(Dsh) de Tukey

EFECTIVIDAD DEL PROPRANOLOL EN COMPARACION CON EL
RANIBIZUMAB EN LA INHIBICION DE LA NEOVASCULARIZACION DEL
POLO POSTERIOR INDUCIDA EN CONEJOS”.
ABSTRACT
OBJETIVO: Evaluar el efecto del Propranolol intravitreo sobre la
neovascularización de segmento posterior inducida en conejos y compararlos con
los efectos del Ranibizumab
TIPO DE ESTUDIO: Experimental, longitudinal, comparativo, prospectivo
MATERIAL Y METODO: Administración de Propranolol intravitreo y Ranibizumab
intravitreo a modelos
experimentales de neovascularización mediante la
aplicación de fotocoagulación, a quienes se les determino la expresión de factor
de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y se evaluó la mejoría clínica mediante
seguimiento con fluorangiografias.
RESULTADOS: Al realizar PCR-TR se observó disminución en la expresión del
gen VEGF en el grupo tratado con Lucentis en comparación con el grupo con
Lasser y con el grupo tratado con Propranolol, Con diferencias estadísticamente
significativas entre cada una de las medias (ANOVA F 4988.57 P< 0.05), y al
aplicar Prueba de Diferencia Significativa Honesta (DSH) de Tukey Se observó
que solo entre el grupo Lasser y Propranolol, no existe una diferencia significativa.
DSH < 7.11. Clínicamente al evaluar los resultados de las fluorangiografias
expresados en porcentajes antes y después de tratamiento en el grupo Lucentis
existe disminución de la NV (X2 = 21.78 1 Gl p<0.005), En el grupo Propranolol
existe disminución NV (X2 = 22.98 1 Gl p<0.05)
CONCLUSIONES: Durante el presente estudio mediante las valoraciones y
seguimiento con estudios de fluorangiografia, el Ranibizumab tuvo mejor
respuesta clínica en comparación con el clorhidrato de Propranolol para la
reducción de la neovascularización inducida con laser. En el presente estudio se
demostró que el Clorhidrato de Propranolol administrado intravitreo en esta dosis
no tuvo los resultados esperados en la reducción del VEGF.
PROPRANOLOL EFFECTIVENESS IN COMPARISON WITH RANIBIZUMAB IN
INHIBITING POSTERIOR POLE NEOVASCULARIZATION INDUCED IN RABBITS
A B S T R A C T.
OBJECTIVE: Evaluate the effect of intravitreal Propranolol on the posterior
segment neovascularization induced in rabbits and compared with the effects of
Ranibizumab
TYPE OF STUDY: Experimental, longitudinal, comparative, prospective
MATERIALS AND METHOD: Intravitreal administration of Propranolol and
Ranibizumab intravitreal neovascularization in experimental models by applying
photocoagulation, who have determined the expression of vascular endothelial
growth factor (VEGF) and clinical improvement was evaluated by monitoring with
fluorangiography
RESULTS: When performing RT-PCR was a reduction in VEGF gene expression
in the Lucentis-treated group compared with the group with Lasser and
Propranolol-treated group, with statistically significant differences between each of
the means (ANOVA F P 4988.57 <0.05), and applying Honest significant
Difference test (HSD) of Tukey was observed only between the group and
Propranolol Lasser, there is no significant difference. DSH <7.11. Clinically to
assess the results expressed as percentages fluorangiography before and after
treatment in the reduction of Lucentis there NV (X2 = 21.78 1 df p <0.005), exists in
the Propranolol group decreased NV (X2 = 22.98 1 df p <0.05).
CONCLUSIONS: In the present study by the assessments and follow-up studies
fluorangiography, Ranibizumab had better clinical response compared with
Propranolol hydrochloride for reduction of laser-induced neovascularization. In the
present study showed that intravitreal administered Propranolol Hydrochloride in
this dose did not have the expected results in the reduction of VEGF
INTRODUCCION.
La neovascularización (NV) es la formación de nuevas estructuras
vasculares en áreas que fueron previamente avasculares1,2.
El Clorhidrato de Propranolol (ClPr) es un agente bloqueante β-adrenérgico
no
selectivo,
utilizado
en
el
tratamiento
cardiovasculares. existen estudios
de
las
enfermedades
en donde el uso de propanolol vía
sistémica inhibe crecimiento y causa regresión de hemangiomas laríngeos
y orbitarios solitarios, sin ningún efecto adverso importante 4,5
se han utilizado beta bloqueadores
vía tópica
Así mismo
como alternativa
de
tratamiento en otras patologías vasculares como los hemangiomas
capilares en lugar de corticoesteroides, demostrando ser seguro y eficaz
para el tratamiento de los mismos6
Existen evidencias de que el sistema adrenérgico está involucrado en la
regulación de la hipoxia inducida por neovascularización y producción de
Factor
de
Crecimiento
Endotelial
Vascular
(VEGF)17.
En
corazón
embrionario la hipoxia causa sobrestimulación catecolaminergica , que a su
vez altera la señalización de las vías de los beta adrenérgicos, además de
que la norepinefrina estimula la producción de VEGF en células endoteliales
en venas umbilicales humanas21
A partir
del 2005 estudios clínicos establecieron la efectividad de
Ranibizumab (Lucentis, Genentech), para el tratamiento de la degeneración
macular relacionada con la edad variedad húmeda, la principal causa de
ceguera legal en los Estados Unidos15, La FDA aprobó su utilización a
partir de junio del 2006, para la mejora y mantenimiento de la agudeza
visual, así como para reducción de las enfermedades vasculares, fuga y
edema de la retina16
En el presente estudio se evaluó el efecto del Propranolol intravitreo sobre
la neovascularización de segmento posterior inducida en conejos y se
comparo con los efectos del Ranibizumab, mediante la evolución clínica
por fluorangiografias y determinación de la expresión del VEGF.
