View/Open - Unidad Politécnica para la Educación Virtual

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
SECRETARIA DE INVESTIGACIÓN Y POSGRADO
SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN
DETERMINACIÓN DE LA POSIBLE ACTIVIDAD
NEMATICIDA DE CINCO NUEVOS COMPUESTOS
HÍBRIDOS DEL BENCIMIDAZOL Y LA NITAZOXANIDA
T
E
S
I
S
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE:
MAESTRO EN CIENCIAS QUIMICOBIOLÓGICAS
P R E S E N T A
BIOL. BLANCA EUNICE GONZÁLEZ GÓMEZ
DIRECTORES:
DR. BENJAMÍN NOGUEDA TORRES
M. EN I.B.B. JORGE LUIS DE LA ROSA ARANA
México, D.F., 2009
0
0
El presente trabajo fue realizado bajo la dirección de:
Dr. Benjamín Nogueda Torres, en la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del
Instituto Politécnico Nacional, adscrito al laboratorio de Helmintología del
Departamento de Parasitología.
M. en I.B.B. Jorge Luis de la Rosa Arana, en el Instituto de Diagnóstico y
Referencia Epidemiológicos de la Secretaria de Salud, adscrito al Laboratorio de
Helmintos Tisulares del Departamento de Parasitología.
1
AGRADECIMIENTOS
En este espacio quiero agradecer profundamente a mis directores de tesis:
Dr. Benjamín Nogueda Torres
M. en I.B.B. Jorge Luis de la Rosa Arana
Por su valioso apoyo, asesoría y dirección en la realización del presente trabajo
Agradeciendo especialmente a mi comité tutorial:
Dra. María Estela Meléndez Camargo
Dra. María Elena Campos Aldrete
Dra. Amalia Monroy Ostria
Dra. Gloria de la Luz León Ávila
Dr. Alejandro Tovar Soto
Por su apoyo en la revisión y corrección del presente trabajo
Agradecimiento especial al Consejo
Nacional de
Ciencia y Tecnología
(CONACyT), por haber financiado la realización de este postgrado, mediante la
beca otorgada No. 205158
0
Quiero agradecer profundamente a mi familia, por su gran apoyo que me ha
brindado en la realización de este importante paso que di en mi vida profesional
Muchas gracias mamá e Iván por apoyarme incondicionalmente, los ama Blanca
Quisiera agradecer enormemente a mis amigos y compañeros de la ENCB, así
como del INDRE, por compartir, convivir y apoyarme en estos formativos años
Agradecimiento especial a mis amigos y compañeros de la USB, por su apoyo
brindado para salir adelante con mi formación académica
Aquello que guardes en tu corazón determinará el transcurrir de tu vida
0
ÍNDICE GENERAL
|ÍNDICE GENERAL
ÍNDICE GENERAL……………………………………………………………………………………..............................i
ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS.…………………………………………………………………………….………...iii
ABREVIATURAS……………………………………………………………………………………………………….....iv
RESUMEN…………………………………………………………………………………………………….…...............v
ABSTRACT..........................................................................................................................................................vi
1. INTRODUCCIÓN.…………...…………………………………………………………………………………............1
2. ANTECEDENTES……………………………………………………………………………………………………….3
2.1. El Modelo experimental………………………………………………………………………………………………3
2.1.1. Toxocara canis………………………………………………………………………………................................3
2.1.1.1. Taxonomía y morfología…………………………………………………………………................................3
2.1.1.2. Ciclo biológico…………………………………………………………………………………………...............5
2.1.1.3. Manifestaciones clínicas y sintomatología…………………………………………………………………….6
2.1.1.4. Diagnóstico……………………………………………………………………………………………….............8
2.1.1.5. Tratamiento…………………………………………………………………………………………....................9
2.1.1.6. Distribución geográfica y epidemiología……………………………………………………………………….9
2.1.1.7. Profilaxis…………………………………………………………………………………….............................10
2.1.2. Trichinella spiralis…………………………………………………………………………………………………11
2.1.2.1. Taxonomía y morfología……………………………………………………………………………................11
2.1.2.2. Ciclo biológico…………………………………………………………………………………….....................13
2.1.2.3. Manifestaciones clínicas y sintomatología…………………………………………………….....................14
2.1.2.4. Diagnóstico……………………………………………………………………………………………..............15
2.1.2.5. Tratamiento……………………………………………………………………………………………..............16
2.1.2.6. Distribución geográfica y epidemiología………………………………………………................................16
2.1.2.7. Profilaxis…………………………………………………………………………………..……………………..18
2.2. Inmunología contra helmintos……………………………………………………………………………………..18
2.3. Fármacos antiparasitarios………………………………………………………………………………………….19
2.3.1. Antihelmínticos………………………………………………………………………………………………….....19
2.3.1.1. Bencimidazoles………………………………………………………………………………………………….20
2.3.1.2. Nitazoxanida………………………………………………………………………………..............................22
2.3.1.3. Compuestos híbridos…………………………………………………………………………….....................24
3. JUSTIFICACIÓN…………………………………………………………………………………………...................28
4. HIPÓTESIS………………………………………………………………………………………..............................28
5. OBJETIVOS………………………………………………………………………………………………..................29
5.1.Objetivo general………………………………………………………………………………................................29
5.2. Objetivos particulares…………………………………………………………………………………...................29
6. DIAGRAMA DE FLUJO DEL DESARROLLO EXPERIMENTAL………………………………………..……….30
7. MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………………………………………….........................31
7.1. Evaluación in vitro de los compuestos híbridos sobre J2 de T. canis, LM y GA de T. spiralis……………..31
7.1.1. Obtención y mantenimiento en medio de cultivo de la fase Juvenil 2 (J2) de Toxocara canis…….……..31
i
ÍNDICE GENERAL
7.1.2. Obtención y mantenimiento en medio de cultivo de larvas musculares (LM) de Trichinella spiralis….....34
7.1.3. Obtención y mantenimiento en medio de cultivo de gusanos adultos (GA) de Trichinella spiralis……...36
7.1.4. Determinación in vitro de la actividad nematicida de los compuestos híbridos…………………………….38
7.1.5. Efecto de los compuestos sobre el índice de capacidad reproductiva en LM de T. spiralis……..........…39
7.1.6. Efecto de los compuestos sobre el índice de larviposición de adultos hembras de T. spiralis………..…41
7.1.7. Análisis estadístico………………………………………………………………………………………………..41
8. RESULTADOS………………………………………………………..……………………………………………….42
9. DISCUSIÓN………………………………………………………………………………………………………..…..59
10. CONCLUSIONES…………………………………………………………………………………………………….66
11. PERSPECTIVAS……………………………………………………………………………………………..……...67
12. BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………………………………………………..………..68
APÉNDICE……….………………………………………………..……………………………………………………...79
I. Soluciones y reactivos……………………………………………………………….………………………………...79
II. Resultados anexos sobre el porcentaje de reducción de LM y el RCI……………………………………….….81
ii
ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS
ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS
Ilustración
Tabla 1
Figura 1
Figura 2
Figura 3
Tabla 2
Figura 4
Figura 5
Figura 6
Figura 7
Figura 8
Figura 9
Figura 10
Figura 11
Tabla 3
Figura 12
Figura 13
Figura 14
Figura 15
Figura 16
Figura 17
Figura 18
Figura 19
Figura 20
Figura 21
Figura 22
Figura 23
Figura 24
Figura 25
Figura 26
Descripción
Clasificación taxonómica de Toxocara spp.
Morfología de la parte anterior de Toxocara canis
Ciclo biológico de Toxocara canis
Áreas del cuerpo donde se aloja larva migrans
Clasificación taxonómica de Trichinella spp.
Morfología de Trichinella spiralis
Ciclo biológico de Trichinella spiralis
LM en célula nodriza y edema periorbital
Distribución de la triquinelosis en la república mexicana
Fórmula general del bencimidazol
Fórmula general de la nitazoxanida
Hibridación molecular
Compuestos madre
Composición de los compuestos híbridos a evaluar
Compuestos híbridos resultantes
Colección de Toxocara canis del intestino de un canino,
Adultos de T. canis, Extracción del útero de hembras de T.
canis y Embrionación de huevos
Eclosión de los J2, Microembudos tipo Baermann y J2 de
Toxocara canis liberadas
Infección con Trichinella spiralis, Carcasa, Molienda,
Digestión enzimática, Embudos de sedimentación,
Trichinella spiralis liberadas de la célula nodriza y
Mantenimiento de Trichinella spiralis
Disección de intestino delgado del ratón experimentalmente
infectado, Incubación para obtención de gusanos adultos de
Trichinella spiralis y Gusanos adultos de Trichinella spiralis
Placa de cultivo con helmintos y compuestos experimentales
Efecto de los compuestos sobre J2 de T. canis, tratados con
0.01, 0.1, 1, 10 y 100 g/mL
Micrografía de J2 de Toxocara canis viable y no viable
Efecto de los compuestos sobre LM de T. spiralis, tratadas
con 0.01, 0.1, 1, 10 y 100 g/mL
Micrografía de LM de Trichinella spiralis viable y no viable
Índice de capacidad reproductiva de las LM con tratamiento
a 0.1, 1, 10 y 100 g/mL
Efecto de los compuestos sobre GA de T. spiralis, tratados
con 0.01, 0.1, 1, 10 y 100 g/mL
Micrografía de GA de Trichinella spiralis viable y no viable
Índice de larviposición de los GA hembras con tratamiento a
0.01, 0.1, 1, 10 y 100 g/mL
Micrografías de LRN de Trichinella spiralis
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58
iii
ABREVIATURAS
ABREVIATURAS
ABZ
Albendazol
CPMIV
1-metil-N-(5-nitro-1,3-tiazol-2-il)-1H-bencimidazol-5-carboxamida
DMSO
Dimetil sulfóxido
dpi
Días postinfección
GA
Gusano adulto
IL
Índice de larviposición
J2
Fase juvenil 2
LM
Larva muscular
LRN
Larva recién nacida
MEM
Medio esencial mínimo
NTZ
Nitazoxanida
PBS
Solución salina amortiguadora de fosfatos
RCI
Índice de capacidad reproductiva
SAG61
N-(5-nitro-1,3-tiazol-2-il)-2-(tiol)-1H-bencimidazol-5-carboxamida
Tx
Tratamiento
VMAS60
N-(5-Nitro-1,3-tiazol-2-il)-2-(triflurometil-1H-bencimidazol-5
-carboxamida
VMAS62
N-(5-Nitro-1,3-tiazol-2-(metilsulfuro)-1H-bencimidazol-5-carboxamida
VMAS74
1-metil-N-(5-nitro-1,3-tiazol-2-il)-2-(metilsulfuro)- bencimidazol-5
-carboxamida
iv
RESUMEN
RESUMEN
Toxocara canis y Trichinella spiralis son dos nematodos que comúnmente se nombran como
“helmintos tisulares”, puesto que sus larvas pueden invadir los tejidos musculares y el sistema
nervioso central. El hombre es accidentalmente un anfitrión en ambas enfermedades parasitarias.
En el primer caso, el principal hospedador de T. canis es el perro y la transmisión al ser humano se
da por el consumo accidental de los huevos embrionados que desarrollan una larva migratoria (J2),
la cual causa el síndrome de larva migrans visceral o ocular. En el segundo caso, el principal
hospedador de T. spiralis es el cerdo; el consumo de carne mal cocida que contiene las larvas
musculares (LM) infecta al hombre, y por lo tanto le causan un síndrome febril. Ambas zoonosis
presentan distribución mundial. El tratamiento de elección es la quimioterapia basada en la
administración de antihelmínticos de amplia gama, como los derivados del bencimidazol (BNZ),
(albendazol (ABZ)) o la nitazoxanida (NTZ). Así, el objetivo de este trabajo fue determinar el efecto
antihelmíntico de cinco nuevos derivados de la unión del BNZ y de la NTZ utilizando T. canis y T.
spiralis como modelos de helmintiosis experimental. En primer lugar la inhibición de la motilidad de
J2 (T. canis) y LM y gusanos adultos (T. spiralis) fue evaluada in vitro agregando el compuesto a
diversas concentraciones. La fecundidad del gusano adulto femenino de T. spiralis también fue
evaluada in vitro. Finalmente el efecto sobre la capacidad infectiva de las larvas de T. spiralis fue
registrado a través del índice de capacidad reproductiva; las larvas fueron incubadas con el
compuesto experimental por un tiempo, después fueron utilizadas para infectar ratones CD1 y al
cabo de cuatro semanas las LM fueron recuperadas y el RCI calculado. Las cinco nuevas
moléculas formadas de la combinación de bencimidazol y la parte activa de la nitazoxanida son
VMAS60, VMAS62, VMAS74, CPMIV y SAG61, las cuales fueron evaluadas a concentraciones
logarítmicas de 100 a 0.01
g/mL con tiempos de exposición a partir de 2, 6 y 12 horas. Se
colocaron veinte gusanos por pozo de placas de microcultivo. La motilidad fue evaluada a través de
la técnica de motilidad relativa (RM). Nuestros resultados mostraron que la motilidad no fue
afectada por los compuestos nuevos; la NTZ redujo en su totalidad la motilidad J2 y la viabilidad en
el 80 % después de las 2 horas de exposición en 100
g/mL. Asimismo la NTZ en T. spiralis
reduce la motilidad hasta el 30 % desde las 2 horas de exposición a concentración de10 g/mL. La
larviposición realizada por el gusano femenino de T. spiralis se redujo un 95 % con los compuestos
VMAS60 y VMAS62, resultados similares se obtuvieron con el ABZ y la NTZ. La capacidad
infectiva de T. spiralis, se redujo significativamente con los compuestos VMAS60 (el 95 %) y
VMAS62 (el 98 %), asimismo resultados similares se obtuvieron con el ABZ (el 99 %) y la NTZ (el
98 %) desde las 2 horas de exposición con una concentración de 100
g/mL. Los resultados
sugieren que los compuestos híbridos no tienen efecto sobre la motilidad de las larvas del T. canis
y de T. spiralis, pero si inhibe a larviposición de los gusanos femeninos de T. spiralis y el RCI.
v
ABSTRACT
ABSTRACT
Toxocara canis and Trichinella spiralis are two nematodes that commonly are named “tissular
helminthes”, since their larvae can invade the muscular tissues and the nervous central system.
