QUANTA LiteTM dsDNA

QUANTA LiteTM Thyroid T ELISA
708595
Para Diagnóstico In Vitro
Aplicación
QUANTA LiteTM Thyroid T es un ensayo basado en la técnica ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent
Assay) para la detección semi cuantitativa de anticuerpos anti-tiroglobulina en suero humano. La presencia
de anticuerpos antígeno tiroglobulina humano puede ser utilizada en conjunción con hallazgos clínicos y
otras pruebas de laboratorio como ayuda en el diagnóstico de la Tiroiditis de Hashimoto.
Sumario y Explicación de la prueba
Los anticuerpos antitiroides existentes en la sangre están implicados en la mayor parte de los casos en la
etiología de enfermedades autoinmunes de la tiroides y tanto los anticuerpos antitiroglobulina como los
antimicrosomales se prueban rutinariamente en la práctica clínica.1,2 Los autoanticuerpos del suero para
antígenos microsomales tiroideos se detectan normalmente en pacientes con enfermedades autoinmunes
de la tiroides y su presencia guarda relación con los cambios histológicos de la tiroiditis de Hashimoto.3 Los
anticuerpos de antígenos microsomales tiroideos son positivos en el 70-90% de los pacientes con tiroiditis
crónica. Dichos anticuerpos se detectan también en el 64% de los pacientes con hipotiroidismo primario, en
el 50% de los pacientes con tirotoxicosis, en el 10% con bocio simple y en el 17% con tumores tiroideos.4
Los autoanticuerpos antitiroglobulina se detectan en pacientes con una alta cantidad de anticuerpos,
principalmente en las enfermedades de tiroiditis autoinmune y de Graves. Los autoanticuerpos del suero
antitiroglobulina/coloide se han encontrado en el 40-70% de los pacientes con tiroiditis crónica y en
porcentajes menores de pacientes con tirotoxicosis o bocio no tóxico.5,6
Hasta hace poco, los autoanticuerpos antitiroides se han investigado por medio de reacciones de
precipitación,7 fijación de látex 8, hemaglutinación9 e inmunofluorescencia.10,11 Recientemente, sin embargo,
se han desarrollado nuevas técnicas ELISA.12-14 Dichos procedimientos ELISA han resultado ser más
sensibles que cualquier proceso de hemaglutinación o inmunofluorescencia12,14 y, al mismo tiempo, ofrecen
resultados más objetivos y no sujetos a interferencias por factores de inhibición de la aglutinación 15 o
anticuerpos heterófilos.
La técnica ELISA empleada en este test es sensible, específica y objetiva. Resulta útil para analizar tanto
grandes como pequeñas cantidades de muestras.
Procedimiento de trabajo
Los pocillos de la microplaca contienen antígeno tiroglobulina humano purificado que se ha unido en
condiciones que mantienen su estado nativo. Se añaden controles y muestras convenientemente diluidas en
pocillos separados, uniéndose durante la incubación los anticuerpos anti Tiroides T al antígeno que los
recubre. El resto de componentes no unidos se elimina mediante lavado y se añade conjugado anti IgG
humana a cada pocillo. Un segundo paso de incubación permite que el conjugado se una a los anticuerpos
presentes. Tras un lavado que elimina el conjugado sobrante, se añade un sustrato cromogénico y tras
incubación la actividad enzimática presente en el pocillo es proporcional a la intensidad de color
desarrollado. El ensayo puede ser evaluado fotométricamente comparando la intensidad de color en las
muestras con la de los controles.