MATERIAL Y METODOS
Ranibizumab en solución inyectable (nombre comercial Lucentis de
laboratorios Novartis), Clorhidrato de D-L propranolol marca Sigma con
peso molecular 295.8 libre se preservantes, Solución salina balanceada,
Bascula analítica marca Sartorius Modelo
Gilson de
TE 64, Micropipetas marca
volumen variable, Xilazina (Procin, PISA Laboratorios)
presentación de 20mg/ml, Ketamina (Anesket, Cheminova Laboratorios)
presentación de 1gr/10ml, Tetracaína solución oftálmica (Ponti Laboratorios
Sofia), Tropicamida Fenilefrina colirio oftálmico (T-P Laboratorios Sofía),
Tobramicina Dexametasona coliro oftálmico(Trazidex Laboratorios Sofía),
24 Tubos de Eppendorf de 1500 microlitros. Trizol marca Invitrogen,
Iniciadores (primers) para amplificar el gen VEGF de conejo, Gel del
agarosa (Sigma), GADPh (Gliceraldehido-3 fosfato deshidrogenasa),
Bromuro
de
Etidio,
Espectrofotómetro
Taq
polimerasa
recombinante
(Invitrogen),
(Genequant Pro, Amersham), Termociclador (Perkin
Elmer Gene Amp. PCR System 9700), Transiluminador de luz UV (LKB
20011 Macrovue), Cámara de electroforesis horizontal modelo Horizon 58
(Gibco BRL Life Technologies), Sistema de visualización digital Ret cam 3
Laser portátil diodo marca Iridex, Lupa de 28 Dp
Se incluyeron
24 ojos de 12 conejos machos
de acuerdo con la
declaración para el uso de animales en investigación oftalmológica y visual
de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (siglas en
ingles ARVO), con un peso aproximado de 2.5–3kg , Se conformaron
cuatro grupos con los doce conejos: Grupo 1. Constituido por 6 ojos
izquierdos de 6 conejos (numerados del 1 al 6), a los cuales se les inducirá
NV, y se aplica tratamiento
con inyección de Ranibizumab intravitreo.
Grupo 2. Constituido por 6 ojos derechos de 6 conejos (numerados de 4 al
9), a los cuales se les inducirá NV. Y se aplica tratamiento con inyección de
Clorhidrato de Propanolol intravitreo. Grupo 3. Constituido por 6 ojos; 3 ojos
izquierdos de los 3 conejos (numerados del 7 al 9), 3 ojos derechos de
los 3 conejos (numerados del 1 al 3) a los cuales se les inducirá NV, y no
se les aplicara el tratamiento. Grupo 4. Constituido por 6 ojos de 3 conejos
(numerados del 10 al 12), los cuales son ojos sanos y no se les realizara
ningún procedimiento.
INDUCCIÓN DE ANESTESIA GENERAL
Para la Inducción de la Anestesia General se utilizo Xilazina (Procin, PISA
Laboratorios) a dosis de 0.5 ml/Kg de peso vía intramuscular (IM), de la
presentación de 20mg/ml, y Ketamina (Anesket, Cheminova Laboratorios) a
dosis de 0.25 ml/Kg de peso vía IM, de la presentación de 1gr/10ml. así
mismo se aplico una gota de tetracaína tópica al 0.5% en el ojo 1 minuto
antes de la aplicación de la fotocoagulación, todo lo anterior se realizo
previo ayuno de 8 hrs antes de la anestesia, y bajo monitoreo por parte de
un veterinario
INDUCCIÓN DE LA NEOVASCULARIZACIÓN
La inducción de la NV se llevo a cabo en base a una modificación del
modelo experimental de Viridi and Hayreh; Bajo anestesia general se
procedió a realizar
dilatación pupilar mediante la instilación tópica de 3
dosis de Tropicamida Fenilefrina colirio oftálmico cada 15 minutos, hasta
lograr midriasis total a todos los animales en estudio. Por oftalmoscopia
indirecta con lupa de 28 dioptrías se realizo fotocoagulación de las 4
venas de la retina, generando oclusión de dichos vasos, utilizando 5 a 7
disparos con laser de diodo con una potencia de 150 a 200 mW, con una
tamaño de 500µm por 0.3 a 0.5 segundos cerca de la papila, directamente
sobre los vasos sanguíneos, y posterior al procedimiento se
antibiótico en colirio oftálmico.
aplico
REALIZACIÓN DE FLUORANGIOGRAFIAS.
Bajo anestesia general se realizo angiografía fluoresceína con el sistema
de visualización digital Ret cam 3 a los 21 días posterior a la aplicación de
la fotocoagulación, para establecer el grado de neovascularización que
desarrollaron los modelos animales, en base a un sistema de puntuación
de retinopatía publicado en protocolos de estudios experimentales
anteriores donde se evaluó de acuerdo a los meridianos afectados por la
presencia de neovasos, tortuosidad de los mismos
fuga y aumento de la
densidad de los vasos sanguíneos de la siguiente forma: Grado 0 :
Corresponde a que no se encuentran cambios anatómicos, Grado 1 o
leve: corresponde a presencia de neovasos, fuga de fluoresceína o
incremento del patrón vascular
corresponde
en < 3 meridianos, Grado 2 o moderado:
a fuga de fluoresceína, incremento del patrón vascular o
presencia de neovasos
en 3 a 6 meridianos, Grado 3 o severo:
corresponde a fuga de fluoresceína o incremento del patrón vascular en 6 a
8 meridianos, Grado 4 o muy severo: corresponde a fuga de fluoresceína o
incremento del patrón vascular o presencia de neovasos
en 9 a 12
meridianos.
