ACTIVACION DE RESPUESTA INMUNE (Dra. Palermo)

Activación de la respuesta inmune innata y
específica en los pacientes con SINDROME
UREMICO HEMOLITICO (SUH).
Div. Inmunología. IIHEMA
Academia Nacional de Medicina
1)Porqué los menores de 5 años son los
más afectados de SUH?
2) Porqué sólo el 10% de los infectados
desarrolla SUH?
3) Porqué el riñón es el principal órgano
afectado?
Hipótesis de trabajo:
La respuesta inmune innata ó inflamatoria es capaz de
potenciar la toxicidad de la toxina Shiga.
La respuesta inmune humoral específica es capaz de
neutralizar la toxina Stx y proteger del SUH
Datos Previos:
* Un recuento alto de neutrófilos (PMN) en sangre periférica a la presentación indica peor
pronóstico.
* Se detectan niveles elevados de IL-8 y elastasa en el suero y orina de pacientes cursando e
período agudo deSUH.
* Los LPS y las citoquinas TNF, IL-1 aumentan la sensibilidad de células epiteliales y
endoteliales a los efectos tóxicos de la Stx.
* En modelos animales el LPS aumenta el daño renal y la mortalidad por Stx.
PMN
„
„
Función dual vigilancia y eliminación in situ
Rápida transición de estado no-adherente a adherente
Expresión dinámica de Moléculas de adhesión
Enzimas que degraden matriz extracelular
Alta deformabilidad
Secreción de efectores en la rta inflamatoria: citoquinas
y quimioquinas
Componentes bactericidas y bacteriostáticos
Gránulos de los PMN humanos
Biogénesis
Mieloblasto
Enzimas mieloides
Serín proteasas neutras
Promielocito
Gránulos primarios
(azurófilos)
• MPO
MPO
• Lisozima
• Elastasa
• Catepsina G
• Proteinasa
•
Metaloproteinasas
Hidrolasas Acidas
otras
metamielocito
Gránulos secundarios
(específicos)
• Lisozima
*N-acetil-β
glucuronidasa
* Catepsina D
* β-glucuronidasa
* β-glicerofosfatasa
* α-manosidasa
β-glucuronidasa
•
•
CD63
CD68
•
PMN maduro
Vesículas secretorias
Gelatinasa
*N-acetil-β
glucuronidasa
* Catepsina D
* β-glucuronidasa?
* β-glicerofosfatasa
* α-manosidasa?
•
•
•
Membrana
Colagenasa
Gránulos terciarios
(organelas almace)
•
•
•
•
•
•
Lactoferrina
Prot unión a
Vitamina B12
Citocromo B
CD15
CD66
Citb-558
(NADPH-ox)
R-FMLP
R-TNF
R-Fibronectina
NGALCD66
NADPH ox
•
Proteínas
plasmáticas:
albúmina,
tetranectina
•
•
•
•
•
•
•
Fosfatasa alcalina
Cit b-558
CD11b/CD18
R-FMLP
R_uroplasminog
CD10,CD13,CD16
CD14,CR1,DAF
CD11b/CD16
Orden de degranulación
Parámetros de activación en los PMN
Parámetros de activación de PMN en los pacientes
CD16 (FcγRIII)
CD11b
400
MPO
400
300
300
100
% IM F
200
200
% IMF
% IMF
300
100
200
100
0
0
p<0.01
p<0.05
0
p<0.01
p<0.01
p<0.05
n.s.
n.s.
n.s.
100
*+
% ADCC
80
60
40
*
Disminución de marcadores de
activación y degranulación en la
membrana de PMN
20
0
* p< 0.05 vs. sanos
+ p< 0.05 vs. SUH
Sanos
Urémicos
SUH
n.s.