Reactivos
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
Microplaca ELISA de poliestireno con pocillos recubiertos con antígeno tiroglobulina purificado (12-1
x 8 pocillos), envasada en su soporte en una bolsa de aluminio con desecante
Control negativo ELISA, 1 frasco de tampón conteniendo conservante y suero humano ausente de
anticuerpos humanos anti tiroglobulina, prediluido, 1.2 ml
Control ELISA Tiroides T Positivo Débil, 1 frasco de tampón conteniendo conservante y suero
humano con anticuerpos anti tiroglobulina, prediluido, 1.2 ml
Control ELISA Tiroides T Positivo Fuerte (Calibrador A), 1 frasco de tampón conteniendo
conservante y suero humano con anticuerpos anti tiroglobulina, prediluido, 1.2 ml
Control ELISA Tiroides T Calibrador B, 1 frasco de tampón conteniendo conservante y suero
humano con anticuerpos anti tiroglobulina, prediluido, 1.2 ml
Control ELISA Tiroides T Calibrador C, 1 frasco de tampón conteniendo conservante y suero
humano con anticuerpos anti tiroglobulina, prediluido, 1.2 ml
Control ELISA Tiroides T Calibrador D, 1 frasco de tampón conteniendo conservante y suero
humano con anticuerpos anti tiroglobulina, prediluido, 1.2 ml
Control ELISA Tiroides T Calibrador E, 1 frasco de tampón conteniendo conservante y suero
humano con anticuerpos anti tiroglobulina, prediluido, 1.2 ml
Diluyente de Muestra HRP, 1 frasco color rosado conteniendo tampón con Tris, Tween 20 y
conservante, 50 ml
Solución de Lavado Concentrada HRP, 1 frasco de concentrado 40x color rojo conteniendo tampón
con Tris y Tween 20, 25ml. Referirse a la Sección “Metodología” para instrucciones de dilución.
Conjugado HRP IgG, con anti- IgG humana de cabra, 1 frasco - color azul conteniendo tampón,
estabilizante de proteína y conservante, 10ml
Cromógeno TMB, 1 frasco conteniendo estabilizantes, 10ml
Solución de Parada HRP, Acido Sulfúrico 0.344 M, 1 frasco, incolora, 10 ml
1
Advertencias
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Aviso: Este producto contiene cloramfenicol al 0.02% en el Diluyente de muestras, controles y
conjugado considerado en el estado de California como causante de cáncer.
Todo material de origen humano usado en la preparación de los controles para este producto se ha
examinado resultando negativo para anticuerpos contra HIV, HBsAg, y HCV por métodos aprobados
por la FDA. Ningún método puede sin embargo ofrecer garantía completa que HIV, HBV, HCV o
otros agentes contagiosos estén ausentes. Por lo tanto, los controles Tiroides T ELISA positivo
fuerte, Tiroides T ELISA positivo débil, Tiroides T ELISA Calibradores y ELISA negativo deben
manejarse como si fueran material potencialmente contagioso.16
Dado que se utiliza azida sódica como conservante, este producto puede ser tóxico por ingestión o
absorción a través de piel o mucosas. La azida sódica puede reaccionar con el plomo o cobre de las
tuberías para formar azidas metálicas potencialmente explosivas. Si se utilizan desagües para la
eliminación de reactivos se recomienda lavarlos con abundante agua para prevenir la formación de
dichas azidas metálicas.
El Conjugado HRP contiene diluido un producto químico venenoso y corrosivo que puede ser tóxico
si se ingiere. Para impedir quemaduras, evitar el contacto con piel o ojos.
El Cromógeno TMB contiene un irritante. Puede ser dañino si es inhalado, ingerido o absorbido por
la piel. Evitar la inhalación, ingestión o contacto con piel y ojos.
La Solución de parada HRP consiste de una solución diluida de ácido sulfúrico. Evitar exposición a
bases, metales, u otros compuestos que puedan reaccionar con ácidos. El ácido Sulfúrico es
venenoso y corrosivo, puede ser tóxico si ingerido. Para impedir quemaduras, evitar contacto con
piel y ojos.
Se recomienda utilizar el equipo protector apropiado al trabajar con este kit.
Los reactivos derramados deben limpiarse inmediatamente. Siga las normas aplicables en su
laboratorio acerca de la eliminación de residuos.
Precauciones
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Este producto es para ser usado en el Diagnóstico In Vitro.
La sustitución de componentes diferentes de los incluidos en el sistema puede generar resultados
inconsistentes.
Un lavado incompleto o ineficiente y una eliminación insuficiente de líquido de los pocillos puede dar
lugar a una pérdida de precisión y/o un fondo elevado.