GRADACIÓN DE LAS FOTOGRAFÍAS.
Las fotografías fueron graduadas por un observador enmascarado a los 21
días posteriores a la aplicación de la fotocoagulación para establecer el
grado de neovacularización en los modelos animales, de todos los grupos
en tratamiento
ADMINISTRACIÓN DE INTRAVITREOS.
Para la preparación de clorhidrato de D-L propanolol, se utilizo D-L
Clorhidrato de Propranolol marca Sigma con un peso molecular 295.8,
libre de conservadores
el cual se diluyo en solución salina balanceada,
hasta obtener una concentración final de 3 x10 -5 molar, y se almacenaron a
-70°C en el laboratorio de Biología Molecular de la EMGS hasta su
utilización. Bajo anestesia general se administró Ranibizumab intravitreo a
los 21 días de la inducción de la neovascularización a los 6 ojos izquierdos
de 6 conejos (numerados del 1 al 6) del grupo 1 a una dosis de 0.1 mg en
0.01 ml a 1 mm del limbo esclerocorneal con una jeringa de insulina y una
aguja calibre 27 Gauge previa anestesia tópica con tetracaina solución
oftálmica y posterior al procedimiento se aplicó antibiótico oftálmico. Bajo
anestesia general se administró Clorhidrato de Propranolol intravitreo a los
21 días de la inducción de la neovascularización a los 6 ojos derechos de 6
conejos (numerados de 4 al 9),
del grupo 2,
a una dosis con una
concentración 30 µM en 0.01 ml, a 1 mm del limbo esclerocorneal con una
jeringa de insulina y una aguja calibre 27 Gauge previa aplicación de
anestesia tópica
con tetracaina solución oftálmica y posterior al
procedimiento se aplico antibiótico oftálmico.
Se realizo angiografía fluoresceína y seguimiento con fotografías digitales
con el sistema de visualización digital Ret Cam 3, a las 72 horas y 7 días
después de la aplicación de los medicamentos intravitreos de cada uno de
los modelos animales, para establecer el grado de reducción de
neovascularización, de acuerdo a las escalas mencionadas anteriormente
PREPARACIÓN DE TUBOS DE EPPENDORF.
Tubos de Eppendorf de 1500 microlitros rotulados cada uno, un total de 24
tubos, 6 tubos para las muestras de tejido retino coroideo de ojos izquierdos
de los conejos del grupo 1, 6 tubos para las muestras de tejido retino
coroideo de ojos derechos de los conejos del grupo 2, 6 tubos mas para la
muestras de tejido de ojos derechos e izquierdos de los conejos del grupo
3 y 6 tubos mas para las muestras de tejido retino coroideo de los ojos
derechos e izquierdos de los conejos del grupo 4, todo lo anterior se realizo
previo al sacrificio de los conejos.
SACRIFICIO DE LOS CONEJOS Y OBTENCION DE MUESTRAS
A los 7 días de la aplicación de medicamentos intravitreos y posterior a la
realización de los estudios de fluorangiografia. Bajo anestesia general se
procedió a realizar el sacrificio de todos los conejos mediante dosis letal de
Xilazina y Ketamina, (consistente en el doble de la dosis habitual para
anestesia general de ambos medicamentos). Se realizo enucleación de
globo ocular mediante la disección 360° de conjuntiva a 3mm de limbo,
tomando
músculos extraoculares y realizando corte de los mismos,
introduciendo tijera Wescott en la parte posterior del globo ocular para
realizar corte de nervio óptico y extraer globo ocular. Posterior a la
enucleación, se
realizó corte a aproximadamente 3mm de nervio óptico
obteniendo muestras de tejido retino-coroideo de 3mm aproximadamente
de los 24 conejos, con la finalidad de colectarlos dentro del tubo de Trizol.
Se procedió a llevar dichas muestras en nevera hacia el laboratorio de
Biología Molecular de la EMGS para su congelación, procedimientos
necesarios para su análisis por RT-PCR; El resto del globo ocular
se
colocó en frascos con formol rotulados del 1 al 24 para posteriormente
realizar cortes histológicos. Las muestras obtenidas de los 4 grupos de
conejos fueron
colectadas en tubos Eppendorf de 1500 microlitros con
Trizol, y se almacenaron a -70°C hasta su procesamiento. Las muestras
fueron rotuladas con un número control y los datos de los 4 grupos de
conejos. La seguridad para el manejo de las muestras biológicas
potencialmente infectadas aplicable a todos los espacios físicos asignados
para la realización de actividades propias relacionadas con la investigación
se regula según las siguientes normas oficiales
NOM-166-SSA-1997,
NOM-017-STPS-1993, NOM-087-ECOL-1995, NOM-056-SSA1-199.
DETERMINACION DE PCR-TR
EXTRACCIÓN DE RNA. Se utilizo 1 ml de trizol marca invitrogen,
incubando 5 minutos a 30°C, adicionando 200 μl de cloroformo al Trizol,
mezclando vigorosamente 15 segundos e incubando durante 3 minutos
luego se centrifugo a 11000 revoluciones por minuto (RPM) durante 15
minutos a 4°C, recuperando la fase acuosa y adicionando a la misma 500
μl de Isopropanol, incubando 10 minutos a temperatura ambiente y
centrifugando a 12000 RPM por 10 minutos Se elimino sobrenadante y se
lavo el pellet con 1 ml de etanol al 75% Se centrifugo a 7500 RPM
durante 5 minutos, para posteriormente secar el pellet a
evaporación
temperatura ambiente y agregar 50 μl de agua.