Comparación entre niños con SUH y con
infecciones bacterianas no asociadas a STEC
200
CD16
CD11b
MPO
700
Capacidad Citotóxica
140
600
120
150
% IMF
500
80
400
100
*
100
*
60
40
300
20
200
50
0
ADCC
100
0
Mediada por
ROSIROs
- mediated
0
p<0.01
n.s.
p<0.01
SUH
Infectados
¾ Estas diferencias aún persisten
Ferná
Fernández et al. Phenotype markers and function of peripheral
neutrophils in children with HUS. Pediatric Nephrology. 17:33717:337344, 2002.
UC
NC
HUS after AP
HUS AP
5
0
*
UC
0
10
*
NC
20
15
*
HUS after AP
40
20
*
HUS AP
#
*
160
140
120
100
80
60
40
20
0
HC
60
25
UC
#
*
30
NC
80
35
HUS after AP
100
HUS AP
*
HC
MFI CD66b
120
MFI DHR (PMA/basal)
40
β-Glucuronidase
activity
*
HC
*
Unidades de b-glucuronidasa
140
Contenido intracelular de marcadores de
degranulación evaluados en los PMN de pacientes con
ROS-production
SUH
i.c. CD66b
* p<0.05 vs SUH
# p<0.05 vs S
Los PMN de pacientes con SUH están “exhaustos”, probablemente como
consecuencia de un fuerte proceso previo de activación, el cual tendría lugar en el
tiempo que transcurre entre la diarrea y el diagnóstico de SUH.
Fernández GC et al, Impaired neutrophils in children with the typical form of Hemolytic
Uremic Syndrome Pedr Nephrol 20:1306-1314, 2005..
0
*
UC
NC
HC
severe HUS
10,2 %
severe HUS
400
mild HUS
*
mild HUS
100
UC
31,9 %
HUS
0
NC
2,7 %
Apoptosis
20,1200% temprana
% cells ANN+/PI+
% cells ANN+/PI-
300
HC
*
severe HUS
mild HUS
UC
NC
Ioduro deHC
propidio
Vivas
HUS
0
HUS
% live cells (ANN-/IP-)
Apoptosis temprana
200
100
200
*
Apopto
Apoptosis tardía
sis
tardía
300
100
Vivas Anexina V
Correlación entre estado funcional de los
PMN y la severidad
SUH
Sanos
Leves
Moderados
Graves
Correlación
Nº PMN
(x109/L)
3.8±0.38.
8.7±0.9*
10.4±1.2*
15.3±1.2*#
*r=0.6,
p=0.001
CD16
151.1±16.4
55.0±8.3*
60.8±10.1*
39.8±7.0*
No correl.
CD11b
184.0±26.1
124.1±19.2*
80.1±11.2*
62.3±7.9*§
-0.37,p=0.01
CD66b
184.6±32.31
156.8±16.5
81.2±15.9*§
103.3±13.8*
-0.35,p=0.01
Mieloperox
166.7±24.0
160.3±23.0
99.3±17.1§
96.0±19.3*§
-0.51,p=0.01
IROs
99.0±10.1
113.6±21.7
123.3±34.0
37.7±17.4*§
-0.51,p=0.01
% apoptosis
54.6±3.3
45.7±4.2
41.05±16.5
25.1±2.9*§
-0.51,p=0.01
*p<0.05 vs sanos; §p<0.05 vs leves
El otro componente celular inflamatorio: los monocitos???
•Datos previos:
•Niveles aumentados de citoquinas derivadas de los monocitos (Mo) en
suero y orina de pacientes con SUH.
*La Stx in vitro induce la síntesis de IL-1β, TNF, IL-6, e IL-8 por Mo.
• La eliminación de macrófagos hepáticos y esplénicos disminuye la
toxicidad de la Stx2 en ratones.
UC
3
4
5
Time elapsed since the
acute period (months)
6
5
0
SC
SUH SUH
PA
rec
NC
UC
*
100
50
0
*
#
#
UC
2
*
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
NC
1
**
10
*
150
UC
0
**
NC
0
15
200
SUH rec
10
20
SUH PA
20
250
#
SC
25
Spearman r=-0,66
p<0,01
30
IMF del CD16 en Mo CD16+
40
% Mo CD16+
% of CD16+ cells
CD16
SUH rec
IC
SUH PA
SUH
SC
Sanos
CD
14
IMF del CD14 en Mo CD16+
A
Los Mo de los pacientes con SUH muestran signos de haber recibido un
estímulo activante previo, el cual los ha diferenciado hacia un perfil o
“subset inflamatorio”
Fernandez et al. Differential expression of function-related antigens on blood monocytes in
children with Hemolytic Uremic Syndrome. J. Leuk. Biol. In press.