La adaptación de este ensayo para su uso en procesadores automáticos u otros dispositivos,
totalmente o en parte, puede producir diferencias en los resultados en comparación con el
procedimiento manual. Es responsabilidad de cada laboratorio de validar sus procedimiento
automatizado y comprobar que produce resultados dentro de los límites aceptables.
Existe una variedad de factores que influyen en la realización del ensayo. Esto incluye la
temperatura inicial de los reactivos, la temperatura ambiente, la exactitud y reproducibilidad de
técnica de pipeteo, la calidad de la técnica de lavando, el fotómetro que se utiliza para medir los
resultados, y los tiempos de incubación durante el ensayo. Es necesario un exquisito cuidado y un
trabajo consistente para obtener resultados exactos y reproducibles.
Se recomienda seguir estrictamente el protocolo.
El sellado incompleto de la bolsa “zip-lock” que contenga tiras sin usar y desecante provocará la
degradación del antígeno que se apreciará en un empeoramiento de la precisión de resultados.
Pueden observarse absorbancias inaceptablemente bajas tras dos o más usos separados de un
conjugado HRP. Es importante seguir todas las recomendaciones de manipulación específicas para
este producto para evitar que esto ocurra.
La contaminación química del conjugado HRP puede ocurrir como resultado de una limpieza o
secado inadecuados del equipo o instrumentos. Residuos de productos químicos comunes en el
laboratorio como formalina, lejía, etanol, o detergente causan la degradación del conjugado HRP con
el tiempo. Enjuague bien todo equipo o instrumentos después de usar dichos productos.
Condiciones de Almacenaje
1.
2.
3.
Guardar todos los reactivos del kit en nevera a 2-8°C. No congelar. Los reactivos son estables hasta
la fecha de caducidad si son almacenados y manipulados correctamente.
Las tiras sin utilizar deben volverse a guardar en la bolsa de aluminio que contiene desecantes
cerrándola herméticamente y almacenándola a 2-8ºC.
La solución de lavado diluida es estable 1 semana a 2-8°C.
Recolección de Muestras
Este kit requiere suero como muestra. La adición de azida u otros conservantes a las muestras puede
afectar adversamente los resultados. No deben utilizarse muestras contaminadas, tratadas por calor o que
contengan partículas visibles. Deben asimismo evitarse las muestras lipémicas o hemolizadas.
Tras la recolección de las muestras de sangre, el suero debe ser separado del coágulo. El documento
NCCLS H18-A2 recomienda las siguientes condiciones de almacenaje para muestras: 1) Guardar las
muestras a temperatura ambiente no más de 8 horas. 2) Si el ensayo no se va completar en 8 horas,
refrigerar la muestra a 2-8°C. 3) Si el ensayo no se va completar entre 48 horas, o para enviar las muestras,
congelar a -20°C o a temperatura inferior. Una vez descongeladas las muestras deben agitarse bien antes
de utilizarse.
2
Procedimiento
Materiales Suministrados
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Microplaca Tiroides T ELISA (12-1 x 8 pocillos), con soporte
1.2 ml control prediluido ELISA negativo
1.2ml control prediluido Tiroides T ELISA Positivo Débil
1.2ml control prediluido Tiroides T ELISA Positivo Fuerte (Calibrador A)
1.2ml control prediluido Tiroides T ELISA Calibrador B
1.2ml control prediluido Tiroides T ELISA Calibrador C
1.2ml control prediluido Tiroides T ELISA Calibrador D
1.2ml control prediluido Tiroides T ELISA Calibrador E
50ml Diluyente de muestra HRP
25ml Solución de lavado concentrada 40X
10ml Conjugado IgG (cabra) anti IgG humana
10ml Cromógeno TMB
10ml Solución parada HRP (Ácido Sulfúrico 0.344M)
Material necesario no incluido
Micropipetas para 5, 100, 200-300 y 500µl
Puntas desechables para micropipeta
Tubos para dilución de muestras, 4ml
Agua destilada
Recipiente de 1L para la solución de lavado reconstituida
Lector de microplacas capaz de medir densidades ópticas a 450nm (y a 620nm para lecturas de doble
longitud de onda)
Metodología
Antes de empezar
1.
