lttl - Universidad de Ciencias Aplicadas y Ambientales UDCA

EN EL
Oi¡EI{óSNCO DE LEPTOSPIRASPP. EN TEDICINA VETERINARIA
DIFERENTES A LA PRUEBA MAT
REv¡sóil AcruALlzADA
DE LAs
tÉcnrc¡s urlLlzADAs
EDrLsoN ANToNlo ARREDoNDo
couÁuez
cÓorco.7o12ooo4
u*,u=?x3$lr?to"J==t?Jo"APLrcADAsYAil-B¡ENTALES
pRoc RA',A
DEJp:?sffig¡ls'ffi1*v
BOGOTA' 2011
lttl;"-'^
REVISóN ACTUALIZADA DE LAS TÉCN|GAS UTILIZADAS EN EL
DIAGNOSTICO DE LEPTOSPIRA SPP. EN TEDICINA VETERINARIA
DIFERENTES A LA PRUEBA MAT
ED¡LSON ANTONIO ARREDONDO
GONáLU
cÓDlco:7o42ooo4
Trabajo de grado pan optar el título de
tédico Veterinario Zootecnista
Director:
HERNANDO GUZTAN CAICEDO
DE CIENCIAS APLICADAS Y AT-BIENTALES
UNIVERSIDAD
-' -' - --iléuireD
DE clElclAs AGRoPEctlARlAs'
vETERINARIA Y zoorEcNlA
pnoiáir-lrrÁ
PROYECTO TRABAJO DE GRADO
BOGOTA' 2011
ólueolclu
Nota de aceptación:
Jurado
Jurado
Director
Bogotá', 2011
DEDICATORIA
AGRADECIMIENTOS
CONTEN¡DO
INTRODUCCION
'12
1. OBJETIVOS
14
1.1. OBJETIVOGENERAL
14
1.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS
14
2. GENERALIDADES DE LEPTOSPIRA
15
2.l
15
MORFOLOGIA
2.2 CLASIFICACION
15
2.2.1 Clasificación serológica
16
2.2.2Filogenética y clasificación basada en ADN
18
2.3 METABOLISMO
2.4 LEPTOSPIROSIS
2.4.1 Epiriemiologia
2.4.2.Palqenia
2.5 INMUNIDAD Y VACUNACION
2.6 PREVENCION Y CONTROL
3. DIAGNOSTICO Y TIPIFICACION DE LEPTOSP]MS
3.1 MICROSCOPIA DE CAMPO OSCURO
3.2 DIAGNOSTICO HISTOPATOLOGICO EN NECROPSIAS
3.3 PRUEBAS SEROLOGICAS
21
22
23
25
26
28
28
29
29
30
(IIAT)
3.3.1 Prueba de aglutinación microscopica
30
(ELISA)
3.3.2 Prueba de inmunoensayo enzimático
33
3.3.3 Fluorescencia Polarizada
3.4 PRUEBAS MOLECULARES
u
35
3.4.1 Hibridación de ADN
35
3.4.2 Eldroloresis de campo pulsado (PFGE)
35
3.4.3 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
37
3.4.4 Polimorfismo de tamaño de Fragmentos de Restricción (RFLP)
38
3.4.5 Numero Variable de Repeticiones en Tándem (VNTR)
39
3.4.6 Tipificación de múltiples locus (MLST)
40
4. DtSCUSIÓN
42
5 CONCLUSIONES
45
6 BIBLIOGRAFIA
46
LISTA DE TABLAS
Tabla
l.
Tabla 1. Diskibución de los serogrupos entre las varias especies de
leptospira
Tabla 2. Comparación de clasificación por autores
Tabla 3. Primers para análisis por PCR de los genes LipL21, LipL32 y LipL41
Tabla 4. Carac{erísticas esenciales del genoma de Lepfosplras qpp. Patógenas y
saprófitas
Tabla 5. Reservorios iipicos y serovares de Lepfoqpira encontrados
Tabla 6. Tabla de interpretac¡Ón de títulos serológicos (MAT) en bovinos
LISTA DE FIGURAS
Figura
1.
Fotomicrografía de Leptospira spp.
Figura 2. . Aóol filogenético basado en la secuenciación de los genes RNAr del
165 de cepas de LePtosPin sPP.
Figura 3. EpkJemkrlogia de la leptospirosis en animales y humanos
Figura 4. Reacciones de la prueba MAT
Figura 5. Patrones de PFGE de 14 aislados clínicos de de Leptospira spp'
Figura 6. lnmunoensayo competitivo por polarización de fluorescencia-
GLOSARIO
AGLUTINACóN: La formación de grumos o agregados cuando un antígeno
particulado reacciona con su anticuerpo específico.
como
inmunoglobulinas
(lS),
son glicoproteínas del tipo gamma globulina. Pueden encontrarse de forma soluble
en ñ saágre u otros fluidos corporales de los vertebrados, disponiendo de una
que actúa como receptor de los linfocitos B y son empleados por
ANTICUERPO: también conocidos
forma idéñtica
el sistema inmünitario para ¡dentif¡car
como bac{erias, virus o Parásitos.
y
neutralizar elementos extraños tales
incluye
ANT¡GENO: Los antígenos son usualmente proteínas o polisacáridos. Esto
y
párt"" G bac{erias (ápsula, pared celular, flagelos, fimbrias, y toxinas), de virus
puede
y
btros microorganismos, que' besencadena la formación de anücr.rerpos
causar una respuesta inmunitaria.
ESPECIFICIDAD:Eslaprobabilidaddequeunsujetosanotengaunresultado
negat¡vo en una prueba diagnÓstica.
que tienen élulas
ESPIROQUETA: Son un filum de bacterias Gram-negativas
Tienen una tongitud comprendida entfe 5
-roiladas hel¡coidatmente.
y 50ó pm y un diánretro de alrededor de 0,1-0'6 pm'
;l"rñ;;t
H¡BR|DAcloN:Esunprocesopore|cualsecombinandoscadenasdeácidos
en una.única
de bases compleme{alas-'
nucleícos antiparalelas y ón
""i*n"ia la estruc:tura de doble tÉlice, donde las
molécula de doble o0""",'qü-to.a
el interior. Los nuclreótidos se uniÉn con
qu"oa,i d*m"
"n
A=U; C=G; G=C; T=A ó
sus complementa¡os oa¡J'conJ¡'c¡onÁs normales: A=T;
U=A.
ñ;;;ü;á¿á"
la. endotoxina de
LIPOPOLISACARIDO: Complejos propios de
la clase M'
inducen la proOucc¡Oñ de'anticuerpos de
""Sát¡*.,
10
gérmenes Gram
LOCUS: Es una posición frja en un cromosoma, como la posición de un gen o de
un marcador genético.
REPRODUCIBILIDAD: Se refiere a la capacidad que tenga una prueba
o experimento de ser reproducido o replicado. El término está estrechamente
relacionado con el concepto de testabilidad.
sAPROFITO: Son aquellos organismos que se alirnentan de materia orgánica
muerta, también se denominan ásí los microorganismos que hace parte de la flora
normal del cuerpo.
SENSIBILIDAD: Es la probabilidad de clasificar conectamente a un individuo
en la
Ánt"nno, es decir, la probabilidad de que para un suleto enfermo se obtenga
prué¡á ún resultado positivo. La sensibilidad es, por lo tanto, la capacidad del test
para detectar la enfermedad.
sus principales
SEROGRUPO: Se define, como la agrupación de serovares según
afinidades anügénicas. No es una subdivÉión taxonómica'
y está representado por
SEROVAR: O serotipo. Es la unidad taxonómica básica
una cepa de referencia'
pertenec¡entes a una misma
TlPlFlcAcloN: Diferenciación de cepas bac{er¡anas
especie.
11
INTRODUCCION
Desde el descubrimiento de la leptospin, agente causal de la leptospirosis, hace
en una .amplia
un siglo, la espiroqueta se ha aislado en el medio ambiente
varieiad de án¡mátes (Cerqueira y Picardeau, 2009); es considerada .una
zoonosis a nivel mundial de preocupación humana y veterinaria, esto sumado al
gran impacto económico que causa en la ¡ndustria agrícola, espec¡ficamente 91 la
mortinatos, infertilktad'
ianaOeiia, debido a sus manifestaciones como abortos,
üisminución en la producción de leche y la muerte (Gómez et al''2OO8l
y
como una enfermedad infecciosa resubtropicales.. Lns seres
La leptospirosis ha sitlo identificada
-r"aienti,
particularmente en regiones tropicales y
se infectari por contacto con el agua contaminada. y/o. el
huma-nos generalmente
-pa¡ses
desano|lados |a zoonosis se ha asociado a las ac{ividades
sueto; en
de salud
á"rpj"¡oná"i y recreativas, sin embargo, los principales problemas
la leptospirosis, se enc¡entra en los países en vía de
p,ñiü q";
reiresenta
desarrol|o,dentrodeamoentes'rura|espobresy-enciertascomunidadesde
i"ñ;; ;',bñ;- (Eslaba-o ef at.,2O1o). i¡t¿s ¿e 500.000 casos de leptospirosis
que exceden el 10%' sin embargo' la
severa ocurren en el año, con casos fatales
los datos, la dificultad para el
enfermedad es sub6ümad; poi t" poOt" cali¿ad de
y
<iel test estándar para diagnosüco. (Gerqueira
áiágnostico y la pobre
""nri¡it¡¿"d
Picardeau,2009)
en función de los
Las leptospiras se clasifican en serogrupog y serotipoj
género
leptospira se
2009) El
determinantes ant¡gen¡cos. i$rqueira y Éiárdeau,
en los carbohidratoe del LPS
divide en más de zso siiotiios, uás¡in¿ose
datos
ótpbn"nt" de heterogeneidad;
(lipolisacarido), oomo un
por otra .parte'
la exis6nÁa de 20 especies de leptospira'
fueron generadas sobre.más de 20
Un gran número 0..*u"itá-"" ¿ártptosp¡t""
esa información ha sido
años de estudios nrogenéti; y taxonbm¡cos' todáGenBank' (Eslaba-o eú a/''
como
depositada en grandes oáses ¿é dabs' tales
2010)
de Colombia ya es conocida
La presencia de leptospira en distintas comunidades
regiones (f.o¡ez '
f asi como en
oracias a diversos estuo¡o-s ieai¡zados en distintas
demostró que' "-'-?l:^T7\
córdoba
de
ái¿"p"tt"mento
Üi"J"üi¡"'i=iiü¿o
"n bolomU¡a, la leptospirosis es una zoonosis lanmente
este departamento, en
dé conoci¡niento de la enfermedad o
diaqnosücada, proO"ULr.*nt" poi f" t"fi"
por leptoepirosb. (Najera S' ef
auóncia de métodos O¡"J"i&ü" ¿"'ü ¡m"o¡On
a/., 2005)
#br";ib,id;;On
¿ef
nDf'¡,-¿"rió"tt"n
Latecno|ogiamodemahamejoradoconsiderab|ementelosprocedimbntosoe
t¡n{ca9!01 de-cepas
ñ üta ;á"*ión, i99$q"¡on. v
taboratorio, en particular
;;ü;;;'üs¡""i-
S::";i.,J*f :':1" ¡"?'f '*'L#;g;'1X i5::'''"X
¡ealiza¡a una rev¡ston
I
importantes sobre la leptospira y se describirán las distintas técnicas citadas por
algunos aúores, sobre métodos de diagnóstico clásicos (MAT), como métodos de
serotipificac¡ón y una breve descripción sobre los rnétodos moleculares para
diagnostico y tipificacion que se han estado desanollando.