OBTENCIÓN DE DNA COMPLEMENTARIO. Se realizó una trascripción
reversa por PCR para obtener el DNA complementario (cDNA), usando
10μg de RNA total y un Oligonucleótido. Se realizo el PCR cuantitativo
usando como templado el Cdna
DISEÑO DE INICIADORES. Mediante un diseño de un cebador forward y
un cebador reverse, se consigue la amplificación de un fragmento del gen
VEGF de conejo y el gen GADPh de conejo (Invitrogen TM Carsbad CA,
USA).
RT-PCR EN TIEMPO REAL BASADA EN SYBR GREEN. Se desarrolló un
RT-PCR en tiempo real en un paso basada en SYBR GREEN. Todas las
reacciones se llevaron a cabo en Stratagene MxPro 3000 usando el Master
Mix y las enzimas provistas por Stratagen. La titulación de los Primers se
realizó enfrentando concentraciones recíprocas de ambos (Forward y
Reverse) desde 4.13 nM a 1004 nM, eligiendo aquellos que aportan la
mayor sensibilidad y el mínimo dímero de primer. Para determinar la
temperatura de anillamiento óptima se hizo un RT-PCR de gradiente y se
eligió la mejor temperatura para la pareja de Primers. El proceso final se
llevo a cabo en un volumen final de 25 microlitros como se describe a
continuación: 2 microlitros de ARN inicial, 12.5 microlitros de Master Mix
SYBR Green (Quantitative RT-PCR Brilliant SYBR Green Master Mix,
®
Stratagene ), 0.0625 microlitros de StrataScript RT/Rnase Block Enzyme
®
Mixture (Stratagene ), 0.04mM de cada primer. El programa termociclador
fue: RT: 15 minutos a 42º C; PCR: 5 minutos a 99º C, 40x y al final, 5
minutos a 4º C. Se realizó al final una curva de disociación empezando a
70º C e incrementando 1º C cada 30 segundos hasta 99º C. Los Primers
utilizados para llevar a cabo la reacción fueron los siguientes: Gen VEGF
Sentido
5’TGGTGGACATCTTCCAGGAGT3’,
Antisentido
5’
GCTTTCATCATTGCAGCAGC3’. Gen GADPh Sentido
5´TGCCCTCAATGACCACTTTG3´,
Antisentido
5´CCTTGGAGGCCATGTGGAC3´.
CORTES HISTOLOGICOS CON HEMATOXILINA Y EOSINA
ANALISIS ESTADISTICO
El análisis estadístico se llevo a cabo mediante el programa STATS 2 TM
para
obtención y análisis de números aleatorios, el cual
consistió en
realizar análisis de varianza de las medias aritméticas obtenidas de cada
uno de los grupos de estudio y aplicación de la prueba de Diferencia
Significativa Honesta de Tukey para determinar si existen diferencias
estadísticamente significativas entre cada uno de los grupos , también se
utilizó la prueba de la Chi cuadrada para la comparación de los grupos con
respecto al grado de expresión del gen VEGF en los 4 grupos.
RESULTADOS
TABLA No. 1
EXPRESIÓN DEL FACTOR DE CRECIMIENTO ENDOTELIAL VASCULAR
POR GRUPO DE ESTUDIO
OJOS
LUCENTIS
1
29.165
2
28.958
3
29.075
4
28.761
5
28.935
6
29.123
MEDIA
29.003
DESVEST
0.149
ANOVA
F= 4988.57; p< 0.05
Nota: VGEF X 103
Fuente: Directa
GRUPO DE ESTUDIO
PROPRANOLOL
LASSER
81.012
84.125
79.151
83.952
77.161
83.752
81.613
84.347
79.160
83.975
81.170
84.747
79.878
84.150
1.696
0.353
SANOS
10.130
12.150
11.170
13.160
14.750
10.150
11.918
1.817
Tabla 1 : Expresion del VEGF en los cuatro grupos de estudio, se obtuvo las medias aritméticas de cada
uno de los grupos y se procedió a aplicar análisis de varianza, se encontró, que si existe una diferencia
estadísticamente significativa entre las medias (F= 4988.57; p< 0.05).
GRAFICA No. 1
PROMEDIO DE LA EXPRESIÓN DEL FACTOR DE CRECIMIENTO
ENDOTELIAL VASCULAR POR GRUPO DE ESTUDIO
SANOS
11.918
LASSER
84.15
PROPANOLOL
79.878
LUCENTIS
29.003
0
20
40
60
80
100
Factor de Crecimiento Endotelial
Nota: Factor del Crecimiento Endotelial X 103
Fuente: Tabla No. 1
F = 4988.57; p < 0.05
TABLA No 2
Prueba de Diferencia Significativa Honesta (Dsh) de Tukey
Tabla de diferencias
Sanos
Med. 4
Lasser
Med. 3
Propranolol
Med. 2
Lucentis
Med. 1
Sanos
Med. 4
-
Lasser
Med. 3
72.23
Propranolol
Med. 2
60.31
Lucentis
Med. 1
17.09
-
-
-
-
-
4.27
-
-
-
53.15
50.88
-
El método de ANOVA, mostró que si existe una diferencia estadísticamente significativa entre las medias de la
Expresión del factor de crecimiento endotelial (p < 0.05) y al aplicar la prueba de Diferencia Significativa
Honesta de Tukey, se observó que solo entre el grupo Lasser y Propranolol, no existe una diferencia
significativa.
rr
TABLA No. 3
EVOLUCIÓN CLINICA DE NEOVASOS MEDIANTE FLUORANGIOGRAFIAS
ANTES DE LA APLICACIÓN DEL TRATAMIENTO
GRUPO
EVOLUCION
LUCENTIS
PROPRANOLOL
LASSER
No.