2.
3.
4.
5.
Llevar todos reactivos y muestras a la temperatura ambiente (20-26°C) y agitar.
Diluir la solución de lavado HRP 1:40 añadiendo el contenido del envase con concentrado a 975 ml
de agua destilada. Si no va a utilizar toda la placa, puede preparar una cantidad menor de solución
de lavado añadiendo 2.0 ml del concentrado a 78ml de agua destilada para cada 16 pocillos que
vayan a utilizarse. El tampón diluido es estable 1 semana a 2-8°C.
Preparar una dilución 1:101 de cada muestra a procesar añadiendo 5 µl de muestra a 500 µl de
diluyente. Las muestras diluidas deben ser utilizadas dentro de las 8 horas de su preparación. NO
DILUIR los controles Tiroides T ELISA positivo débil, positivo fuerte, Calibradores y ELISA negativo.
La determinación de la presencia o ausencia de anticuerpos anti Tiroides T usando unidades
arbitrarias requiere dos pocillos para cada uno de los tres controles y uno o dos pocillos para cada
muestra. Se recomienda que las muestras se hagan por duplicado.
Si lo desea, los resultados pueden semicuantificarse en unidades de la OMS. Para una curva
estándar de 5 puntos, utilice un control prediluido Tiroides ELISA positivo fuerte (Calibrador A) y
Calibradores B a E directamente desde el vial. La curva estándar de cinco puntos tiene los
siguientes valores:
Punto
Unidades de la OMS para la Tiroides T
A
Prediluido Tiroides T ELISA Positivo Fuerte (Calibrador A))
1000.0
B
Prediluido Tiroides T ELISA Calibrador B
500.0
C
Prediluido Tiroides T ELISA Calibrador C
250.0
D
Prediluido Tiroides T ELISA Calibrador D
125.0
E
Prediluido Tiroides T ELISA Calibrador E
62.5
Procedimiento de Ensayo
1.
2.
3.
4.
TODOS REACTIVOS DEBEN ESTAR A TEMPERATURA AMBIENTE (20-26°C) ANTES DE
EMPEZAR EL ENSAYO. Ponga el número necesario de tiras en el soporte. Devolver
inmediatamente las tiras sin utilizar a la bolsa de aluminio y sellarla firmemente para
minimizar la exposición a la humedad.
Agregar 100µl de los controles prediluidos Tiroides T ELISA Positivo Débil, Tiroides T ELISA
Positivo Fuerte, Tiroides T ELISA Calibradores B a E si lo desea, ELISA Negativo y las muestras
prediluidas a los pocillos. Cubrir los pocillos e incubar 30 minutos a temperatura ambiente en una
superficie plana. El tiempo de incubación empieza después de la adición de la última muestra.
Lavado: Aspirar el contenido de cada pocillo. Agregar 200-300µl de solución de lavado a todos
pocillos y aspirar. Repetir esta secuencia dos veces más para un total de tres lavados. Invertir la
placa y golpearla suavemente en material absorbente para eliminar cualquier fluido residual tras el
último lavado. Es importante que cada pocillo esté completamente vacío después de cada paso de
lavado. Mantener la misma secuencia para la aspiración que la usada para la adición de muestras.
Agregar 100µl de Conjugado IgG HRP a cada pocillo. El conjugado debe pipetearse en las
condiciones más asépticas posibles y siguiendo buenas técnicas de laboratorio. Aspirar solamente la
cantidad de conjugado necesaria para el ensayo. PARA EVITAR CUALQUIER CONTAMINACIÓN
POTENCIAL MICROBIANA Y/O QUÍMICA, NUNCA DEVOLVER EL CONJUGADO SIN USAR A
SU RECIPIENTE ORIGINAL. Incubar los pocillos 30 minutos como en el paso 2.
3
5.
6.
7.
8.
Lavado: Repetir el paso 3.
Agregar 100µl de Cromógeno TMB a cada pocillo e incubar 30 minutos en oscuridad a temperatura
ambiente.