The man is an accidentally host in both parasitic diseases. In the first case, the main host of T.
canis is the dog and transmission to human are by consumption of embrionated eggs that develop
in a migrant larva (J2) that causes the visceral or the ocular larva migrans syndrome. In the second
case, the main host of T. spiralis is the pig; man is infected by the consumption of undercooked
meat containing the muscular larvae (ML) causing a febrile syndrome. Both zoonosis are of worldwide distribution. The treatment of election is the chemotherapy by administration of wide spectrum
anthelmintics, as the benzimidazole (BNZ) (albendazole (ABZ)) or the nitazoxanide (NTZ). Thus,
the aim of this job was to determine the anthelmintic effect of five new derivatives of the union of
BNZ and the NTZ using the T. canis and T. spiralis as models of experimental helminthiosis. In the
first instance, inhibition of J2 (T. canis) and ML y adults worms (T. spiralis) motility was evaluated
in vitro by adding the drug in different concentrations. Fecundity of female adult worm of T. spiralis
was also evaluated in vitro. Finally the effect on the infective capacity of T. spiralis larvae was
recorded by the reproductive capacity index; larvae was incubated with the experimental drug by a
time, then used to infect CD1 mice and after four weeks, ML was recovered and the RCI calculated.
The five new molecules formed by the combination of benzimidazole and the active part of the
nitazoxanide are VMAS60, VMAS62, VMAS74, CPMIV and SAG61 and were evaluated in
logarithmic concentrations of 100 to 0.01
g/mL with exposure times from 2, 6 and 12 hours.
Twenty worms by well were placed in plates of microculture. Mobility was evaluated by means of
the relative motility (RM) technique. Our results showed the mobility was not affected by the new
compounds; the NTZ reduced totality the J2 motility and the viability in 80 % since the 2 hours of
exposition at 100 g/mL. As far for T. spiralis, the NTZ reduces the motility to 30 % since the 2
hours of exposition at 10 g/mL. Larviposition of T. spiralis female worm was reduced in 95 % by
the VMAS60 and VMAS62 compounds at 24 hours of exposition and 100
g/Ml. Similar results
were obtained with the ABZ and the NTZ. The infective capacity of T. spiralis was reduced with the
use of VMAS60 (95 %) and VMAS62 (98 %), similar results were obtained with the ABZ (99 %) and
the NTZ (98 %) when were used since 2 hours of exposition at 100 g/mL. These results suggest
that the hybrid compounds have not effect on the motility of T. canis and T. spiralis larvae but inhibit
the larviposition of female T. spiralis worms and reduce the RCI.
vi
INTRODUCCIÓN
1. INTRODUCCIÓN
El parasitismo es una asociación biológica entre dos organismos de especies
distintas (parásito y hospedador), en donde el parásito vive a expensas de su
hospedador adquiriendo de este vivienda y nutrientes de la sangre, tejidos o
contenido del tubo digestivo. Para adaptarse a la vida parasitaria, los parásitos
han desarrollado órganos de fijación, simplificación anatómica y funcional, así
como hiperactividad de órganos subsistentes como los sexuales (GállegoBerenguer, 1997).
Las geohelmintiosis son el conjunto de parasitosis helmínticas en las que los
huevos de los helmintos parásitos son expulsados con las heces, los cuales aún
no presentan embrión y para que este pueda desarrollarse y ser infectante
necesita permanecer en suelo húmedo un promedio de 7 a 14 días (GállegoBerenguer, 1997).
En México las geohelmintiosis más comunes son causadas por los siguientes
nemátodos: Ascaris lumbricoides (Linnaeus, 1758), Trichuris trichiura (Linnaeus,
1771), Enterobius vermicularis (Linnaeus, 1758), Ancylostoma duodenale (Dubini
1843) y Necator americanus (Dubini 1843), y aunque también se incluye Toxocara
spp. (Wilder, 1950), debido a su ciclo de vida que éste presenta en el ser humano
se le asigna en el grupo de los helmintos tisulares (Flisser et al., 2008).
Las helmintiosis tisulares son un conjunto de padecimientos ocasionados por
nematodos que invaden los tejidos de su hospedador del cual se benefician
absorbiendo de ellos nutrientes, entre las principales helmintiosis tisulares que
afectan al hombre se encuentran la triquinelosis, la cisticercosis, la fasciolosis, la
equinococosis, la oncocercosis y la toxocariosis (Lamothe-Argumedo y GarcíaPrieto, 1988).
1
INTRODUCCIÓN
Las estrategias de prevención y control de las helmintiosis han sido diversas y
cambiantes, especialmente en lo que se refiere al “blanco” de las acciones. Debido
a que aún no se cuenta con vacunas, la principal estrategia es la administración
de fármacos antiparasitarios (Belkind-Valdovinos et al., 2004). Entre los fármacos
antiparasitarios cabe destacar a los derivados bencimidazólicos, los cuales son
utilizados como tratamiento de amplio espectro para toda clase de helmintiosis;
asimismo,
los
nitrotiazoles
como
la
nitazoxanida
han
sido
evaluados
principalmente contra protozoarios, aunque en estudios recientes como los de
Dávila-Gutiérrez y colaboradores (2002) y los de Díaz y colaboradores (2003), han
demostrado su eficacia contra helmintiosis intestinales en humanos. En el trabajo
recientemente publicado por Rodríguez-Morales y colaboradores en 2008
demostraron
la
eficacia
de
la
nitazoxanida
en
ratones
infectados
experimentalmente con Toxocara canis.
Con respecto a los bencimidazoles utilizados contra Trichinella spiralis (Paget,
1835), son muchos los trabajos que han reportado su efectividad in vivo, en los
que se utilizan modelos murinos inclusive en perros y gatos (Douglas et al., 1993).
En el estudio realizado por Bolas-Fernández y colaboradores en el 2004,
demuestran una actividad importante nematicida contra T. spiralis del ricobendazol
(metabolito activo del albendazol o sulfóxido de albendazol). Con la nitazoxanida,
Fonseca-Salamanca y colaboradores (2003), mostraron que en modelo murino in
vivo, la tizoxanida vuelve inactivas a los gusanos preadultos de T. spiralis. Aunque
in vivo se ha demostrado que con el tratamiento antihelmíntico la carga parasitaria
se disminuye significativamente, ésta no se elimina totalmente y los parásitos que
sobreviven, no pierden su capacidad infectiva (De-la-Rosa et al., 2007). Por lo que
nuestro grupo de trabajo consideró pertinente evaluar compuestos híbridos
formados de la molécula del bencimidazol y la nitazoxanida, considerando que si
se unen estas dos moléculas se tendrá un espectro con acción más amplia y con
mayor efectividad contra Toxocara canis y Trichinella spiralis, empleados como
modelos experimentales.
2
ANTECEDENTES
2. ANTECEDENTES
2.1. El Modelo Experimental
2.1.1. Toxocara canis
Wilder en 1950 describió por vez primera la infección con Toxocara en el ser
humano, identificando una larva de una especie de nematodo desconocido en un
granuloma retinal de un niño; Beaver y colaboradores en 1952 (revisado en
Despommier, 2003) reportaron un caso similar en un grupo de pacientes que
presentaban eosinofilia y enfermedad multisistémica, describiendo así las
características de la larva migrans visceral (LMV). Mediante el análisis
histopatológico de biopsias clasificaron correctamente a los agentes etiológicos de
este padecimiento: Toxocara canis y Toxocara cati (Despommier, 2003).
2.1.1.1. Taxonomía y morfología
La diferenciación de las especies del género Toxocara se basa en las
características morfométricas que han sido descritas por Schacher (1957).
Toxocara es un gusano dioico, en el cual se pueden observar tres regiones, una
anterior donde se encuentra la boca y el anillo nervioso, una media donde se
observa el intestino y una posterior donde se localizan las gónadas y la cloaca. En
la parte anterior se encuentra un par de aletas cefálicas, que le dan las
características diagnósticas del género (Figura 1) y en la boca se observa la
presencia de tres labios bien desarrollados; el extremo posterior del macho
termina arqueado y se observa en él la papila caudal. La diferencia de tamaño
entre machos (10 cm) y hembras (18 cm) es notoria. Otras características
diagnósticas del género son la ornamentación de la cutícula y las espículas
desiguales.
El tamaño aproximado de los huevos es de 80 m y se describen de la siguiente
manera: presentan tres capas que son de color café claro, su cascarón de origen
3
ANTECEDENTES
proteico presenta hendiduras llamadas fosetas y recién que son ovopositados los
embriones son inmaduros (Levine, 1968).
La Clasificación taxonómica de Toxocara spp. se encuentra descrita en la tabla1 y
es una adaptación de la descrita por Bischoff y colaboradores (2003) y De-la-FéRodríguez y colaboradores (2006).
Tabla No. 1. Clasificación taxonómica de Toxocara spp. (Bischoff et al., 2003; Dela-Fe-Rodríguez et al., 2006.
Reino: Animalia
Subreino: Eumetazoa
Dominio: Eukaryota
Rama: Protostomia
Grado: Bilateria
Infrareino: Ecdysozoa
Superphylum: Aschelmintes
Phylium: Nemathelmintes
Clase: Cecermentea
Subclase: Rhabditia
Orden: Ascaridida
Suborden: Ascaridina
Superfamília: Ascaridoidea
Família: Toxocaridae
Género: Toxocara
Espécie: T. canis
T. lyncis
T. vajrasthirae
T. paradoxura
T. cati o T. mystax
T. alienata
T. warreni
T. vincenti
T. malaysiensis
T. mackerrasae
T. canarisi
T. indica
T. tanuki
T. pteropodis
T. genettae
T. vitulorum
T pearcei
T. apodemi
T. manzadiensis
T. cynonycterides
T. suricattae
T. Sprenti
T. hippopotami
T. elephantis
4
ANTECEDENTES
A
B
Figura 1. Morfología de la parte anterior de Toxocara canis. En el panel A se observa la
parte anterior del gusano adulto con las aletas cefálicas (flecha), mientras que en el panel
B es un acercamiento de la boca donde se observan los labios (Fuente: College of
Veterinary Medicine, University of Georgia, 2007).
2.1.1.2. Ciclo biológico
El ciclo de vida de Toxocara canis comienza con la ingesta (geofagia, común en
niños) de huevos embrionados que contienen la fase juvenil 2 (J2) y estos se
encuentran en el suelo, ya que los perros depositan sus deyecciones ahí.
Posterior a la ingestión de los huevos, los J2 eclosionan en el estómago y se
dirigen al intestino delgado, ahí penetran la pared intestinal, entran en circulación y
migran (término conocido como larva migrans) a todos los órganos a través de los
vasos sanguíneos. En cachorros menores a dos meses de edad, los J2 atraviesan
los alvéolos pulmonares, ascienden a la faringe en donde son deglutidos para
pasar al esófago y de ahí migrar al intestino delgado, donde crecen y maduran
hacia el estado adulto. Los adultos se desarrollan entre los 60 y 90 días post
infección. Los gusanos hembras producen huevos no embrionados y son
eliminados a través de las deyecciones; la embriogénesis ocurre entre los 9 y 15
días a temperaturas de 25 a 30 ºC o en 35 días a temperaturas de 16 ºC (Figura 2)
(Magnaval et al., 2001; Despommier, 2003; CFSPH-IOWA UNIVERSITY, 2005;
Tolan y Laufer, 2007).
5
ANTECEDENTES
Únicamente los cachorros de canes son los hospedadores definitivos de este
helminto, sin embargo el hombre y otros animales solo son hospedadores
paraténicos. La infección por Toxocara canis en caninos también se adquiere por
vía transplacentaria, ya que los J2 migran a través de la placenta (Tolan y Laufer,
2007).
Figura 2. Ciclo biológico de Toxocara canis (Fuente: Cordero del Campillo, 2001).
2.1.1.3. Manifestaciones clínicas y sintomatología
Las manifestaciones clínicas y la sintomatología en el ser humano dependerá del
grado del daño del órgano que haya sido invadido, como hígado, pulmones,
sistema nervioso central (SNC) y ojos, por lo que la enfermedad se conoce como
larva migrans visceral (LMV) o larva migrans ocular (LMO). Asimismo la carga
parasitaria y la edad del hospedador son factores importantes para determinar la
gravedad de la enfermedad (Del-Valle-Guardis et al., 2002; Despommier, 2003).
6
ANTECEDENTES
Los signos y síntomas ocasionados por la LMV son: distensión abdominal, falta de
apetito, inquietud, dificultad para respirar, fiebre, hepatomegalia y necrosis del
hígado, esplenomegalia, tos, broncoespasmos, manifestaciones asmáticas,
miocarditis,
nefritis
y
daño
al
SNC
que
puede
provocar
síntomas
neuropsiquiatricos y encefalopatías (Figura 3), este tipo de infección ocurre en
promedio en la población infantil menor de cinco años. Los datos generados en el
Instituto de Diagnóstico y Referencias Epidemiológicos (InDRE) (De-la-Rosa et al.,
2004) indican una prevalencia de anticuerpos moderadamente alta en personas en
edad productiva (48.1%). También se presenta leucocitosis y eosinofilia.
Además larva migrans estimula la formación de hipergammaglobulinemias e
isohemoglutininas, también puede haber presencia de granulomas secundarios
(Despommier, 2003; Magnaval et al., 2001; Ruíz-Espinosa, 2007; Tolan y Laufer,
2007).
Las manifestaciones clínicas ocasionadas por la LMO principalmente son:
retinoblastoma, visión unilateral en ocasiones acompañada por estrabismo, por
otro lado la invasión en la retina provoca la formación de un granuloma el cual
ocasiona uveitis, endoftalmitis difusa, papilitis, corioretinitis y heteropia. Evidencias
epidemiológicas demuestran que cuando se presentan manifestaciones oculares
no hay manifestaciones sistémicas y viceversa (Magnaval et al., 2001;
Despommier, 2003; Tolan y Laufer, 2007).
7
ANTECEDENTES
Figura 3. Áreas de cuerpo humano en donde se aloja larva migrans (Modificado de
Kelsey, 2002).
2.1.1.4. Diagnóstico
El diagnóstico para la toxocariosis se establece sobre bases clínicas como la
triada: eosinofilia-hepatomegalia-hiperglobulinemia y el síndrome de Löeffler. Los
ensayos inmunológicos como los de inmunoprecipitación y el ELISA en los cuales
se emplean antígenos secretados y recombinates de la fase juvenil 2, muestran
una sensibilidad del 78 % y especificidad del 92 %, demostrando muy buenos
resultados; también se realiza radiología y biopsias de órganos afectados, aunque
la sensibilidad del método no es muy confiable (Canese et al., 2001; Magnaval et
al., 2001; Despommier, 2003; De-la-Rosa et al., 2004).
8
ANTECEDENTES
2.1.1.5. Tratamiento
Para el tratamiento de la toxocariosis la OMS ha recomendado la administración
oral de dietilcarbamacina (DEC), en la cual se ha observado que mata los J2 y
detiene la enfermedad, su dosis se inicia con 1 a 3 mg/kg 2 veces al día hasta
llegar a 3 mg/Kg 2 veces al día, sin embargo debido a las reacciones adversas
que este fármaco ocasiona se ha suspendido su administración. Actualmente y de
manera eficaz se utiliza el albendazol (ABZ) como antihelmíntico de primera línea
(400 mg una vez al día por 5 días), aunque el mebendazol ha sido utilizado como
antihelmíntico secundario, empleando una dosis de 200 a 400 mg divididos
durante 21 días (Despommier, 2003; Chira et al., 2005). Aunque el tiabendazol
(3000 mg dos veces al día por 5 días) y el febendazol (7.5 mg/kg, 25 mg/kg o 50
mg/kg según sea el caso) se han utilizado como fármacos alternos para el
tratamiento (De-la-Fe-Rodríguez et al., 2006).