%
No.
%
No.
%
LEVE
2
33
3
50
3
50
MODERADA
4
67
3
50
3
50
TOTAL
6
100
6
100
6
100
X2 = 7.807; 2 GL; p < 0.05
Fuente: Directa
TOTAL
No.
8
10
18
%
44
56
100
Tabla 3. Con respecto a la evolución clínica de los neovasos se establecieron en leves y moderadas a todos los
grupos, de este modo se observó que en los grupos Propranolol y Lasser, se distribuyeron en 50 % leves y 50 %
moderadas, solo el grupo de Lucentis, había un predominio de moderadas en relación a las leves Con esta
distribución porcentual, se puede afirmar que si existe una diferencia significativa (X2 = 7.807; 2 GL; p < 0.05)
GRAFICA No. 3
EVOLUCIÓN CLINICA DE NEOVASOS MEDIANTE
FLUORANGIOGRAFIAS
ANTES DE LA APLICACIÓN DEL TRATAMIENTO
80
67
70
60
50
50
40
50
50
50
33
30
20
10
0
LUCENTIS
PROPANOLOL
LEVE
LASSER
MODERADA
Fuente: Tabla No. 3
X2 = 7.807; 2 GL; p < 0.05
TABLA No. 4
EVOLUCIÓN CLINICA DE NEOVASOS MEDIANTE FLUORANGIOGRAFIAS
A LOS 3 DIAS POSTRATAMIENTO
GRUPO
LUCENTIS
No.
%
LEVE
2
33
MODERADA
4
67
TOTAL
6
100
2
X = 7.807; 2 GL; p < 0.05
Fuente: Directa
EVOLUCION
PROPRANOLOL
No.
%
3
50
3
50
6
100
LASSER
No.
3
3
6
TOTAL
%
50
50
100
No.
8
10
18
%
44
56
100
Tabla 4. De acuerdo con la evolución clínica de neovasos mediante Fluorangiografías a los 3 días de la aplicación
del tratamiento, prácticamente quedaron de manera similar a la distribución observada antes del tratamiento
como se muestra en las Tablas No. 3 y 4
GRAFICA No. 4
EVOLUCIÓN CLINICA DE NEOVASOS MEDIANTE
FLUORANGIOGRAFIAS A LOS 3 DIAS DE LA APLICACIÓN DEL
TRATAMIENTO
80
67
70
60
50
50
40
50
50
50
33
30
20
10
0
LUCENTIS
PROPANOLOL
LEVE
LASSER
MODERADA
Fuente: Tabla No. 4
X2 = 7.807; 2 GL; p < 0.05
TABLA No. 5
EVOLUCIÓN CLINICA DE NEOVASOS MEDIANTE FLUORANGIOGRAFIAS
A LOS 7 DIAS POSTERIOR A PROCEDIMIENTO
GRUPO
LUCENTIS
No.
5
1
6
EVOLUCION
LEVE
MODERADA
TOTAL
PROPRANOLOL
No.
%
4
67
2
33
6
100
%
83
17
100
LASSER
No.
3
3
6
TOTAL
%
50
50
100
No.
12
6
18
%
67
33
100
X2 = 24.51; 2 gl; p < 0.05
Fuente: Directa
Tabla 5. El mayor cambio en relación a la evolución clínica, de neovasos, se observa a los 7 días,
principalmente en el grupo Lucentis, en donde el 83 % se encuentra con una presencia leve de neovasos.
También en el grupo Propranolol, predominó la frecuencia de neovasos moderados.
GRAFICA No. 5
EVOLUCIÓN CLINICA DE NEOVASOS MEDIANTE
FLUORANGIOGRAFIAS A LOS 7 DIAS DE LA APLICACIÓN DEL
TRATAMIENTO
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
83
67
50
50
33
17
LUCENTIS
PROPANOLOL
LEVE
LASSER
MODERADA
Fuente: Tabla No. 5
X2 = 24.51; 2 GL; p < 0.05
TABLA No. 6
EVOLUCIÓN CLINICA DE NEOVASOS MEDIANTE FLUORANGIOGRAFIAS
ANTES Y A LOS 3 DIAS DE LA APLICACIÓN DEL TRATAMIENTO CON LUCENTIS
EVOLUCION
LEVE
MODERADA
TOTAL
LUCENTIS
ANTES
No.
2
4
6
DESPUES
No.
2
4
6
%
33
67
100
TOTAL
%
33
67
100
No.
4
8
12
%
33
67
100
X2 = 0.023; 1 GL; p = 0.88
Tabla 6. Al comparar cada grupo por separado, de la evolución clínica de neovasos mediante
fluorangiografias antes y a los 3 días de la aplicación del tratamiento, el Grupo con Lucentis, , mostro
que el número de neovasos, es igual al encontrado Antes y a los 3 días de tratamiento.
GRAFICA No. 6
EVOLUCIÓN CLINICA DE NEOVASOS MEDIANTE
FLUORANGIOGRAFIAS ANTES Y A LOS 3 DIAS DE LA APLICACIÓN
DEL TRATAMIENTO CON LUCENTIS
80
67
70
67
60
50
40
33
33
30
20
10
0
ANTES
DESPUES
LEVE
MODERADA
Fuente: Tabla No. 6
X2 = 0.023; 1 GL; p = 0.88
TABLA No. 7
EVOLUCIÓN CLINICA DE NEOVASOS MEDIANTE FLUORANGIOGRAFIAS
ANTES Y A LOS 3 DIAS DE LA APLICACIÓN DEL TRATAMIENTO CON PROPRANOLOL
PROPRANOLOL
ANTES
No.