13
t.
I.I
oBJETIVOS
OBJETIVOGENERAL
Realizar una revisión de literatura, basada en la recopilación de información de
investigaciones importantes y ac{uales, sobre Leptospira spp., que incluyan
métodos
principáhente daios como, tipificación, clasificación de cepas
y
principalmente
serología
ánalíticos para el diagnostico de la leptospirosis,
técnicas moleculares
y
1.2 oB.TETIVOS ESPECIFICOS
o
Recolec{ar infomación
de
estudios actuales sobre Lefospin spp,
por
incluyendo generalidades de la bac{eria y la identificación de serovares,
mediodetecnicasespecificasutilizadasparae|diagnost¡codeesteagente.
o
construir una rcvisión dc litcratura mediantc la información más relcvante
sobre/epfospiraspp.,desdegenera|idadesde|abac{eriay|aenftrmedad,
hasta las pruebas diagnosticas más utilizadas'
rPresentarundocumentoquegenefenuevoshorizontesinvesügaüvosene|
lue adómás sirva como guÍa y tuente 9t.¡{9aT'jn
enfermedad que afecta
v prbouaoió en el diagnostico de esta
tema de leptospirosis;
" "ot"g"" las ganaderías de nuestro país'
fuertementé
14
2.
GENERALIDADES DE LEPTOSPIRA
Las leptospiras son espiroqueüas, con un diámetro alrededor de 0.1mm por 620mm de longitud, el género incluye especies saprofitas y patógenas, las cuales
peretencen a la familia leptospiraceae, del orden Spirochaetales. (Adler y De la
Peña Moctezuma,2010) verfigura 1.
Figura
l.
Fotomicrograña de Lqpúospíra spp'
Fuente: Adlery De la Peña Moctezuma (2010).
2.l ilrORFOLOGiA
un
son bac{erias delgadas de foma helicoidal o espiral, muy móviles mediante. a
fl"g"¡"-i"añ; de É envoltura de la bacferia y c¡n una gran divercidad en.cuanto
química, acido nucleico, nr¡trición y metabolismo. son visibles al
a
"oñlpó"i"¡on
micóscopio de campo oscuro en preparaciones- frescas y muy susceptibles
a un gancho en uno
taAores áel medio ambiente, presentan una estrucfura similar
téáios semisólidos forman colonias densas (Simpson y
o en ambos extremos;
"n
White,19O4).
2.2 CLAS¡FICACÉN
primera vez.por Sümso1 en 1907' en los
Las leptospiras fueron observadas
-ál .." por
'momento las bac{erias obsewadas fueron
teiidos de un pac¡ente:
intenogans' pero debido a la ausencia de
ü'".im*d"" *li-sp¡-inut"
informaciónadiciona|,e|nombredeestaespecienoseajustabaa]osralisitos
descripción valida de
del código intemacional á"-"áté*r"t'ra' La primera Binger en 1914; v de
tue pioporc¡onada por Woibach v
r"pt""iiü"
"áltó¡'ta"
lepstopiras patógenas fueron proporcionadas por Inada et al., en 19'16. (Gerqueira
y Picardeau, 2009)
2.2.1 Clasif¡cación serológica
La principal característica que se considera paÍa la clasificación serológica de las
leptospiras es su estructura antigénica. Todas las leptospiras apatogenas se
incluyen en el grupo denominado "complejo biflexa'y las patógenas, en el grupo
"com-ptejo intenogans', y se agrupan en serotipos que coñiparten cierto grado de
agfutinatión c¡uzadai puesto que poaBen ciertos antígenos @munes, estos
sérotipos se reagrupan en serogrupos; no ocurre reaccón cnzada entre los
microscópica de
Srupob, criterio que se sigue bajo la técnica de aglutinación
absorción cruzada (fúAT). (Rodríguez et al, 2005).
El test de absorción de aglutinación cruzada (CAAT), ha sido la prueba utilizada
por décadas para la clasif¡cación de serovares de leptospira y a partir.de este
áproximadaménte 250 serpvares patógenos so_n ahoftt reconocirJos; alrededor de
8b serovares de L. intenogans se hán identificado, 60 de estas ya habían sido
descritas. Los serotipos comprenden serovares ant¡génica[lcnte relacionados, se
han descrito 24 serogrupos para las cepas patógenas (Cerque¡ra y Picardeau'
200s)
gara rcal,i7ar
Sin embargo, el CAAT es dispendioso y se requiere de mucfio tiempo
,n" t¡pmc"i"¡On de rutina, adbmás son pocos los laboratorios capaces de realizar
y Picardeau, 2009). Gon la aparición de la üpificación
é"á ie*io. (Cerqueira
'ha
enconirádo que el concepto de un serovar no es plenamente
molecular, se
define las oepas más - , ¡mportantes
que este
satisfac'torio,
molecular
áp¡O-á.bbgl*óente'de una forma decuada, en cambb la üpificacón
serogrupos'
algunos
de
há demostádo dar una mayor diferenciación en las cepas
(Cerqueira y Picardeau, 2009)-
no
ya
fáciles de
La secuenciaciÓn es un máodo a nivel mundial que produce datos
.":11á9 ba.rato
int"tpt"t", y confiables, por otro parte es. un 1yev9 enfoeue czr¿' (Eslaba-o
ef aL,
pára' la ctasificación de tos aislados.
*|no
;;;;;pÉrt"
.ü*
2010)
muestra la clasificación mas reciente elabofada pq lo: gutgres
hechos
M. y Picardeau-rtl- tioogl, basada. en estudios de clasificación
porio-áutoteá mas ¡mportaniei en iñvestigaciones sobre el género Leptospin'
La tabta
ó;rÑit
I
16
Tabla
l.
Distribución de loe sercgrupos entre las varias eepeciee de
leptospira
SetofWo
E*ede¡fepbf,r¡o
¡a
a
ü ¡E
I
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¡ü|rl
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I
1
Tomado de:
P-oatoqenas, l- intermedias, S-sap rofttas '
; riorÉ"n"rátut" reconocida por genomoespecies 1'3'4 y 5'
en slack ef aL (2006)'
" no reacción en crus, basado
dtire of 1/100. Mathias ef al.(2008)'
ef aL (2006)'
" indeterminado, basado en levett
y espede
Los números representan serovares por serogrupos
iO"t"Oo *Ot" I'o" d"to" de hibridación de ADN' slack ef aL (2009)'
t7
'.:.
J
En la siguiente tabla se muestra una oomparación entre la clasificación vista en la
tabla anterior y la clasificación que propone B. Adler y A. de la Peña Moctezuma
2010 en una publicación mas reciente pero que es basada en datos más antiguos
(2001) Picardeau, autor de la tabla anterior.
Tabla 2. Comparacién de clagificación por eutorca
o
É
g
o
o
A
5
varff
tnü
Yan4awae
Vanthhlli
urro¡adr¡
6
Yanagawae
Slack 2(x)8
I - il4ry.,-----,--,-*'---------.-(2010)'
' p¡áioeau
i2Óosi, Óé |a peña Moctezuma
2.2.3 Filogenéüca y clasificación basada en ADN
por una genotíp¡ca' en la
La clasificación fenotípica de leptospiras se ha.sustituído
se incluyen todos los serotipos de L'
que en un número o"
g"-ñ;'bo¡t"
intenogans y L. biflexa. La heterogeneidad genéüca se demostrÓ ya hace algún
tiempo y los estudios de hibridacion de ADN llevaron a la definición de 10 genome
especies de Leptospim. Un genomo-especie se añadió más tarde L. ki¡schnei.
Después de un extensivo estudio, el centro para el control de enfermedades
(cDC), más recientemente definió 16 genomoespecies de leptospira que incluían
És descritas anteriormente y la adición de cinco nuevos, uno de los c¡ales fue
nombrado L. alexanderi. (Levett, 2001)
Los genomo-especies de leptospira no conesponden con las anteriores dos
patógenos y no
espeóies (L.
'se intenogans and L. biflexa), de hecho, serovares
forma ni el
esta
paiógenos
encuentran dentro de la misma especie, de
ierogrupo ni el serovar son fiables para pedecir la especie de Leptospirc. (Levett,
2001)
La secuenciación del gen ,7s es un método estándar para la diferenciación de
especies en todas bs ámas del árbol filogenético de la vida, los análisis basados
en el Rl,lAr de la subunidad ribosomal 165 han indicado que las espiroquetas son
un antiguo grupo de bacterias que se desanollaron a partif de una sola protoespiroqueta áncestral común. (Cerqueira y Picardeau' 2009)'
La figura 2 muestra la filogenia de todas las especbs de leptospiras conocfolas
165'
basaáo en un análisis comp=arativo de la secuencia RNAr de la subunidad
Figura 2. Árbol filogenóüco basado en la secuenciacién de loo genes RNA'
de! 165 de cePas de LqPbsPÍa sPP'
¡s AY887899 (P) L borgp.tcrlcni¡ Velüat Bat¡via
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442795¡19 (ND) L. kíi€tyi B€Plc(¡qT)
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(t) L farng BUT 6(f)
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¡wgeoes o) L broom¡¡ 5399Cr)
¡vograg€ (l) L 'nada' 1o(T)
(l)
L wolñt' Khor¡i'H2(T)
EFO25t96
|
,"1
AY7la96¡l (Out) Let|bocÍ|a ¡lrn¡ 3O55(T)
Fuente: Ceryuein Y Picañeau, (2009)'
19
En este árbol se identifican tres grupos, que reflejan el estatus de patogenicidad
de la bacteria, las especies se indican como saprofitos (S), intermedios (l)'
patógenos (P) y no determinados (ND); ND se refiere a especies que no se han
probado en modelos experimentales de animales o que no se han aislado de
animales ni humanos.
Hay más de 200 serotipos de Leptospira patógenas reconocidas. Los serovares
patógenos pueden ser específicos de hospedadores mamíferos reservorios; la
d¡versidad de los serovares entre las leptospiras se ha atribukjo a diferencias en la
estructura y composición del LPS (lipopolisacarido). El genoma de la Leptospin
spp. a difeiencia de otras espiroquetas, contbne un loctts de 100kt incluidos los
genes necesarios para la biosíntesis de los LPS. (Xue ef aL' 2009)
Las leptospiras son bacterias intracelulares obligatorias y al parecer las proteinas
de la membrana extema (oMP) juegan un papel crucial en el mecanismo de
adaptación, al facilitar las interacciones entre las bacierias, las élulas y su
hospedador; adcmás de la difcrcncia en la composición del LPS, también la
aispos¡c¡on espacial de las proteinas de la membrana extema (ompL),
LipL4t-tracen que las leptospiras sean
particularmente OmpL1, LipL32
antigénicamente disüntas.(Vedhagiri ef al.' 2009)
y
y
otros OMPs de Leptospin han sido
Jé"*u¡"ttd", de ló c¡.¡ales et t-¡plSo es conocido por ser la. proteina más
áestacada de fas OMP de Leptospin spp y se distribuye solo en espec*s
secuencia. y
p"ie;"", no se ha encontrado en leptospiras saprofitras, Laentre
espec¡es
;ñ;;ñ'd" lo" !"n"" del LipL32 son _attamente conseryadas
LipL32, LipL36, LipL41, OmpLl
esto b ha verificado en experimentos con animales en
;;ióGñ ie rcpiosp¡n,
proteina se muestra como el antígeno inmunodominante. (Sun ef
ios c"uates esta
a|.,2010)
Tabfa 3. Primerc para análbie por PcR de lo8
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M ItAlctTctct
r:(G( OtGff i)üo l)CT IIC
f:
gen€ Li9L21, LipL32 y LipL4l
CTT
C,fi
m CK
Pnri€r5
Fuente: Luo et al. (2010).