El grado de eficacia para el tratamiento LMV y LVO es dietilcarbamacina (DEC) >
tiabendazol (TBZ) > albendazol (ABZ) = febendazol FBZ = mebendazol (MBZ),
aunque el DEC como se mencionó antes, no es aceptado por los pacientes debido
a sus reacciones adversas (De-la-Fe- Rodríguez et al., 2006).
2.1.1.6. Distribución geográfica y epidemiología
Epidemiológicamente la toxocariosis es una zoonosis cosmopolita y se encuentra
asociada a perros y gatos, es conocida como una parasitosis doméstica, los
cachorros pueden infectarse a través de la lactancia y en los seres humanos
principalmente los niños, la zoonosis está asociada al “síndrome de pica”, al ingerir
huevos encontrados en la tierra o la arena (cajas de arena). Los parques
recreativos de áreas urbanas y suburbanas son un sitio apropiado para encontrar
huevos de Toxocara spp., debido a que comúnmente es frecuentado por
paseantes y sus mascotas (Despommier, 2003). Los cachorros caninos menores
a seis meses de edad son más afectados que los adultos. Comúnmente un canino
9
ANTECEDENTES
se muestra enfermo cuando presenta síntomas como vómito y diarrea, lo que
atribuye a que pueda tener toxocariosis, sin embargo estos síntomas son tan
comunes que se pueden confundir con una gastroenteritis pasajera. Aunque en
infecciones masivas los cachorros presentan el vientre abultado, lo que facilita un
diagnóstico más especifico a toxocariosis. (Warren y Mahmoud, 1979).
En México no se ha encontrado alta incidencia en la población de caninos
callejeros y por lo tanto la prevalencia es escasa, y aunque se conozca su poder
biótico, en zonas urbanas cada vez es menos frecuente encontrar caninos
infectados, este factor se debe a las campañas de desparasitación (RuízEspinoza, 2007).
La prevalencia mundial demuestra que el 10% de parques recreativos estudiados
presentan huevos de Toxocara spp. La seroprevalencia de población adulta sana
es de 8.3% y en un estudio de niños asmáticos se encontró que el 28 % de ellos,
resultaron positivos a antígenos de Toxocara canis (Ghiani, 2001). Un ejemplo
citado recientemente por el Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos
(InDRE-SSA) en México es el que se observó que en una población abierta de 77
pacientes adultos solo el 2.60 % presentó anticuerpos contra Toxocara ( JiménezBalderas et al., 2008). Y en una población de 302 individuos adultos con signos
complatibles a toxocariosis (eosinofilia, problemas respiratorios o problemas
visuales) se detectaron anticuerpos en el 10.9 % (De-la-Rosa et al., 2004).
2.1.1.7. Profilaxis
La profilaxis empleada principalmente para evitar la infección por T. canis, es
básicamente
la
higiene
personal,
higiene
de
mascotas,
asimismo
la
desparasitación frecuente de estas últimas y evitar la defecación al aire libre de
canes (Magnaval et al., 2001).
10
ANTECEDENTES
2.1.2. Trichinella spiralis
La triquinelosis es una zoonosis de origen alimentario frecuente en poblaciones en
donde se consume carne de cerdo cruda o insuficientemente cocida (MartínezBarbosa et al., 2001). El agente etiológico de la triquinelosis es el nematodo
Trichinella spiralis. El ciclo de vida monoxeno se lleva a cabo en un sólo
hospedador, donde se establece en el músculo esquelético e induce alteraciones
en la estructura celular que incrementan su propia sobrevivencia (GállegoBerenguer, 1997).
2.1.2.1. Taxonomía y morfología
La diferenciación de las especies del género Trichinella spp., se basa en las
características morfométricas como el extremo anterior delgado, boca carente de
papilas, faringe con esticocitos, papilas laterales en los machos, la ornamentación
de la cutícula, larvas musculares encapsuladas (Figura 4) y en estudios basados
en pruebas enzimáticas y genéticas (Schmidt y Roberts, 1977).
La clasificación taxonómica de Trichinella spp., se encuentra descrita en la tabla 2
y es una adaptación de la descrita por Bischoff y colaboradores en 2003.
11
ANTECEDENTES
Tabla No. 2. Clasificación taxonómica de Trichinella spp. (Birchoff et al., 2003).
Reino: Animalia
Subreino: Eumetazoa
Dominio: Eukaryota
Rama: Protostomia
Grado: Bilateria
Infrareino: Ecdysozoa
Superphylum: Aschelmintes
Phyllum: Nemathelmintes
Clase: Adenoforea
Subclase: Enoplia
Orden: Enoplida
Suborden: Trichinellina
Superfamília: Trichuroidea
Família: Trichinelloidea
Género: Trichinella
Especie: T. nativa
T. spiralis
T. murrelli
T. pseudospiralis
A
T. papuae
B
T. zimbabwensis
T. nelsoni
T. britovi
T6
C
T9
D
T8
El grupo A se caracteriza por tener una distribución mundial y que presenta
cápsula, el grupo B se caracteriza por que no presenta cápsula además de que su
distribución es mundial, el grupo C se distribuye únicamente en zonas templadas y
el grupo D se distribuye únicamente en zonas cálidas, asimismo los grupos C y D
se presentan en hospedadores específicos.
12
ANTECEDENTES
Hembra
Espículas en machos
LRN
Macho
LM
Figura 4. Morfología de T. spiralis: diferencia de sexos, arreglo de espículas y LM
enquistada. (Fuente: Rodríguez-Uribe, 2003).
2.1.2.2. Ciclo biológico
El ciclo de vida de Trichinella se constituye por dos fases: enteral y parenteral
(Figura 5). En la fase enteral el nematodo adulto dioico se encuentra en el
intestino delgado a nivel de duodeno y yeyuno, la cópula se lleva a cabo a los
cinco días post infección en las paredes de la mucosa y en la luz intestinal, la
hembra libera entre 500 a 1500 larvas recién nacidas (LRN o J1), a partir del
décimo día post infección éstas penetran la mucosa intestinal se dirigen hacia los
vasos sanguíneos y linfáticos hasta entrar a la circulación sistémica invadiendo
múltiples tejidos y encapsulándose únicamente en el músculo estriado en donde
se desarrolla la fase infectiva J2 o larva muscular (LM). En un periodo de 2 a 3
semanas, comenzando así su ciclo de vida parenteral (Despommier, 1983).
El parásito induce en las células musculares modificaciones, iniciando así la
formación de una estructura conocida como “célula nodriza”, la cual es una
13
ANTECEDENTES
asociación entre la larva infectiva y el miocito, a esta nueva entidad se le nombra
como complejo “célula nodriza-larva infectiva” (Despommier et al., 1991).
Figura 5. Ciclo biológico de Trichinella spiralis. (Fuente: Rodríguez-Uribe, 2003).
2.1.2.3. Manifestaciones clínicas y sintomatología
El padecimiento triquinelosis se divide principalmente en tres periodos críticos:
incubación,
migración
y
encapsulamiento
(Olsen,
1974).
Incubación,
posteriormente del 1ro al 5to día post ingestión se presenta un cuadro
gastroentérico que es comúnmente confundido con gastroenteritis (Kilgore et al.,
1988). Migración, a los 15 días post infección ocurre la migración de las larvas J1
al músculo esquelético y se manifiesta por: dolor muscular durante la respiración,
la conversación, el movimiento ocular o durante el masticado, edema
peripalpebral, agrandamiento de los ganglios linfánticos y se puede presentar
14
ANTECEDENTES
fiebre intermitente. Encapsulamiento: a partir de los 35 a 40 días post infección, la
larva se establece en el músculo esquelético (Figura 6 A) y se caracteriza por
mialgias, artralgias, edema (Figura 6 B) y fiebre (Biagi, 1985).
A
B
Figura 6. LM de T. spiralis en la célula nodriza (Foto Ramírez-Melgar) (panel A), Fuente:
InDRE-SSA, 2000 y Edema periorbital (panel B). (Fuente: Medical-Chemical Corporation,
2001).
2.1.2.4. Diagnóstico
Son varias las técnicas para el diagnóstico de la triquinelosis, dichas técnicas se
clasifican en tres importantes tipos:
1. Diagnóstico parasitoscopico que incluye técnicas como triquinoscopía y
digestión enzimática para recuperar larvas musculares (Despommier et al., 1974).
2. Diagnóstico inmunológico que incluye pruebas intradérmicas, fijación del
complemento,
hemaglutinación
indirecta,
floculación
de
bentonita,
inmunoflorescencia indirecta (IFI), contrainmunoelectroforesis, inmunoensayo
enzimatico
(ELISA),
difusión
en
gel-ELISA
(DIG-ELISA)
e
inmunoelectrotransferencia (IET) o Western Blot. (Gómez-Priego et al., 2000;
Tinoco-Velázquez et al., 2002).
15
ANTECEDENTES
3. Diagnótico molecular que incluye pruebas como reacción en cadena de la
polimerasa (PCR por sus siglas en Inglés) y Southern blot (De-la-Rosa y GómezPriego, 2000).
2.1.2.5. Tratamiento
Para el tratamiento se utilizan los bencimidazoles, más específicamente el
albendazol, aunque el mebendazol se administra como segunda opción, la dosis
de ambos fármacos se administra con 400 mg 3 veces al día seguido de 500 mg 3
veces al día durante 3 días, aunque se ha sugerido que la dosis indicada para
administración vía oral de cualquiera de estos dos derivados es de 50 mg/kg
durante 5 días consecutivos (Thomson-PLM, 2007).
Actualmente se administra el albendazol (específico para LM) y su dosis
terapéutica es de 400 mg/día durante 3 días seguido de 800 mg/día durante 15
días ó de 800 mg/día en dosis divididas, durante 6 días. Asimismo para el
tratamiento sintomático se utiliza analgésicos, antipiréticos y corticosteriodes
(McCracken, 1978; Thomson-PLM, 2007; Correa et al., 2006 revisado en Flisser y
Pérez-Tamayo, 2006).
Sin embargo, según en el artículo publicado por De-la-Rosa y colaboradores en el
2007, al administrar un tratamiento subóptimo (20 mg/kg/día) se presenta alta taza
de reducción de gusanos adultos y LM (73% y 90% respectivamente). Lo que
indica que los helmintos sobrevivientes posiblemente hayan desarrollado algún
tipo de resistencia.
2.1.2.6. Distribución geográfica y epidemiología
La triquinelosis presenta amplia distribución mundial. Es frecuente en América,
(aunque no en México (frecuencia < 5%)) y en algunos países de Europa, poco
frecuente en África y Asia y raramente se encuentra en Oceanía (GállegoBerenguer, 1997; De-la-Rosa et al., 1998).
16
ANTECEDENTES
Este padecimiento ha sido estudiado en México desde finales del siglo XIX, en
1862 se descubrió en la ciudad de México que el agente etiológico se encontraba
en carne porcina, y no fue hasta 1891 que se diagnóstico el parásito en cadáveres
de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional Autónoma de México
(Mazzotti revisado en Tay-Zavala et al., 2004). Otros estudios reportados en varios
estados de nuestro país han demostrado la presencia de T. spiralis en ratas
(Rattus norvergicus, Berkenhout, 1769), gatos (Felis catus, Schreber 1775) y
perros (Canis familiaris, Linnaeus 1758). Asimismo se han clasificado como de
alta, mediana y baja prevalencia en diferentes estados de la república mexicana
(Ortega-Pierres et al., 1996), (Figura 7).
Figura 7. Distribución de la triquinelosis en la República Mexicana (numerados). Estados
con alta prevalencia (negro): Distrito Federal, Durango, Estado de México y Zacatecas;
estados con mediana prevalencia (café): Chihuahua, Jalisco y Michoacán; Estados con
baja prevalencia (blanco): Aguascalientes, Guanajuato, Guerrero, Hidalgo, Nuevo León,
Querétaro, Sonora y Veracruz. (Fuente: Ortega-Pirres y colaboradores, 1996).
En México se han presentado numerosos brotes epidémicos de esta zoonosis, sin
embargo es considerado como un problema económico más que de salud pública,
debido a pérdidas ganaderas y a que el diagnóstico no se realiza con frecuencia
17
ANTECEDENTES
en humanos y por lo tanto son pocos los datos reportados por el Sistema Nacional
de Vigilancia Epidemiológica (Martínez-Barbosa et al., 2000).
2.1.2.7. Profixalis
Como profilaxis para la triquinelosis se cita principalmente consumir carne de
cerdo bien cocida o frita, someter a la congelación prolongada (–20ºC) lo que
causa la muerte de las larvas (estas medidas también se aplican a otro tipo de
carne de consumo humano). Mejorar las inspecciones sanitarias en rastros y
mercados, realizar encuestas, establecer diagnósticos epidemiológicos metódicos,
limitar y establecer mejores cercos sanitarios (Gállego-Berenguer, 1997; NOM194-SSA2-2004).
2.2. Inmunología contra Helmintos
Los helmintos parásitos presentan mayor tamaño, tienen estructuras y ciclos de
vida más complejos, por lo que esto hace que presenten mayor número de
antígenos y mayor especificidad por cada etapa de desarrollo del parásito
(Takahashi, 1997).
Los helmintos parásitos inducen una expansión de los linfocitos Th2, dicha
respuesta incluye aumento de concentración de IgE totales, IgG, eosinofilia y
mastocitosis, esta respuesta es inmunitariamente protectora y además se
encuentran citocinas que previenen la patología de algunas parasitosis. Esta
cuestión tiene interés debido a que IgG4 puede bloquear los mecanismos
mediados por IgE aunque ambos isotipos están promovidos por el mismo tipo de
citocinas Th2 (Caballero-Soto, 1998).
Los mecanismos de evasión presentados por los nematodos son los siguientes,
muda de componentes de la superficie de la cutícula, enzimas antioxidantes,
18
ANTECEDENTES
resituación de los tejidos, imitación molecular, camuflaje con moléculas del
hospedador e inmunomodulación (Caballero-Soto, 1998).
La identificación de antígenos que determinan tales respuestas es útil
principalmente
para
una
doble
actividad:
desarrollar
inmunodiagnósticos
provechosos y comprender las bases de la protección inmunitaria, incluso la
proteómica con su consecuente caracterización de antígenos, lo que ayudará a
proponer antígenos como candidatos para vacunas en acción con adyuvantes
(Takahashi, 1997).