Agregar 100µl de Solución de parada a cada pocillo. Mantener la misma secuencia y
temporalización que la efectuada en la adición de Cromógeno. Agitar suavemente la placa para
mezclar bien los pocillos.
Leer la absorbancia (DO) de cada pocillo a 450nm en un plazo máximo de una hora. Si se desea
seguir el método de lectura bicromática puede utilizarse 620 nm como longitud de onda de
referencia.
Control de Calidad
1.
2.
3.
4.
Los controles Tiroides T ELISA Positivo Débil, Tiroides T ELISA Positivo Fuerte y Control Negativo
ELISA deben procesarse con cada lote de muestras para asegurar que todos reactivos y
procedimientos funcionan correctamente.
El usuario debe notar que debido a que los controles Tiroides T ELISA Positivo Débil, Tiroides T
ELISA Positivo Fuerte y ELISA Negativo son prediluidos, no controlan procedimientos asociados con
dilución de especímenes.
Pueden añadirse controles adicionales según las directivas o requisitos del laboratorio. Pueden
prepararse controles válidos haciendo alícuotas de un “pool” de suero humano que debe
almacenarse a < -20°C.
Para considerar válidos los resultados deben considerarse satisfechos todos los criterios
especificados a continuación, si alguno de ellos no se cumple la prueba debe considerarse inválida y
repetirse.
a.
La absorbancia del control Tiroides T Positivo debe ser superior a la del control Tiroides T
positivo débil y la de este debe ser superior a la del control negativo.
b.
El control Tiroides T positivo fuerte debe tener una absorbancia mayor que 0.8 mientras que
la del control negativo no debe exceder de 0.2.
c.
La absorbancia del control Tiroides T positivo débil debe ser superior al doble del control
negativo, u oscilar entre 0.25.
d.
Los controles ELISA negativo y Tiroides T positivo fuerte están pensados para monitorizar
problemas de reactivo de magnitud substancial. El control Tiroides T positivo fuerte no puede
asegurar precisión alguna en el punto de corte del ensayo.
e.
El usuario puede referirse al documento NCCLS (National Committee of Clinical Laboratory
Standards) C24-A para una guía adicional acerca de buenas prácticas de laboratorio.
Cálculo de Resultados
Debe determinarse en primer lugar el promedio de densidades ópticas de cada juego de duplicados. La
reactividad para cada muestra se calcula dividiendo la densidad óptica promedio de la muestra por la
densidad óptica promedio del control Tiroides T positivo débil.
DO Muestra
Valor de la Muestra = —————————————————— x Valor ELISA Positivo Débil
(unidades)
DO ELISA Positivo Débil
(unidades)
La reactividad de la muestra está relacionada de manera no lineal con la cantidad de anticuerpo presente.
Mientras que los aumentos y disminuciones en la concentración de anticuerpos del paciente se reflejarán en
el aumento o disminución correspondiente de la reactividad, los cambios no son proporcionales (por
ejemplo, al doblarse la concentración de anticuerpo no se dobla la reactividad). Si se deseara una
cuantificación más precisa de la cantidad de anticuerpo, puede informarse como el título de anticuerpo de la
muestra la última dilución positiva de una serie de diluciones seriadas de la muestra.
Para expresar los resultados semicuantitativos en unidades de la OMS, utilice papel de gráficos log-log
y introduzca las unidades de cada punto de la curva estándar (A-E) comparadas con la densidad óptica
media. Trace la curva que mejor que ajuste a los puntos. Para obtener las unidades de la OMS del paciente,
lea la densidad óptica media del paciente fuera de la curva. Como alternativa, puede usarse cualquier
programa de reducción de datos lineales registrados en el laboratorio.
Interpretación de los Resultados
La técnica ELISA es muy sensible y es capaz de detectar pequeñas diferencias entre poblaciones de
pacientes. Los valores presentados a continuación son sólo valores sugeridos. Cada laboratorio debe
establecer su propio rango normal basado en su propia metodología, controles, equipo y población de
pacientes.