Laserotipificacionde|ascepasdeLeptospiraesunprocedimientoespecia|izadoy
centros especializados mediante
compleio, que solo ."'puJá-rpu"'. ? o-b en
inequívoca. Por esta razón una
cultivos y no siempre pi*én un" identiñcación
20
serie de técnicas moleculares se ha presentado como altemativas o como
complemento del método de serotipiñcaclon; esto incluye todo el análisis de la
hibridación del ADN, entre otros. (Ahmed et al.,2O'lOl
La hibridación del ADN es altamente utilizada como método estándar para la
determinación de especies en los procariotas. Por medio de múltiples
experimentos basados en hibridación de ADN han sido descritas un total de 20
especies del genero Leptospita; sin embargo la correlaciÓn entre los sistemas de
clasificación serológica y genotípica es pobre, esto indica que los geries que
determinan el serdipo pueden ser transfefiro6 horizontalmente entre eepecbs.
(Cerqueira y Picardeau, 2009)
En la década de los 90's se produjo un alejamiento entre los métodos
de
genotipo
identificación basados en el fenotipo hacia los métodos basados en el
como la electroforesis en gel de campos pulsantes (PFGE) y métodos basados en
la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). (Cerqueira y Picardeau, 2@91 ver
tabla 4.
Tabla
4. caracbrist¡cas esenciale del
genoma
de Lqpfospiras
spp.
Patógenae y aaPrófitas
lD)
Nu rrüer of gencs
Codiry &rstY (x)
Nu rr{¡er of Pseüdo,gcncs
Nurr5ef of tr¡nspor6cs
Size
{
L búgFtern.ai
L ,úcrro9Pr'6
L biÉxa
3931
4t627
39fi
2W
ao
354
24t6
7779
75
35q)
26
9
4l
92
33
Fuente: Adter y de ta Peña Moctezuma (2010)'
2.3 METABOLISMO
con un optimo
Las leptospiras son microorganismos aerob¡os obligados'
mediog
enriquecidos
simples
crecimiento a temperaturas deig-go.c, cre@n en
de cadena.larg! Y sales de amonio; los
fuente de caóono y lo
ácidos de cadena larga son uil¡zados cpno única
leptospira.en medios
,-áüOoUá" por p_oxid;ción-. Se han descrito crecimientos de
proteinas libres
oue cont¡enen suero o áiuunl¡n" y medios que contienen
.intét¡o". (Adlery de la Peña Moctezuma,2010)
;;;idi;""
B'l'y
P.12, ácirlos grasos
E|crecimientodelas|eptospirassue|eser|entoenunais|adoprimario.y|os
de ser desechados' El
antes
cultivos tienen que ser r"t*iJo" ¿uonte 13 semanas
buenos resultados y es el
da
lfquido.
almacenamiento a largo pi"t" L"
"ittOgeno
de la Peña Moctezuma'
(Adler
método preferido p"r" t"nt"n"t la virúbncia'
2010)
y
Existen pequeñas variaciones metabólicas entre Leptospim spp.
Se
ha
demostrado quela L. biflexa sintetiza isoleucina a través de de las vías de piruvato
y treonina, mientras que la L. intenogans y L. borgptersonii sintetiza la isoleucina
exclusivamente por la vía del piruvato. (Xue ef
al, 2009)
2.4 LEPTOSPTROSIS
La leptospirosis es una enfermedad sistémir:a de los seres humanos y
los
animales domésticos, principalmente de los caninos, bovinos y porcinos; la cual se
hepática. (Adler de la Peña
caracteriza por frebre, insuficiencia renal
y
y
Moctezuma,2010)
Hace aproximadamente 100 años desde que weil, profesor de medicina _en
fue el primero en describir esta enbnnedad, cuyo nombre fue
Heidelberg (1s86),
'entermeOa¿
en los seres humanos (enfurmedad de Weil)' Las
dado a la
leptospiras se habían üsto en esc momcnto pero no se habían cultivado, y fue
Si¡msón en 1907 quien la nombro Leptospin intenqans, al obsérvalas .en
preparaciones teñirJas con plata del hlgado de un paciente, quien se creía, había
mubrto por fiebre amarilla y que realmente habia muerto por la enfemedad de
Weif . (Sambasiva et al., 2OO3)
La leptospirosis es ahora considerada una zoonos¡s de distribución mundial' Los
roedores'son los principales reservorios de la enfermedad, dispersan las bactenas
por medio de la odná, los seres humanos suelen infec{arse a través de la
Eip*[6n directa o ¡nd¡recta gon agua dulce contaminada con la orina de los
animales reservorios. (Cerqueira y Picardeau' 2009)
y
Las ratas generalmente son reservorios de serovares cnmo lcterchaemonhagiae
an¡males
Ballum, y-fos ratones son reservorios para el serogruPo Ballum' .!os
a los
albergan
cerdos
los
son reservorios accirlentales;
domésticos tamb¡én
los
rérou"r"" Pomona, Iarassow y Bntislavai las ovejas, Hadio y Pomona;
p.tro", Canicota; el ganado -v-acung puede albergar serovares como
Aip4typn"u, Fon¡ona v H;rdlo. (Céspedes , 20fJl5) Ner tabla 5)
y
27
Tabfa 5. Reservorio3 típicoo y serova¡es de Leptospin enconüados
Rcscrvorios
Sc rova r(s )
Cerdo
vacu no
Caballo
Perro
Oveja
Pomona, Taras:;ovl
Hardjo. Pomon¿r. Gr¡ppotyphosa
Brat¡slava
Canicola
Hardjo
lcterohaemorrhag¡ae, Copenhaqenl
Ballum. Arborea. Bam
Grippotyphosa
Cynopteri. Wolffa
Rata
Ratón
[4arsuprales
Murc¡élago
Fuente: Cespedes (2005).
La patogénesis de la infección por leptospira en los seres humanos se observa
p¡nl¡páittt nt" en los pulmones, hígado y riñones; en los últimos años una forma
todo el.mundo y se caractenza con. un
ir"u" Oe leptospirosis ha emergido en
ctinico muy importanté, b presentación de hemoragia pulmonar' Los
y la
mecanismos de la-patogénesis, la.respuesta inmunitaria del huésped
;;;iü¡ó" d" r" eptoipita-tr.nt al sistema inmune, permanecen poco conoc¡dos'
(Da Sifva et al.,20091
iiná.t.
presentan una variedad, de
Los pacientes humanos con leptospirosis en general
que pueden iniluir,'dofires de ca-beza, fiebre, mialgias, escalofríos,
(Slack ef a/.,
y
"ini.ñ"",
iuOorac¡On,'artálgia, nauseas, vómitos, insuficiencia renal hepáüca.
áóóA. Cuatro síñdromes se han identificado en perros: ictericia, hemorrag¡a'
Los perros con leptospirosis
,r"tia, abortos y cachorros prematuros débiles'
diarrea' coagulación intravascular
tibüij""J"" pi"sentar fiebre ictericia, vómitos,los.bovinos
y cerdos' los s¡gnos.de
diseminada, urem¡a, hemorragias y muerte' En
momificación
incluyen taltos-Jn la',reproducción, aborto, mortinatos,
2010)
fetal, lechones y terneros débiles. (Adbr y de la Peña Moctezuma'
6iüñ"i,
2.4.1 Epidemiologia
con mí¡yor incidencia en
La leptospirosis es una zoonosis de distribución mundial'
|aszonastropicalesqu"-"nlasregionescon.c|imascálidoscomo|acosta:
mayor freorencia en zonas donde hay
;";ñ;;t" il transm¡s¡on'ocr"t" ón e-n..na¡ses
en vías de desanollo' Se
expansión poblacbnal, ;p.";ñ;t"
de la enfermedad'
desconoce su real incrdenJ;, á;b¡d; a h falta de conocimiento
y que
il;t* ;¿p"r"ion ¿" ¡ntó¡on subclinica que puede pasar desap€rcibida'
23
los métodos diagnósticos no están disponibles en las áreas
endémicas.
(Cespedes, 2OO5). Verfuun 3.
Figura 3. Epidemiologia de la leptoapirogb en animales y humanos
\
...
t
f-
Water,
/
Fuente: Adler y De La Peña Moc'tezuma (2010)'
primero' se produce en cl¡mas
Se han definido tres patrones epklemiológicos' El.
y la infección humana
templaOos, en donde po"o"..rbuatts eJtán involucrados
ganado
por óntaao o¡reao con animales infectados' como la cría de
en zonas tropicales húmedas' donde
;á""tóót"no. El segundo, se produce
animales'. y abundan las
hay muchos serovares lntectánteé para humanos .y
de granja y peros; la
i...rvorios, inctuyenJo ,o"Oot"", animalespero
prcde resultar más
""ó"1¡""
exposición humana no oü-fitit"¿a a la ocupackfn'
es donde los brotes de
lá estacion lrr"¡oo; en estas áreas
se producen tras inundaciones, huracanes u
Hó.pir""¡" son más pro¡áúe" by compone
la infección transmitida por roedores
otros desastres. El tercef t"t d, -Ot
paises
intecc¡On se ve raramente en los
i¡pt
en el entomo urbano,
de
pobres
en ciudades
""ü
desanollados, p.ro pu"o"n""ií"t¡r-¡iotes especialmente
(Levett' 2001)
faises en via dá desanollo.
;';ü;;
;üi";-;"
El primer estudio de esta enfermedad en Colombia fue en 1957, por Muñoz-
Rivas, en el que se estudiaron 3 lotes de sueros humanos con MAT, encontrando
4-28% de humanos positivos al serovar icterchaemonagiae. En 1969 se presentó
el primer caso clínico colombiano de leptospirosis por el serovar canicola, en un
joven con un cuadro de icfericia progresiva que afecto adernás riñones y
meninges. La única epídemia documentada se describió en agosto de 1995, en el
departamento del Atlántico, con un total del 47 casos confirmados y 2&4 casos
soipechosos, h modalidad de los casos confirmados fr.¡e de un 17olo, se aislo L
canicola.
intánogans de las serovariedades ictetq,hap/monqiae, Po¡nona
y
(Florez,2005)
En Colombia, la leptospirosis no es de reporte obtigatorio, lo que puede estar
las
¡nc¡AienOo en'la bajá notificac¡ón y diagnóstico en humanos, en contraste con
altas tasas de seróposiüvldad encontradas en animales doÍÉstb6 en dive6as
a un grupo de médigo"
fuionés. En el dtudio ealizado en Mllavicencio
prueba MAT,
uáie¡nár¡os de consultorios de pequeños animales, por medio de la
particular
resalta . la
se concluyo que la seropÉvaiencia es alta en
los
seroneactividad al serovar'L. Bntislava, que no es especie especjfico de
prevalente
en
más
áninos; Ef sero\rar L. bntislava ha sido reportado cofno el
áir* páito que coinckte con estr'rdios a nirrel local en grupos humanos.¡^le
y
anima|es.Lamayofseropreva|enciadereactoresenlosveterinarios(26%)
(z'i 7"), puede reflejarun nl"vgt9r4-o-,1"-"y9.:'9:1? l"'
lo"
at,
"rií¡"r""
razón de us ádiv¡da¿eg piopias de ta prorfesión. (Quitián ef
;ilü;"
di";óir*; ;
200e)
Enunestudiorealizadoenelaño2OO2,pandeterminarlaSeroprevalenciade
un total
poot""lon porcina en et departamento de cordoba, de
de los 5
Já-oóóán¡t"re. zá¿ t¿sv"i órá.entaron reaúón positiva a Leptosp,in;..