2.3. Fármacos antiparasitarios
Los fármacos antiparasitários presentan actividad limitada y en ocasiones
específica contra diversas especies de parásitos, ya sea helmintos o protozoarios.
Los fármacos antiparasitarios en general reúnen las siguientes características:
presentan básicamente carbono, oxígeno, hidrógeno y nitrógeno, los anillos
aromáticos son muy comunes, sus grupos substituyentes con frecuencia son
metilos y aminos. Los principales mecanismos de acción de los antiparasitarios
son: inhibidores de la síntesis de cofactores, inhibidores de la síntesis de ácidos
nucleicos, inhibidores de la síntesis de proteínas, inhibidores de la síntesis de la
membrana, inhibidores de la función microtubular, inhibidores del metabolismo
energético e inhibidores de la función neuromuscular (específicamente para
artrópodos) (Köhler, 2001; Aparicio et al., 2003).
2.3.1. Antihelmínticos
Los antihelmínticos representan el principal método para el control de
nematodiosis, existen varios tipos, aunque los más importantes son las
avermectinas, bencimidazoles y agonistas nicotínicos. Los fármacos disponibles
comercialmente
son:
imidazoles,
tetrahidropirimidinas,
bencimidazoles,
salicilanilidas y avermectinas (Köhler, 2001; Márquez-Lara, 2003).
19
ANTECEDENTES
En muchas ocasiones el descubrimiento de nuevos compuestos químicos para el
control de helmintiosis, han hecho que estos organismos evadan su mecanismo
de acción, por lo que este fenómeno es conocido como resistencia, la cual es
definida como la capacidad que tiene una fracción de la población para tolerar
dosis tóxicas letales, lo que atribuye como característica importante la herencia a
su progene de esta resistencia (Köhler, 2001; Márquez-Lara, 2003).
2.3.1.1. Bencimidazoles
Debido al descubrimiento del tiabendazol en 1961 como potente antiparasitario
sobre helmintos entéricos, se obtuvieron los bencimidazoles (Figura 8) como
antihelmínticos de amplio espectro tanto de importancia clínica y veterinaria
(Craig, 1993; Tracy y Webster, 1996).
Son cientos los derivados que se han probado, como principales ejemplos se
citan:
flubendazol,
triclabendazol,
parbendazol,
febendazol,
oxfendazol,
oxibendazol, proflubendazol, cianida-bencimidazol y selenio-bencimidazol pero
cabe destacar que los compuestos con mayor utilidad terapéutica son aquellos
que presentan modificaciones en las posiciones 2 y 5 o ambas del anillo del
bencimidazol, los cuales son el mebendazol (MBZ), albendazol (ABZ) y el
tiabendazol (TBZ) ya que los otros se han utilizado en menor escala (Karunakaran
y Denham, 1980; Gómez-Barrio et al., 1986; Latif y Surin, 1993; Tracy y Webster,
1996; De-Silva et al., 1997).
Mucho se cuestiona sobre la eficacia de los derivados del bencimidazol como el
tiabendazol para combatir la etapa muscular de las larvas de T. spiralis,
investigaciones como las de Rodríguez-Caabeiro y colaboradoes (1978) y de Hess
y colaboradores (1986) señalan que otro derivado del bencimidazol (el
mebendazol) elimina más del 80 % de larvas musculares en ratones tratados
después de 4 a 15 días post infección.
20
ANTECEDENTES
Estos derivados del bencimidazol presentan gran actividad antihelmíntica, aunque
su acción no depende de la concentración que alcanza a nivel sistémico, sus
productos son altamente eficaces contra diferentes especies de geohelmintos y
helmintos tisulares, ya sea en infecciones únicas o mixtas. Estos bencimidazoles
presentan actividad tanto en fases adultas como fases larvarias, asimismo
destruyen huevos de tricocéfalos y ascáridos (Tracy y Webster, 1996; De-Silva et
al., 1997).
Los bencimidazoles ocasionan muchos cambios bioquímicos en los nemátodos
sensibles a ellos, tales son como inhibición del fumarato reductasa de
mitocondrias, que es vital para la producción de energía, disminución del
transporte de la glucosa y desacoplamiento de la fosforilación oxidativa, pero su
principal mecanismo de acción es inhibir la polimerización de microtúbulos al
unirse a -tubulina (Tracy y Webster, 1996; De-Silva et al., 1997; Köhler, 2001;
Márquez-Lara, 2003).
Los bencimidazoles poseen hidrosolubilidad limitada y las pequeñas diferencias de
solubilidad de los derivados ocasionan un efecto mayor de absorción. El
albendazol por ejemplo, fue utilizado por primera vez en 1977 como vermífugo en
ovejas y en el año de 1983 fue aprobado para humanos. Actualmente es el
antihelmíntico más utilizado para combatir la etapa muscular de T. spiralis y J2 de
T. canis, su absorción es variable e irregular y no se detecta en el plasma porque
es metabolizado rápidamente en el hígado formando sulfóxido de albendazol
(ABZ-SO), este metabolito presenta una potente actividad antihelmíntica. Este
importante metabolito alcanza concentraciones máximas de 300 ng/mL, se liga un
70 % a las proteínas plasmáticas, su vida media en el plasma es de 8 a 9 horas y
se distribuye adecuadamente en los tejidos. La formación del ABZ-SO es
catalizada por la flavida monooxigenasa microsómica y en menor magnitud por
algunas formas del citocromo P450, asimismo el ABZ-SO es oxidado para generar
el metabolito de sulfato el cual es inactivo, los metabolitos son excretados por la
orina (Tracy y Webster, 1996; De-Silva et al., 1997).
21
ANTECEDENTES
Se han realizado estudios con respecto a la utilización de nuevos productos
derivados del albendazol como N-metoxycarbonil-N’-((2-nitro-4-propiltio)-fenil1)
tiourea y N-metoxycarbonil-N’-((2-nitro-5-propiltio)-fenil1) tiourea, concluyendo que
no son muy efectivos en la reducción de fase muscular de T. spiralis (menos del
40%) (Yépez-Mulia et al., 1999).
N
N
H
Figura 8. Fórmula general del bencimidazol, con su amina terciaria en la posición 1.
(Fuente: Ruíz-Espinoza, 2007).
2.3.1.2. Nitazoxanida
La nitazoxanida (2-acetiloxi-N-(5-nitro-2-tiazol) benzamida (Figura 9), es un nuevo
compuesto de nitrotiazol benzamida eficaz para el tratamiento de parasitosis
intestinales ya sea por protozoarios y helmintos, fue sintetizada y descrita por
primera vez en 1976 por Rossignol y Cavier e inicialmente su uso fue
exclusivamente veterinario como antihelmíntico contra nematodos y cestodos
intestinales así como para tremátodos del hígado (Fox y Saravolatz, 2005).
En humanos este fármaco ha sido reportado como eficaz contra diversos
protozooarios parásitos como Giardia lamblia (Kunstler, 1882), Entamoeba
histolytica (Schaudinn, 1903) Trichomonas vaginalis (Donné, 1836) entre otros,
asimismo se reporta eficacia en nematodos como Ascaris lumbricoides (Linnaeus
1758) y Trichuris trichura (Linnaeus, 1771) y en platelmintos como Taenia saginata
(Goeze 1782), Hymenolepis nana (Blachard, 1891) y Fasciola hepatica (Linnaeus,
22
ANTECEDENTES
1751), aunque también presenta buenos efectos antibacteriales (Fox y Saravolatz,
2005).
Estudios in vitro han demostrado buena actividad contra platelmintos como
Echinococcus spp. y F. hepatica. Sobre nemátodos como Ascaris spp., han
presentado efectos nematicidas arriba de un 70 % y en tricocéfalos arriba del
80 %, sin embargo Díaz y colaboradores reportaron una efectividad del 100 %
contra estos nemátodos y posteriormente Fonseca y colaboradores (2000)
demostraron que 1 g/kg in vitro no presenta actividad contra la fase de preadultos
de T. spiralis (Dávila et al., 2002; Díaz et al., 2003; Fonseca et al., 2003; Fox y
Saravolatz, 2005).
La farmacocinética de la nitazoxanida demuestra que en sangre es rápidamente
hidrolisada por las esterasas plasmáticas en tizoxanida (desacetil-nitazoxanida), el
cual es un metabolito activo. Seguida de una administración oral la tizoxanida
alcanza su concentración máxima en plasma entre 1 a 4 horas, su
biodisponibilidad es mejor si se administra el fármaco con alimentos (Laboratorios
Romark, 2005).
La tizoxanida se une casi un 100 % a las proteínas plasmáticas y su vida media de
eliminación por vía renal es de 7.5 horas, su máxima concentración plasmática es
de 1 g/mL. Su mecanismo de acción se basa en inhibir la polimerización de la
tubulina. La tizoxanida es conjugada por glucuronidación para ser excretada. Otros
metabolitos menores que se han encontrado en orina son ácido salicilúrico, sulfato
de tizoxanida, y trazas de hidroxil-tizoxanida y en heces el salicilato (Fox y
Saravolatz, 2005; Laboratorios Romark, 2005).
23
ANTECEDENTES
Figura 9. Fórmula general de la nitazoxanida con su parte activa nitrotia. (Fuente:
Laboratorios Romark, 2005).
2.3.1.3. Compuestos Híbridos
A su fórmula original de algunos fármacos se les hace modificaciones en sus
diferentes grupos funcionales para disminuir o aumentar su actividad, asimismo se
puede dar origen a moléculas híbridas (Figura 10), las cuales son formadas por
algunas de las agrupaciones de los compuestos originales (asociación molecular).
La asociación de partes distintas o mixtas por formación de enlace covalente en
dicho proceso se denomina hibridación molecular (Korolkovas, 1974).
24
ANTECEDENTES
Nitazoxanida con la
nitrotia
Bencimidazol
Compuesto Híbrido
Figura 10. Hibridación molecular: Se tomó la parte activa de la nitazoxanida y la molécula
del bencimidazol, además se realizó una modificación en la posición 2 para aumentar su
actividad
En el presente trabajo se utilizarán una serie de nuevos compuestos híbridos de la
molécula original del benzimidazol y la nitaxozanida para evaluar su eficacia sobre
larva muscular y nematodo adulto de T. spiralis y el juvenil 2 de T. canis, así como
la larviposición de GA en T. spiralis. Asimismo conocer su efecto que pueda tener
la parte farmacofórica de las moléculas originales.
Se buscarán mejores perspectivas terapéuticas, así como baja toxicidad, buena
eficacia y bajo costo como han demostrado los bencimidazoles originales y la
nitazoxanida.
El grupo de investigación consideró que si se unen en una sola molécula la
estructura del bencimidazol junto con la parte activa de la nitazoxanida, se
generará un compuesto antihelmíntico de mayor espectro y eficacia.
Para la síntesis de estas moléculas se calculó el Clog P, el cual indica la
permeabilidad que tiene una molécula para atravesar una membrana biológica. Se
estima que una molécula debe presentar un valor entre 0 y 2. Por otro lado la
solubilidad acuosa debe ser mayor a 100 g/mL para que no presente problemas
25
ANTECEDENTES
de disolución, sobre todo cuando los compuestos se administran por vía oral
(Ruíz-Espinosa, 2007).
En el presente trabajo de tesis se llevará a cabo la evaluación de la actividad
nematicida de cinco híbridos formados del bencimidazol con el 5-nitro-2-tiazol de
la nitazoxanida (Figuras 11 y 12), previamente sintetizados, los cuales se
representan en la tabla 3.
R51
R
N
R
R2
R6
R
2
4
N
RR
1
3
Figura 11. Compuesto madre: molécula del bencimidazol en donde se muestran las
posiciones a los cuales se les unen moléculas activas de otros compuestos, halógenos,
azufre o metilos. (Fuente: Ruíz-espinoza, 2007).
Tabla No. 3. Composición de los compuestos híbridos a evaluar
Posiciones en la molécula del Bencimidazol
Clave
Peso
Molecular
R5
R6
R1
R2
VMAS60
Nitrotia*
H
H
CF3
357.268
VMAS62
Nitrotia*
H
H
SCH3
335.362
VMAS74
Nitrotia*
H
CH3
SCH3
349.388
CPMIV
Nitrotia*
H
CH3
H
303.297
SAG61
Nitrotia*
H
H
SH
321.331
Clog P
2.82
2.90
3.02
1.86
2.90
26
ANTECEDENTES
* Nitrotia
MOLÉCULAS HÍBRIDAS FORMADAS
S
NO2
S
N
NH C
NO2
CF3
O
N
N
NO2
SCH 3
VMAS60
VMAS74
N-(5-Nitro-1,3-tiazol-2(metilsulfuro)-1H-bencimidazol5-carboxamida
1-Metil-N-(5-nitro-1,3-tiazol-2-il)2-(metilsulfuro)-bencimidazol-5carboxamida
S
S
NO2
NH C
N
N
O
NO2
N
NH C
O
1-Metil-N-(5-nitro-1,3-tiazol-2-il)1H-1H-bencimidazol-5carboxamida
N
SH
N
H
NCH 3
CPMIV
SCH 3
NCH 3
VMAS62
N-(5-Nitro-1,3-tiazol-2-il)-2(triflurometil-1H-bencimidazol
-5-carboxamida
N
NH C
N
N
H
N
H
O
S
N
NH C
O
SAG61
N-(5-nitro-1,3-tiazol-2-il)-2(tiol)-1H-bencimidazol-5carboxamida
Figura 12. Compuestos híbridos como resultado de la unión del bencimidazol y la
nitazoxanida, en los cuales se les unió en la posición 5 la nitrotia y en las posiciones 1 y 2
se le realizaron modificaciones uniendo nitrógeno, azufre, metilos y fluor.
27
JUSTIFICACIÓN E HIPÓTESIS
3. JUSTIFICACIÓN
La nitazoxanida y compuestos derivados del bencimidazol, como el albendazol y el
mebendazol, han demostrado actividad antihelmíntica. De acuerdo a la bibliografía
el más efectivo para tratar las nematodiosis es el albendazol, mientras que la
nitazoxanida es un fármaco alterno para la eliminación de parasitosis intestinales.
Ambos compuestos no eliminan el 100 % de las formas parasitarias, ya sea por la
baja biodisponibilidad de los fármacos y/o la resistencia antihelmíntica descrita
recientemente que sus metabolitos han seleccionado. En la literatura no se
describen estudios sobre la efectividad de la nitazoxanida en nematodiosis
tisulares. Por las razones anteriormente expuestas, en el presente trabajo se
evaluará la posible actividad nematicida de cinco nuevos compuestos híbridos de
la fórmula original del bencimidazol y la nitazoxanida sobre diferentes etapas de
desarrollo de T. spiralis y larva migrans de T. canis.