%
LEVE
3
50
MODERADA
3
50
TOTAL
6
100
2
X = 0.02; 1 GL; p = 0.888
EVOLUCION
DESPUES
No.
3
3
6
TOTAL
%
50
50
100
No.
6
6
12
%
50
50
100
Tabla 7. Al comparar cada grupo por separado, de la evolución clínica de neovasos mediante
fluorangiografias antes y a los 3 días de la aplicación del tratamiento, el Grupo con Propranolol,
mostro que el número de neovasos, es igual al encontrado Antes y a los 3 días de tratamiento.
GRAFICA No. 7
EVOLUCIÓN CLINICA DE NEOVASOS MEDIANTE
FLUORANGIOGRAFIAS ANTES Y A LOS 3 DIAS DE LA APLICACIÓN
DEL TRATAMIENTO CON PROPANOLOL
60
50
50
50
50
50
40
30
20
10
0
ANTES
DESPUES
LEVE
MODERADA
Fuente: Tabla No. 7
X2 = 0.02; 1 GL; p = 0.888
TABLA No. 8
EVOLUCIÓN CLINICA DE NEOVASOS MEDIANTE FLUORANGIOGRAFIAS
ANTES Y A LOS 7 DIAS DE LA APLICACIÓN DEL TRATAMIENTO CON LUCENTIS
LUCENTIS
EVOLUCION
ANTES
No.
LEVE
2
MODERADA
4
TOTAL
6
X2 = 21.78; 1 GL; p < 0.05
Fuente: Directa
%
33
67
100
DESPUES
No.
5
1
6
TOTAL
%
83
17
100
No.
7
5
12
%
58
42
100
El grupo tratado con Lucentis, muestran una diferencia significativa, antes y a los 7 días del
tratamiento. La distribución de la frecuencia de neovasos en forma leve, predominan a los 7 días de
tratamiento, lo que permite afirmar que existe la suficiente evidencia que el Lucentis disminuye
significativamente el número de neovasos a los 7 días de tratamiento.
GRAFICA No. 8
EVOLUCIÓN CLINICA DE NEOVASOS MEDIANTE
FLUORANGIOGRAFIAS ANTES Y A LOS 7 DIAS DE LA APLICACIÓN
DEL TRATAMIENTO CON LUCENTIS
Fuente: Tabla No. 9
X2 = 21.87; 1 GL; p < 0.05
TABLA No. 9
EVOLUCIÓN CLINICA DE NEOVASOS MEDIANTE FLUORANGIOGRAFIAS
ANTES Y A LOS 7 DIAS DE LA APLICACIÓN DEL TRATAMIENTO CON PROPRANOLOL
PROPRANOLOL
EVOLUCION
ANTES
No.
%
LEVE
3
50
MODERADA
3
50
TOTAL
6
100
X2 = 22.98; 1 GL; p < 0.05
Fuente: Directa
DESPUES
No.
4
2
6
TOTAL
%
67
33
100
No.
7
5
12
%
58
42
100
Tabla 9. La evolución clínica de neovasos mediante fluorangiografias antes y a los 7 días de la aplicación del
tratamiento con Propranolol, muestran una diferencia significativa, ya que en la evaluación antes del
tratamiento predominan los neovasos en forma moderada, mientras que en la determinación de neovasos a
los 7 días, predominan los neovasos en forma leve, esta distribución marca una diferencia significativa,
GRAFICA No. 9
EVOLUCIÓN CLINICA DE NEOVASOS MEDIANTE
FLUORANGIOGRAFIAS ANTES Y A LOS 7 DIAS DE LA APLICACIÓN
DEL TRATAMIENTO CON PROPANOLOL
Fuente: Tabla No. 10
X2 = 22.98; 1 GL; p < 0.05
TABLA No. 10
TOTAL DE NUMERO DE VASOS EN CORTES HISTOLÓGICOS
EN 5 CAMPOS (40X) POR GRUPO DE ESTUDIO
GRUPO DE ESTUDIO
LUCENTIS
PROPANOLOL
1
20
13
2
16
17
3
20
11
4
14
10
5
18
15
6
19
15
MEDIA
17.83
13.50
DESVEST
2.40
2.66
ANOVA
F= 9.15; p < 0.05
Fuente: Directa
OJOS
LASSER
19
18
18
16
17
17
17.50
1.05
SANOS
20
19
20
25
19
18
20.17
2.48
Tabla 10. El mayor número de vasos se encontró en los ojos del grupo control (sanos) con una
media de 20.17 en segundo lugar el grupo Lucentis, con una media de 17.83 vasos.
El tercer lugar lo ocupó el grupo tratado solo con Lasser con una media de 17.50 vasos, en
tanto que el grupo de Propanolol, presentó una media de 13.50 vasos
GRAFICA No. 10
PROMEDIO DEL NUMERO DE VASOS EN CORTES HISTOLÓGICOS
EN 5 CAMPOS (40X) POR GRUPO DE ESTUDIO
SANOS
20.17
LASSER
17.5
PROPANOLOL
13.5
LUCENTIS
17.83
0
5
10
15
20
Número de Vasos
Fuente: Tabla No. 2
F = 9.15; p < 0.05
25
DISCUSION.