(54%)
seguido
más alta
rr"á,p¡"" é"tuo¡aoos, coóña presento !q.9r9va!ncia
cereJé (36%) v Monteq (327o)'.Se
Feravg
-i¡¡;q'á
;;; ó¡,ínad oro tsb"¿i,- san
r
canicota (4%l'l' bntidava (2o/ol'
tüwl,'
os serovapJ'l
resultados demuestran
í..á-iiwipnósa (2o/ol y t. icier*aemómgiae (1o/ol' Estos
de generar un
áátát¡"" seioprÑatec¡a de leptospirosis porcina' que además
de riesgo potencial en la
""á
oran impac{o econOmlco, fresent¿h¿oó una zoonosis
dá departam'ento' (Almenteros et al'' 20o4'¡
¿püt,;;"ná
;;;;[¿¡i"
ffi¡
ó
J{}i t'
;íbf¡""
2.4.1 Patogenia
cortes o abrasiones por
Las leptoepiras entran al organismo airaYé€ de-ry11ueños
circulan
la coniuntiva o ? tlavér de la piel húmeda;
las membrana"
de
después
la.fase de bacteremia'
en el tonente sangu¡neo ñJá pttlt¡as' en
y en loo tej'rloe llega a un nivel crítico'
]a
que el número o"
ru*"-dro
r"pt*pi[llí
""ngt"
oom¡enza a aparecer lesiones debida a la acción de las toxinas o a componentes
celulares tóxicos y como consecuencia aparecen los slntomas. Las lesiones
primarias son daños en el endotelio de los vasos sanguíneos pequeños'
generando isquemia localizada en los órganos, resultando en daños tubulares
ienales, necrosis hepatocelular y pulmonar, meningitis, miosiüs y placentitis- (Adler
y Moctezuma, 2010)
Leptospira causa enfermedad a través de un proceso mediado por toxinas, las
cuales inducen lesiones vasculares, en particular vasculitis de los vasos
pequeños, no se han encontrado restos de estas tox¡nas, pero posiblemente se
incluyen proteínas de membrana extema, glicoproteínas de membrana,
hemofisinas y lipopolisacaridos. (Sun et al.,2O1O)
un estudio de todo el genoma reveló que una serie de hemolisinas jugaban un
papel en el daño del éndotelio de los vasos sanguíneos, lo que da lugar a la
'hemorragia
e isquemia localizada. La adquishion de hieno no solo es un facfor de
virulenciá importante en muchas bacierias patógenas sino que también puede ser
un proceso áave para la supervivencia en el med¡o ambbnte; se ha en@ntrado
que cenas especiés de Leptospin oontienen receptores TonB dependientes de la
de
membrana externa, que púeden estar involucrados en el transporte del hemo o
otras moléculas que contienen hbno' (Xue ef a/-' 2(X)9)
no
Los mecanismos por los cuales Lepfospfa causa daño en el tejklo hospedador
de
factores
están bien definirlos, en particular las bases moleculares de los
virulenc¡a aun se desconooen, debirlo principalment€ qu€ hasta hqce q999 s"
(Adler y
tienen las herrambntas genéticas para la manipulaciiin de Leptospin.
Moc'tezuma, 2010)
2.5 INTUNIDAD
Y VACUNACION
Lainmunidadfrentea|a|eptospirosisesdetipohumoralpredominanternenteen
animales, incluyendo penos,
,"é, t ur"no" y en la m'ayoiia de tas especies
érdos, cuyes y hamsters. (Adler y de la Peña Mo@zuma, 2010)
dificil, las medidas de
La prevención de la teptospifosis sin vacunación es bastante
de orina
hioiene en el trabaio, comb et uso de ropa protectora' evitar salpicaduras
de apl6ar' poque impitlen el trabalo
;";il; ;";;;ú;-úüles, pero dif¡cile'
no hs áceptan; e1 adelf9.m.w dincil
Iolüü';;t q-"á:rüi.ri"jadores
p;bbs tropk'ales para que eviten aclividades como
á"e"óia, fou naUitantes de lo€
de humedad'
el contacto con cerdo. y ott"i áninrales,'o trabájar en condkiones
ó.o fo. anozales. (AdÉr y de la Peña MocGzuma' 2010)
Vacunasparahumanosyanima|essehanuti|izadodesdeladécadade1920'la
desÍuidas por
mayoria fueron preparaoas á part¡r de- élulas óe Leptospins
*|no ábr, iormol, fenol, hradiación, etc. Muchas de estas
diversos métodos
primeras preparaciones eran demasiado reactogenic€ts para su uso generalizado
en humanos. (Adler y de la Peña Moctezuma, 2010). Las vacunas disponibles en
la actualidad solo imparten inmunidad a corto plazo, mediada por ant¡cuerpos
opsonizantes y no ofreCen protección cruzada contra el gran número de serotipos
patogénicos. Por oba parte, las vacunas inac{ivadas no previenen el
desprendimiento pemanente de leptospiras por parte de los animales infectados.
Una vacuna ideal contra la infección de Leptospin, debería activar la respuesta
inmune humoral y celular. (Faisal ef al., 2009)
Para que las vacunas contra leptospirosis sean eficaces, además de ser
inmunogenicas, deberían prevenir tanto la leptospirosis aguda como el estado de
portadoi, las vacunas comerciales disponibles ac{ualmente para animales e1 todo
el mundo, son vacun¿¡s muertas de élulas enteras, económ¡cas y muy fáciles de
producir, pero no ofrecen protección cruzada frente a un gfErn ntlmero de
i.rogrup"i. por to tanto krs pefro6 adccuadamente yacr¡nadc, es decir que han
seguido el protocolo de vacunación conec{amente pueden ser d¡agnosticados con
leptospirosis aguda. (Suepaul et al.,2O1Ol
se ha informado que la inmunoprotección cruzada frente a los diferentes
es muy
serogrupos y sero,¡arb de bptospira por pañe de las vacunas comerciales
Oébii AAuainente las vacunas q'ue se usan @ntra Leptopfua, están compuestias
serovariedades muertas de Leptospin qtF son @munes
generafmente de
de los
y dada la limitada inmunoprotección cn¡zada, cuahu¡era
podrla
causar
inonqans, que no estén incluidos en la vacuna,
serotipos
una epidemia fulminante de leptospirosis. (Luo ef aL' 20'10)
ioá¡r*nt
É t.
3{
LasproteinasLi¡ftreronitJenüfidascomo]asprincipabscompofientesde|a in
de crecimiento
G hsfuptospiras que no se expresan en condiciories>90%
de ratones
""p"ñi.
ufi". io¿zut¡ et al., 20{X determinaron una protección
an¡mal
¡nmun¿a¿os con LigA y/o LigB, aunque el raton no es un modelo
A parece ofrecer, la
ieconoc¡¿o para la ieptdspiroslís; a peür de esto ta Lig
(Adler
pLÁpea¡"a más prornetedofE¡ para una vacuna con proteína rec¡mbinante.
y de la Peña Mociezuma' 2010)
Actualmentevacunascontra|eptospirosismed¡anteproteinasfecomb¡nantes
y ateni¡ad-3 , están en desanollo y prueba' entre estas
i"áü"* fpsl inacÍivadas dn
(proteinas de membrena extema) v las
:;;rd; ii" uá."¿"" el oMPL(pioteinas
asociadas a hemolisis)' Lig A y
la r-¡pi¿1,-t-ipl-sz
lioooroteinas, como
úg'8. tSu.p"ul et al.,2O1O; Luo
eú aL,
2010)
27
2.6 PREVENCION Y CONTROL
La prevención de la leptospirosis no es posible en todas las situaciones, debido a
que está muy extendida en todo el mundo y la presentan muchos animales. Lo
mejor que se puede hacer es limitar los efectos de h leptcpirosis en los seres
numanós y los animales que dependen de ellos; esto implica la detección de las
fuentes y fa eliminación de estas o sus efec'tos. (Sambasiva et al.' 2OO3l
El control de ratas en los almacenamientos de alimentos, areas de preparac¡ón'
almacenamiento de cultivos, establos, instalaciones de producción animal
intensiva y viviendas es diflicil, pero se eliminarla una importante fuente_ de
y
leptospirosis en humanos y animales domesücos. El.uso de ropas de proteggi-qt
la'higiéne en los sitios de traba¡o también son indicadas. (Sambasiva et al.,2OO3)
La inmunización ha sido ampliamente rfilizada por muchos años, mediante la
inducción de inmunidad en animales y humanos, con un éxito limitado. En los
ganado y los penos son ampliamente
fai"es Oesanolladoe, tos cerdoe, el paises
en desarollo las vacunas que
inmunizados, en la mayoría de los
contienen los serovafes pertinentes a nivel local no están disponibles. La
vacunac¡ón requiere un intérvalo de revacunac¡ón anual' (Lewtt' 2001)
3. DIAGT{OSNCOYTIPIFICACIOII
DE LEPTOSPIRAS
es ne@sano
La leptospirosis es una enfermedad de urgencia clínjca, en la cual
complementarios a los esh¡lios serológicos; por lo cual tt "-u91"-f
reahár
"náti"¡s
ar.omentooeobterrerlamrresfaparasero|ogia,obtenera|¡cuotaspalaotfEls
quimica sanguinea que
pruebas pertinentes, como una bionietria hemática, una
renal y hegá!9o, para establecer criterios sobre
;;;it" ;"i"¿rel tuncionamiento
Ll pronóetico de ta enfermedad- (Luna ef aL, 2fi)8)
Debidoalagrandiversiladdelossignosclinicm'eldiagnostico.de.la
de laboratorio, tales
l"pt*p¡ÁS-olnA V OqñnJe de una vafodad de ensayos
;;;' b pnrba de aglutinackin microscópku (MAT)' o
inruno.natlticos
(ELISA), áñtt"
-e^nsayos
ott""' (Adler y de la Peña Mociezuma' 2010)'
Tambiéne|diagnosticomendiante|atécn¡cadecampoosanro,histopatologiae
en animales'
para el diagnosüco
inmunohistoquimica, son ut¡lizados especialmente
de mucfio tiempo para
Las pruebas serológ'rcas son dispendiosas y requieren
métodos molecr¡lares, se ha hecto
tipiftcartas, por lo que con ,i'oo"-"álo de lc
de Leptospin; haY v?lo9.mglodos
#¿s,a;ú;i rúir" t¡p¡r'J"¡án áá-*tou"to
induyeng_o_la_hibrilacón de
moleq¡lares basados .n ÁóÑ'pái" |a dasficacón,
de canpos pulsantes (PFGE)' reac¡ión en
ü;iéñ;;,-eparofoÁis Ln gel
"pot¡momsnios de longitud de fragmentos de
cadena de la polimera";-0¿ñl'
restricción (RFLP), detección de un numero de variables de repeticiones en
tándem (VNTR) y tipificación de múltiples locus (MLST), enüe otras.(Ahmed ef a/.,
2010)
3.1
T¡CROSCOP¡A DE CATPO OSCURO
El principio empleado en el microscopio de campo oscuro es el "efecto de Tyndall',
que permite ver diminutas particulas prácticamente invisibles bajo una iluminaciÓn
normal; pefo que si son ¡luminadas oblicr¡anrente en un ambiente oscuro, fefle¡an
luz y aparecen como objetos o puntos luminosos. Este microscopio parece superar
b résoluc¡On del m¡6¡.oscopio de campo claro (aunque la resolución es la misma),
pues permite obs€fvaf objetos de tamaño menor que el lfmite de resolución del
inicroicopio de luz. Se utiiiza para el examen de organbmos como el Trcponema
patlidum (agente de la sifilis), Bonetia sp. y Leptospin sp' (Rodriguez ef a/',
'ZOOS)
f-ai teptospiras se destacan corio hebras de plata sobre el fondo oscuro'
(Organización Mundial de la Salud, 2008)
para la
Si bien esta técnica se describe en los libros de texto como un método úül
de
demostración de las bptospiras en los fluidoe, varias veces 8e ha mostrado
Proteínas
áudoso valor, aún en las manos de personal muy experimentado.