4. HIPÓTESIS
El albendazol y la nitazoxanida de manera independiente presentan una
importante actividad nematicida. Si utilizamos compuestos híbridos de la fórmula
original de ambas moléculas su acción se potencializará, entonces se esperaría
una actividad nematicida similar o esta aumentaría por el efecto sinérgico.
28
OBJETIVOS
5. OBJETIVOS
5.1. OBJETIVO GENERAL
Evaluar la actividad nematicida en Toxocara canis y Trichinella spiralis de cinco
nuevos compuestos híbridos del bencimidazol y la nitazoxanida, denominados
como: VMAS60, VMAS62, VMAS74, SAG62 y CPMIV.
5.2. OBJETIVOS PARTICULARES
1. Evaluar in vitro el efecto parasiticida de los compuestos híbridos sobre la
motilidad del estadío juvenil 2 de T. canis y la larva muscular de T. spiralis.
2. Evaluar in vivo el efecto de los compuestos híbridos sobre la infectividad de la
larva muscular de T. spiralis a través del índice de capacidad reproductiva.
3. Evaluar in vitro el efecto parasiticida y/o inhibidor de la fecundidad de los
compuestos híbridos sobre el adulto de T. spiralis.
29
DIAGRAMA DE FLUJO
6. DIAGRAMA DE FLUJO DEL DESARRROLLO EXPERIMENTAL
Estandarización de las técnicas para obtención de los helmintos
Trichinella spiralis
Propagación y mantenimiento en
medio de cultivo de LM y GA
Toxocara canis
Embrionación, eclosión y mantenimiento
en medio de cultivo de J2
Tratamiento de los cinco compuestos híbridos del bencimidazol y la nitaxozanida a
concentraciones logarítmicas de 0.01 a 100 g/mL
Periodo de Incubación de 2 y 6 horas
Someter 20 nemátodos de cada especie por concentración
Evaluar la motilidad en los parásitos del experimento
de acuerdo al método realizado por Kiuchi y colaboradores en 1987
5 corridas por 5 replicas cada una
Viabilidad
Cristal violeta al 1 %
J2 de T. canis
LM de T. spiralis
GA de T. spiralis
Índice de capacidad reproductiva
en LM de T. spiralis
Índice de larviposición
en GA de T. spiralis
Registro de Resultados
Análisis y discusión de Resultados
30
MATERIALES Y MÉTODOS
7. MATERIALES Y MÉTODOS
7.1. Evaluación in vitro de los compuestos híbridos del bencimidazol y la
nitaxozanida (VMAS60, VMAS62, VMAS74, SAG61 y CPMIV) sobre la
motilidad de los modelos experimentales J2 de Toxocara canis, LM de
Trichinella spiralis y GA de Trichinella spiralis
7.1.1. Obtención y mantenimiento en medio de cultivo de la fase juvenil 2 (J2)
de Toxocara canis
Para la obtención de los nematodos adultos de Toxocara canis sólo se emplearon
perros que fueron sacrificados en los centros antirrábicos del Estado de México
(Ecatepec) y en la Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán de la UNAM, de los
cuales fueron extraídos los parásitos.
1. Se obtuvieron especimenes hembras de T. canis a partir de necropsias de
cachorros caninos mayores a 5 semanas de nacidos, infectados naturalmente. Se
diseccionó el intestino delgado de los cachorros y se colectaron los nematodos
adultos (Figura 13 A).
2. Los adultos hembras de T canis se lavaron con solución salina y sobre una
charola de disección se separó la parte media del pseudoceloma del nematodo
para extraerle el útero. Los ejemplares machos se descartaron (Figura 13 B y C).
3. El útero se lavó con PBS 1X y se colocó en una solución de formol al 1 %
disuelto en PBS 1X. Posteriormente se seccionó para liberar la mayor cantidad de
huevos. Los huevos inmaduros se colocaron en una solución de formol al 1 % a
temperatura ambiente y se incubaron durante 4 semanas.
4. Posteriormente al periodo de incubación, se observó que los huevos ya
presentaban el estadío juvenil 2 (estadío infectivo de la enfermedad toxocariosis)
(Figura 13 D). Los diferentes rendimientos de embrionación (obtenidos en
31
MATERIALES Y MÉTODOS
porcentaje) hasta J2 de T. canis de los tres lotes adquiridos (cada uno consistente
en aproximadamente 2500 huevos) se obtuvieron a 30 ± 10 %, 40 ± 10 % y
70 ± 10 % y pueden ser atribuibles a los mecanismos que se siguieron en el
sacrificio de los cachorros.
5. Los huevos embrionados se lavaron varias veces con solución salina 0.8 % por
centrifugación y resuspensión alternadas. Posterior al último lavado el botón
resultante se resuspendió en una solución de hipoclorito de sodio al 1 % y se agitó
manualmente durante 20 minutos (De-Savigny, 1975).
6. Transcurrido este tiempo y en condiciones estériles, los huevos de T. canis se
lavaron 4 veces con solución salina al 0.8 % estéril por centrifugación y
resuspensión alternadas. Posteriormente se lavaron 4 veces con medio de cultivo
(MEM + glucosa) estéril por centrifugación y resuspensión alternadas.
A
B
C
D
Figura 13. Colección de T. canis del intestino de un canino (panel A), Adultos de T. canis
en solución salina (panel B), Extracción del útero de hembras de T. canis (panel C) y
Embrionación en huevos de T. canis, se observa la presencia de la fase juvenil 2 de
izquierda a derecha (400X) (panel D).
32
MATERIALES Y MÉTODOS
7. El cuarto lavado no se desecho si no se resuspendió junto con el botón de
huevos y se colocó en agitación magnética durante una hora en condición estéril.
Este procedimiento se realizó para acelerar el proceso de eclosión de los J2 de T.
canis. Se observó que los J2 se liberaron del cascarón (Figura 14 A y B).
8. Para separar los J2 del cascarón se utilizaron microembudos tipo Baermann, los
cuales consistieron en una pipeta tipo Pasteur de vidrio a la cual se le adiciona un
trozo de algodón y esta se colocó dentro de un tubo de vidrio de 1.6 cm x 12.5 cm
con tapón de rosca, dicho sistema se esterilizó en autoclave (Adams y Kayes,
1979) (Figura 14 C).
9. Antes de la separación en condición estéril, se adicionó MEM + glucosa dentro
del tubo hasta cubrir el algodón, después se le agregó lentamente la suspensión
de huevos utilizando una pipeta tipo Pasteur (1 mL por tubo).
10. El cultivo se incubó en estufa bacteriológica a 37ºC y en cámara de CO 2
durante 24 horas.
11. Posterior al cultivo, con mucho cuidado se retiró la pipeta tipo Pasteur y se
recuperaron los J2 del fondo del tubo. Estos se guardaron en un tubo estéril con
medio de cultivo a 37ºC hasta su evaluación con los compuestos (Figura 14 D).
33
MATERIALES Y MÉTODOS
A
C
B
D
Figura 14. Eclosión de los J2 (400X y 100X) (panel A y B), Microembudos tipo Baermann
(Panel C) y J2 de Toxocara canis, liberadas en medio de cultivo (100X) (panel D).
7.1.2. Obtención y mantenimiento en medio de cultivo de larvas musculares
(LM) de Trichinella spiralis
1. Se obtuvo la cepa MSUS/México/92/CM-92 de Trichinella spiralis de un modelo
murino y se propagó en ratas cepa Wistar machos y edad adulto joven (250-300 g)
a la dosis oral infectiva de 28 LM por gramo de peso por rata (se utiliza una
micropipeta de 100 L para administrar solamente 100 L de solución con las LM)
(Figura 15 A) (De-la Rosa y Correa, 1996).
2. Al cabo de 40 días post infección (dpi) se le realizó la necropsia a una rata y se
obtuvo el diafragma, lengua, músculo esquelético y maceteros, asimismo se
extrajeron las vísceras, la cabeza y la piel, los cuales fueron desechados.
34
MATERIALES Y MÉTODOS
3. Se partió la carcasa junto con los huesos en pedazos pequeños y se molieron, a
esta molienda se le agregó pepsina (0.1 g por cada gramo de peso), agua y HCl a
37.9% (0.1 mL por cada gramo de peso) y se procedió a digerir a 37ºC durante 3
horas (Figura 15 B, C y D).
4. Se sedimentó el producto de la digestión para que las LM por gravedad
formaran un botón de color rosado en el fondo de la copa de sedimentación, este
se recuperó y se lavó varias veces con PBS 1X hasta que estuviera libre de
detritus (Figura 15 E y F).
5. Transcurrido este tiempo y en condiciones estériles las LM de T. spiralis se
lavaron 4 veces con PBS 1X estéril por centrifugación y resuspensión alternadas.
Posteriormente se lavaron 4 veces con medio de cultivo (MEM + glucosa) estéril
por centrifugación y resuspensión alternadas.
6. Se colocaron las LM en un tubo cerrado con MEM + glucosa estéril a
temperatura ambiente hasta su evaluación con los compuestos (no más de 48
horas) (Figura 15 G).
35
MATERIALES Y MÉTODOS
B
C
A
G
D
F
E
Figura 15. Infección de T. spiralis por vía oral en modelo murino (panel A), Carcasa
(panel B), Molienda (panel C), Digestión enzimática a 37°C (panel D), Embudos de
sedimentación (panel E), T. spiralis liberadas de la célula nodriza, 10X (panel F) y
mantenimiento de T. spiralis en medio de cultivo (panel G).
7.1.3. Obtención y mantenimiento en medio de cultivo de gusanos adultos
(GA) de Trichinella spiralis
1. De la cepa propagada, se obtuvieron LM de T. spiralis a los 45 días post
infección y se infectaron ratones cepa CD1 o ratas cepa Wistar, ambos machos
adultos jóvenes (250-300 g) a la dosis infectiva de 28 LM por gramo de peso por
ratón.
2. Los gusanos adultos se obtuvieron a partir de la disección del intestino delgado
del murino a los 7 días post infección (Dennis y Despommier, 1970). En este
método se sacrificó al murino por dislocación cervical, ya que el éter mata a los
adultos de T. spiralis (Figura 16 A).
36
MATERIALES Y MÉTODOS
3. Se realizó un corte longitudinal al intestino, se colocó en una rejilla sumergida
en una solución de PBS 1X a 37ºC y se incubó durante 2 horas (Figura 16 B).
4. Pasado este periodo los gusanos adultos machos y hembras se recuperaron de
la solución mediante centrifugación a 3500 rpm y se lavaron varias veces con PBS
1X, hasta que estuvieran libres de detritus (Figura 16 C).
5. Transcurrido este tiempo y en condiciones estériles los GA de T. spiralis se
lavaron 4 veces con PBS 1X estéril por centrifugación y resuspensión alternadas.
Posteriormente se lavaron 4 veces con medio de cultivo (MEM + glucosa) estéril
por centrifugación y resuspensión alternadas. Se prosiguió a evaluar el efecto
nematicida de los compuestos experimentales.
A
B
a
b
b
C
Figura 16. Disección del intestino delgado del murino experimentalmente infectado (panel
A), Incubación para la obtención de los gusanos adultos (panel B) y Gusanos adultos de
T. spiralis recuperados (100X), se observa la hembra (a) y el macho (b).
37
MATERIALES Y MÉTODOS
7.1.4. Determinación in vitro de la actividad nematicida de los compuestos
híbridos el bencimidazol y la nitazoxanida
1. Se evaluó in vitro la posible actividad nematicida de cinco nuevos compuestos
híbridos del bencimidazol y nitazoxanida (clave VMAS60, VMAS62, VMAS74,
CPMIV y SAG61) sobre la motilidad y viabilidad los J2 de Toxocara canis, las LM
de T. spiralis y los GA de T. spiralis, de igual manera se evaluó el albendazol
(como derivado del bencimidazol mas común en el tratamiento de la toxocariosis y
triquinelosis) y la nitazoxanida (fármaco alterno utilizado contra helmintiosis
tisulares).
2. Se obtuvieron los compuestos experimentales y los dos antihelmínticos
comerciales para aplicar éstos últimos como controles positivos, los cuales se
estandarizaron
(se
realizaron
diluciones
logarítmicas)
de
acuerdo
a
la
biodisponibilidad del albendazol y de la nitazoxanida (concentración máxima
plasmática / tiempo) señalada por los laboratorios GlaxoSmithKline® y Romark®.
Como testigos negativos se utilizó el medio de cultivo sin compuestos a evaluar y
dimetil sulfóxido (DMSO).
3. Sobre una placa de cultivo estéril de 96 pozos se colocó una serie de
concentraciones logarítmicas de 100
g/mL a 0.01
g/mL de los compuestos
problema, se utilizó como disolvente DMSO, el cual al evaluar los fármacos este
no debió ser mayor a 2.5 %.
4. En cada pozo de la placa de cultivo se colocó un volumen de 100 L con una
suspensión de 20 gusanos fase juvenil 2 o 20 larvas musculares o gusanos
adultos (T. canis y T. spiralis respectivamente).
5. Cada placa de cultivo se dejo en incubación por periodos de 2, 6 y 12 horas a
37ºC, se utilizaron estos rangos considerando el tiempo máximo de la
concentración plasmática del albendazol y la nitazoxanida, asimismo la vida media
38
MATERIALES Y MÉTODOS
de ambos fármacos (Figura 17) (Tracy y Webster, 1996; Laboratorios Romark,
2005)
6. El siguiente criterio se empleó para evaluar la motilidad a los J2, las LM y los
GA después de haberse sometido al tratamiento, asignando una escala de mayor
a menor de acuerdo a lo reportado por Kiuchi y colaboradores en 1987:
Movimiento del todo el cuerpo: 3
Movimiento de la mitad del cuerpo: 2
Motilidad de una parte del cuerpo ó LM de T. spiralis enrollada: 1
Muerto: 0
7. La viabilidad se observó tiñendo los helmintos con el colorante vital cristal
violeta al 1 %, siguiendo el criterio de que si se teñían en su totalidad éstos
encontraban muertos.
Figura 17. Placa de cultivo con helmintos y compuestos experimentales.
7.1.5. Efecto de los compuestos híbridos sobre el Índice de la capacidad
reproductiva o capacidad infectante (RCI por sus siglas en inglés) en LM de
Trichinella spiralis
1. Se evaluó el Índice de capacidad reproductiva de cinco nuevos compuestos
híbridos del bencimidazol y la nitazoxanida (clave VMAS60 VMAS62, VMAS74,
SAG61 y CPMIV) sobre la fase LM de Trichinella spiralis.
39
MATERIALES Y MÉTODOS
2. Para realizar este experimento se colocaron sobre una placa de cultivo de 24
pozos una serie de concentraciones logarítmicas de 100 g/mL a 0.1 g/mL de los
compuestos problema y los testigos. Se consideró la biodisponibilidad máxima del
albendazol de 0.250 a 0.300 g/mL y la nitazoxanida de 1 g/mL (Tracy y Webster,
1996; Laboratorios Romark, 2005).