Existen evidencias de que el sistema adrenérgico está involucrado en la
regulación de la hipoxia inducida por neovascularización y producción de
VEGF, además de que se ha reportado que los beta bloqueadores son una
opción terapéutica efectiva en el tratamiento de hemangiomas capilares
infantiles, hemangiomas cavernosos y hemangiomas de subgloticos
ya
que reduce los niveles de VEGF, y de existir protocolos donde se evalúa
la seguridad y eficacia de la administración del propanolol
de recién
nacidos prematuros con fases tempranas de retinopatía del prematuro
para contrarrestar la progresión de la misma.17,6
Al realizar RT PCR
los resultados que obtuvimos
de acuerdo al
comportamiento de la expresión del Factor de Crecimiento Endotelial
Vascular, en los 4 grupos de estudio, se encontró que la expresión
del
VEGF fue mayor en el grupo con Lasser que no recibió tratamiento con
intravitreos en comparación con el grupo que recibió Lucentis
y con el grupo que recibió Propranolol (Grafica 1, Tabla 1),
intravitreo
se encontró
media aritmética de 84.150 en el grupo con Lasser, en tanto que la media
en el grupo tratado con Propranalol fue de 79.878, en el grupo de Lucentis
la media fue de 29.003, mientras que la media menor se encontró en el
grupo de Sanos, con solo 11.918, Con estas medias se procedió a la
aplicación de Análisis de Varianza (ANOVA), en donde fue necesario
multiplicar todos los valores por 103 , de esta forma se encontró, que si
existe una diferencia estadísticamente significativa entre las medias (F=
4988.57; p< 0.05)
de cada uno
los grupos que se sometieron a
tratamiento.
Posteriormente al aplicar la prueba de Diferencia Significativa Honesta de
Tukey, se observó que solo entre el grupo Lasser y Propanolol, no existe
una diferencia significativa. (DSH = 7.11).
En tanto que las puntuaciones obtenidas de las gradaciones
de las
fotografías de las fluorangiografias en todos los grupos a los que se les
aplico Lasser para establecer el grado de neovascularización,
se
etiquetaron en leves y moderadas, en el presente estudio ninguno de los
grupos obtuvo puntuaciones severas ni muy severas, de este modo las
puntuaciones se expresaron en porcentaje y para su análisis se aplico la
prueba de Chi cuadrada observando que el grupo Propranolol al igual que
el grupo al que solo se aplico el Lasser desarrollo neovascularización leve y
moderada en igual proporción con una distribución porcentual de 50 %
leves y 50 % moderados, mientras que el grupo al que se le aplico
Lucentis, tuvo un predominio en el desarrollo de los neovasos, con una
distribución porcentual de 33% leves y 67 % como moderados. Con esta
distribución porcentual, se puede afirmar que si existe una diferencia
significativa (X2 = 7.807; 2 GL; p < 0.05) en cada uno de los grupos con
neovascularización inducida por Lasser.(Tabla 2 Grafica 2).
En relación a la evolución de la neovascularización posterior a la
administración de propranolol y de Lucentis
las fotografías de las
flurangiografias
no presentaron cambios clínicos significativos en ninguno
de los 2 grupos a los 3 días después de la administración de intravitreos, ya
que las distribuciones porcentuales en el grupo de propranolol persistió en
50 % leves y 50 % moderados
(X2 = 7.807; 2 GL; p < 0.05), y para el
grupo de Lucentis las distribuciones porcentuales persistió en 33% leves y
67 % como moderados
(X2 = 7.807; 2 GL; p < 0.05), es decir que a los 3 días posterior a la
aplicación de los intravitreos los grupos en estudio no presentaron cambios
clínicos significativos (Tabla 4, Grafica 4).
Los resultados de las fotografías de las flurangiografias en relación a la
evolución clínica a los 7 días posteriores a la aplicación de intravitreos nos
muestran que el grupo al que se administro Lucentis presento una
disminución importante de los neovasos ya que al expresarlos en forma
porcentual 83% redujo el grado de neovascularización a leves mientras
17% de este grupo persistió con neovascularización moderada
con
resultados estadísticamente significativos (X2 = 21.78; 1 GL; p < 0.05).
(Tabla 8 Grafica 8).
En tanto que en el grupo de Propranolol a los 7 días posteriores a su
administración intravitrea, las fotografías de fluorangiografias expresadas
en forma porcentual presentaron una disminución de la neovascularización
de 67% del grupo a neovacularización leve, mientras que 33% de este
grupo
persistió
con
neovascularización
moderada
con
resultados
estadísticamente significativos (X2 = 22.98; 1 GL; p < 0.05) (Tabla 9 Grafica
9).
En relación a los cortes histológicos que se realizaron a todos los grupos,
no fue posible realizar una tinción plana especial para poder evidenciar los
neovasos en su totalidad, ya que el departamento de patología carece de
la infraestructura y el equipo adecuado para poder realizarla, por lo que se
realizaron tinciones con Hematoxilina Eosina y se contaron los vasos a nivel
coroides en 5 campos (40X) encontrando el mayor número de vasos en los
ojos del grupo control (sanos) con una media de 20.17. En segundo lugar el
grupo Lucentis con una media de 17.83 vasos y con cambios inflamatorios
en los mismos. El tercer lugar lo ocupó el grupo tratado solo con Lasser con
una media de 17.50 vasos, en tanto que el grupo de Propranolol, presentó
una media de 13.50 vasos.
De tal modo que se puede afirmar que la media aritmética del número de
vasos es significativamente menor en el grupo tratado con Propanolol (F=
9.15; p < 0.05) con un 95 % de confianza. (Tabla 10 Grafica 10).
Posterior a administración de intravitreos se presentaron 3 ojos del grupo de
propanolol que desarrollaron catarata iatrogénica, no hubo cambios en la
conducta de alguno de ellos, ni tampoco en los hábitos alimenticios, no
hubo muerte de los animales durante el presente estudio.