séricas, hebras de fibrina y otros residuos celulares pueden pafecerse. a las
de
leptospiras s¡endo que, adeinás, la concentración de organismos en la orina
por
t'ür"ñór V animalé es frecuentemente muy bala como para s9r detecfables
este máoáo. por lo tanto, mucho cuidado y una gfE¡n experiencia son.necesarios
de la Salud'
;;;á ;"iñA"fundir artmc¡os con leptospiras. (Organización Mundial
2008)
En|aprimerafasede|aerrfermedadporLeptospin,nosehane|evado|ostítu|os
las bpto*p¡ras en
O1 aniicuerpos, por lo que et diagnosiico se realiza observando
;;"gr;;l*'ó¡reroi
7 dias, o en tiquido cefaloraquideo . entre el.cuarto
y
parEl
dia, poi m¡croscopia de campo oscuro,.lomándoee las muestras
la segunda
,éÁ¡á et óu'ltlvo del micróorganismo que dura días o semanas' En
leptospiras
¡.s
observando
fase de la enftrmedd, .. p,rá" realizai et diagnostico
puede difrcultar según la
en ia or¡na al microscopio d" otpo oscuro, lo cual se
G¿ñ;
acidez de la orina (hornbre). (Rodriguez et aL' 2001)
3.2 DIAGNOSTIGO HISTOPATOLOGICO EN NECROPSIAS
de necropslas.se ven
Tanto en seres humanos conto en animahs en los hallazgos
sistema nervioso cenÚal' En
comprometidos riñones, i,igaOo y.en algunos casos
universidad del Valle, las
un estudio realizado a óres humanos por la que
s€ encontraron fueron;
alterac¡onec h¡etopatologba"'á" áf tejirJo hépático'
severa alteración arquitec.tural caracterizada por disociación de cordones con
pérdida de cohesividad interhepatocltar¡a. En algunos se encontnron focos de
necrosis centroacinar sin respuesta inflamatoria. En riñón se evidenció necrosis
tubular renal alterada con túbulos presefvados. En el parénquima cercbral se
observaron divesos grados
de
edema @n manguitos
¡nflamatorios
(Perez
J. 1997)
mononucleares perivasculares y p€queños trombos capilares.
En un estudio feal¡zado en México, en perros; los hallazgos de necropsia incluyen
emaciación marcada, deshidratación, ulceras en cavidad oral, debidas a la
secrec¡ón de urea y su degradación en amoniaco por bacferias productoras de
ureasa; el hígado éstá friable con bordes ligeramente redondeados, colestas¡s,
bilis con cons¡stenc¡a espesa, riñones ligeramente aumentados de tamaño con
zonas hemonágicas. (Luna et al., 2OO8l.
3.3 PRUEBAS SEROLOGICAS
un gran número de técnicas serobgicas son usadas para el di4nó6üco de la
bptispirosis, cada una con su sensibilidad y especificidad ..propias.
Fiecuentemente es riecesario usar varias técnicas, ya sea al misrno tiempo o
sucesivamente, para alcan 7l¡f un diagnóstico confiable. El inmunoensayo
enzimático o eñzimoinmunoanálisis (ELBA) y la prueba de aglutinación
microscopica (MAT) son los métodos de laboratorio más comúnmente utilizaclos;
rin ét¡átgo,'¡a lÁ.r, desanollada por Martin &-Petit (1918), sigue sbndo el
método de-referencia. (Organización Mundial de la Salud' 2008)'
ñuofescencia polarizada, un comple¡ento adicional a.las
H;y;dfá
"¡ "ülzadib
dé realizar y con un cooto más baio. (lCA
V" Liptá"t*, más senci'a y rápida
2010)
3.3.1 Prueba de agluiinación microocópica
(ilATXilAL)
leptospirosis
Es el método de refurencia para el diagnóstico serológico de-la
o
serovar
alta sensibilidad y especiñcidad, además puede identificar el
la
"u
Leptospin ómprómet¡¿a en la infección' La MAT es también
puede
que
ser
puesto
de prevalencia'
óiuéóá'te" apropiada para'estudios animát
y h gama de los antígenos usados
á" *"fqre, é"po¡"
loiioá"
" "u",,b" olttinüit *gdn b requerido' (cespedes' 2005)
O"UiOo á
;"d"d¡;
l5p"J"-"tJr¡"io
LaMATesunapruebaquedetermina|osanticrerposag|utinant€sene|.suerode
con leptospiras vivas
pái,"r,t ,*iiante la *áá" de varias diluciones de éstepresentes
en
""
(formolizadas). tos antitxerpos antileptoepiras
; lí;td
"1,-"1:to
unas a otras b-rmado grumos' Este proceso
il;;qr" üs eptospiral -p"gu"n
usando microscopia de
de agrupamiento es llamió á!i"ti"a"io.1 y es ob--lado
;;ü-oscñi. Ver figun ¿l] r-* antict¡erpos aglutinantes pueden ser de las
clases lgM e lgc. Esta prueba puede ofrecer una indicación del serogrupo al cual
pertenece el serovar infec{ante, pero raramente lo identifica. La prueba no puede
ser estandarizada ya que utiliza antígenos vivos y factores como la edad y
densidad del antigeno en el cultivo puede infuir en el título de aglutinación'
(Organización Mundial de la Salud, 2008)
La MAT es la prueba diagnóstica más utilizada (gold estándar), t¡ene la ventaja de
tener alta especificidad para serovares, pero no puede discriminar entre
anticuerpos resultantes de infección o vacunación; esto Puede causar problemas
particularmente en animales, por ejemplo en cass de importación o e)Qortación.
(Adler y de la Peña Moctezuma, 2010). Realizar un diagnóstico temprano con esta
prueba no es posibh, debido a que esta se basa en la detección de anticuerpos
contra antígenos de leptospira, los cuales no son detectables sino hasta una
semana después de iniciados los sintomas. (Cerqueria y Picardeau' 2009)
Figura 4. Reaccionee de la prueba de
IAT
Figura 4. Reacciones de la prueba (le aglut'nación mtcroscóp¡á ( l'tnf ) a: lám¡na control; b: lámrna con 25oo de aglutlnaclon {zonas como copos de algodÓrr)' c: lám¡na con 5ooo de
aglutlnaclón; d: lámina con 759o de aglut'nación: c: lámlna cony
1OO9o de aglutinac¡ón; f: lám'na corr 1OO9o de aglutinaciÓn
lisis. g: lámi¡ra con l OOo"o de lisis, h: lámina negatlva'
Fuente:Cespedes(2005),|eptopspirosis:enfermedadzoonoticareemergente.
¿;üta pttrán" de me¿icína experimental
y salud pública (22)
tiempo' debido a
Esta es una prueba complicada y dispendiosa, @nsume mucho
vivos de diferentes cepas para usarlas
gran *i"""ián á"
"úniuo"
anticuerpos aglut¡nantes; .los rcsultados
ánt¡g.nos, pafa detec{ar los
ya que estos dependen de la
obtenidos son también dificiles de estandarizar'
q;;ür¡"*tna
üro
experiencia del biólogo que opera el microscopio. La interpretación de los
resultados también es complicada por las frecuentes reaccior¡es cruzadas que
ocurren entre lo3 Serogrupgs, como las que suele ocunir con aerovares saprófitos
y patógenos. (Cerqueira y Picardeau, 2009)- Los anticuerpc que causan
reacciones cruzadas, son los primeros que nomalmente aparecen pero
desaparecen rápidamente. Los anücuerpos homólogos, s¡ b¡en aparecen un poco
después, persisten por más tiempo, permitiendo la ¡denüficación presuntiva del
serogrupo responsable de la infección y también la detección de rastros indicando
infecciones previas. (Organización Mundial de la Salud' 2(X)8)
En áreas en donde la leptospirosis no es endémica, en sefes humanos un bajo
título en la MAT (>1/1OO) puede indicar que el paciente tuvo leptospirosis, en
contraste. en áreas donde la leptospirosis es endánirp un titulo afto (>400300)
en la MAT puede ser sospec*la de leptospirosis. (cergueira y Picardeau, 20$))
El centro de control y prevencón de enfermedades (cDc), establedó un tltulo de
I12OO pa-¿ def¡nir i¡ñ caso probable de leptospirosis; sin embargo, sólo es
apropiáo para poblaciones donde la expooición es infiecuente, por lo que en
áieai endémicas se usan tltulo6 más altos como 1/800 en pacientes sintomáücos,
incluso recombndan títulos hasta 1/1600. Los tltulos que sbuen d99gyés
aguda generalmente son e¡<Íemadamente altoe (1/25600).
;ñú;
oe t'a ¡nteccion
(Cespedes,2005)
1/100 o
En animales se @nskleran como posiüvos a la infección con un título de
superiores. (Uribe eú af., 2001; Uribe 2005).
serovafes,
Los animales vacunados presentan títulos baios o moderados a varios
relacionadoconelempleodevacunaspolivabntes,perotiendela.desaparecer
Oé.p"e" de la vacunáción en foma más o rnenos rápi<ta' En los animalesy
tienden a persistir durante más tiempo
¡nfectaOos loa títulos de anticuerpos
'oespués
de tratambntos con antibióücos' Para
muestran tendencia a descender
h sih¡acién sanitaria del rcbaño es necesafio deteminar el prcmedio de
;"*;
|ostítu|osdeant¡cuefposde|apobhciónanima|;resu]tadognegativoso
sospechososrequierenunasegunda.sero|ogíay|ainterpretaciónestaÉsu|etaa
la indicada en la tabh. (Affaro ef aL' 20(X)
(MAT) en bovinos
Tabla 6. Tabla de intepretación de títulos serolfuicos
Caso
3.
1:100-1:
moderado
(1:200-1:400)
muestra en 15 dfas
ffipospost-infección,
vacunados (realizar segundo
rá"Ñ."t" en animales
muestreo en an¡males no vacunados
i;
t2
(1:400-l:800)
5.
altos ( >1:800)
no vacunados)
lnfección activa
Fuente: 1999. Guía de Procedimientos Técnicos y operacionales para Diagnóstico
y Control de la Leptospirosis en Venezuela,
3.3.2 Prueba de inmunoengayo enzimáüco (ELISA)
Debido a que muchos laboratorios no tienen las facilidades que se requieren para
desanollar la MAT. la técnica ELISA es usualmente utilizada, pof ser una prueba
que detecta anticuerpos de una forma simple y se realiza un diagnostico rápido.