3. En cada pozo de la placa de cultivo se colocó un volumen de 500 L con una
suspensión de 600 larvas musculares (LM).
4. La placa se dejó en incubación durante 2 y 6 horas a 37ºC, se utilizó este rango
considerando el tiempo máximo de la concentración plasmática del albendazol y la
nitazoxanida (Tracy y Webster, 1996; Laboratorios Romark, 2005).
5. Posteriormente a esos periodos de incubación, se recuperaron las LM y se
lavaron tres veces con PBS 1X para eliminarles el exceso de los compuestos. In
vivo las LM se utilizaron para infectar a ratones cepa CD1 agrupados de acuerdo a
cada compuesto experimental y a cada dosis de tratamiento. De manera que por
cada compuesto experimental (n = 9) y cada tratamiento (n = 4) fueron 5
repeticiones, aunado a que los experimentos se hicieron con 2 y 6 horas de
incubación.
6. El Índice de capacidad reproductiva o capacidad infectante se calculó de
acuerdo a la fórmula:
No. de LM recuperadas por ratón
RCI =
No. de LM administradas por ratón
40
MATERIALES Y MÉTODOS
7.1.6. Efecto de los compuestos híbridos sobre el índice de larviposición de
adultos hembras de Trichinella spiralis
1. Los gusanos adultos posterior a la exposición con los compuestos, se incubaron
a 37ºC durante 24 horas para que las hembras larvipusieran, en este periodo se
obtiene un máximo de larvas recién nacidas (LRN) liberadas.
2. Pasado las 24 horas se realizó el conteo de LRN y de gusanos adultos hembras
3. El Índice de larviposición se calculó mediante la fórmula:
No. de Larvas recién nacidas
IL =
No. de Gusanos adultos hembras
7.1.7. Análisis estadístico
1. Se realizó análisis porcentual de la escala de motilidad, índice de capacidad
infectante e Índice de larviposición (Daniels, 1992).
2. Se realizó un análisis de varianza monofactorial, para encontrar semejanzas y
diferencias entre los grupos experimentales y las escalas de motilidad con ayuda
de el Sofware Excel(R) 2003.
41
RESULTADOS
8. RESULTADOS
8.1. Efecto in vitro de los compuestos híbridos del bencimidazol y la
nitaxozanida sobre la motilidad del segundo estadío juvenil (J2) de Toxocara
canis.
Los datos de todos los grupos de tratamiento fueron analizados por la prueba de
varianza monofactorial (ANOVA). Asimismo se analizó la interacción entre el
efecto nematicida y tratamiento.
El criterio para evaluar la motilidad fue implementado de acuerdo a lo reportado
por Kiuchi y colaboradores en 1987, de tal manera que la escala se muestra en
cuatro diferentes colores, representándose así: escala 3, movimiento de todo el
cuerpo y de color negro, escala 2, movimiento de la mitad del cuerpo y de color
azul rey, escala 1, movimiento de una parte del cuerpo y de color azul claro y
escala 0, muerta y de color blanco.
La figura No. 18 muestra la escasa actividad nematicida de los compuestos
híbridos sobre los juveniles 2 de T. canis (promedio de la motilidad relativa) y
testigos. A una concentración de 100
g/mL la nitazoxanida registró alta
mortalidad a las 2 horas postratamiento, mostrando una diferencia significativa (p
= 0.0001) con relación al control negativo (DMSO) y los demás compuestos. A las
6 horas la actividad nematicida fue más notoria, aproximadamente la motilidad del
No. 1 aumentó un 10 % (p = 0.034).
El albendazol presentó menor actividad nematicida (motilidad No. 0) y disminución
de la motilidad vigorosa (No. 1) en comparación con la nitazoxanida. A todos los
tiempos registrados, la actividad de los compuestos híbridos fue menor o
semejante a la originada por el albendazol, no se registró diferencia significativa
en la disminución de la motilidad (p > 0.05).
42
RESULTADOS
La nitazoxanida presentó mayor mortalidad a dosis de 10 g/mL en el periodo de 2
y 6 horas postratamiento en comparación con el testigo negativo DMSO, sin
embargo estas diferencias no fueron tan marcadas en las lecturas de las 12 horas
y por lo tanto éstas no fueron significativas (p > 0.05) con la actividad de los
compuestos híbridos.
A las 12 horas de tratamiento el efecto de los compuestos híbridos sobre la
motilidad y viabilidad no fue posible determinarlo, ya que el control sin compuestos
mostró que las condiciones ambientales afectaron a los J2, por lo tanto los
resultados a las 12 horas presentan gran heterogeneidad en los grupos testigos,
por lo que los datos no fueron considerados para el análisis de resultados.
Se muestran los resultados obtenidos con: VMAS60 (1), VMAS62 (2), VMAS74
(3), CPMIV (4), SAG61 (5), NTZ (6), ABZ (7), DMSO (8) y Sin tratamiento (9).
43
RESULTADOS
2 Horas
0.01 g/ml
0.1 g/ml
6 Horas
100%
100%
100%
50%
50%
50%
0%
0%
0%
100%
100%
100%
50%
50%
50%
0%
0%
100%
100%
100%
50%
50%
50%
0%
0%
0%
100%
100%
100%
50%
50%
50%
0%
0%
0%
100%
100%
100%
50%
50%
50%
0%
0%
0%
1 g/ml
10 g/ml
100 g/ml
1
2
3
4
5
6
7
8 9
12 Horas
Horas
0%
1
2
3 4
5
6
7
8 9
1
2
3 4
5
6
Compuestos y testigos
3
2
1
0
Figura 18. Efecto de los compuestos híbridos del bencimidazol y la nitazoxanida así como
los testigos sobre juveniles 2 de T. canis, tratados con una concentración de 0.01, 0.1, 1,
10 y 100
g/mL, medida a través de la motilidad (promedio de la motilidad relativa).
Lectura a las 2, 6 y 12 horas.
44
7
8
9
RESULTADOS
8.2. Viabilidad de juveniles 2 de Toxocara canis
Para observar la viabilidad de los J2 se utilizó el colorante vital cristal violeta al
1 %, el cual no tiñó a los J2 cuando éstos estaban viables. En general la prueba
coincide con número registrado de ejemplares vivos y muertos (Figura 19).
A
B
Figura 19. Micrografías de J2 viable (panel A) y J2 no viable, completamente teñida
(panel B) a 400 X.
8.3. Efecto in vitro de los compuestos híbridos del bencimidazol y la
nitaxozanida sobre la motilidad de la larva muscular (LM) de Trichinella
spiralis (LM)
A partir de los modelos murinos infectados experimentalmente con T. spiralis se
obtuvo un número considerable de LM (por cada 7000 LM como dosis de infección
se logró una recuperación de 100,000 LM a los 40 días post infección).
Los datos de los grupos de cada tratamiento fueron analizados por la prueba de
varianza monofactorial (ANOVA). Asimismo se analizó la interacción entre el
efecto nematicida y tratamiento.
45
RESULTADOS
El criterio para evaluar de la motilidad fue implementado de acuerdo a lo reportado
por Kiuchi y colaboradores en 1987, de tal manera que la escala se muestra en
cuatro diferentes colores, representándose así: escala 3, movimiento de todo el
cuerpo y de color negro, escala 2, movimiento de la mitad del cuerpo y de color
azul rey, escala 1, movimiento de una parte del cuerpo y de color azul claro y
escala 0, muerta y de color blanco.
La figura No. 20 muestra la actividad nematicida sobre ejemplares LM de T.
spiralis tratados con los compuestos híbridos (promedio de la motilidad relativa) y
testigos. A dosis de 100
g/mL ninguno de los compuestos activos presentó
actividad nematicida semejante a la nitazoxanida y al albendazol después de las 2
horas de incubación. Aunque disminuyó la motilidad relativa de T. spiralis durante
el tiempo de exposición a los compuestos experimentales, ninguno de ellos
presentó actividad nematicida a las 6 horas.
La nitazoxanida a 100 g/mL disminuyó la motilidad en LM a partir de las 2 horas
postratamiento (p = 0.007 (Motilidad No. 3), p = 0.525 (Motilidad No. 2), p = 0.014
(motilidad No. 1), valores con diferencia significativa al compararla con el DMSO, y
los grupos experimentales. Asimismo la nitazoxanida utilizada a 10
g/mL,
presentó una diferencia significativa a las 6 horas postratamiento (0.029 (motilidad
No. 3), 0.671 (motilidad No. 2), 0.766 (motilidad No. 1)) en comparación con el
DMSO y los grupos experimentales.
Después del tratamiento con 1 g/mL, 0.1 g/mL y 0.01 g/mL, se observó una
actividad nematicida nula sobre los ejemplares LM de T.spiralis tratados con los
compuestos híbridos.
Aunque disminuyó la motilidad relativa de T. spiralis durante el tiempo de
exposición a los compuestos experimentales, ninguno de de ellos presentó
actividad nematicida a las 12 horas. En general todos los compuestos
experimentales y testigos mostraron un patrón similar, el análisis estadístico
46
RESULTADOS
corroboró que no hay diferencia significativa entre los grupos experimentales y
controles (p > 0.05).
Se muestran los resultados obtenidos con: VMAS60 (1), VMAS62 (2), VMAS74
(3), CPMIV (4), SAG61 (5), NTZ (6), ABZ (7), DMSO (8) y Sin tratamiento (9).
47
RESULTADOS
2 Horas
6 Horas
100%
100%
100%
50%
50%
50%
0%
0%
12 Horas
Horas
0.01 g/ml
0.1 g/ml
0%
100%
100%
100%
50%
50%
50%
0%
0%
0%
100%
100%
100%
1 g/ml
50%
50%
50%
0%
0%
0%
100%
100%
100%
50%
50%
50%
0%
0%
0%
10 g/ml
100%
100%
100%
50%
50%
50%
0%
0%
0%
100 g/ml
1
2
3
4
5
6
7
8 9
1
2
3 4
5
6
7
8 9
1
2
3 4
5
6
Compuestos y Testigos
3
2
1
0
Figura 20. Efecto de los compuestos híbridos del bencimidazol y la nitazoxanida así como
los testigos sobre larvas musculares de T. spiralis, tratadas con una concentración de
0.01, 0.1, 1, 10 y 100 g/mL, medida a través de la motilidad (promedio de la motilidad
relativa). Lectura a las 2, 6 y 12 horas.
48
7
8
9
RESULTADOS
8.4. Viabilidad de larvas musculares de Trichinella spiralis
En la figura 21 se observa la viabilidad de las LM, se utilizó el colorante vital cristal
violeta al 1 %, el cual indicó si una LM fue viable o no, observando LM sin teñir y
completamente enrollada (viable) o teñida en su totalidad y además adquirieron
forma de garfio (no viable).
A
B
Figura 21. Micrografías de Trichinella spiralis. LM viable (enrollada) a 1000 X y LM no
viable (forma de garfio y completamente teñida) a 400 X (panel A y B respectivamente).
8.5. Efecto de los compuestos híbridos del bencimidazol y la nitaxozanida
sobre el índice de capacidad reproductiva de Trichinella spiralis (LM).
El índice de capacidad reproductiva (RCI) o índice de capacidad infectante fue
calculado mediante la fórmula correspondiente al número de LM recuperadas
entre el número de larvas administradas (n = 120). Los datos de todos los grupos
de tratamiento fueron analizados por la prueba de varianza monofactorial ANOVA.
Asimismo se analizó la interacción entre el efecto nematicida y tratamiento.
El análisis de datos con ANOVA muestran diferencias significativas al utilizar los
compuestos y testigos a una concentración de 100
g/mL y 10
g/mL en un
periodo de tratamiento de 2 y 6 horas, sin embargo ya no se presenta diferencia
49
RESULTADOS
significativa a las concentraciones de 1 y 0.1 g/mL, en un periodo de 2 y 6 horas
post tratamiento.
La figura No. 22 muestra el índice de capacidad reproductiva (RCI) de ejemplares
LM de T. spiralis tratados con los compuestos experimentales (promedio de RCI ±
DS) y testigos. La lectura se realizó a las 2 y 6 horas. Se presentaron valores con
diferencia significativa (p = 0.0003 y p = 0.0012) a partir de las 2 horas, en la
reducción del RCI al tratar LM con los compuestos VMAS60 (el 95 %), VMAS62
(el 98 %), albendazol (el 99 %) y nitazoxanida (el 98 %) a una concentración de
100 g/mL, los cuales se compararon con el DMSO (47 %).
Los valores estadísticos del índice de capacidad reproductiva de las LM de T.
spiralis tratadas con una concentración de 10
g/mL, mostraron diferencia
significativa (p < 0.05) en la reducción del RCI al utilizar el compuesto VMAS60 y
los fármacos testigos de referencia albendazol y nitazoxanida.
Después del tratamiento con 1
g/mL y 0.1
g/mL con los compuestos
experimentales, el RCI de las LM de T. spiralis, demostró que los valores
estadísticos no tuvieron diferencia significativa (p > 0.05) en la reducción de carga
parasitaria, comparándolos con el DMSO.
Se muestran los resultados obtenidos con: VMAS60 (1), VMAS62 (2), VMAS74
(3), CPMIV (4), SAG61 (5), NTZ (6), ABZ (7), DMSO (8) y Sin tratamiento (9).
50
RESULTADOS
2 Horas
0.1 g/ml
6 Horas
100
100
50
50
0
0
90
1 g/ml
90
45
45
0
0
10 g/ml
100 g/ml
80
80
40
40
0
0
80
80
40
40
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1
2
3
4
5
6
7
8
Compuestos y Testigos
Figura 22. Índice de capacidad reproductiva de las LM tratadas con los compuestos
híbridos del bencimidazol y la nitazoxanida (promedio de RCI en los compuestos
experimentales) a una dosis de 0.1, 1, 10, 100 g/mL. La lectura se llevó a cabo a las 2
horas y a las 6 horas.
51
9
RESULTADOS
8.6. Efecto in vitro de los compuestos híbridos del bencimidazol y la
nitaxozanida sobre la motilidad del estado adulto de Trichinella spiralis
A partir de modelos murinos infectados experimentalmente con T. spiralis se
obtuvo un número considerable de gusanos adultos (por cada 7000 LM como
dosis de infección se logró una recuperación de 700 GA a los 6 días post
infección, extraídos del intestino delgado).
Para realizar éste experimento, los datos de todos los grupos de tratamiento
fueron analizados por la prueba de varianza monofactorial (ANOVA). Asimismo se
analizó la interacción entre el efecto nematicida y tratamiento.