Porqué es el riñón el principal órgano afectado??
Fractalquina: CX3CL1
* La expresión de fractalquina y la presencia de células que expresan su
receptor (CX3CR1) en el riñón ha sido demostrado en pacientes con varios
tipos de nefropatias.
* En modelos animales, el tratamiento con anti-CX3CR1 bloquea la
infiltración de leucocitos en el glomérulo y mejora la función renal.
Fractalquina expresada sobre el endotelio inflamado
podría potenciar el daño vascular, capturando células
citotóxicas circulantes que expresan el CX3CR1.
Poblaciones Leucocitarias en sangre periférica
que expresan el CX3CR1
PMN
Monocitos
Linfocitos y NK
SSC
Control de isotipo
Niños sanos
Niños con SUH
CX
12%
3CR1
3%
CX3CR1
16
Leucocitos que expresan el CX3CR1 incluyen:
monocitos, células NK y un subset de células
T citotóxicas
Todas estas poblaciones tiene un alto
potencial citotóxico
% C X 3 C R 1 + ce lls
14
12
10
8
6
4
2
0
HC
HUS
UC
NC
Cambios en la poblaciones positivas para CX3CR1
Células NK
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
HUS AP
20
% CD3- CD56+
HC
*
*
*
15
10
*
5
0
HC
CXC-/16+
CXC+/16+
CXC-/16-
HUS
UC
IC
CXC+/16-
CD56bright
CD16CX3CR1-
14
% CD3-CD56 Dim
%
Monocitos
12
10
CD56
8
CD16+
3,0
CX3CR1+
2,0
6
*
4
dim
4,0
3,5
2,5
1,5
2
1,0
0
0,5
HC
HUS
UC
IC
0,0
HC
HUS
UC
IC
La expresión aumentada de fractalquina en el riñón y la específíca
disminución de los leucocitos circulantes positivos para este
receptor, sugiere que esta quimioquina podría participar en la
patogénesis del SUH, favoreciendo la adhesión al endotelio y
epitelio, y potenciando el daño iniciado por la toxina Stx2.
Papel de la respuesta inflamatoria en la toxicidad de la Stx.
PMN Activation
PMN degranulation, ROS release
Daño Endotelial
Monocyte activation
IL-8
TNF-α
IL-1β
2- Endothelial Activation
 P y E-selectinas e ICAM
IL-8 secretion, FKN induction
TNF-α
IL-1β
Endothelium
Subendotelium
1- GB3 induction
Stx-direct mechanism:
Inhibition of protein sinthesis
Stx-indirect mechanism:
Mediated by activated PMN, Mo
and NK
La intensidad o tipo de respuesta inflamatoria
durante el prodromo, tendría un papel activo
en la evolución de la enfermedad
Infección con E. coli productora de Stx
Diarrea no sanguinolenta
Papel de la
Respuesta
Inflamatoria?
?
Diarrea sanguinolenta
SUH
(10%)
(90%)
Servicios de nefrología
División Inmunología
Lic Leticia Bentancor
Lic María Victoria Ramos
Dr. Ramón Exeni
Dra. Irene Grimoldi
Dra. Marta Alduncín
Bioq. Romina Fernández Brando
Dra. Gabriela Fernández
Dra. Graciela Dran
Gabriela Camerano
Dr. Mario Diaz
Dra. Laura Lopez
Dra. Flavia Ramirez
Dr. Martín Isturiz
Departamento de Patología.
Dr. Roberto Meiss
Dra. Graciela Vallejo
Dra. Christian Elias-Costa
MUCHAS GRACIAS!!!