(Cerqueira y Picardeau, 2009)
Esta técnica se usa ampliamente como prueba de deteccion género especiftca en
el hombre. Tanto la peroxidasa y conjugados de ureasa se ha úilizado de manera
satisfactoria; el uso'de lectores automat¡zados y eontroles adecuados, mejoran la
reproducibilidad y valor predictivo de esta prueba. (sambasiva et al.,2oo3)
Esta es una prueba serolfuica que se usa comúnmente de varias maneras
cuso de la
dápendiendo O'el t¡po de antígLno y'los reactivos empleados durante el
y no es apropiada Pfra. la
ilJ;ba Sób det¿ia antcórpoe-gérieroLosespecificos
anticuerpos en los sueros a estudiar
identificación del serogrupo o'seÑar.
son puestos en contac'to con un anfgeno que está fijado en un soporte sólido
óró un" placa de microtitulación. Luego de un período de incubación y de
un anticuerpo
numerosos iavados para eliminar exoesos de anticuerpos, se añade
enzima' La
u.na
c9n
probado) conjugado
1a ta cuál pertenece el suero
"nti""poi"eniimátirn €s entonoos deteminada por el agregado. de un.sustrato
aAivkia¿
la
La intensidad de la reacción de color, que está relacionada. con
"iorogén¡"o.
de subsúato degradado, es propofc¡onal a la canüdad de anticuerpo
iueto analádo. (organizacirin Mundial de la Salud' 2008)
;;iid;¡
;;;;¿
"ñ "i
EnlggT,lapruebadotELISAfueevaluada'usandoantígenosobtenidosde
'de
Leptospira intenqans, sero\rares como bras¡linansis, canicola,
óltiuo"
la detecciiir de lsG' lsM v ¡sA
aguda
áí, r*"ú""" de sueros de 63 pacbnte humanos con bptosp¡rosis 19^fase
de.los
62(987.o)
lgM. en
con la forma icterohemona!ü. s. o"t"a"ron anticr.¡erpos
y
de eatos' Asi ellos
760/o
Toch
observadas en
ó"á""i"", lgc v lgA frIeñn'er-rsn
prueba
de dctección
pr''e¿e scr utilizada como
quá
'so¡re
tooo para la detección de anticueryoe lgM' y üene
ráuot"tb¡os,
én
tbrnpo de eic¡c|¡datn, facilitad y beF costo.
"iiÁia¡,
¡;i;;iñd
lá.
;;"¿j." ;
nto,i;^"it"v ¡a"aát*ot'¡agirr' Fn
ript.u"
É;inoe de áüir¡.,ttto,
(Sambasiva et al., 2OO3)
LapruebadeELlsAdaunarespuestapos.'tlvaenlaeva|uacióndiagnósticade
porque es más sensibb para los
leptospirosis algo más t"i"po"o-q* la'i¡lAT
33
ant¡cuerpos lgM, generalmente se observa posilivirlad 6 - 8 días después de la
aparición de los primeros signos clínicos. Una ventaja potencial de la ELISA es
que puede ayudar a diferenciar entre una leptospirosis actual de una previa,
debido a que ios anticuerpos de una infección pasada o una inmunización pueden
no ser detectables. Sin embargo, si un conjugado anti lg o lgc humano es usado,
la positividad de la prueba pr.rede ser extendida, permitbndo la detec¡ión de
anticuerpos residuales en pacientes en recuperación o inmunizados. La prueba de
ELISA es muy sensible y específica para el diagnóstico biológico de leptospirosis,
Sin embargo, la pnreba no permite el diagnóstico a nivel de serogrupo'
(Organización Mundial de la Salud, 2008)
3.3.3 FLUORESENCIA POLARIZADA
Es un tipo de inmunoensayo homogéneo compeütivo por fluorcscencia. Gon la
unión competitiva, el antQéno de una muestra y el reactivo marcado antlgeno-
fluoresceína (AgF) compiten por los puntos de unión en el anticuerpo'
Figura 5. Inmunoensayo compeüüvo por polarización de fruoleocencia.
Ab
Ag't
Ab/As
Ag
Ab/As-F
{+€0, + €D*-{¡9--dD,
¡t¡gE
0
ffACfM)
r*Acli
rgrüoo
tH!É|f,nEI$
üxtfturs{Es
(2004)
Fuente: Abbott División Diagnóstico. Global Ma*eting: Inmunoquím¡ca
antigenos de leptospiras
La información sobre la naturaleza y la idenüdad de los
su ímportancia en la inmunirdad' patogenia v
pao
una caracterísüca y es el
"rr"¡oát Las teptoepiras
oe ü nptospirosis.
'máiadatienen
'
por dos flageloo periplasmicos
ráiirünt" en espiral, h- lual esta
insertadossubtermina|merrteenelci|indroprotop|asmático.Aná|isisdesecuencias
que hav dos
flagelares de varias espiroquetas muestran
y FLaB en el fihmento' (Bughio
clases distintas Oe proteinil U" p'ot"¡n"" FLaA
et a1.,1999)
;; ;;;¿"t"
;;g;*üó
;;i;;é;;;tftot"in""
EnelestudiodeBughioetal.,lggg.Seinvestigótauti|idaddelaproteinaFLaBde
Fo.ona eñ el diaqnostico serológico de la
leptospin inte¡rogans
""ió"",a" n'"¡á"""q1 nglalza¿a (FPA)' Una población
leptospirosis mediante
y 208 huesfas negativas mediante el
"r "i"ává
de 20g muestras O" sre. tJ¡no pos¡t'as
los sueros MAT positivos
MAT, fueron anal¡zadas ."0¡ánt"-"1 fpn; él 83.7o/o_d.
aiJi" d" lá" t'!tr"" MAT negatÚas fueron negativas'
resultaron positivos v
"r
34
La comparación de los resultados indica que la prueba FPA es una técnica sencilla
y rápida para la detección de anticuerpos antileptospira. (Bughio et al., 1999)
3.4 PRUEBAS TOLECULARES
a
las dificultades asociadas con la idenüficación serológica
de
para
la
moleculares
máodos
los
aislamientos, hubo un gran inteés de introducir
identificación y subtipificacón. (Cespedes, 2005) Entre las técnicas moleculares
más utilizadas están la hibridación del ADN, la electroforesis en gel de campos
pulsantes (PFGE), la reacción en c.¡dena de la polimerasa (PcR), polimorfismos
de restricción por tamaño de fragmento (RFLP), detección de un numero de
t¡pificac¡i5n de múltiples locus
variables de rdpeticiones en tándem (VNTR)
(MLST), entre otras. (Ahmed et al.,2O1O)
Debido
y
3.4.1 Hibridación de ADN
El uso de la hibridaciÓn cuantitativa de ADN-ADN para medir las relaciones entre
árÁoN de las cepas de leptospiras, es el método de referencia para clasificar.las
¡Auahenie, cerca de 300 cepas han skto clasificadas sobre
áp""
"n ""p."iés.
de ta homología del ADN. (Organización Mundial de la salud, 2fl)8)
lai bases
y
Esta técnica es muy util para la diferenciación genética entre serogrupos
para..
serovares de las espec¡es, sin embargo no es apropiada
-cualquier
(Kositanont
laborator¡o, debído al uso de muchas sondas y otras compli@ciories'
et al.,2OO7\
aisladas, divitjidas
Los acidos nucleicos que contbnen secuencias específicas son
no
y etiquetadas con una molécula reportera, la cual puede ser radioac{iva o los
ADN en
i"J¡oáJ¡u". El ADN ethuetado de ádena sencilla se hibrirla con el
o en solución
i;t'¿;lhütid"oon ,'¡ i¡rul' en papel (hibddación Southem blot)
ñibr¡dación);'si bé éecuencias de.nucleóüdos de la sonda son
iráf""¡Oi,
son
a bs de íá muestra, se prduo8 ta hibnilacion yl,os resultados
las sondas marcadas con
supervisados por una autorradir¡grafia en el .caso de
cotor¡mañcamente si son con matefial no radioac{ivo.
á"
;;;-ü;d"rú
material radioac{ivo
o
(Sambasiva et al., 2OO3)
3.,f.2 Electroforcab de c¡mpo pulnado (PFGE)
gel de agarosa' que p€rmite el
La PFGE es una variación de la elec'troforesb en
de una orden de mayor
análisis de fragmentoo de-ADN bacterial' a través
(análisis de enzimas de restricción)' Este
magnitud que la de l" *tiu"nt'¡oáñeA
¿m"¡f, tequür" de un equipo costoso' *.ryT1=9:
proceso es técnicamente
con fiagmentos b¡en
oero ofrece perñles o. t""tti""¡On ánamente reproducibles'
iesuettos. (Sambasiva et al -' 2OO3l
tl"
35
En la electroforesis de campo pulsado (PFGE), enzimas de restricción, tales como
Nofl, se usan para diferenciar enlre Lepfospha spp y muchas veces también entre
cepas. Tales enzimas cortan el ADN en fragrrentos largoo, los que son separados
electrofoéticamente en geles de agaro*r, dando patrones característicos. Este
método ofrece la ventaja de poder interpretarse de una manera simple ya que
están presentes sólo bandas grandes y por lo tanto pocas. (Organización Mundial
de la Salud, 2008)
La macronestriccion genóm¡ca con endonucleasas como Notl, seguida por PFGE'
es considerada como un método de tipificación de gran alcance para la
clasificación de cepas de Leptospin. Hermann et al., ('1992) reporto muy buena
c¡ncordancia entre los resultados de PFGE y serotipifiación. Los patrones de
PFGE obtenidos para un serovar fueron únicos para ese serovaq por ejemplo, la
clasiftcación de la cepa Dadas como un nuevo serovaf del serogrupo
Gripptyphosa fue fr¡ertemente soportado por un único parón de PFGE; sin
emb'argd las discrepancias entre el PFGE y los métodos serológicos también se
han descrito. (Cerqueira y Picardeau, 2009)
I
Por todas estas razones la PFGE se cons¡dera la prueba gold estándaf para la
tipificación molecular de serovares de Leptospin en cornparacirin a todas las otras
técnicas, sin embargo, este máodo es muy laborioso y no es-tá dbPonible en la
áayoria de loo Ubóátor¡os en las zonas topicales, donde la incidencia de la
enfémedad es más alta. (Cequeira y Picadeau, 2009)
En el estudio de Rornero et al. (2009), la PFGE no pudo diferenciar entfe las
serorarierlades tcterchaenwfltqie y Copnhageni, pero fue gap* tt"
sin
identificar el sefovar canicola en-los ablados de loe pacientes de.Brasil,
demostrado
emú;ú, tanto fa lcterohaennnhagiae y Copnhqeni habianEste
estudio
pr*ár"-"té ser similares en pn ebas serotfuicag y mobculares.
inóstro que la pFGE y h ÍrlAT reveló resultados s¡mihre€ a nivel de serogrupos'
(Verfigura 5)
36
Figura 6. Patrones de PFGE de 14 aisladoe clinicos de de Lepfospira spp.
oce (oPt 1.50d.) rrd
PFGE tlot
1
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ld.e'clt€,emorrtug¡aeic openrngent
opefüngent
opé¡atagenl
inbnogrt¡s lcterohaernoíttag¡ec opefthagefi
L. inbt¡ogats C cpqthag€nl i¡t20
Fuente: Romero ef a/. (2009).