La muestra puede clasificarse con un valor negativo, positivo débil, positivo moderado o positivo fuerte
según la tabla siguiente.
Unidades
Negativo
<0.6
Positivo Débil
0.6 – 1.0
Positivo, de Moderado
a Fuerte
>1.0
Cada laboratorio debe definir sus propios rangos de positividad si utiliza unidades WHO
4
1.
2.
3.
Un resultado positivo indica la presencia de anticuerpos anti-tiroglobulina y sugiere la posibilidad de
Tiroiditis de Hashimoto.
Un resultado negativo indica la ausencia de anticuerpos anti-tiroglobulina o niveles inferiores al
punto de corte del ensayo.
Se sugiere que los resultados informados por el laboratorio incluyan la afirmación “Los siguientes
resultados se obtuvieron con el kit INOVA QUANTA LiteTM Thyroid T ELISA. Los valores obtenidos
con kits de diferentes fabricantes pueden variar y no pueden intercambiarse entre ellos. La magnitud
de los niveles informados de IgG no puede correlacionarse con un punto final”.
Limitaciones del Procedimiento
1.
2.
3.
4.
La presencia de inmunocomplejos u otros agregados de inmunoglobulinas en la muestra del
paciente puede producir un aumento de uniones inespecíficas y causar falsos positivos en este
ensayo.
No todos los pacientes con Tiroiditis de Hashimoto son tiroglobulina positivos.
Los resultados de este ensayo deben utilizarse conjuntamente con hallazgos clínicos y otras
pruebas serológicas.
La funcionalidad del ensayo no ha sido establecida para matrices diferentes del suero.
Valores Esperados
La capacidad del kit QUANTA LiteTM Thyroid T ELISA para detectar anticuerpos anti Tiroides T fue evaluada
en comparación con un test de hemaglutinación disponible en el mercado. Los resultados del test de
hemaglutinación se determinaron de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
Rango Normal
Ciento una muestras fueron seleccionadas aleatoriamente y probadas con el ensayo Tiroides T ELISA. La
media de la población fue de 0.186 unidades con una desviación estándar de 0.087 unidades. El rango fue
de 0.12 a 0.79 unidades. Esta prueba indica que la media de la población normal está 4.8 desviaciones
estándar del punto de corte.
Sensibilidad y Especificidad Relativas
Para determinar la sensibilidad y especificidad del ensayo, se sometieron a test 50 muestras que debían
pasar una prueba de tiroides mediante los métodos de hemaglutinación y ELISA. De las 50 muestras, 30
dieron positivo y 18 negativo con ambos métodos. Una muestra dio positivo con el método de
hemaglutinación y negativo con el método ELISA. La muestra restante dio positivo con el método ELISA y
negativo con el ensayo de hemaglutinación. Los resultados del ensayo ELISA para Tiroides T se resumen
en la tabla siguiente.
+
INOVA
+
30
1
Sensibilidad relativa
Especificidad relativa
Eficiencia relativa
HA
-
1
18
96.8%
94.7%
96.0%
Precisión y Reproducibilidad
La precisión y reproducibilidad del ensayo se midió mediante seis replicados de muestras fuertemente
positivas, moderadamente positivas y negativas en cuatro ensayos separados. La reactividad media de los
positivos fuertes fue de 4.58 unidades, de los positivos moderados 1.90 y de los negativos fue de 0.197. La
desviación estándar (DE) y el coeficiente de variación (CV) para cada muestra se resume a continuación.
Global
Intra ensayo
Inter ensayo
Negativo
DE
0.018
0.015
0.014
Positivo Fuerte
DE
CV
0.257
5.6%
0.069
1.5%
0.284
6.2%
CV
8.9%
7.4%
7.3%
5
Positivo Moderado
DE
CV
0.104
5.7%
0.048
2.5%
0.114
6.0%
Referencias
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
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Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National
Institute of Health, 2007, Fifth Edition
Fabricante:
INOVA Diagnostics, Inc.
9900 Old Grove Road
San Diego, CA 92131
United States of America
Representante Autorizado:
Medical Technology Promedt Consulting GmbH
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July 2009
Revision 13
6