrointestinal, una de las rutas principales de contagio de este patógeno.
La estabilidad de la IS711 y su presencia en loci definidos del genoma de Brucella,
convierte a esta IS en un excelente marcador genético. La existencia de una única copia de IS711
en las cepas de Brucella que infectan a mamíferos marinos permite diferenciarlas de las cepas de
Brucella que afectan a los animales terrestres soporta esta idea (Zygmunt et al., 2010). Además,
IS711 permite diferenciar aislados de campo de B. abortus de las cepas 2308 y RB51 (Bricker y
Halling, 1994). La transposición de IS711 en Brucella no es un evento recurrente. Sin embargo,
esta tesis evidencia que la transposición de IS711 en la cepa B12 es un mecanismo activo en B.
abortus y por lo tanto, una fuente de diversidad génica del patógeno.
59
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