3.¿1.3
Reacción en cadena de la polimerasa (PGR)
LaPCRsehaconvertidoen|abasedeldiagnósücode|afaseagudade
organismosmo|estoscomoLepfospira,Esteofrecevariasventajassobre|ala
incluyendo menos tiempo en su pro@so, menos propensión a
prü"ü"
".tá"áár,eliminá h necesidad de producir anüsuero hiperinmune de
Lntaminac¡On,
i"tg,"n"¡á para determinar la identir1ad del organismo cultivado. La PCR en tiempo
que no se requieren
ráal otrecé más ventajas que la PCR mnvencional, ya
manipulaciones post-PCR. (Slack et al , 2007)
para dele{1-91 ADN de
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se usa
de ADN que son
Leptospin en muestras clíniás. Primerc (secuencias cortas
páá upto+ira"), en combinación con.una polimerasa del ADN estable
pre.énc¡á de nucleótidos y sometirtoo a ciclos de temperatura,
,ná sección oeinol de leptoópira' La PCR puede ser empleada'con
post'nnftem)
"*prmün
r"iisti,l¡ñá, l¡quuo cerai"naquüJ'v t'tjotras de tejido (ante o
(Org-anización Mundial de la Salud' 2008)
;!ñ;i*"
;i"ñ;,-d
37
Varios protocolos de PCR para la detección de ADN de leptospin, en materiales
clínicos. se han desanollado desde la década de los 90's; la mayoría de ellos han
reportado una alta sensibilidad. Sin embargo solo dos han sido extensamente
evaluados en esfudios clínicos. El protocolo de Merien ef al', (1995) es un ensayo
genero especifico, que amplifica el ADN de ambos serovares patógenos y no
patogenos. Por otro lado, el enfoque descrito por Gravecamp ef af.' (1993)'
requiere de dos conjuntos de cebadores para detectar todas las especies que
contienen agentes patógenos. (Adler y de la Peña MocÍezuma, 2010)
En el estudio de Baquero et at., (201O) se demostró que un protocolo de PCR y la
amplificación del gen Rl,lAr de la subunidad 16s, pemitió la identificación de
especies de Leptospin infecfantes.
La reacción en cadena de la polirnerasa (PCR) prowe una base novedoea para la
tipificación de las leptospiras. (organización Mundial de ]a salud, 2008). Los
métodos siguientes pr.rcden ser usados:
.
e
o
o
.
o
Uso de cebadores deducidos de secuencias de especies o cepas'
Determinación de secuencias de produdos de PCR
Aplicación de técnicas de RFLP a productos de PCR
uso de cebadores sobre secuencias que tienen posiciones características
de cepa en el genoma, p.ej. elementos de inserción tales como lSl5O0' y
por ln tanto gefiefaf patrofies carac{erísticos de cepa en geles de agafoG€¡
Ánáfisis del polimorfismo de conformación de cad€na sencilla (sscP)cebadorss de secuencia arbitraria por PCR (AP-PCR), amplif¡cación al
aza¡ deADN potimórfico, o PCR de bajo rigor (L$PCR)'
de
otros investigadores en 1995, evaluaron la PCR pala la detección temprana
la
leptosp¡ras eñ muestras de pacientes con leptospirosb aguda. Ellos compararon
rápido'
método
un
cuftivos y serotogia, y ooncluyeron que h PCR, es
Póii,
."nribl" y específió para diteciar infección por leptospira,,especialmente durante
los primeros d¡as de la enbrmedad. (Sambasiva et al'' 2@31
A;
3.4.4PolimorfismodetemeñodeFragmentoadeRegtricción(RFLP)
en
de restricción son usadas para cortar el ADN de las leptospiras
Las enzimas-t["mado
fragmento
de
por
tamañoPolimorfismo de restricción
tr"g.;d*
Estos fragmentos son
cepa'
de
nivel
a
nfii"l, que pueden ser caraderísticos
.n gel de agarosa' Jormando patrones de bandas
."pátáíol poi
entre las cepas
Se pueden
-los-ento¡ices establecer las relaciones
ái""t rirt¡ü". "re"ltotot""c
pátrono de_epas desconocllas con aquelloa de
bacterianas comparanoo
con los RFLPs se alcanzan altos grados de
Li"t *"*¡¿"é 6"t"t"n"áf
-"lp"tanOo
los de los métodos serológicos y pueden
resolución, muchas ue"e"
revelar pequeñas diferencias entre cepas de leptospiras. (Organización Mundial de
la Salud, 2008)
El análisis RFLP de la amplificación por PCR de los genes RNAr 165 y 23S'
permitió la agrupación de 48 serovares dentro de 16 mapas de sitios de
polimorfismo de restricción. Uülizando este enfoque las genomo+species de
los genotipos de hañiobovis y
ieptospira pudieron ser identificadas
hadjopnjitro del serovar hañio fueron claramente diferenciados. El método ha
sido simplificado para producir solo cinco perfiles mediante el uso de una enzima
y
de restricción única. (Levett et a1.,2O01)
Rec¡entemente, patrones de restricción sobre el gen Rl,lfu han sklo utilizados para
la identificación de especies o para tipificacion epidemiológica. La conservación
natural del gen Rl,¡Ar permite el uso de una sola sonda para la üpificación. de
baclerias paia cualquier comparac¡ón filogenetica. La variación gefÉtica entre la L
intenogans serogrupo icterchemorngiae fue encontrada mediante patrones de
fragmentos de restricción de los genes RMr; otros invesügadores exam¡naron el
AD-N ribosomal de 103 cepas patógenas en 1993, usando Eco R1 RFLP de los
genes RNAr y describieron 69 nuevos riboüpos de Leptospirc, además de 49 que
!a se habían observado previamente. (Sambasiva et al-,2OO3l
La agrupación de las bacterias por ribotipificaglÓn (es decir, la determinación de
lor pémte" de fragmentos de restricción de ADN cromosómico d(¡erido probado
y para la
con RMr) ha sidtutilazada frecüentemente, tanto para fines taxonómicos
áracterizáción de subgrupos de microorganismos pertenecientes^a d'ferentes
éip"C¡"". Leptospin Spp. úene dos juegos de genes RNAr 165 y 23S y uno o dos
genes RtlAr'SS, q'e no estan esfeótramente relacbndos, sbndo dispefsos en el
este método de
é.ro"or" grande. Dado el pequeño número yde.genes RNAr,
tipificación nóes muy discriminaüvo' (Cerqueira Picardeau, 2009)
3.¿1.5
Número Variable de Repeücionea en Tándem (VNTRI
variabb de
Repeticiones polimórficas en tándem, también llamada número
para
la toma de
tánd.. (VNTR) ha silo ampliamente utitizada
las del ser
nüei6s daailares (fingerprints)'en eucariotas superiores, inclui6as
'n"r""o.
que
genomas
El análisis dJdátos de repeticiones en tándem demostró
númeJo- de repeüciones en tándem con
de L. intenogans contenían un gian
-<le
longitud. Estas repet¡cbnes :on adecuadas
dé menos de 100pb
de productos de PCR'
"á"r"n"¡""
iái".iáñán"¡" de polimorfts-mó o"r.¿o én h etectroforesis
y
po"o" to"i vÑlC- tá éncuentran en el patógeno L' botgpetersenii
qrimep es-pecíficos
"t¡átgo
ta;i" ulvn lanaiisis multilocus de VNTR) requiere
el M.LV| es
y
kirchrnn),
L'
"t
(coi¡ eicepcon de L intenogans
especie
a
pertenecientes
serovares
específica para las ."p"" p"tóg"nas y puede distinguir
del genero Lepstospin.
las especies patógenas ,a" ñ""u.,itér"nte fepoftadas
(Cerqueira Y Picardeau' 2@9)
ñ;i¿ñ;.i
ir
ü;ü
;;;.;A
El análisis de 16 cepas de L. intenogans serovar Pomona, por MLVA revelo una
gran diversidad genética de este serovar en Argentina, ya que cuatro genotipos no
habían sido anteriormente rec¡nocidos. Los cuatro nuevos genotipos
demonimados A, B, C y D, fueron genéticamente relacionados entre sí, y se
encontró que eran más cercanos entre sí que cualquier otro genotipo definido
previamente por MLVA. Argentina presenta cuatro nuevos genotipos solo para el
serovar Pomona, lo que representa casi el 10% de la diversidad total que se ha
descrito, esta gran diversidad sugiere una amplia gama de leptospiras restiantes
por descubrir. (Pavan ef al., 2008)
3.4.6 Tipificeción de
múlüpls locus (ilLST)
En el MLST. las variaciones en los diferentes locus se detectan de foma directa
por secuenciación del ADN en fragmentos de genes seleccionados, pemitiendo la
identificación de grupos de microorganismc con genotipoe kJéntk;os (clones) o
altamente relacionados (líneas clonales). Esto permite identificar todas las
variaciones. (Vazquez y Benon, 2ü)4)
de las secuencias de multiples locus
(MLóA) se han propuesto recientemente como altemativas para definir o
i"cono"er disüntas cepas de especies mencinnadas. Esta tecn¡ca requiere
La tipificación de múltiples locus y el análisis
identificación de los loci que evoluc¡onan más rápidamente que los genes
RlAr
y
el análisis de múltiples genes para proveer una protección contra efectos
distorsionadores de recombinación en un solo locus. (Leon ef at" 2010)
Varias herramientas moleculares que hasta ahora se han descrito para el
por
diagnostico de Leptospin están asociados a inconvenientes, ya sea
y
óñpf¡"..¡ono Éónbás o difrcultades de ¡nterpretacbn, portrabilidad
repóducibilidad; algunos de estos métodos requieren de organismos vivos o
todos
cócentrac¡ones ¿e ¡Otl de muy alta pureza. El enfoque de MLST supera
un
secuenciador
y
de.
estos inconven¡entes, @mo h técnica'es sencilla requiere
automát¡codeADN,locuabssonamp|iamentedisponib|esen|amayoíade|os
principal
.ventaja
f"¡óráto¡o" y la secuencia de datos ei inequlvoca y eplicita. La
y
de la MLSi es la transferencia de datos que pueden ser. Tmp?rtf.T
óró"r"Oo"
(Nalam
entre diferentes laboratorios con facilidad a tfavés de intemet.
et al.,2O1O)
Hasta|afechaungrannúmerodeorganivnoshansidotipiñcadosrr¡ediante|a
Este
f,rflSi, f" cual ha á.r*ir"¿o ser uná técnica altamente discriminatoria'
lo
s99'l
de tqp.foq¡ira
método es el más aO"cu"áó en h irJentificación de espec¡es
las especles'
iná¡ooo po, la agrupac¡ón de patrones a nivel del genoma de
(Nalam ef a1.,2010)
de desanollar un
Una de las importantes ventajas de MLST es la capacidad.
espaciados en tiempo y geografia'
análisis de los datos de evolucón que son muy
Los datos actuales muestran el valor de esta henamienta para la investigación
epidemiológica de un brote local. Sin embargo, una aplicación más amplia seria,
sobre los aislados de colecciones históricas y contemporáneas en todo el mundo,
lo que nos dará una mayor comptensión de la biología de la evolución de este
importante patógeno. (Levett, 2007)
4L
4.