Aunque no se existen estudios similares sobre el uso de Propranolol
intravitreo, Fatemeh Hajighasemi and Sakineh Hajighasemi estudiaron el
efecto del Propranolol sobre factores angiogenicos en líneas celulares in
vitro,
las
cuales
fueron
cultivadas
en
concentraciones, encontrando que a partir
Propranolol
en
diferentes
de 30 µM se presentaban
disminución en la expresión del VEGF con resultados estadísticamente
significativos 14.
CONCLUSIONES
A.
El
Ranibizumab
es
el
antiangiogenico
de
elección
para
Degeneración macular relacionada con la edad variedad húmeda y
edema macular diabético. Se utiliza de manera intravitrea
buenos
resultados para transtormos
con
neovasculares como la
retinopatía diabética proliferativa y no proliferativa así como
glaucoma neovascular con rápida regresión de los vasos sanguíneos
patológicos2,8,15
B.
Existen múltiples estudios clínicos y experimentales en donde el uso
del
Propranolol
para
reducción
de
los
procesos
de
neovascularización ha
dado buenos
resultados ya que reduce de forma importante
la
expresión del VEGF.
C.
Durante el presente estudio mediante las valoraciones y seguimiento
con estudios de fluorangiografia, el Ranibizumab
tuvo mejor
respuesta clínica en comparación con el clorhidrato de propranolol
para la reducción de la neovascularización inducida con laser.
D.
En el presente estudio
Propranolol administrado
se demostró que el Clorhidrato de
intravitreo en esta dosis
no tuvo los
resultados esperados en la reducción del VEGF.
E.
Aunque existen evidencias de que el sistema adrenérgico
involucrado
en
la regulación
de
la hipoxia
inducida
está
por
neovascularización y producción de VEGF, además de que se ha
reportado que los beta bloqueadores son una opción terapéutica
efectiva en el tratamiento de hemangiomas capilares infantiles ya
que reduce los niveles de VEGF, y de existir protocolos donde se
evalúa la seguridad y eficacia de la
administración del propranolol de recién nacidos prematuros con
fases tempranas de retinopatía del prematuro para contrarrestar la
progresión de la misma, durante el presente estudio el Clorhidrato de
Propranolol no demostró tener efecto similar al de Ranibizumab
intravitreo en la reducción de la neovascularización inducida por
laser.
PRESPECTIVAS Y RECOMENDACIONES
Hasta el momento aunque no existen estudios comparativos entre el uso
de Ranibizumab y el Clorhidrato de Propranolol para la reducción de la
neovascularización mediante la expresión del VEGF, existen estudios en
donde los beta bloqueadores si reducen la expresión del VEGF
y si
reducen clínicamente los procesos de neovascularización.
Se recomienda seguir con estudios experimentales de este tipo mediante
otras dosis, concentraciones y otras vías de administración
también
presentar
así como
estudiar los efectos adversos como toxicidad que se
por
el
uso
intravitreo,
también
es
importante
pudiera
realizar
determinaciones de la expresión del VEFG
de forma
seriada, para
establecer con mayor precisión la expresión del mismo.
Existen
dificultades para llevar a cabo la adecuada evaluación de los
efectos del Propranolol y compararlos con Ranibizumab en experimentos
en animales, desde el hecho de que no todos los animales reaccionan de la
misma manera al tratamiento, el hecho de no contar con toda la
infraestructura para llevar a cabo
experimentos de este tipo, y en el campo clínico las causas y la severidad
de la NV son muchas, lo cual puede complicar de cierta manera análisis
adecuado de los datos al momento de realizar estudios de este tipo
II.
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number 6.
27. David Sabaté1, EL TAMAÑO DE MUESTRA EN LOS ESTUDIOS DE
EFICACIA, Rev. Epidem. Med. Prev. (2003), 1: 27-30
ANEXOS
Fig 1. Clorhidrato de propranolol
libre de preservantes Fuente:
Directa.
Fig 2 Preparación de Clorhidrato
de Propranolol Fuente: Directa.
Fig 3 Administración de intravitreos
a los grupos de estudio Fuente:
Directa.
Fig 4 administración de fluroceina
sódica para realización de
flurangiografias Fuente: Directa.
Fig 6 Neovascularizacion moderada 21 dias
posterior a aplicación de lasser (conejo 1
grupo Propranolol) Fuente: Directa.
Fig 5 Utilización del sistema de
visualización digital Ret Cam 3 Fuente:
Directa.
Fig 7 Reduccion de Neovascularizacion 7 dias
posteriores a aplicación de Propranolol
(conejo 1 grupo Propranolol) Fuente: Directa.
Fig 8 Neovascularizacion moderada
21 dias posterior a aplicación de lasser
(conejo 7 grupo Lucentis) Fuente:
Directa.
Fig 9 Neovascularizacion leve 21 dias
posterior a aplicación de Lucentis (conejo 1
grupo Lucentis) Fuente: Directa.
Fig 11 Obtención de tejido retinocoroideo Fuente: Directa.
Fig 10 Sacrificio de los conejos y
obtención de muestras de tejido
retino-coroideo Fuente: Directa.
Fig 12 muestras de tejido RetinoCoroideo colectadas en tubos de Trizol
Fuente: Directa.
Figura 13 Tubos de Eppendorf de
1500 microlitros con Trizol, en
donde se depositaron muestras de
tejido. Fuente: Directa.
Figura 14 . Amplificacion del gen GADPh en muestra de tejido Retino-coroideo
obtenido por electroforesis en gel de agarosa correspondiente a 100 pares de
bases. Fuente: Directa.
100 pb
Figura 15 . Amplificación del gen VEGF en muestra de tejido Retino- Coroideo de
conejo obtenido por electroforesis en gel de agarosa correspondiente a 100 pares de
bases. Fuente: Directa.