El criterio para evaluar de la motilidad fue implementado de acuerdo a lo reportado
por Kiuchi y colaboradores en 1987, de tal manera que la escala se muestra en
cuatro diferentes colores, representándose así: escala 3, movimiento de todo el
cuerpo y de color negro, escala 2, movimiento de la mitad del cuerpo y de color
azul rey, escala 1, movimiento de una parte del cuerpo y de color azul claro y
escala 0, muerta y de color blanco.
En la figura No. 23 se muestran los resultados obtenidos posterior al tratamiento
con de los compuestos híbridos, en los cuales se observó escasa actividad
nematicida (promedio de la motilidad relativa) y testigos, sobre GA de Trichinella
spiralis. Con una dosis de 100 µg/mL, todos los compuestos presentaron un patrón
similar, aunque se ve una reducción de motilidad No. 2. con el albendazol a las 6
horas postratamiento, por lo que el 100% de los GA presentó una motilidad No. 1,
obteniendo así un valor estadístico significativo (p = 0.004) en relación a los
demás compuestos experimentales y el DMSO.
Al tratar con los compuestos híbridos a concentraciones de 10 g/mL, 1 g/mL,
0.1 g/mL y 0.01 g/mL se observa la escasa actividad nematicida sobre los GA
de T. spiralis. Todos los compuestos presentaron un patrón similar, por lo que no
52
RESULTADOS
se presenta diferencia significativa entre los grupos experimentales y testigos
(p > 0.05).
A las 12 horas de tratamiento el efecto de los compuestos sobre la motilidad y
viabilidad no fue posible determinarlo, ya que los controles sin fármacos mostraron
que las condiciones del ambiente afectaron a los GA. Por lo tanto los resultados
no fueron considerados en el análisis.
Se muestran los resultados obtenidos con: VMAS60 (1), VMAS62 (2), VMAS74
(3), CPMIV (4), SAG61 (5), NTZ (6), ABZ (7), DMSO (8) y Sin tratamiento (9).
53
RESULTADOS
2 Horas
0.01 g/ml
6 Horas
100%
100%
100%
50%
50%
50%
0%
0.1 g/ml
0%
0%
100%
100%
100%
50%
50%
50%
0%
0%
0%
100%
100%
100%
12 Horas
Horas
1 g/ml
50%
50%
50%
0%
0%
0%
100%
100%
100%
50%
50%
50%
10 g/ml
0%
0%
0%
100%
100%
100%
50%
50%
50%
0%
0%
0%
100 g/ml
1
2
3 4
5
6
7
8
9
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1
2
3 4
5
6
7
Compuestos y Testigos
3
2
1
0
Figura 23. Efecto de los compuestos híbridos del bencimidazol y la nitazoxanida así como
los testigos sobre gusanos adultos de T. spiralis, tratados con una concentración de 0.01,
0.1, 1, 10 y 100 g/mL, medida a través de la motilidad (promedio de la motilidad relativa).
Lectura a las 2, 6 y 12 horas.
54
8 9
RESULTADOS
8.7. Viabilidad en adultos de Trichinella spiralis
Para observar la viabilidad del estado GA se utilizó el colorante vital cristal violeta
al 1 %, el cual no tiñó a los GA viables. En general, la prueba coincide con el
número registrado de ejemplares vivos y muertos (Figura 24).
A
B
Figura 24. Micrografía de Trichinella spiralis: Gusano adulto viable y no viable
(completamente teñido) a 400 X (panel A y B respectivamente).
8.8. Efecto in vitro de cinco compuestos híbridos del bencimidazol y la
nitaxozanida sobre la índice de larviposición (IL) de Trichinella spiralis
(gusanos adultos)
Para el análisis de datos, el índice de larviposición (IL) fue calculado mediante la
fórmula correspondiente al número de larvas recién nacidas (LRN) recuperadas
entre el número de gusanos adultos hembras. Se realizó la lectura a las 24 horas
postratamiento, después de evaluar la motilidad de los gusanos adultos. Este
tiempo fue considerado para tener el máximo de LRN y poder de esta manera
realizar el conteo con más exactitud. Los datos de todos los grupos de tratamiento
fueron analizados por la prueba de varianza monofactorial ANOVA.
55
RESULTADOS
En la figura No. 25 se presenta el índice de larviposición (IL) de ejemplares GA
hembras de T. spiralis tratados. En el eje de las ordenadas se representan los
compuestos y testigos y en el eje de las abscisas se representa el índice de
larviposición.
A la concentración de 100 g/mL (Promedio de IL ± DS) y testigos, se presentó un
valor significativo (p = 0.0002), en la reducción del IL (95 %) al utilizar los
compuestos VMAS60, VMAS62 y los fármacos de referencia, en comparación con
el DMSO.
El índice de larviposición (IL) de ejemplares LM de T. spiralis tratados con los
compuestos híbridos a las concentraciones de 10
0.01
g/mL, 1 g/mL, 0.1
g/mL y
g/mL, con un periodo de incubación de 24 horas, no presentó diferencia
significativa (p > 0.05), por lo que se estableció que únicamente hubo efecto sobre
el índice de larviposición al utilizar una concentración de 100 g/mL.
56
RESULTADOS
100 g/ml
10 g/ml
Índice de larviposición
80
40
Tx
SI
N
M
SO
D
N
AL
B
TZ
PM
IV
C
G
61
SA
AS
74
VM
AS
62
VM
VM
AS
60
0
1 g/ml
0.1 g/ml
0.01 g/ml
50
AL
B
N
M
SO
SI
N
Tx
D
VM
TZ
0
AS
6
VM 0
AS
VM 62
AS
74
SA
G
61
C
PM
IV
Índice de larviposición
100
Figura 25. Índice de larviposición (Promedio de IL) de los GA hembras tratadas con los
compuestos experimentales a la concentración de 100, 10, 1, 0.1 y 0.01 g/mL.
57
RESULTADOS
En la figura No. 26 se muestran larvas recién nacidas, después de 24 horas de
incubación postratamiento, las micrografías no registran daños aparentes con el
aumento utilizado (400 X).
Figura 26. Micrografías de LRN de Trichinella spiralis, las flechas señalan las LRN. No se
observaron alteraciones (400X).
58
DISCUSIÓN
9. DISCUSIÓN
Los estudios que se han realizado in vitro con helmintos, donde se ha demostrado
la actividad nematicida de algunos compuestos químicos, aún no han utilizado
compuestos híbridos de moléculas líderes en la industria farmacéutica, las cuales
se administran para la eliminación de parasitosis, tales como los carbamatos
derivados del bencimidazol (albendazol, mebendazol, etc.) y el nitrotiazol
benzamida (Holt, et al., 1981; Laboratorios Romark, 2005).
En el presente trabajo se observó que la nitazoxanida presenta in vitro 2 veces
más actividad nematicida en comparación al albendazol, dicho resultado puede
ser de interés ya que hasta donde se conoce no está descrita su actividad sobre
este parásito. A los tiempos y concentraciones valorados, los cinco derivados
evaluados (VMAS60, VMAS62, VMAS74, SAG61 y CPMIV) no presentaron
actividad nematicida sobre la fase J2 de T. canis, semejante a la que origina los
fármacos de referencia. La actividad nematicida de la molécula nitazoxanida se
registró a partir de las 2 horas postratamiento (diferencia significativa (p = 0.0001)
en comparación con los controles), con una concentración de 100
g/mL y se
mantuvo a las 6 horas de incubación, en donde ya no hubo incremento de
mortandad (Figura 18). La lectura a las 12 horas presentó problemas ya que los
controles mostraron que los J2 son afectados de manera importante por las
condiciones de mantenimiento, por lo que no se consideró este resultado.
Observamos también que a concentraciones menores (1 g/mL, 0.1 g/mL y 0.01
g/mL) esta actividad no es diferente a los demás compuestos, simplemente
disminuyó con el tiempo. Las lecturas más importantes son a las 2 y 6 horas
postratamiento, ya que la nitazoxanida se mantiene en circulación sanguínea de 2
a 6 horas tras la administración oral de una sola dosis de 500 mg (Laboratorios
Romark, 2005).
El testigo positivo albendazol presentó poca actividad nematicida a las dosis y
tiempos evaluados, sin embargo ésta no fue significativa con respecto a los
59
DISCUSIÓN
controles sin fármaco (p > 0.05). El tiempo de lectura a las 2 horas es un tiempo
importante, ya que el albendazol alcanza en este periodo su concentración
máxima plasmática tras la administración oral y permanece hasta las 8 horas. Sin
embargo éste fármaco no presentó actividad nematicida de interés.
La disminución de la motilidad que originó el albendazol al estadío juvenil de T.
canis concide con el estudio reportado previamente con Satou y colaboradores en
el 2005, quienes muestran que el albendazol disminuye la motilidad en casi un
40% a una concentración de 0.1 mg/mL, aunque la dosis fue diferente y se evaluó
in vivo. En su trabajo utilizaron como compuestos experimentales alcaloides
-
carbolinos (n = 17), de los cuales 12 presentaron actividad nematicida, destacando
así que al utilizar los compuestos 1, 2, 9, 11, 16 y 17 (marcados así por los
autores), disminuyeron la motilidad menos del 20 % sobre J2, asimismo el
tiabendazol presentó casi el 50 % de disminución de la motilidad. Únicamente
fueron realizados trabajos in vivo donde se probaron moléculas recién
sintetizadas, como el estudio realizado por Holt y colaboradores en 1981, quienes
demostraron que los carbamatos derivados del bencimidazol tales como
mebendazol, oxfebendazol, albendazol y febendazol así como piperazina y
dietilcarbamacina presentaron baja actividad nematicida in vivo en ratones
(cerebro), sin embargo fue alta en músculo esquelético. Delgado y colaboradores
en 1989, mostraron la reducción en la motilidad de J2 en cerebro de ratón
posterior al tratamiento con albendazol con 9 y 3 mg cada 24 y 48 horas durante 8
días, Otro estudio que podemos citar es el realizado por Hrckova y colaboradores
en el 2001, quienes demostraron que el albendazol presenta gran actividad
nematicia en cerebro de ratones (92.2 % de J2 muertas).
Las moléculas híbridas utilizadas para este experimento no presentaron actividad
nematicida, ni acción alguna sobre la motilidad de las larvas musculares de
Trichinella spiralis. El fármaco de referencia nitazoxanida evaluado a dosis de 100
g/mL no presentó actividad nematicida como en el caso de T. canis, solamente
disminuyó la motilidad. Asimismo no se obtuvo actividad nematicida a la
60
DISCUSIÓN
concentración 10 µg/mL, únicamente la nitazoxanida presentó un valor significativo
de disminución de la motilidad a las 6 horas. Con respecto a las concentraciones
1 g/mL, 0.1 g/mL y 0.01 g/mL, su patrón de comportamiento fue similar entre
todos los compuestos, no habiendo así ninguna actividad parasiticida.
Al igual como en Toxocara canis, los trabajos publicados referentes a la actividad
nematicida in vitro sobre LM de T. spiralis, no demuestran la utilización de
compuestos híbridos y las referencias sobre el efecto nematicida in vivo en T.
spiralis, tampoco han publicado el uso de compuestos híbridos de moléculas
líderes, si embargo se han registrado buenos efectos antihelmínticos contra T.
spiralis. Gómez-Barrio y colaboradores en 1986, demostraron que el albendazol
en modelos in vivo de ratones a dosis única de 100 mg/kg reduce un 56 % las LM.
López-García y colaboradores en 1997, mostraron la reducción de larvas
enquistadas en modelo in vivo, utilizando albendazol con una dosis de 50 mg/kg,
obtuvieron una reducción de 33.6 % y con 100 mg/kg, la carga parasitaria se
redujo a 94.7 %; con el ricobendazol (metabolito sulfóxido de albendazol) a dosis
de 50 mg/kg, la reducción fue a 23.2 % y con una dosis de 100 mg/kg la carga
parasitaria se redujo a 65.5%. Yépez-Mulia y colaboradores en 1999 publicaron
que el porcentaje de reducción de larvas musculares con el albendazol en ratón a
una dosis de 25 mg/kg fue de 37 %.
Nuestros resultados pueden ser atribuibles a que el mayor tamaño de las
moléculas de los compuestos híbridos, impida el paso a través del intestino del
nematodo y llegar a su blanco que son los microtúbulos de ß-tubulina en músculo
longitudinal, situación que es compatible cuando comparamos el peso molecular
(PM) del híbrido más pequeño (303,3 g), mientras que el albendazol sólo es de
265.3 g. Sin embargo no es la misma situación cuando comparamos la
nitazoxanida, que tiene un peso molecular de 307.3 g, la cual es más grande que
la molécula híbrida. Otra circunstancia que no apoya, es la suposición de que las
moléculas de alto peso molecular presenten menos actividad parasiticida, como en
el caso de la ivermectina (PM 875.10 g), molécula con más actividad nematicida
61
DISCUSIÓN
que el albendazol. Otra posibilidad es que las partes híbridas de las moléculas que
se seleccionaron no sean las responsables de la actividad nematicida, por ejemplo
en el presente estudio demostramos mayor actividad de la nitazoxanida que el
albendazol, por lo que la molécula híbrida podría llevar más componentes de la
nitazoxanida.
En cuanto a la capacidad infectante de LM de Trichinella spiralis medido a través
del índice de capacidad reproductiva, se observó que las moléculas VMAS60 y
VMAS62 redujeron más del 50% (p = 0.0003) la recuperación de LM en
comparación con el DMSO, casi igualándose a los testigos positivos albendazol y
nitazoxanida, con una concentración de 100
g/mL a partir de las 2 horas de
incubación. Este trabajo coincide con los estudios publicados por FonsecaSalamanca y colaboradores (2003), quienes mostraron la actividad nematicida de
la nitazoxanida contra T. spiralis in vivo, indicando que ésta con una
administración de 1g/kg en ratón inactiva completamente la etapa preadulta y
comparándola con el mebendazol el cual se administra con 10 mg/kg, disminuye la
carga parasitaria de LM un 83 %. Asimismo es importante resaltar que en nuestro
experimento el farmaco nitazoxanida disminuye un 100% la carga parasitaria
después de una exposición de 6 horas, presentando así un valor significativo de
p = 0.001. Éste dato coincide con lo reportado por De-la-Rosa y colaboradores en
2007, que muestran una reducción del 73 % al 90 % de LM, en ratones tratados
con albendazol y mebendazol, aunque los ratones fueron infectados in vivo. El
DMSO a la concentración de 100
g/mL sin compuesto redujo casi un 47 % la
recuperación de LM, este resultado probablemente se deba a su toxicidad que
normalmente presenta.