DISCUSTÓN
La leptospirosis es una zoonosis remergente de distribución mundial, (Levett,
2001: Sambasiva et al., 2OO3: Flo¡e2,2005; Levett, 2007; Slack et al., 2007;
Feamley et al., 2008; Pavan ef al., 2OO8; Lin et al., 2009; Vedhagin et al., 2OO9;
Quitián ef al.. 2009; Takeri et a1.,2010; Sun ef al., 2O1O; Gomez et al.' 2008;
Suepauf et al., 2O'lO; Nalam ef al., 2O1O) con mayor incidencia en las zonas
tropicales. Ac{ualmente su transmisión ocurre con mayor frecuencia en zonas
donde hay expansión poblacional, especialmente en pa¡ses en vía de desanollo;
Generalmente se reportan la mayoría de los brotes durante las épocas de lluvia y
se relaciona la infección humana con la ocupación laboral (producción
agropecuaria, cuftivos de anoz, contacto directo con animales domésücos).
(Levett, 2001; Sambasiva et al., 2003; Gespedes, 2005; Levett, 2007; Cerqueira y
Piccardeau, 2009; Adler y de la Peña Moctezuma, 2010; Eslaba-o et al.'2010)
que afecta a los . seres
humanos y a los animales domésticos, principalmente los caninos, bovinos y
porcinos; É cual se ea¡a6.enza por fiebre, insuficiencia renal y hepáüca. (Adler y
de fa Peña Moctezuma,2010; Eslaba-o etal.'2010)
La leptospirosís es una enfermedad sistémica
gfE¡Ye
La inmunización ha sido ampliamente r¡tilizada por muchos años, mediante la
inducción de inmunidad en animales y humanos, con un éxito limitado. En los
paises desanollados, los cerdos, el ganado y los penos son ampliamente
inmunizados; en la mayoría de los países en desarollo las vacunas que
contienen los serovares pertinentes a nivel local no están disponibles. (Levett'
2001 ; Cerqueira y Picardáu, 2@9; Adler y de la Peña Moctezuma, 2010)
de
La serotipificación y el diagnóstico de leptospirosis se realizan mediante el uso
y ELISA.
tecnicas iue son ampliaménte reconocidas a nivel mund¡al, como la MAT
Estas tecnlcas serológicas son loe fftétodos de laboratorio más comúmnente
utilir"do"; sin embargó, MAT, desanollada pof Maftin & Petit (1918), sigue
sünoo er'm¿to¿o de*referencia (Gold estándar). (Levett, 2001; cespedes, 2005;
h
OrganizaciónMundialdelaSalud,2003;AdlerydelaPeñaMoctezuma)
prueba puede ofrecer
La mayor ventaja de la MAT es su alta especificidad. Esta
pero
una indicación del serogrupo al cual pertenece el sefovar ¡nfectante'
MAT es
iáámente lo identifica. (órg'anizac¡ón Mundiat de ta salud, 2008). La
quepuede
puesto
tá.'¡en la prueba mas a¡irofiaCa para estudios de prevalencia,
ápf¡oOá a sueros Oé cuatqu¡ér espe,og animal y la gama.de los antígenos
""t
puede ampliar o divninuir según kr rcquerido' (ces@es' 2005)
ñJó";
pnreba no es pos¡ble'
Sin embargo, realiza¡ un diagnóstico temprary con esta
antígenos de
J"¡¡áó á qué ésta se basá e"n la deteccién de antiorerpos contra
después de
leotosoira. los cuales no-*n detectablee sino hagta una ssnana
int¡"d'o" los síntomas. (Cequeria y Picardeau, 2009)
La MAT es una prueba complicada y dispendiosa, consume mucho tiempo, debido
a que requiere una gran colección de cultivos vivos de diferentes cepas para
usarlas como antígenos, para detec{ar los anticuerpos aglutinantes. La
interpretación de los resultados es complicada por las frecuentes reacciones
cruzadas que ocurren entre los serogrupos, como las que suele ocunir con
serovares saprof¡tos y patógenos. (Cespedes, 2005) (Cerqueira y Picardeau,
2009) (Adler y de la Peña Moctezuma, 2010)
La prueba de ELISA da una respuesta positiva en la evaluación diagnóstica de
leptospirosis algo más temprano que la [lAT porque es más sensible para los
anticuerpos lgM, generalmente se observa posltivirlad 6 - 8 días después de la
aparición de ios primeros signos clínicos. Una ventaja potencial de la ELISA es
que puede ayudar a diferenciar entre una leptospirosis actual de una previa'
(organización Mundial de la salud, 2008) esta técnica es utilizada ampliamente
por los laboratorios, por su facilidad y bajo costo' (Sambasiva, 2003). A pesar de la
alta sensibilidad de las pruebas ELlsA, como se basa en un antfgeno género
específico, no da índicacién del serovar infectante. (organizacón Mundial de la
Salud,2008)
Actualmente, diversas técnicas moleculares son utilizadas con buenos resufhados,
entre estas, ia PFGE, PCR, RFLP, VNTR y MLST, entre otras; cada una de ellas
y el uso complementario entre las mismas, han sirJo ensayadas oor diferglles
áutores. 1t-evótt,2007; Slack etat.,2007; Pavan ef al.,2oO8; Romero etal''2009;
Cerqueira y Picardeau, 2009; Ahmed et at.,2O1O: Qaqugrg et al', 2010; Nalam el
Levett, 2010; Leon et al-, 20'lO; Adler y de la Peña
at., 2O'tO; Galloway
Moctezuma,2010)
En la PFGE, enzimas de restricción, tales como Nofl, se usan para dife¡enciar
la
entre Lepfospr,ia spp y muchas veces también entre cepas. Este método ofrece
presentes-sólo
venta¡a á" po¿"r inierpretarse de una manera simple ya que está1
¡ánOá" gáOe" y poi to tanto pocas. (Organizacirin Mundial de la Salud, 2008).
de
Hermanñ et at. (iSigZ) reporto muy buena concordancia entre los resuftados
pfCly *t"t¡pmcac¡On. Én el estudio de Romero ef aL (2009) la PFGE y la MAT
razones la
,"""t"ón ,esilhd* similares a nivel de sefogrupos. por todas estas
tipificación molecular de
pÉCg se considera la prueba gold estándar pa'"
s¡n embargo,
serovares de Leptospin en comfaración a todas las otfas técnicas,
este método es muy-laborioso. (Cerqueira y Picardeau' 20ff))
y
la
aguda de
La PCR se ha convertido en la base del diagnóstico de la fase
Otros invesügadores
organismos molestos cnÁá teptospin (glack et al'' 2007'¡
en muestras
ávatuaron ta pCR pará ¡" detección temprana de bptospiras
con cultivos y
áá pacientes con leptospirosis aguda' Ellos compararon la PCR' y específico
ptn, es un.métod.o rápido' sensible
serología, y concluyeron qu" f"
durante los primeros días de
oara deteútar infección po-llápto"pit", especialmente
ia enfermedad. (Sambasiva et al'' 2003)
áriiiisl
La RFLP ha sido utilizada principalmente para la identificación de especies o para
tipificación epidemiológica. (Sambasiva et al., 2OO3l Dando muy buenos
resultados especialmente en ribotipificación, aunque dado el pequeño número de
genes RNAr de leptospin spp., este método de tipificación no es muy
discriminativo. (Cerqueira y Picardeau, 2009)
La
WNR y MLVA, es una técnica exitosa para distinguir serovarcs pertenecientes
a las especies patógenas más frecuentemente reportadas del genero Lepsfosplra
(Cerqueira y Picardeau, 2009), con la WNR las repeticiones en tándem.son
ádecuadas para el análisis de polimorfismos entre cepas, lo cual ha permitido el
hallazgo de nuevos genotipos en un mismo serovar- (Pavan efaL' 2008)
En el MLST. las variaciones en los diferentes locus se detectan de foma directa
por secuenciación del ADN en fragmentos de genes seleccionados, permitiendo la
identificacón de grupos de microorganismoe con genotipoe ¡denticos (clones) o
attamente relacioinaáos (líneas clonales). Esto permite identificar todas las
variaciones. (Vazquez y Benon, zOAq. La técnica es sencilla y requiere de un
secuenciadoi automático de ADN, lo cuales son ampliamente disponibles en la
mayoría de los laboratorios y la secuencia de datos es inequívoca y explicita. La
priícipal ventaja de la MLST es la transferencia de datos que pueden ser
y inmparados entre diferentes laboratorbs con frcilkJad a través de
borpárt¡O*
intemet. (Nalam ef a/., 2010)
M
5.
CONCLUSTOT{ES
La leptospirosis es una zoonosis reemergente de distribución mundial, con mayor
inCidencia en las zonas tropicales. Su transmisión ocurre 6gn mayOr frecuencia en
zonas donde hay expansión poblac¡onal, espec¡almente en países en vía de
desarrollo; la mayoría de los brotes se reportan durante las épocas de lluvia y se
relaciona la infección humana con la ocupación laboral (producción agropecuar¡a'
cultivos de arroz, contiacto directo con an¡males domésticos). Por rnedio de
métodos de diagnostico como el test de absorción de aglutinación cruzada CAAT
se han podido clasificar aproximadamente 250 serovares patógenos reconocidos,
alrededor de 80 serovares de L. intenogans se han identificado, 60 de estas ya
habían sido descritas. Por otra parte la tipificación molecular ha dado mayor
diferenciación en las cepas de algunos serogrupos.
El diagnostico de leptospirosis se basa principalmente en los resuftados de la
prueUJ 9o6 estándar 1tUÁn, sin embargo, se ha reportado baja sensibilidad y la
interpretácirin de los'resul&ados puede ser conrplicada por las frecu_g{es
r."""tion"" cruzadas que ocurren entre los serogrupos' Las pruebas.de ELISA
pr"O"n ser realizadas ie forma Épida y sencilla en la mayoría de los laboratorios;
un
be ha demostrado además, que son altamente sensibles, incluso para realizarque
diagnostico temprano de la enfermedad.De todas las técnicas moleculares,
ái¡iten at¡ora pára el diagnostico y la üpificacion de cepas de leptospira' se.ha
*n"fu¡Oó qu" L ebctofoiesis de ámpo pulsado PFGE ha reportado resultados
;*¡láá" i tá prueoa MAT a nivel de serogrupos, s¡n embargo, este método es
'uvl"uo,io"oynoestádisponib|een|amayoriade|oslaboratorios.LaPcRcon
.rn¡ple" protocolos, ha demoetfado ser un nÉtodo rápido, sensiblelosy
"ul
para deteclar la infección por leptospira, especialmente dufante
eipecmco
¿¡á" de la enfermedad, pero se requiere de equipos attiamente-costosos
para tipificación o
ñáráiu reat¡zación, por lo que su'uso podría ser más aplft:ativo
estudios de Prevalencia.
ó¡iá.
genoüpos, p9t l9-qu"
Con el uso de estas nuevas técnicas se han hallado nirevos
vanadones;
r" i¡pmá"¡on e incluso la taxonomía debe incluir todas estas nuevas
más
la
técnica
será
en un futuro @rciano se Jeue determinar cuál de estas forma realizar,una
parEr la tipificación de.leptospiras' y de esta
i""tJf"l
"t"ai"a
nuevaclasificacióntaxonómica.Colombiaporserunpaístropical'endondela
tanto en humanos como en an¡males; este
irá-""Li"ü o.la ieptosp¡r*is es alta
de estud¡os de
trabajo puede servir como !ui" t"o¡o .para la realización
para la estandarización de un
Drevalenc¡a o ¡ncluso pará-trá¡ajos posteriores
ilü;;t|e"tlar, esúcifico para cepas de nu€stro pa¡s'
45
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