Es crítico señalar que el RCI evaluado después de exponer las LM a 10 g/mL, 1
g/mL y 0.1 g/mL no fue bajo, ya que se obtuvo una carga parasitaria dentro de
los valores normales al infectar con 120 LM previamente tratadas (recuperación de
LM superior a 60 LM por cada LM inoculada). Al analizar estos resultados, nuestro
grupo de investigación observó que al exponer los helmintos por 2 y 6 horas a
62
DISCUSIÓN
altas concentraciones (100 g/mL) se presentó un efecto en cuanto a la capacidad
reproductiva de los nemátodos, este resultado posiblemente se debió a que su
sistema reproductor fue blanco de acción de los compuestos o bien las LRN no
alcanzan una madurez apropiada.
Las diferencias que se presentaron en la disminución de la capacidad infectante
de las LM de T. spiralis tratadas, puede atribuirse a que los compuestos que
presentaron cierta actividad como el VMAS60 y VMAS 62, no están sustituidos en
la posición 1 del anillo bencimidazol, mientras que VMAS74 y CPMIV presentan un
metilo. Entre los compuestos sin sustitución en la posición 1, como la molécula
SAG61, su actividad menor se le atribuye a las diferencias en hidrofobicidad que
genera el grupo tiol en la posición 2. Además también de las propiedades
electroatrayentes del grupo trifluorometilo (VMAS60) y del metilsulfóxido
metabolito generado de la posible biotransformación del metilsulfuro (VMAS62).
Los trabajos publicados referentes a la reducción y RCI de LM T. spiralis se
mencionan a continuación, sin embargo estos fueron realizados in vivo y no in vitro
exponiendo las LM a diferentes concentraciones durante una cinética, y
posteriormente inoculadas a modelos murinos como se realizó en este trabajo.
Entre ellos está el trabajo publicado por Rodríguez-Caabeiro y colaboradores en
1978, quienes mostraron el poder de infestabilidad de LM recuperadas posterior
de los tres días de tratamiento con 30 y 50 mg/kg de mebendazol, demostrando
que el 6 % de estas LM desarrollan el estado adulto y que sólo el 7 % y 2 %
(respectivamente) alcanzan a enquistarse en músculo. Chávez-Ruvalcaba y
colaboradores en 2003, utilizaron el modelo murino (ratas) in vivo, a las que se les
administró albendazol a 200 mg/kg como dosis única y con una infección de 500 y
1000 LM demostraron que se obtiene un RCI de 25.5 y 395 respectivamente. Al
utilizar la nitazoxanida a una dosis de 7.5 mg /kg/12 horas, por 3 días y con una
infección de 500 y 1000 LM, los mismo autores obtuvieron un RCI de 437.5 y 750
respectivamente, no mostrando así eficacia nematicida.
63
DISCUSIÓN
Al exponer el estado adulto de Trichinella spiralis a los compuestos hibridos con
tratamiento de 100 g/mL, 10 g/mL, 1 g/mL, 0.1 g/mL y 0.01 g/mL, se observó
que éstos no presentaron alguna actividad nematicida. Al igual que en los otros
casos, dichas moléculas no fueron absorbidas suficientemente de forma
adecuada. En estos datos se observó un patrón de comportamiento similar entre
ellos durante la cinética de tratamiento (de 2 a 6 horas). Lo único que se pudo
percibir fue que el fármaco de referencia albendazol presentó un valor significativo
(p = 0.004) con respecto al incremento de la motilidad No.1 (100%) al utilizar la
dosis de 100 g/mL con 6 horas de exposición. Este fenómeno posiblemente se
debió al factor tiempo, porque los gusanos adultos no estuvieron en condiciones
ambientales que requieren al 100 %, ya que aunque en condiciones naturales se
encuentran en el intestino delgado y por lo tanto son aerobios facultativos
probablemente intervinieron otros factores como la temperatura y falta de
nutrientes al realizar la cinética empleada (lectura de 2, 6 y 12 horas).
Entre las publicaciones que han demostrado eficacia nematicida contra gusanos
adultos de T. spiralis destacan el trabajo presentado por Sujatha y colaboradores
en 1976, quienes mostraron que al utilizar mebendazol, éste redujo un 94 % y el
fenbendazol redujo un 99.2 % de gusanos adultos en ratones a las 7 horas.
McCracken en 1978, tuvo un 100 % de eficacia contra gusanos adultos al utilizar
mebendazol y albendazol a dosis de 50 mg/kg.
Cuando se expusieron los gusanos adultos de Trichinella spiralis a las
concentraciones establecidas durante 24 horas, posterior a este periodo se
recuperó el índice de larviposición (IL), el cual fue relativamente bajo (menor al
estandar de 60 LRN por gusano hembra), sin embargo al utilizar los compuestos
experimentales y los testigos a una concentración de 100 µg/mL, se mostró que la
larviposición de hembras adultas tratadas con los compuestos VMAS60, VMAS62,
albendazol y nitazoxanida fue menor a 4 LRN, es decir se recuperó 4 LRN por
cada hembra. Este resultado obtuvo un valor con gran diferencia significativa (p =
0.0002), entre estos compuestos. El conteo de LRN se realizó posterior a las 24
64
DISCUSIÓN
horas, debido a que se pudo recuperar el máximo de larvas recién nacidas, ya
que las hembras adultas continuamente están larviponiendo en un lapso
prolongado.
Se sugiere que en las hembras tratadas con los compuestos VMAS60, VMAS62,
albendazol y nitazoxanida, posiblemente la larviposición se inhibió debido a que
los compuestos tuvieron como blanco el útero (inhibición de la tubulina y por lo
tanto hay parálisis de los músculos) de las hembras. Un trabajo similar fue el
presentado por De-la-Rosa y colaboradores (2007), quienes obtuvieron un
porcentaje de 100 % en reducción de LRN in vivo al utilizar albendazol y
mebendazol, con una dosis administrada de 20 mg/kg una vez recuperados los
gusanos adultos. El trabajo publicado por Yépez-Mulia y colaboradores en 1999
demostraron que los gusanos adultos hembras presentan una reducción en su
taza de fecundidad del 87% y 82% al administrar el albendazol (25 mg/kg y 50
mg/kg de dosis respectivamente) y al administrar los profármacos del albendazol
N-metoxycarbonil-N'-[(2-nitro-4-propiltio)-fenil] tiourea (componente No. 2) y Nmetoxycarbonil-N'-[(2-nitro-5-propyltio)-fenil] tiourea (componente No. 3) con las
mismas dosis, demostraron que el compuesto No. 2 reduce la fecundidad un 45%
y 88% respectivamente y el compuesto No. 3 reduce la fecundidad un 88 y 85%
respectivamente.
65
CONCLUSIONES
10. CONCLUSIONES
1. Los compuestos híbridos (VMAS60, VMAS62, VMAS74, CPMIV y SAG61) no
presentaron actividad parasiticida ni parasitostática in vitro sobre el estadío J2 de
T canis y LM de T. spiralis.
2. El fármaco de referencia nitazoxanida presentó actividad antihelmíntica a partir
de concentraciones de 10 µg/mL sobre J2 de T. canis y parasitostática sobre la LM
de T. spiralis.
3. El fármaco de referencia nitazoxanida tiene una mejor actividad nematicida (2
veces más) que el albendazol en el modelo in vitro sobre el estadio J2 de
Toxocara canis a dosis de 100 µg/mL.
4. Los compuestos VMAS60 y VMAS62 a concentración de 100 g/mL y un tiempo
de exposición de 2 y 6 horas, afectaron la capacidad reproductiva de la LM de T.
spiralis, sin superar a la actividad observada en el albendazol y nitazoxanida.
5. El índice de larviposición solamente se redujo cuando los gusanos adultos
fueron expuestos a una concentración de 100 g/mL de las moléculas híbridas
VMAS60 y VMAS62, actividad semejante a los fármacos de referencia albendazol
y nitazoxanida.
6. Los resultados in vivo de la actividad del albendazol y la nitazoxanida mostraron
que a pesar de no haber muerte o disminución importante de la motilidad de las
larvas musculares de T. spiralis si existió alteración en sus mecanismos de
infectividad y larviposición.
66
PERSPECTIVAS
11. PERSPECTIVAS
El diseño de nuevos compuestos puede ser útil para combatir las parasitosis, sin
embargo debido a que el tratamiento subóptimo es una constante en los
tratamientos masivos e individuales, conlleva a que siempre haya parásitos en la
naturaleza. Asimismo nuestros experimentos fueron realizados in vitro, lo que
atribuye a pensar que una mejor propuesta de utilizar estas nuevas moléculas, es
mediante el uso de modelos experimentales in vivo, para que intervengan factores
metabólicos del hospedador (como la absorción, biotransformación, etc.) éste
último paso es importante para que los compuestos se oxiden, reduzcan o se
hidrolicen y así tengan una mejor actividad nematicida.
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78
APÉNDICE
APÉNDICE
I. Soluciones y reactivos (De-la-Rosa, 2005)
1. Solución amortiguadora de fosfatos (PB) 10X
- NaH2PO4.H2O.................................................2.62 g
- Na2HPO4 (anhidro)..........................................11.50 g
- Aforar con H2O................................................1000 ml
2. Solución amortiguadora de fosfatos (PBS pH 7.2)
- PB 10X……………………………………………100 ml
- NaCl………………………………………………8.75 g
- Aaforar con H2O…………………………...........900 ml
3. PBS estéril + antibióticos
- PBS estéril……………………………………….100 ml
- Mezcla de antibióticos (1X)…………………….1 ml
4. Solución salina fisiológica
- NaCl……………………………………………….87.5 g
- Aforar con H2O…………………………………...1000 ml
Filtrar con membrana de 0.22 micrómetros
5. Preparación de Glucosa al 1 %
- Glucosa grado biología molecular………………..1 g
- Aforar con H2O destilada………………………….100 ml
Filtrar con membrana de 0.22 micrómetros
6. Medio RPMI 1650 ó DMEM
- MEM…………………........................…………106 g
- H2O……………………………………………….800 ml
79
APÉNDICE
- Hepes………………………………………………2 g
- NaHCO3……………………………………………2 g
Mezclar y ajustar el pH entre 6.8-6.9.
Aforar a 1000 ml
Filtrar com membrana de 0.22 micrómetros
7. Médio de cultivo + antibióticos
MEM (preparado)……………………………………99 ml
Mezcla de antibióticos (1X)………………………….1 ml
8. Preparación de los compuestos
- Se pesaron 5 mg de cada compuesto sólido (VMAS60, VMAS62, VMAS74,
SAG61, CPMIV, albendazol y nitazoxanida) y se disolvieron en DMSO obteniendo
una concentración final de 5 mg/mL
80
APÉNDICE
II. Resultados anexos sobre el porcentaje de reducción de LM y el RCI
Porcentaje de la reducción de LM y RCI utilizando los compuestos a 100
durante 2 horas de exposición.
Moléculas y Testigos
RCI + DS
Reducción (%)
VMAS 60
5 ± 1.9
95
VMAS 62
2 ± 1.2
98
VMAS 74
68 ± 2
32
SAG 61
70 ± 1.6
30
CPM IV
69 ± 2.6
31
Nitazoxanida
2 ± 1.1
98
Albendazol
1 ± 0.8
99
DMSO
53 ± 3.3
47
Sin Tratamiento
72 ± 1.6
28
Porcentaje de la reducción de LM y RCI utilizando los compuestos a 100
durante 6 horas de exposición.
Moléculas y Testigos
RCI + DS
Reducción (%)
VMAS 60
6±3
94
VMAS 62
3±1
97
VMAS 74
65 ± 3
35
SAG 61
59 ± 6
41
CPM IV
39 ± 24
61
Nitazoxanida
0±0
100
Albendazol
2±3
98
DMSO
27 ± 7
73
Sin Tratamiento
65 ± 1
35
g/mL
g/mL
81
APÉNDICE
Porcentaje de la reducción de LM y RCI utilizando los compuestos a 10
durante 2 horas de exposición.
Moléculas y Testigos
RCI + DS
Reducción (%)
VMAS 60
32 ± 3
68
VMAS 62
72 ± 6
28
VMAS 74
73 ± 0.
27
SAG 61
74 ± 4
26
CPM IV
73 ± 3
27
Nitazoxanida
52 ± 3
48
Albendazol
26 ± 3
74
DMSO
77 ± 2
23
Sin Tx
77 ± 4
23
Porcentaje de la reducción de LM y RCI utilizando los compuestos a 10
durante 6 horas de exposición.
Moléculas y Testigos
RCI + DS
Reducción (%)
VMAS 60
22 ± 2
78
VMAS 62
66 ± 3
34
VMAS 74
65 ± 7
35
SAG 61
68 ± 2
32
CPM IV
64 ± 1
36
Nitazoxanida
43 ± 8
57
Albendazol
13 ± 2
87
DMSO
57 ± 4
43
Sin Tx
72 ± 1
28
g/mL
g/mL
82
APÉNDICE
Porcentaje de la reducción de LM y RCI utilizando los compuestos a 1
durante 2 horas de exposición.
Moléculas y Testigos
RCI + DS
Reducción (%)
VMAS 60
74 ± 2
26
VMAS 62
73 ± 2
27
VMAS 74
83 ± 3
17
SAG 61
87 ± 2
13
CPM IV
72 ± 2
28
Nitazoxanida
74 ± 5
26
Albendazol
61 ± 2
39
DMSO
79 ± 4
21
Sin Tx
84 ± 3
16
Porcentaje de la reducción de LM y RCI utilizando los compuestos a 1
durante 6 horas de exposición.
Moléculas y Testigos
RCI + DS
Reducción (%)
VMAS 60
73 ± 1.5
27
VMAS 62
71 ± 2
29
VMAS 74
85 ± 3
15
SAG 61
89 ± 2
11
CPM IV
71 ± 3
29
Nitazoxanida
70 ± 2
30
Albendazol
60 ± 3
40
DMSO
77 ± 4
23
Sin Tx
81 ± 2.5
19
g/mL
g/mL
83
APÉNDICE
Porcentaje de la reducción de LM y RCI utilizando los compuestos a 0.1
durante 2 horas de exposición.
Moléculas y Testigos
RCI + DS
Reducción (%)
VMAS 60
80 ± 3.6
20
VMAS 62
94 ± 4.6
6
VMAS 74
92 ± 8.5
8
SAG 61
93 ± 7.4
7
CPM IV
84 ± 5.5
16
Nitazoxanida
67 ± 7.1
33
Albendazol
73 ± 1.3
27
DMSO
88 ± 8.8
12
Sin Tx
78 ± 1.7
22
Porcentaje de la reducción de LM y RCI utilizando los compuestos a 0.1
durante 6 horas de exposición.
Moléculas y Testigos
RCI + DS
Reducción (%)
VMAS 60
79 ± 4
21
VMAS 62
91 ± 5
9
VMAS 74
94 ± 4
6
SAG 61
90 ± 8
10
CPM IV
89 ± 8
11
Nitazoxanida
75 ± 4
25
Albendazol
71 ± 1
29
DMSO
88 ± 6
12
Sin Tx
87 ± 9
13
g/mL
g/mL
84